JPH10511547A

JPH10511547A - 化合物

Info

Publication number: JPH10511547A
Application number: JP8520284A
Authority: JP
Inventors: テイラーソン，クリストファー・ジョン; エッゲルテ，ヘンドリクス・ジョアネス; ダラゴナ−フィオル，アントーニオ; ラヴィン，ブライアン・ロバート; ボイル，フランシス・トーマス; ヘナム，ジョン・フレデリック; ブレイキー，デイヴィッド・チャールズ; マーシャム，ピーター・ロバート; ヒートン，デイヴィッド・ウィリアム; デイヴィーズ，デイヴィッド・フー; スレイター，アンソニー・マイケル; エンヌカン，ローレン・フランスワ・アンドル
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 1998-11-10
Anticipated expiration: 2015-12-21
Also published as: TR199501654A3; MX9704575A; JP3805365B2; FI972683L; DE69527805D1; US5985281A; AU701916B2; EP0806964B1; FI972683A7; NO972882D0; AU4269796A; CN1171054A; BR9510490A; CN1095677C; SK80997A3; RU2189251C2; EP0806964A1; FI972683A0; HUT77450A; BR9510490B1

Abstract

(57)【要約】改良された標的酵素プロドラッグ療法、特に抗体−特異的酵素−プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）であって、用いる酵素が宿主酵素の突然変異形であり、その天然の宿主酵素、たとえばリボヌクレアーゼはイオン対相互作用によりその天然基質を認識し、この相互作用を突然変異酵素および相補的プロドラッグの設計に際して逆転させてある（“逆極性”）。

Description

【発明の詳細な説明】化合物本発明は、天然に起こらない突然変異形の宿主酵素、特に突然変異形のリボヌクレアーゼを用いる抗体−特異的酵素−プロドラッグ療法（antibody directed enzyme prodrug therapy，ＡＤＥＰＴ）に関する。患者の癌細胞を殺すように選択的に薬物をターゲティングさせることは、医学研究にとって長年の課題であった。ＡＤＥＰＴはこの課題を解決するための１方法である。ＡＤＥＰＴは酵素に結合した腫瘍選択性抗体を用いる。この結合体を患者に投与し（通常は静脈内）、腫瘍部位に局在させ、全身循環から清掃する。次いでプロドラッグを患者に投与すると、これは上記の酵素（腫瘍部位に局在）により細胞毒性薬物に変換され、これが腫瘍細胞を殺す。１分子の酵素が多数の細胞毒性薬物分子の生成を触媒できるので、増幅効果が得られる。さらに、この抗体により認識される抗原性を示さない腫瘍細胞（腫瘍は通常はミクロ不均質性を示す）も、酵素により増幅された細胞毒性薬物生成によって殺される。既知の系は酵素成分として原核細胞酵素カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）を用いる（国際特許出願公開第ＷＯ８８／０７３７８号を参照されたい）。原核細胞酵素を用いる系の欠点は、正常な腸内細菌叢に、非選択的な細胞毒性薬物生成を誘導する可能性のある原核生物が含まれる場合がある点である。既知の系についての問題はさらに、結合体の反復投与により宿主の免疫反応が起こり、治療の効果を低下させることである。抗体成分は一般にマウスモノクローナル抗体であり、これを既知の方法でヒト化して免疫原性を低下させることはできる。しかし酵素成分の免疫原性の低下は、より問題が多いことが分かっている。これは、この酵素成分が宿主であるヒトの循環内に天然に存在してはならないからである。さもなければプロドラッグから細胞毒性薬物への早期変換が起こり、腫瘍に対する選択毒性がみられない。アクゾは国際特許出願公開第ＷＯ９０／０２９３９号に、ヒトの酵素をＡＤＥＰＴに用い、選択性は循環内に普通は存在しないヒト酵素、たとえばリゾチームを選ぶことにより維持することを提唱した。アクゾは彼らの酵素としてリゾチームを選んだので、基質要求性のため［エンドグリコシダーゼであるので、それは解裂のためにＮ−アセチルグルコサミンのβ−_1-4結合ポリマー（ＮＡＧ−キチン）を必要とする］、そのような官能基を含むプロドラッグを製造せざるをえなかった。細胞への進入を阻止するために、さらにタウリン残基をもつオリゴマーを調製した−このスルホン酸によって細胞への進入を阻止し、したがって細胞毒性を阻止した（２０倍低い）−国際特許出願公開第ＷＯ９０／０２９３９号の図１３。ＡＤＥＰＴに哺乳動物酵素、たとえばアルカリホスファターゼ（センターら：米国特許第４，９７５，２７８号）、またはヒト酵素、たとえばβ−グルクロニダーゼ（ベーリングウェルケ；西ドイツ特許第４２３３６２３７号）またはリゾチーム（アクゾ；国際特許出願公開第ＷＯ９０／０７９２９号）を用いることには、それらの酵素が非哺乳動物酵素と比較して免疫原性が低いか、または免疫原性をもたないという利点がある。哺乳動物またはヒトの酵素を用いることの欠点は、それが患者に内在し、したがって投与した抗体−酵素結合体によってではなくプロドラッグから薬物へ代謝回転する可能性がある点である。このためこの型のＡＤＥＰＴ法では毒性が高くなりやすい。アルカリホスファターゼに対するプロドラッグは、マウスにおいても（Ｄｏｙｌｅ，Ｔ．Ｗ．およびＶｙａｓ，Ｄ．Ｍ.,ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔｍｅｎｔＲｅｖｉｅｗｓ１７，１２７−１３１，１９９０）、ヒトにおいても（Ｈａｎｄｅら，ＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ５３，２３３，１９９３）、内因性アルカリホスファターゼが広く分布するため投与結合体の不在下で薬物に変換される。したがってこれはこの酵素についての重大な問題であることが確認された。β−グルクロニダーゼまたはリゾチームに対するプロドラッグについてのヒトのデータはない。グルクロニダーゼおよびリゾチームは血漿中および他の組織部位に存在する。アクゾはリゾチームが乳汁、涙、唾液、脾臓、白血球および単球中に存在すると報告している。ベーリングウェルケは西ドイツ特許第４２３３６２３７号に、活性化したマクロファージ、顆粒球および血小板がグルクロニダーゼを分泌すると報告している。これらの細胞は身体全体に広く分布するので、これは望ましくないプロドラッグ活性化をもたらす可能性がある。実際にベーリングウェルケは、マウスにおいてドキソルビシンのプロドラッグを投与したのち、これらの細胞の豊富な供給源である脾臓に高濃度の遊離薬物が蓄積することを示した（西ドイツ特許第４２３３６２３７号の表３を参照されたい）。このＡＤＥＰＴ法にヒトの酵素を用いるのは、主として細胞内に分布する酵素のみを使用でき、かつそれらと共に用いるプロドラッグは毒性を最小限に抑えるために細胞外に保持されなければならないという事実によって制限される。これはＡＤＥＰＴ系を調製する選択数をいちじるしく制限する。リゾチームは小型の酵素であるが、ＡＤＥＰＴにとって欠点をもつ。リゾチームは活性薬物を放出せず、未知の薬理活性をもつ誘導体を放出する。アクゾが示した例では、遊離ドキソルビシンではなくＤｏｘ−(ＧｌｃＮＡｃ)₁またはＤｏｘ−(ＧｌｃＮＡｃ)₅を放出する。グルクロニダーゼは有効薬物、たとえばアドリアマイシンをグルクロニドプロドラッグから放出することができ、抗腫瘍活性があると報告されている（Ｂｏｓｓｌｅｒら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５４，２１５１−５９，１９９４）。しかしヒトグルクロニダーゼは高分子量の酵素であり（１５０〜３００ＫＤａ）、したがって得られるターゲティング結合体はきわめて大型になりやすい。これは腫瘍などの組織中への浸透に問題を生じると思われる。小型のタンパク質ほど速やかに充実性腫瘍中へ浸透することは十分に立証されている。さらにグルクロニダーゼはグリコシル化され、このグリコシル化によってＡＤＥＰＴに用いた抗体−グルクロニダーゼ結合体が急速に血液から清掃される。この血液からの急速な清掃の結果、結合体は異種移植体である腫瘍へほとんど局在しない。高い分子量と血液からの急速な清掃とが組合わさって、患者の腫瘍への局在は少なくなると思われる。したがってグルクロニダーゼはＡＤＥＰＴに理想的な酵素ではない。本発明は、宿主酵素（たとえばヒトリボヌクレアーゼ、すなわち全身循環中に天然に存在する酵素）を工学的に処理して、天然の宿主酵素は有意に認識しないＡＤＥＰＴ療法プロドラッグを認識するようにできるという知見に基づく。この工学的に処理した酵素はアミノ酸組成においては天然の宿主酵素にきわめて類似するので、細菌酵素、たとえばＣＰＧ２と比較して免疫原性がいちじるしく低いという利点をもつ。工学的に処理した酵素は天然には存在しないので、天然菌叢またはヒト酵素による非選択的なプロドラッグ活性化の誘導は少なくなるという利点がある。この方法はさらに、天然の酵素分布により制限されず、細胞内へ進入するプロドラッグを使用できるので、ヒトまたは哺乳動物の広範な酵素に適用できるという利点をもつ。これらの問題には国際特許出願公開第ＷＯ９５／１３０９５号（ウェルカム・ファウンデーション）が一部対処しているが、これは本発明の最初の優先権主張日の後に公開された。この特許出願は、対応する天然酵素によっては活性化されないプロドラッグを活性化する突然変異した哺乳動物酵素を用いるＡＤＥＰＴ法を提供するが、本発明を開示してはいない。きわめて意外なことに、帯電した残基、すなわち酵素の基質結合部位もしくは触媒部位またはその近くに位置する残基を反対の電荷の残基で置換すると、無傷の触媒中心をもつ突然変異酵素が得られ、この突然変異酵素は関連する相補的な、ただし電荷が逆転した基質特異性要件をもつ点においてのみ天然酵素と異なる。さらに、ウェルカムに開示されたプロドラッグ／薬物結合体（メトトレキセートおよびメルファランに基づく）は、能動輸送機構の遮断によりプロドラッグの細胞浸透を阻止する。このためプロドラッグ／薬物の可能性の範囲をこのような能動輸送機構をもつものに制限する。これに対し本明細書に開示する逆極性法によれば、プロドラッグの細胞浸透を遮断するためにプロドラッグ（能動輸送特性があってもなくてもよい）の帯電性を選ぶことができ、したがって本発明はより広範に選ばれたプロドラッグ／薬物に利用できる。本発明の１態様によれば、宿主に使用するために設計した調和する２成分系であって、それらの成分が（ｉ）腫瘍に付随する抗原と結合しうるターゲティング部分である第１成分；該ターゲティング部分はプロドラッグを抗腫瘍性薬物に変換させうる突然変異酵素に連結している；および（ii）該酵素の作用下で抗腫瘍性薬物に変換しうるプロドラッグである第２成分を含み、それらにおいて突然変異酵素は宿主酵素の突然変異形であり、その天然の宿主酵素はイオン対相互作用により天然基質を認識し、この相互作用を突然変異酵素および相補的プロドラッグの設計に際して逆転させてあり（“逆極性”）；第１成分は宿主において実質的に非免疫原性であり；かつプロドラッグである第２成分は宿主において突然変異していない天然の宿主酵素によって有意には抗腫瘍性薬物に変換しえない系が提供される。好ましくは上記の系は、第１成分がその系を使用する予定の宿主と同じ種に由来する酵素に基づく突然変異酵素を含むものである。好ましくは上記の系は、ターゲティング部分が抗体またはそのフラグメントであるものである。好ましくは上記の系は、抗体フラグメントがＦ（ａｂ'）₂フラグメントであるものである。好ましくは上記の系は、突然変異酵素が突然変異リボヌクレアーゼであるものである。好ましくは上記の系は、突然変異酵素が位置６６に負に帯電したアミノ酸を含むヒトリボヌクレアーゼであるものである。好ましくは上記の系は、リボヌクレアーゼの位置６６の負に帯電したアミノ酸がＧｌｕであるものである。上記の系につき他の好ましい態様は、突然変異酵素が突然変異グルクロニダーゼであるものである。本発明の他の態様によれば、宿主に使用するために設計した調和する２成分系であって、それらの成分が（ｉ）腫瘍に付随する抗原と結合しうるターゲティング部分である第１成分；該ターゲティング部分はプロドラッグを抗腫瘍性薬物に変換させうる突然変異酵素に連結している；および（ii）該酵素の作用下で抗腫瘍性薬物に変換しうるプロドラッグである第２成分を含み、それらにおいて突然変異酵素は宿主酵素の突然変異形であり；第１成分は宿主において実質的に非免疫原性であり；かつプロドラッグは宿主において突然変異していない天然の宿主酵素によって有意には抗腫瘍性薬物に変換しえない系が提供される。 “プロドラッグは宿主において突然変異していない天然の宿主酵素によって有意には抗腫瘍性薬物に変換しえない”という語は、宿主に投与した際にプロドラッグが不都合な毒性の問題を生じないことを意味する。 “実質的に非免疫原性”という語は、宿主に第１成分を２回以上投与しても、たとえば細菌酵素に連結したマウス抗体を宿主に用いた場合にみられるような有意の宿主免疫反応を起こさないことを意味する。好ましくは突然変異酵素は、その系を使用する予定の宿主と同じ種に由来する酵素に基づくが、不都合な免疫原性の問題を生じないのに十分な程度に酵素の構造が種間で保存されている限り、突然変異酵素は異なる種に由来する宿主酵素に基づくものであってもよい。好ましくはターゲティング部分は抗体、特に抗体フラグメント、たとえばＦ（ａｂ'）₂である。酵素への連結は既知の方法で、たとえばヘテロ二官能性試薬を架橋剤として用いて、または遺伝子融合その他の好適な方法で行うことができる。抗体は同一宿主に由来するものであってもよく（たとえばマウス抗体をマウスに使用）、または選ばれた宿主において有意には異物と認識されないように抗体を操作してもよい（たとえばヒトにおいてキメラ、ＣＤＲグラフト化、または被覆したマウス抗体を使用）。ヒト抗体の定常部ドメイン中へのげっ歯類の可変部ドメインの移植（キメラ抗体）、またはヒト抗体中へのげっ歯類の抗原結合性ループ（ＣＤＲ）の構築（ＣＤＲグラフト化）は両方とも、げっ歯類の免疫原性をおおはばに低下させることがサルおよびヒト患者における前臨床試験で示された。ＣＤＲグラフト抗体ですら、げっ歯類の抗体配列に由来する多数（＞５０）のアミノ酸がヒト枠組み中に取り込まれる。それにもかかわらず、サルおよびヒト患者で免疫原性がおおはばに低下すると報告された。これは、宿主酵素の触媒部位のごく限られた数のアミノ酸を突然変異させても、免疫原性が低く、もちろん非宿主酵素より免疫原性の低い酵素が得られるという証拠になる。下記の参考文献を参照されたい：Ａ．ＭｏｕｎｔａｉｎおよびＪ．Ｒ．Ａｄａｉｒ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｖｉｅｗｓ１０，１−１４２，１９９２；Ｇ．ＷｉｎｔｅｒおよびＷ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１４，１３９−１４３，１９９３；Ｉ．Ｉ．Ｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，２８４４−５７，１９９３；Ｊ．Ｈａｋｉｍｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，１１３５２−５９，１９９１；ならびにＪ．Ｄ．Ｉｓａｃｓら，ＴｈｅＬａｎｃｅｔ，３４０，７４８−７５２，１９９２。定常部ドメインは、たとえばヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインであってもよい。ヒトＩｇＧ２および３（特にＩｇＧ２）が好ましいが、ＩｇＧ１および４イソタイプも使用できる。ヒト抗体を産生するように工学的に処理したマウスにおいて生成したヒト抗体自体も使用できる。宿主酵素を突然変異させて（いずれか好適な方法、たとえば化学的またはバイオテクノロジーによる遺伝子合成または標的突然変異による）、酵素活性部位とプロドラッグの相互作用様式を天然の宿主酵素の様式と比べて変化させる。好ましくは酵素の突然変異は、その活性部位の極性を変化させるものであり、これによってこの酵素は相補的極性をもつプロドラッグを代謝回転するが、そのプロドラッグは突然変異していない宿主酵素によっては有意に代謝回転されない。好ましくは天然の宿主酵素はイオン対相互作用によりその天然基質を認識するものであり、この相互作用を突然変異酵素および相補的プロドラッグの設計に際して逆転させる。好ましくは酵素は逆の極性をもつ突然変異したリボヌクレアーゼ、特にヒトリボヌクレアーゼである（図１２〜１５参照）。ヒトリボヌクレアーゼ中のリシン６６は正に帯電した残基であり、これはこの酵素に対する天然ＲＮＡ基質上の負に帯電したリン酸基と相互作用する。この残基の極性を、たとえば遺伝子工学により（ただし化学合成も考慮される）逆転させて、負に帯電した残基、たとえばグルタミン酸にする。得られた“逆の極性をもつ”酵素は、突然変異していない宿主酵素によっては有意に認識されない本発明のプロドラッグを認識する。基質結合性および代謝回転特性を最適にするために、天然部位領域の残基に対する変更をさらに行うことができる。工学的に処理した形のリボヌクレアーゼ酵素は、本発明の他の態様である。リボヌクレアーゼはその分子量が低く（約１３６００Ｄａ；投与後に腫瘍への浸透が良好である）、かつ熱負荷およびタンパク質分解に対する安定性が良好であるので、有利な酵素である。好ましくはプロドラッグは図１１に示す式１のマスタード−リボヌクレオチドである。式中：ＱはＯまたはＮＨ（特にＮＨ）であり；Ａは式−Ｘ−Ｙ−の基であり、ここでＹはＳＯ₂、ＣＯまたは単結合（好ましくはＣＯ）であり、ただしＱが酸素である場合にはＹはＳＯ₂ではなく；Ｘは−（ＣＨ₂）_n−であり、ここでｎ＝１〜４（好ましくはｎ＝１、ただしＹが単結合である場合にはｎは好ましくは２である）であり、これは所望により任意の炭素原子においてＣ₁ _〜4アルキルで置換されていてもよく（いずれのキラル原子においてもＲおよび／またはＳ配置が考慮される）、またはＹがＣＯであり、かつｎ＝１である場合には、Ｘは炭素において所望によりアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンの側鎖で置換されていてもよく（いずれのキラル原子においてもＲおよび／またはＳ配置が考慮される）；Ｒ１は図１１に示すようにウラシルまたはシトシンであり；Ｒ２およびＲ３は独立してＨまたはＣ₁ _〜4アルキルを表し（好ましくはメチル、特にＲ２＝Ｒ３＝Ｈ）；Ｒ５およびＲ６は独立してＣｌ、メシルまたはトシルを表し（好ましくはＲ５＝Ｒ６＝Ｃｌ）；Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立してＨ、Ｃ₁ _〜4アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ₁ _〜4アルコキシ（好ましくはメトキシ）、ＦまたはＣｌ（好ましくはＣｌ）を表し、Ｈ以外の基を表すのに好ましい位置はＲ８およびＲ９であり、ただしＲ７＝Ｒ８＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈが特に好ましい。好ましい態様において、マスタードリボヌクレオチドはＱがＮＨであり；Ｘが−（ＣＨ₂）_n−であり、ここでｎ＝１〜４であり；Ｙが−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｒ１がウラシルまたはシトシンであり；Ｒ２およびＲ３がＨであり；Ｒ５およびＲ６がＣｌであり；かつＲ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がＨであるものまたはその塩である。以下の具体的な化合物が特に好ましい：リン酸水素Ｏ−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（２−アミノアセトアミドメチル）−５−（２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン −１−イル）−４−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロフラン−３−イル］Ｏ−［４−（ビス［２−クロロエチル」アミノ）フェノキシ］。これを図７に最終生成物として示す。他の好ましい化合物は、図７の最終生成物のシトシン類似体である。本明細書において、総称“アルキル”には直鎖および分枝鎖アルキル基が両方とも含まれる。ただし個々のアルキル基、たとえば“プロピル”は直鎖形のみに限定され、個々の分枝鎖アルキル基、たとえば“イソプロピル”は分枝鎖形のみに限定される。他の総称についても同様な慣例を適用する。式１の特定の化合物が１個またはそれ以上の不斉炭素原子により光学活性形またはラセミ形で存在する場合、本発明は本発明の突然変異酵素の基質としての特性をもつ光学活性形またはラセミ形をいずれもその定義に包含すると解すべきである。光学活性形の合成は当技術分野で周知の有機化学的標準法により、たとえば光学活性な出発物質からの合成により実施するか、またはラセミ形の分割による。突然変異酵素に対する基質特性も標準的な実験室的方法で評価できる。点突然変異については以下のように述べる：天然アミノ酸（１文字命名法を採用）、位置、新規アミノ酸。たとえば“Ｄ２３５Ｋ”は、位置２３５のアスパラギン酸（Ｄ）をリシン（Ｋ）に変更したことを意味する。１酵素における多重突然変異は角かっこ間に示される。本明細書においてＣＰＢという語は、別途指示しない限り、または論旨から自明でない限り、以下のものを含む：ｉ）“標識（ｔａｇ）”を含むか、または含まない成熟プロ形およびプレプロ形の酵素（たとえばｃ−ｍｙｃ）； ii）ＬｙｓまたはＡｒｇをＣ末端にもつペプチド系基質に対する特異性を備えたすべてのカルボキシペプチダーゼ；膵臓および血漿ＣＰＢ酵素（膵臓酵素が好ましい）。本発明の突然変異ＣＰＢは、本発明に必要な目的特性をもつ上記のすべてのＣＰＢの突然変異体である。以下の膵臓ＨＣＰＢが好ましい：Ｄ２３５Ｋ、Ｄ２３５Ｒ、特に［Ｇ２５１Ｎ．Ｄ２３５Ｒ］；他のＣＰＢにおける対応する突然変異も考慮される。本発明の突然変異体ＣＰＢは、鍵突然変異の特性を有意に変化させない他の“保存”突然変異（挿入、置換および／または欠失）をも含む。本明細書の目的に対し、保存的アミノ酸置換は、自然に起こる確率が偶然に起こるその置換の確率の１０倍より大きい置換である（Ｄａｙｈｏｆｆら，ＡｔｌａｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９７１，ｐ．９５〜９６および図９〜１０により記載されたコンピューター法により定めたもの）。ＣＰＢに関する参考文献には以下のものが含まれる：ＦｏｌｋＪＥ，Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＶｏｌＩＩＩ，アカデミック・プレス（１９７１），ｐ．５７；ＣｏｌｌＭら（１９９１）ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１０，１〜９；ＥａｔｏｎＤＬら（１９９１）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６６，２１８３３−２１８３８；ＹａｍａｍｏｔｏＫら（１９９２）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６７，２２７５−２５８１；米国特許第５３６４９３４号（ジーンテク）；および国際特許出願公開第ＷＯ９５／１４０９６号（イーライ・リリー）。本発明の化合物は種々の無機および有機の酸および塩基と塩を形成することができ、これらも本発明の範囲に含まれる。これらの塩にはアンモニウム塩、アルカリ金属塩、たとえばナトリウム塩およびカリウム塩、アルカリ土類金属塩、たとえばカルシウム塩およびマグネシウム塩、有機塩基との塩、たとえばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミン塩、アルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩が含まれる。有機酸および無機酸、たとえばＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ₂ＳＯ₄、Ｈ₃ＰＯ₄、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、フマル酸およびカンファースルホン酸との塩も好ましい。生理学的に許容しうる無毒性塩が好ましいが、たとえば生成物の単離または精製には他の塩も有用である。上記の塩は常法により、たとえば遊離酸形または遊離塩基形の生成物を１当量またはそれ以上の適切な塩基または酸と、塩が不溶性である溶剤もしくは媒質中で、または水中で反応させ、次いでこれを真空中で、もしくは凍結乾燥により分離することによって形成するか、または好適なイオン交換樹脂上で既存の塩のカチオンを他のカチオンと交換することによって形成できる。本発明の化合物は経口投与のための錠剤、カプセル剤、直腸投与のための坐剤、非経口投与または筋肉内投与のための無菌液剤または懸濁剤などの組成物中に使用できる。本発明の化合物は、処置を必要とする患者（動物およびヒト）に、最適な薬剤学的効果を与える量で投与できる。用量は疾病の性質および程度、患者の体重、患者にその後与える特別食、併用薬剤、ならびに当業者に自明の他の要因に応じて患者ごとに異なるが、用量は一般に患者１人当たり１日約１〜４０００ｍｇであり、これを単回または多数回投与できる。用量範囲は好ましくは患者１人当たり１日約１００〜４０００ｍｇ、より好ましくは患者１人当たり１日約５００〜３０００ｍｇである。癌の治療における本発明の結合体およびプロドラッグの最も効果的な投与様式および用量計画は、疾病の程度、患者の健康状態および治療に対する反応、ならびに担当医の判断など、多数の要因に依存する。したがって結合体およびプロドラッグの用量は個々の患者に合わせるべきであるが、結合体の有効量は２０〜約２００ｍｇ／ｍ²であると思われる。プロドラッグの有効量は用いる個々の薬物、および母体薬物の毒性に依存するであろう。プロドラッグは母体薬物より細胞毒性が低いので、母体薬物のＭＴＤが分かっている場合にはそれが出発点になるであろう。母体薬物に関して臨床データがないフェノールマスタード系薬物については、治療用量範囲が不確実であり、標準的な動物毒性試験、および患者において低い用量から出発する用量漸増試験により判定する必要があろう。しかし一般に治療用量は５００〜２０００ｍｇ／ｍ²である。もちろんこれらの用量範囲は１日量を分割投与するのに必要な単位基準で調節でき、前記のように用量は疾病の性質および程度、患者の体重、特別食その他の要因に応じて異なるであろう。一般にこれらの組合わせを後記の薬剤組成物中に配合できる。一般に１〜１００ｍｇの式Ｉの化合物もしくは化合物の混合物またはその生理的に許容しうる塩を、生理的に許容しうるベヒクル、キャリヤー、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤、着香剤などと共に、受け入れられている薬剤実務によって適切とされる単位用量剤形に配合する。これらの組成物または製剤中の有効物質の量は、上記範囲の量が得られる量である。錠剤、カプセル剤などに装入できる佐剤の例は以下のものである：結合剤、たとえばトラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン；賦形剤、たとえば微晶質セルロース；崩壊剤、たとえばコーンスターチ、予め糊化したデンプン、アルギン酸など；滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム；甘味剤、たとえば白糖、乳糖またはサッカリン；着香剤、たとえばハッカ、またはウィンターグリーン油もしくはサクランボ。用量単位剤形がカプセル剤である場合、それは上記の種類の物質のほかに、液体キャリヤー、たとえば脂肪油を含有してもよい。他の種々の物質がコーティングとして、または他の形で用量単位剤形の物理的形態を変更するために存在してもよい。たとえば錠剤をセラック、糖または両方でコーティングしてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、有効化合物、甘味剤としての白糖、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、着色剤および着香剤、たとえばサクランボまたはオレンジのフレーバーを含有してもよい。注射用の無菌組成物は、通常の薬剤実務に従って有効物質をベヒクル、たとえば注射用水、天然植物油、たとえばゴマ油、ヤシ油、ラッカセイ油、綿実油など、または合成脂肪系ベヒクル、たとえばオレイン酸エチルなどに溶解または懸濁することにより配合できる。緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などを必要に応じて装入できる。本発明の他の態様によれば、宿主において新生細胞の増殖を抑制する方法であって、有効量の第１成分を宿主に投与し、第１成分を全身循環から実質的に清掃させ、そして有効量の第２成分を投与することを含む方法に使用するための、本明細書に定める系が提供される。好ましくはこれらの成分を静脈内投与する。本発明の他の態様によれば、宿主において新生細胞の増殖を抑制する方法であって、有効量の前記に定める第１成分を宿主に投与し、第１成分を全身循環から実質的に清掃させ、そして有効量の前記に定める第２成分を投与することを含む方法が提供される。本発明の他の態様によれば、腫瘍に局在させるのに有効な量の本明細書に定める第１成分、および薬剤学的に許容しうるキャリヤーまたは希釈剤を含む薬剤組成物が提供される。好ましくはこの組成物は静脈内投与に適する。好ましくは第１成分を乾燥固体として供給し、これを使用前に好適な希釈剤で再溶解する。本発明の他の態様によれば、有効な抗腫瘍量の本明細書に定める第２成分、および薬剤学的に許容しうるキャリヤーまたは希釈剤を含む薬剤組成物が提供される。好ましくはこの組成物は静脈内投与に適する。好ましくは第２成分を乾燥固体として供給し、これを使用前に好適な希釈剤で再溶解する。本発明の他の態様によれば、前記に定める第１成分を含む薬剤組成物が提供される。本発明の他の態様によれば、前記に定める第２成分を含む薬剤組成物が提供される。好ましい薬剤組成物は無菌である（静脈内投与用）。本発明の他の態様によれば、前記に定める第１成分が提供される。本発明の他の態様によれば、前記に定める突然変異酵素が提供される。本発明の他の態様によれば、プラスミドｐＱＲ１６２が提供される。プラスミドｐＱＲ１６２は、ブダペスト条約のもとで１９９４年８月１６日に、寄託番号ＮＣＩＭＢ４０６７８としてＮＣＩＭＢ（２３ＳｔＭａｃｈａｒＤｒｉｖｅ，ＡｂｅｒｄｅｅｎＡＢ２１ＲＹ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ、英国）に寄託された。ｐＣＧ３３０（ｐＩＣＩ１６９８としても知られる）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳＤ１６４６は、ブダペスト条約のもとで１９９４年１１月２３日に、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）（２３ＳｔＭａｃｈａｒＤｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ、英国、ＡＢ２１ＲＹ）に寄託された。受理番号はＮＣＩＭＢ４０６９４である。ＮＣＩＭＢ４０６９４は本発明の他の態様である。抗体Ａ５Ｂ７は、ブダペスト条約のもとで１９９３年７月１４日に、ＥＣＡＣＣ、ＰＨＬＳＣｅｎｔｒｅｆｏｒＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＰｏｒｔｏｎＤｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＷｉｌｔｓｈｉｒｅＳＰ４ＯＪＧ．英国）に寄託番号９３０７１４１１として寄託された。Ｆ（ａｂ'）₂の形のヒト化した抗体Ａ５Ｂ７が好ましい。ＡＤＥＰＴに有用な他の抗体は以下に記載されている。抗体ＢＷ４３１／２６はＨａｉｓｍａＨ．Ｊ．ら，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３４：３４３−３４８（１９９２）に記載された。抗体Ｌ６．９６．５およびＩＦ５は欧州特許第３０２４７３号に記載された。抗体１６．８８は国際特許出願公開第ＷＯ９０／０７９２９号に記載された。抗体Ｂ７２．３は欧州特許第３９２７４５号に記載された。抗体ＣＥＭ２３１は欧州特許第３８２４１１号に記載された。抗体ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−１１（ユニパス社、英国ベイジングストーク・ハンス）は乳脂球膜（ｍｉｌｋｆａｔｇｌｏｂｕｌｅｍｅｍｂｒａｎｅ）上にあるムチン様の糖タンパク質分子と反応するので、乳癌および卵巣癌をターゲティングするのに使用できる。抗体ＳＭ３（ケミコン・インタナショナル社、英国ロンドン）はムチンのコアタンパク質分子と反応するので、乳癌および卵巣癌をターゲティングするのに使用できる。抗体８５Ａ１２（ユニパス社、英国ベイジングストーク・ハンス）およびＺＣＥＡ１（パース・ケミカル・カンパニー、英国チェスター）は腫瘍抗原ＣＥＡと反応する。抗体ＰＲ４Ｄ１（セロテック、英国オックスフォード）は結腸腫瘍に付随する抗原と反応する。抗体Ｅ２９（ダコ社、英国ハイ・ワイコーム）は上皮膜抗原と反応する。抗体Ｃ２４２はＣＡＮＡＧダイアグノスティックス（スウェーデン国ゴセンバーグ）から入手できる。種々の抗体に関するデータを含む、国際特許出願公開第ＷＯ９５／１３０９５号（ウェルカム）２０８頁の表３も参照されたい。一般にＡＤＥＰＴに有用な抗体は、それらが認識する腫瘍細胞によってほとんどインターナリゼーションされない。このためターゲティングしたプロドラッグ活性化用酵素は細胞表面に滞在し、腫瘍部位において循環プロドラッグから有効薬物を生成することができる。抗体のインターナリゼーションは、たとえばＪａｆｒｅｚｏｕら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５２，１３５２（１９９２）およびＰｒｅｓｓら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，４８，２２４９（１９８８）に示された既知の方法でアッセイできる。本発明の他の有用性は、第１および第２成分をインビトロ診断に利用することである。たとえば特定の抗原の検出は、抗原と結合しうる抗体などのターゲティング部分を含む本発明の第１成分に診断試料を暴露することにより達成できる。その後、結合していない第１成分を、たとえば洗浄により除去し、次いで第２成分であるプロドラッグの代謝回転を第１成分が触媒する能力により、結合した第１成分の量を定量できる。プロドラッグの代謝回転はいずれか好適な手段、たとえばＨＰＬＣにより定量できる。Ｄ．Ｍ．ＫｅｍｅｎｙによるＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＥＬＩＺＡ（パーガモン・プレス、１９９１）を参照されたい。本発明の他の態様によれば、抗体Ａ５Ｂ７の組換えネズミＦ（ａｂ'）₂フラグメントであって、ヒンジ部のＨ鎖間に３つの鎖間ジスルフィド結合を含むフラグメントが提供される。本発明の他の態様によれば、Ｈ鎖およびＬ鎖につきそれぞれ配列番号：２５および２６に示した配列をもつ、抗体Ａ５Ｂ７の組換えネズミＦ（ａｂ'）₂フラグメントが提供される。ＳｕｎｔｅｒらはＧｅｎｅ１１３(１９９２)２２３−２３０に、組換え体の調製に際して良好に二量体を形成するためには抗体のヒンジ部にシステインをさらに導入することが必要であると教示している。組換えにより調製されたフラグメントは汚染物質である全抗体が存在しないことにより、タンパク質分解により調製されたものとは異なる。また組換えにより調製された材料の方が、ファルマシア・バイアコア（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉａｃｏｒｅ、商標）計測器により測定して、ＣＥＡ抗原に対し高い結合親和性をもつであろう。本発明の他の態様によれば、腫瘍に付随する抗原と結合しうるターゲティング部分、およびプロドラッグを抗腫瘍性薬物に変換しうる酵素であって、宿主酵素の突然変異形である酵素を連結させることにより本明細書に記載する第１成分を製造する方法が提供される。突然変異酵素とターゲティング部分を当技術分野で知られている常法により、たとえばヘテロ二官能性試薬により連結させることができる。遺伝子融合も考慮される。突然変異酵素およびターゲティング部分は、当技術分野で知られている遺伝子発現法により製造できる。そのような発現系は宿主細胞をベクターで形質転換することにより得られ、このような系は、たとえば大腸菌、酵母および哺乳動物宿主中におけるものが周知である（参照：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５、アカデミック・プレス、１９９０）。他の発現系、たとえばトランスジェニック非ヒト哺乳動物も考慮される。これは当該遺伝子（好ましくはベクターから切り取ったものであるが、発現したタンパク質を動物の乳汁中へ分泌させるためのプロモーターを含む）を哺乳動物接合体の前核に導入し（通常は前核中の２つの核のうち１つ（通常は雄核）中へのマイクロインジェクションによる）、次いで育ての母に移植したものである。この母から生まれた動物の一定割合が染色体中に組み込まれた導入遺伝子を保有し、かつ発現する。通常はこの組み込まれた遺伝子は一般的な繁殖法で子孫に伝達され、したがってストックを容易に拡大できる。好ましくは当該タンパク質を雌トランスジェニック動物の乳汁から採取するだけでよい。以下の刊行物を参照されたい：Ｓｉｍｏｎｓら（１９８８），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１７９−１８３；Ｗｒｉｇｈｔら（１９９１），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：８３０−８３４；米国特許第４，８７３，１９１号；および米国特許第５，３２２，７７５号。マウス胚の操作法はＨｏｇａｎら，“ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８６、に記載されている。たとえば以下の刊行物に記載されるトランスジェニック植物法も考慮される；ＳｗａｉｎＷ．Ｆ．（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ９：１０７−１０９；ＭａＪ．Ｋ．Ｃ．ら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２４：１３１ −１３８；ＨｉａｔｔＡ．ら（１９９２）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３０７：７１−７５；ＨｅｉｎＭ．Ｂ．ら（１９９１）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒｅｓｓ７：４５５−４６１；ＤｕｅｒｉｎｇＫ．（１９９０）ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１５：２８１−２９４。所望により、以下に概説する標準法により宿主遺伝子を不活性化または修飾してもよい：たとえば“ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｔｉｎｇ；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”、ＩＲＬプレス、１９９３、に記載。標的遺伝子（またはその一部）を、その機能を混乱させるために該遺伝子に挿入した選択マーカー（たとえばＮｅｏ）と共にベクター中へクローン化することが好ましい。このベクターを線状にし、次いで胚幹（ＳＥ）細胞（たとえばマウスの１２９／Ｏｌａ株に由来）中へ形質転換すると（通常はエレクトロポレーションによる）、一定割合の幹細胞中で相同的組換え事象が起こる。この遺伝子分断を含む幹細胞を増殖させ、胚盤胞（たとえばＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来）に注射し、育ての母に移植して発育させる。キメラ子孫は外皮着色マーカーで確認できる。ＥＳ由来の配偶子と宿主胚盤胞由来の配偶子との識別を可能にする遺伝子マーカーをもつマウスと交配することによりキメラ体を繁殖させて、生殖系列へのＥＳ細胞の関与を確認する。ＥＳ細胞由来の配偶子のうち半分は遺伝子修飾を保有するであろう。子孫をスクリーニングして（たとえばサザンブロット法による）、遺伝子分断を含むものを確認する（子孫の約５０％）。これらの選択された子孫はヘテロ接合体であり、したがって他のヘテロ接合体、およびその後選択したホモ接合体子孫（子孫の約２５％）と交配できる。遺伝子ノックアウトを含むトランスジェニック動物を、既知の方法、たとえばＥＳ細胞の前核中へのＤＮＡマイクロインジェクション、スフェロプラスト融合（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５−２５８）、または脂質仲介トランスフェクション（Ｌａｍｂら（１９９３），ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ５２２−２９）により形成したトランスジェニック動物と交配させて、内因性遺伝子ノックアウトおよび異種遺伝子置換を含むトランスジェニック動物を得ることができる。標的遺伝子分断を含むＥＳ細胞を、特定の変更を含む標的遺伝子配列（形質転換前にベクター中へクローン化し、線状にすることが好ましい）で形質転換することにより、さらに修飾できる。相同組換え後に、この変更された遺伝子をゲノムに導入する。次いでこれらの胚幹細胞を用いて、前記のようにトランスジェニック体を形成できる。本明細書において“宿主”という用語には、発現技術に好適な原核細胞または真核細胞、たとえば細菌、酵母、植物の細胞、および非ヒト哺乳動物接合体、卵母細胞、胚盤胞、胚幹細胞、ならびにトランスジェニック技術に好適な他のいかなる細胞も含まれる。場合によっては“宿主”という用語には、形質転換した非ヒト哺乳動物接合体、卵母細胞、胚盤胞、胚幹細胞、植物細胞、およびトランスジェニック技術に好適な他のいずれかの細胞から発現した、トランスジェニック植物または非ヒト哺乳動物も含まれる。本発明の他の態様によれば、下記のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選ばれるポリヌクレオチド配列が提供される：前記に定めたいずれかの第１成分；および前記に定めたいずれかの突然変異酵素。本発明の他の態様によれば、前記に定めたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。本発明の他の態様によれば、前記に定めたポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。本発明を以下の例により説明する。図１は、プラスミドｐＱＲ１７７の構築法を示す。図２は、ウシリボヌクレアーゼの精製を示す。銀染色した０．１％ＳＤＳ−１６％ポリアクリルアミドゲル上での、組換えＲＮアーゼの純度評価。ＡおよびＧ列は市販のＲＮアーゼ（分子量１３７００）に対応する。Ｃ〜Ｅ列は、大腸菌［ｐＱＲ１６３］培養物からのペリプラズム抽出物をイソクラティク溶離したのち得られた、正に帯電したタンパク質を含有する；異なる濃度のＩＰＴＧ（それぞれ０．５、２および０ｍＭ）で誘導。Ｆ列は３〜５列と同じであるが、培養物は大腸菌［ｐＫＫ２２３．３］細胞（対照）を含有していた。Ｂ列はイオン交換クロマトグラフィー処理後の精製した組換えＲＮアーゼである。図３は、プラスミドｐＡＴＦ４を得るためのＰＣＲ法を示す。プライマー３〜６をＰＣＲ反応に用い、（ａ）ウシのシグナル配列およびヘキサペプチドのコード配列を、ヒト膵臓リボヌクレアーゼ遺伝子に対して５′側に取り込み、そして (ｂ)ＨＰ−ＲＮアーゼ酵素の最後の７個のアミノ酸のコード配列および終止コドンを取り込む。プライマー５および６はＥｃｏＲ１に対する制限部位をも含む。図４は、発現したＲ４Ａ．Ｋ６Ａヒト膵臓ＲＮアーゼのＰＡＧＥによる純度評価を示す。ＡおよびＦ列、２μｇのＲＮアーゼＡ；ＢおよびＣ列、ｐＡＴＦ４を含む大腸菌細胞の細胞周辺腔から得た、異なる量の、正に帯電したタンパク質；ＤおよびＥ列、１μｇおよび５００ｎｇの精製ＨＰ−ＲＮアーゼ。図５は、組換えサークルＰＣＲによるｐＡＴＦＺ４４の生成を示す。図６は、ＬｏＶｏ細胞に対するプロドラッグと対応薬物の毒性の比較を示す。図７は、ウラシル系プロドラッグの合成経路を示す。図８は、オリゴヌクレオチドプライマーを示す。図９は、ウラシル系プロドラッグ類似体の合成経路を示す。図１０は、シチジン系プロドラッグ類似体の合成経路を示す。図１１は、化学式を示す。図１２は、リボヌクレアーゼＡ−基質複合体の活性部位の模式図である。図中のＢ、ＲおよびＰは、それぞれ塩基、リボースおよびリン酸に対するサブサイトを示す。Ｂ₁はピリミジンに対して特異的であり、Ｂ₂はプリンを“好む”。３′ −ピリミジンモノヌクレオチドはＢ₁Ｒ₁Ｐ₁に結合する。５′−プリンモノヌクレオチドはＢ₂Ｒ₂Ｐ₁に結合する。３′−ＡＭＰはＢ₂Ｒ₂Ｐ₂に結合する。酵素で加水分解されたホスホジエステル結合のリン酸基はＰ₁に結合する。各部位に関与することが知られている残基を示す。図１３は、逆極性突然変異酵素の活性部位にあるプロドラッグの模式図である。図中の：^* は逆極性残基を表し（天然リボヌクレアーゼではＬｙｓ６６）；Ｘは正に帯電した基である（逆極性残基が結合している）。図１４は、逆極性突然変異酵素によるプロドラッグの解裂を示す。図１５は、天然ヒトＲＮアーゼの作用機構を示す。図１６は、ＣｐＡおよびＣ＞ｐＲＮアーゼの構造を示す。図１７は、シチジン系プロドラッグの合成経路を示す。図１８は、膵臓ＨＣＰＢのクローニングを示す。図１９は、膵臓ＨＣＰＢの配列決定を示す。図２０は、ベクターｐＩＣＩ１２６６を示す。図２１は、ｐＩＣＩ１２６６発現ベクター遺伝子のクローニングを示す。図２２は、プロドラッグおよび対応薬物の細胞毒性を示す。図２３は、増殖培地の組成を挙げる。図２４は、天然リボヌクレアーゼとリボ核酸フラグメントとの鍵アミノ酸相互作用を表す図である。位置Ｐ₀にある正に帯電したＬｙｓ６６が負に帯電したホスホジエステル結合とイオン相互作用し、一方ではＰ₁にある残基が触媒過程において重要であることを示す。図２５は、マスタードプロドラッグと突然変異ＲＮアーゼの相互作用を示す。天然ＲＮアーゼによる代謝回転を避けるために、位置６６の鍵アミノ酸を負に帯電したグルタミン酸に変更した。このＧｌｕ−６６は、プロドラッグ中の正に帯電した“Ｘ”部分とイオン相互作用して、逆極性相互作用が完了する。さらに位置Ｒ₂およびＢ₂を突然変異させると、プロドラッグとの相互作用が高まるであろうと予想される。図２６は、Ｐ₀のＧｌｕ−６６との相互作用に影響を及ぼす、リボースの５′ 側の位置における正に帯電した部分につき可能な２つの選択を示す。図２７〜３３は、化学合成法を示す。略号ＡｃアセチルＡＤＥＰＴ抗体−特異的酵素−プロドラッグ療法ＢＯＣｔ−ブトキシカルボニルＢＰ-ＲＮアーゼウシ膵臓リボヌクレアーゼＣＰＢカルボキシペプチダーゼＢＤＣＣＩ１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＭＡＰ４−ジメチルアミノピリジンＤＭＦＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＤＭＳＯジメチルスルホキシドＥｔエチルＥＤＣＩ１-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチル-カルボジイミドＨＣＰＢヒトＣＰＢＨＯＢＴ１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＨＰＲＮアーゼヒト膵臓リボヌクレアーゼＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応ＴＨＡトリフルオロ酢酸ＴＨＦテトラヒドロフラン参考例１組換え成熟ウシ膵臓リボヌクレアーゼの調製組換えウシ膵臓リボヌクレアーゼは、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ（ＢＰ−ＲＮアーゼ）前駆体をコードする配列から、Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら，Ｇｅｎｅ（１９９２）１１８，２３９−２４５の記載に従って調製された。このタンパク質を大腸菌から、ｐＱＲ１６３中の２つのシストロン発現フラグメント由来のｔａｃプロモーターの制御下に発現させた。これら２つのシストロンフラグメントを含むプラスミドをｐＱＲ１６２（ＮＣＩＭＢ４０６７８）と表示した。参考例２Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａヒト膵臓リボヌクレアーゼの調製ヒト膵臓リボヌクレアーゼ（ＨＰ−ＲＮアーゼ）遺伝子をコードする配列は、ヒト頬上皮細胞から抽出したゲノムＤＮＡより、Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら，ＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＬｅｔｔｅｒｓ（１９９４）１，７６−８３の記載に従ってＰＣＲ法で得られた。ＨＰ−ＲＮアーゼの調製については、工学的に処理したＨＰ−ＲＮアーゼを大腸菌において発現させることが記載されている。この組換えヒト膵臓酵素の発現を大腸菌の細胞周辺腔へ誘導するために、ウシ膵臓ＲＮアーゼシグナルをヒト遺伝子の５′側に融合させた。組換え酵素を発現させる最初の試みは成功しなかった。したがって部位特異的突然変異誘発を利用して、大腸菌において発現しうるようにＨＰ−ＲＮアーゼ遺伝子を遺伝子工学的に処理した。得られた工学的に処理した酵素は相同ウシ酵素と類似の動力学的特性を示す。（ａ）Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６ＡｌａＨＰ−ＲＮアーゼをコードする成熟配列のクローニング制限酵素消化、脱リン酸化、連結反応、形質転換、および小規模のプラスミドＤＮＡ精製を、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）の記載に従って実施した。オリゴヌクレオチドはサイクロン（Ｃｙｃｌｏｎｅ、商標）ＤＮＡ合成装置により合成された。ＨＰ−ＲＮアーゼ遺伝子の成熟配列は、頬上皮細胞から抽出したゲノムＤＮＡよりＰＣＲ法で得られた。要約すると、口中で０．９％塩類溶液１０ｍｌを２０秒間激しく動かすことにより上皮細胞を採取した。この頬上皮細胞懸濁液(１.５ｍｌ)を遠心によりペレットとなし、１００μｌの１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡに再懸濁した。さらに遠心したのち細胞ペレットを７５μｌの２０ｍＭＮａＯＨに再懸濁し、１００℃で３０分間インキュベートした。細胞片をペレットとなし、上清を−２０℃に保存した。普通は一定部分（２〜３μｌ）をＰＣＲインキュベーションに際して鋳型として用いた。ＨＰ−ＲＮアーゼの成熟配列の５′末端および３′末端に相補的な２種類のプライマー（配列番号：５および配列番号：６；図８、プライマー１および２を参照されたい）をＰＣＲインキュベーションに際して用い（各５ｐｍｏｌ）、その際以下のものも含有させた：ヒトゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭｄＮＴＰ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、商標）緩衝液（１×）［１０×緩衝液は２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１０ｍＭＫＣｌ、６０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，２０ｍＭＭｇＣｌ₂、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ、商標）Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼ不含ＢＳＡ］、および２．５単位のｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）。ＰＣＲインキュベーションは、９２℃で３０秒間の変性、５５℃ で３０秒間のアニーリング、および７５℃で１分間の延長を３０サイクル採用して実施された。得られたＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分析し、分離した。目的フラグメントをアガロースゲルから切り取り、遠心ユニット（スピン−Ｘ（Ｓｐｉｎ−Ｘ、商標）、コスター）によりＤＮＡを抽出した。完全組換え酵素の発現を大腸菌ＪＭ１０７細胞の細胞周辺腔内へ誘導するために、ウシ膵臓ＲＮアーゼのシグナル配列をヒト遺伝子の５′末端に融合させ、ＨＰ−ＲＮアーゼの最後の７個のアミノ酸のコード配列および終止コドンをＰＣＲ法により３′末端に結合させた。次いで、鋳型としてのこのＰＣＲで得たＨＰ−ＲＮアーゼ遺伝子の成熟配列であって最後の７個のアミノ酸をコードする配列を欠如するもの、種々の濃度（内側プライマーから最外プライマーまで０．１、０．５および５０ｐｍｏｌ）の一組のオーバーラッププライマー（配列番号：７〜１０；図８、プライマー３〜６を参照されたい）、０．２ｍＭのヌクレオチド、ストラタジーン緩衝液（１×、上記参照）、および２．５単位のｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を含有させてＰＣＲインキュベーションを設定した。上記と同じ条件でインキュベーションを行った。ＰＣＲ生成物を上記に従って処理し、目的フラグメントを切り取り、アガロースゲルから抽出した。このフラグメントをＥｃｏＲＩで開裂させ、予め消化および脱リン酸化したｐＵＣ１８に連結反応させて、二本鎖ＤＮＡをジデオキシ３）により配列決定可能にした。次いでこの融合遺伝子を発現ベクターｐＫＫ２２３．３３に連結反応させた；実施例１）参照。上記のウシシグナル配列は、ヘキサペプチドをコードするＤＮＡ配列を読取り枠に対して５′側に取り込んだものである。これはプロモーターの転写開始に際して生成するｍＲＮＡの二次構造を混乱させるために用いる。上記に従って組換え酵素の誘導、発現および精製を行った。この処理後に得られた細胞周辺腔タンパク質の分析では、組換えＲＮアーゼ活性を示す生成物は認められなかった。組換えウシ酵素が細胞周辺腔へ移動するようにウシシグナル配列を有効に誘導したので、これらの実験でヒト酵素が発現しなかったのは予想外であった。天然のヒト酵素とウシ酵素のＮ末端配列を比較すると、位置４と６における違いが示される。すなわちここでウシ酵素のアラニン残基が、対応するヒト酵素ではそれぞれアルギニン残基とリシン残基に置換されている。正に帯電したアミノ酸が成熟配列中に早期に存在すると停止伝達シグナルとして作用し、それ以上のトランスロケーションを阻止する可能性のあることが知られている。この問題を克服するために、ヒト酵素の位置４と６のアルギニンとリシンをアラニン残基で置換する方法を開発した。こうしてＲＣＰＣＲ（目的とする突然変異の導入に用いたプライマーは配列番号：１１〜１４；図８、プライマーＥ〜Ｈを参照されたい）を用いて、目的とする置換基を含む組換えクローンｐＡＴＦ３を形成した（図３参照）。このプラスミドキメラを二本鎖配列決定に際して鋳型として用い、位置４と６にアラニン残基をコードする配列が取り込まれたことを立証した。ＥｃｏＲＩで切り出してｐＫＫ２２３．３で連結反応させることによりキメラ発現ベクターｐＡＴＦ４を形成し（図３）、工学的に処理したヒト酵素の発現にこれを用いた。（ｂ）大腸菌からの組換えＡｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６ＡｌａＨＰ−ＲＮアーゼの発現および精製大腸菌をｐＡＴＦ４で形質転換し、ＩＰＴＧ誘導して、工学的に処理した組換えヒト酵素を発現させ、これを相同ウシ酵素の製造につき上記に述べたプロトコールにより細胞周辺腔内容物から単離する。細胞周辺腔内容物から工学的に処理した組換えＨＰ−ＲＮアーゼを単離し、均質になるまで精製した（図４参照）。この組換え酵素のＮ末端配列を決定したところ、ウシシグナル配列が適正に開裂したことが示された。これは、Ａｒｇ−４およびＬｙｓ−６がアラニンで置換されたことも立証する。動力学的特性の解明は基質としてＣｐＡおよびＣ＞ｐを用いて行われた（図１６）。動力学的パラメーターＫｍ、ｋｃａｔ、およびｋｃａｔ／Ｋｍを、市販のウシ膵臓ＲＮアーゼと組換え体とに関して、同じアッセイ条件下で得た数値につき比較した（表参照）。このデータは工学的に処理したＨＰ−ＲＮアーゼ酵素の動力学的特性が対応する相同のウシ酵素のものと有意差がないことを示す。基質としてのＣｐＡに対する種々の酵素のｐＨ７．０における動力学的パラメーター kcat/Km(mM^-1/s^-1) 組換えＨＰ-ＲＮアーゼＲ４Ａ:Ｋ６Ａ 1700(480) 組換えＢＰ-ＲＮアーゼ 2800(370) ＢＰ-ＲＮアーゼ 2300(600) 基質としてのＣ＞ｐに対する種々の酵素のｐＨ７．０における動力学的パラメーター kcat/Km(mM^-1/s^-1) 組換えＨＰ-ＲＮアーゼＲ４Ａ:Ｋ６Ａ 4.2(0.8) 組換えＢＰ-ＲＮアーゼ 3.9(0.9) ＢＰ-ＲＮアーゼ 2.3(0.5) （ｎ）は標準誤差を示す参考例３ネズミＡ５Ｂ７−ウシ膵臓リボヌクレアーゼ結合体の合成および単離腫瘍付随抗原と結合しうる具体的な抗体はマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７である。抗体Ａ５Ｂ７はヒト胎児性癌抗原（ＣＥＡ）に結合し、結腸直腸癌をターゲティングするのに特に好適である。Ａ５Ｂ７はダコ（ＤＡＫＯ）社（１６ＭａｎｏｒＣｏｕｒｔｙａｒｄ，ＨｕｇｈｅｎｄｅｎＡｖｅｎｕｅ，ＨｉｇｈＷｙｃｏｍｂｅ，Ｂｕｃｋｓ，ＢｕｃｋｓＨＰ１３５ＲＥ，英国，イギリス）から入手できる。抗体フラグメント、たとえばＦ（ａｂ'）₂は全ＩｇＧ抗体からＭａｒｉａｎｉＭ．ら（１９９１），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２８，６９−７７の記載に従って常法により調製できる。一般に抗体（または抗体フラグメント）−酵素結合体は少なくとも２価とすべきである。すなわち少なくとも２つの腫瘍付随抗原（同一でも異なってもよい）を結合できなければならない。抗体分子は既知の方法で、たとえば欧州特許第２３９４００号に記載される“ＣＤＲグラフト法”により、または米国特許第４８１６５６７号に記載されるように完全な可変部をヒト定常部にグラフトさせることにより、ヒト化してもよい。ヒト化した抗体は抗体（または抗体フラグメント）の免疫原性を低下させるのに有用である。ヒト化した形の抗体Ａ５Ｂ７は国際特許出願公開第ＷＯ９２／０１０５９号に記載されている。モノクローナル抗体Ａ５Ｂ７を産生するハイブリドーマはユーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ、生物学的製剤部門、応用微生物学および研究のためのＰＨＬＳセンター（ＰｏｒｔｏｎＤｏｗｎ，Ｓａｉｌｓｂｕｒｙ，ＷｉｌｔｓｈｉｒｅＳＰ４ＯＪＧ，英国）に寄託された。寄託日付は１９９３年７月１４日であり、受理番号は９３０７１４１１である。抗体Ａ５Ｂ７は、寄託したハイブリドーマから当技術分野で既知の標準法、たとえば下記に記載された方法により得られる：ＦｅｎｇｅＣ，ＦｒａｕｎｅＥおよびＳｃｈｕｅｇｅｒｌＫ，“ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｆｒｏｍＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓｉｎＣｕｌｔｕｒｅ”（ＳｐｉｅｒＲＥ，ＧｒｉｆｆｉｔｈｓＪＲおよびＭｅｉｇｎｉｅｒＢ編），バターワース−ハイネマン，１９９１，２６２−２６５、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎＢＬおよびＧｒｕｅｎｂｅｒｇＭＬ，“ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（ＳｅａｖｅｒＳ．編），マーセル・デッカー，１９８７，１７５−１９５。この細胞は、良好な抗体産生水準を維持するためには、希釈を制限してときどき再クローニングする必要があろう。ネズミＡ５Ｂ７の誘導体形成に用いたリンカーは、ＳＡＴＡ（商標）（Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、シグマ（製品コートＡ９０４３）である。ウシ膵臓リボヌクレアーゼ（ＢＰ−ＲＮアーゼ）の誘導体形成に用いたリンカーは、ＳＭＰＢ（４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、シグマ（製品コードＡ６１３９）である。ＳＡＴＡ（シグマ）をＤＭＳＯ（ファイソンズ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。５０ｍｇのＡ５Ｂ７［５．４ｍｇ／ｍｌの溶液、１００ｍＭリン酸／１００ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２（緩衝液Ａ）中］に、３０９μｇ（３０．９μｌ）のＳＡＴＡ溶液（Ａ５Ｂ７より４モル過剰となる）を添加し、混合し、室温に４０分間放置した。得られた溶液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、商標）Ｇ２５カラム（ファルマシア）（２１０ｍｌ，２．６×３８ｃｍ）に室温で導通して、過剰の試薬を除去し、最終濃度２．０９ｍｇ／ｍｌの誘導体Ａ５Ｂ７を得た（全容量２３．５ｍｌ）。このＳＡＴＡ誘導体Ａ５Ｂ７を１．０ｍｌの１０％ｖ／ｖ５００ｍＭヒドロキシルアミンＨＣｌ／５００ｍＭリン酸ナトリウム／３０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）と混合して、誘導体Ａ５Ｂ７を脱アセチル化した。この反応は室温で４０分間行われた。タンパク質濃度を２８０ｎｍでのＵＶ吸収によりｅ＝１．４と仮定して測定した（またはブラッドフォードのタンパク質アッセイ法による）。リンカー挿入量をエルマン−ＳＨアッセイにより測定して、Ａ５Ｂ７の１モル当たりリンカー１．２であることが認められた。ＢＰ−ＲＮアーゼ（シグマ）を６．０ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.２（緩衝液Ｂ）に再懸濁して、８.３３ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。ＳＭＰＢ（シグマ）をＤＭＳＯ（ファイソンズ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。５０ｍｇのＢＰ−ＲＮアーゼの溶液を６５００ｍｇ（６５０ｍｌ）のＳＭＰＢ溶液（ＢＰ−ＲＮアーゼより５モル過剰となる）と混合し、室温に１２０分間放置した。過剰の試薬をゲル透過クロマトグラフィー（セファデックスＧ２５、２１０ｍｌ、２．６×３０ｃｍ）により除去した。誘導体タンパク質濃度をＵＶＡ２８０によりｅ＝０．６と仮定して測定した。既知量の２−メルカプトエタノールをマレアミド誘導体ＢＰ−ＲＮアーゼに添加して未反応ＳＨ基をアッセイすることにより、リンカー挿入量を“逆”エルマンアッセイ法によって測定した。結合反応は、等重量の脱アセチル誘導体Ａ５Ｂ７および誘導体ＢＰ−ＲＮアーゼを添加し、脱イオン水で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、窒素下に混合することにより行われた。反応を室温で２０時間進行させたのち、１ｍｇ／ｍｌのグリシン水溶液の添加により停止した。粗製結合体を５０ｍＭリン酸、ｐＨ８．０（緩衝液Ｃ）中へ透析することにより緩衝液交換し、得られた溶液を、緩衝液Ｃ中で平衡化したＱセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、商標）（ファルマシア）カラム（３０ｍｌ、１．６×１５ｃｍ）に付与した。カラムを緩衝液Ｃ中で洗浄して過剰のＡ５Ｂ７およびＢＰ−ＲＮアーゼを除去し、次いで結合体を流量１ｍｌ／分の０．５ＭＮａＣｌ洗浄液で溶離した。得られた結合体の純度をＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定したところ、合計５．７５ｍｇの結合体を含有しており、組成はレーザーデンシトメトリーによれば８８．４％の結合体、および１１．６％の遊離形誘導体Ａ５Ｂ７であった。参考例４ネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ウシ膵臓リボヌクレアーゼ結合体の合成および単離Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂誘導体形成に用いたリンカーは、ＳＡＴＡ（Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、シグマ（製品コードＡ９０４３）である。ウシ膵臓リボヌクレアーゼ（ＢＰ−ＲＮアーゼ）の誘導体形成に用いたリンカーは、ＳＭＰＢ（４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、シグマ（製品コードＡ６１３９）である。ＳＡＴＡ（シグマ）をＤＭＳＯ（ファイソンズ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。１８．２０ｍｇのＦ（ａｂ'）₂フラグメント［２．１４ｍｇ／ｍｌの溶液、１００ｍＭリン酸／１００ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２（緩衝液Ａ）中］に、１６７μｇ（１６．７μｌ）のＳＡＴＡ溶液［Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂より４モル過剰となる］を添加し、混合し、室温に４０分間放置した。得られた溶液をアミコンＹＭ１０（商標）（分子量１００，０００カットオフ）メンブランにより２．０ｍｌ（９ｍｇ／ｍｌ）に濃縮し、次いでセファデックスＧ２５（商標）カラム（ファルマシア）（５０ｍｌ、１．６×１６ｃｍ）に室温で導通して過剰の試薬を除去し、最終濃度１．０４ｍｇ／ｍｌの誘導体Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を得た（全容量１０ｍｌ）。このＳＡＴＡ誘導体Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を１．０ｍｌの１０％ｖ／ｖ５００ｍＭヒドロキシルアミンＨＣｌ／５００ｍＭリン酸ナトリウム／３０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）と混合して、誘導体Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を脱アセチル化した。この反応は室温で４０分間行われた。タンパク質濃度を２８０ｎｍでのＵＶ吸収によりｅ＝１．４と仮定して測定した（またはブラッドフォードのタンパク質アッセイ法による）。リンカー挿入量をエルマン−ＳＨアッセイ法により測定して、Ｆａｂ₂の１モル当たりリンカー１．２であることが認められた。ＢＰ−ＲＮアーゼ（シグマ）を２．０ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２（緩衝液Ｂ）に溶解して、７．５０ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。ＳＭＰＢ（シグマ）をＤＭＳＯ（ファイソンズ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。１５ｍｇのＢＰ−ＲＮアーゼの溶液を１９４９ｍｇ（１．９５ｍｌ）のＳＭＰＢ溶液（ＢＰ−ＲＮアーゼより５モル過剰となる）と混合し、室温に１２０分間放置した。過剰の試薬をゲル透過クロマトグラフィー（セファデックスＧ２５、５０ｍｌ、１．６×１６ｃｍ）により除去した。誘導体タンパク質濃度をＵＶＡ２８０によりｅ＝０．６と仮定して測定した。既知量の２−メルカプトエタノールをマレアミド誘導体ＢＰ−ＲＮアーゼに添加し、未反応ＳＨ基をアッセイすることにより、リンカー挿入量を“逆”エルマンアッセイによって測定した。結合反応は、等重量の脱アセチル誘導体Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂および誘導体Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を添加し、脱イオン水で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、窒素下に混合することにより行われた。反応を室温で２０時間進行させたのち、１ｍｇ／ｍｌのグリシン水溶液の添加により停止した。粗製結合体を５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０（緩衝液Ｃ）中へ透析することにより緩衝液交換し、得られた溶液５ｍｌ（６．５ｍｇ）を、緩衝液Ｃ中で平衡化したＭｏｎｏＱ（商標）（ＨＲ５／５）（ファルマシア）カラムに付与した。カラムを緩衝液Ｃ中で洗浄して過剰のＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を除去し、次いで結合体および残留ＢＰ−ＲＮアーゼを流量１ｍｌ／分の塩濃度勾配（０．１〜１．０Ｍ、２０カラム容量にわたって）で溶離した。残留酵素からの結合体の分離は、結合体を含有するプールした画分をＳ２００（商標）ＧＰＣカラム（ファルマシア）（６０ｍｌ、１．６×３０ｃｍ）に付与し、流量１ｍｌ／分のＰＢＳ中で溶離することにより行われた。得られた結合体の純度をＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定したところ、合計０．７０ｍｇの結合体を含有しており、組成はレーザーデンシトメトリーによれば９５．５％の結合体、および４．５％の遊離形誘導体Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂であった。ネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂は参考例５の記載に従って、または下記の方法で調製された：参考例３に記載したＡ５Ｂ７抗体（７８０ｍｌ，５．４ｍｇ／ｍｌ）を、１３０ＫＤａのメンブランを含むアミコン（商標）ＣＨ₂らせんカートリッジ装置により、７容量の０．１Ｍリン酸ナトリウム、３ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションすることにより、消化用として調製した。回収した材料（３６８２ｍｇ、２８０ｎｍでのＡＢＳにより推定）は０．２２μＭであり、これを濾過し、使用時まで４℃で保存した。結晶質パパイン懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌのもの９ｍｌ；ベーリンガー・マンハイム、製品コード１０８０１４０）を、１００ｍＭのＬ−システインを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム、３ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．４）と混合し、３７℃に３０分間放置した。次いで過剰のシステインを、流量３ｍｌ／分で流す０．１Ｍリン酸ナトリウム、３ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．４）によるサイズ排除クロマトグラフィー（ファルマシアＧ２５Ｍ（商標）カラム、サイズ：直径２．６ｃｍ、長さ３０ｃｍ、全容量約１６０ｍｌ）によって除去した。画分（１分間）を採取し、還元パパインプールにプールする前にＯＤ２８０および簡単なＤＴＮＢスポット試験により監視して、遊離システインを含有しないことを確認した。還元パパインプールの濃度は１．６５ｍｇ／ｍｌ、容量３２．８ｍｌ、有効全タンパク質５４ｍｇと測定された（ＯＤ２８０による、Ｅ＝２．５と仮定）。消化は、１／６０ｗ／ｗの還元パパイン／Ａ５Ｂ７比で３７℃において、有効パパイン全量および６５５ｍｌの抗体（消化実施前に３７℃に加温）を用いて、推定タンパク質濃度４．９ｍｇ／ｍｌで行われた。２０時間後に、全反応容量の０．１倍の５０％エタノール中１００ｍＭＮ−エチルマレイミドで反応を停止した。２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ３．３）でｐＨおよび導電率が平衡化緩衝液のものと一致するまで平衡化した（１５℃で１９．７ｍＳ）４００ｍｌのプロテインＡセファロースＦＦ（商標）（ファルマシア）カラム（寸法５ｃｍ×２０ｃｍ）により、Ｆ（ａｂ'）₂をＦｃおよび痕跡量の未消化抗体から精製した。粗製消化物をカラム用緩衝液で１：１に希釈し、２バッチ（６６０ｍｌと８４０ｍｌ）に分割し、それぞれを６．５ｍｌ／分（線流量０．３３ｍｌ／ｃｍ²／分）でプロテインＡカラムに装填した。１０ｍｌずつの画分を採取した。装填したのち、カラムを２８０ｎｍにおける吸収が基準線に近づくまで平衡化用緩衝液で洗浄した。最初の洗浄液は５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）からなり、続いてさらに５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）洗浄、次いで５０ｍＭクエン酸（ｐＨ３.５）、続いて最後に５０ｍＭクエン酸（ｐＨ２.８）洗浄を行った。洗浄中にＯＤ２８０値を測定し、次いで採取したプールを３０分以内にオルトリン酸水素二ナトリウム溶液（０．４Ｍ）で中和した。プールの試料をＳＤＳＰａｇｅ（ファルマシア、エクセル（Ｅｘｅｌ、商標）ゲル、クーマシー染色）で分析した。Ｆ（ａｂ'）₂はｐＨ４．０の緩衝液で溶出し、未消化Ａ５Ｂ７は最低ｐＨの洗浄液中に溶出した。Ｆ（ａｂ'）₂プール試料を１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）中へダイアフィルトレーションし（アミコン（商標）ＣＨ２３０ＫＤａメンブラン、７容量のダイアフィルトレーション）、合計８４５ｍｇのＦ（ａｂ'）₂（２ｍｇ／ｍｌ）を得た。参考例５骨髄腫細胞中における組換えネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂の調製この例はＡ５Ｂ７ハイブリドーマからのｃＤＮＡの調製、ＰＣＲによる特異的ＦｄおよびＬ鎖フラグメントの単離、これらのフラグメントの完全ＤＮＡ配列の決定、次いで骨髄腫細胞中での同時発現による組換えＦ（ａｂ'）₂フラグメントの生成、骨髄腫細胞の発酵、ならびに組換えＦ（ａｂ'）₂タンパク質の精製につき記載する。遺伝子工学的に処理した抗体を骨髄腫細胞中で産生させるためのいくつかの方法が、以下を含めた文献に記載されている：Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ３１２，６０４−６０８，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ（１９８６），Ｇｅｎｅ４３，３１９−３２４，ＷｒｉｇｈｔおよびＳｈｉｎ（１９９１），Ｍｅｔｈｏｄｓ２，１２５−１３５，Ｔａｕｎｅｃｋｅｒ（１９９１），ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９，１０９−１１３，ならびにＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎら（１９９２），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，１６９−１７５。便宜上、この例ではＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎらが記載した、選択的マーカーとしてのグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）に基づく方法を本質的に採用する。ａ）ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製真核細胞からポリＡ＋ｍＲＮＡを単離するにはいくつかの方法がある（ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．，ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．，ＭａｎｉａｔｉｓＴ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、第２版、１９８９、８章、ｐ３、以下Ｍａｎｉａｔｉｓと呼ぶ）。これらの方法のうちの１つはファルマシアからキットの形で提供される。これは比較的少数の細胞（１０⁷個以下）を溶解したのち、ポリＡ＋ｍＲＮＡをオリゴｄＴカラムに結合させることによる。目的外の細胞成分を低い塩濃度で洗浄することにより除去したのち、ｍＲＮＡを高濃度の塩溶液で高温において溶離する。ｍＲＮＡは、１０⁷個のＡ５Ｂ７ハイブリドーマ細胞からクイックプレプ（Ｑｕｉｃｋｐｒｅｐ、商標）ｍＲＮＡキット（ファルマシア・バイオテクノロジー社）により調製された。ｍＲＮＡの濃度は、試料をユビコン（Ｕｖｉｋｏｎ）９３０分光光度計（コントロン（Ｋｏｎｔｒｏｎ、商標）インスツルメンツ）で３００ｎｍから２２０ｎｍまで走査し、２６０ｎｍにおける４０μｇ／ｍｌ／単位ＯＤのファクターを用いて推定された。ｍＲＮＡは２．５μｇずつエタノールに沈殿させて保存された。ｂ）ｃＤＮＡの合成ｃＤＮＡの合成に用いた方法はガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン（Ｈｏｆｍａｎ）の方法に基づくものであり、これはプライマー付きｍＲＮＡから逆転写し、次いでＲＮアーゼＨ処理して、ＤＮＡポリメラーゼＩにより第２鎖をプライミングおよび合成することによる。ｃＤＮＡ合成のための他の方法はＭａｎｉａｔｉｓ（第８章）に概説されている。ｍＲＮＡの試料５μｇに、２．５ｕの胎盤性ＲＮアーゼ阻害薬（ライフ・テクノロジーズ社）を含有する溶液１０μｌ（ＲＮアーゼを含有しない水で調製）中において７０℃でインキュベートすることによりオリゴｄＴ（１２〜１８ｍｅｒ混合物、ファルマシア・バイオテクノロジー社、０．５μｇ）を付加し、次いで氷上で冷却した。次いで４μｌの５×Ｈ−ＲＴ緩衝液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３，２００ｍＭＫＣｌ，３０ｍＭＭｇＣｌ₂および０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）、２μｌの０．１ＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，２０ｍＭ）、４μｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、商標）逆転写酵素（ライフ・テクノロジーズ社）を添加し、４２℃で１時間インキュベートすることにより、第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。第２鎖反応には、１.５μｌのｄＮＴＰ混合物(上記) 、９２．５μｌのＲＮアーゼ不含の水、３０μｌの５×反応緩衝液（１２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５，５００ｍＭＫＣｌ，２５ｍＭＭｇＣｌ₂，５０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．５ｍｇ／ｍｌ β−ＮＡＤ）、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１０ｕ、ライフ・テクノロジーズ社）、４μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ（４０ｕ、ライフ・テクノロジーズ社）、および１μｌのＲＮアーゼＨ（２．７ｕ、ライフ・テクノロジーズ社）を添加し、１６℃でさらに２時間、インキュベーションを続けた。平滑末端ｃＤＮＡが形成されるのを保証するために２μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（１０ｕ、ライフ・テクノロジーズ社）を添加したのち、１６℃で５分間、最終インキュベーションを行った。次いで７０℃で１０分間のインキュベーションにより酵素活性を停止した。ｃ）ＰＣＲによる抗体遺伝子フラグメントの単離上記のｃＤＮＡを鋳型として用いて、Ａ５Ｂ７ＦｄおよびＬ鎖フラグメントの単離を行った。Ｆｄフラグメントをヒンジ配列（ｃ−末端トレオニン）の直後で終止し、これを以下、タンパク質分解型Ｆｄと呼ぶ。この例においてタンパク質分解型Ｆｄとは、参考例４に記載したタンパク質分解により調製したＦｄに等しい組換えＦｄであることを意味する。第１鎖ｃＤＮＡ反応から得た、または第２鎖反応完了後の物質は、鋳型として好適である。この物質は完了した反応物からそのままで、または２回蒸留水中の希釈液として（最高で１００中１）使用できる。ＦｄおよびＬ鎖フラグメントの形成にはオリゴヌクレオチド（配列番号：１７〜２４）を用いた。各抗体フラグメントにつき、５′側領域オリゴヌクレオチド（Ｆｄフラグメントについては配列番号：１７、Ｌ鎖については配列番号：１８）が制限酵素部位（ＦｄについてはＨｉｎｄＩＩＩ、Ｌ鎖についてはＥｃｏＲＩ）、翻訳開始を最大にするためのコンセンサスコザック（Ｋｏｚａｋ）配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、および天然ネズミシグナル配列の一部をコードした。タンパク質分解型Ｆｄフラグメント（配列番号：１９）は抗体ヒンジ部の３′末端に対して相補的であり、ヒンジ部の直後に縦列翻訳終止コドン（ＴＡＧおよびＴＡＡ）を導入する突然変異をコードし、この配列中にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含んでいた。Ｌ鎖の３′領域はコード領域の末端に対して相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号：２０）により決定され、追加の翻訳終止コドン（ＴＡＡ）およびＥｃｏＲＩ制限部位を導入した。さらに、沈黙突然変異を各ＤＮＡ鎖に導入するために、各フラグメントにつき一対の部分オーバーラップする相補的オリゴヌクレオチド（Ｆｄフラグメントについては配列番号：２１および２２、Ｌ鎖については配列番号：２３および２４）を用い、その結果、コードするアミノ酸配列を変更することなくＦｄフラグメントのＣＨＩおよびＬ鎖のＶＬからＢａｍＨＩが除かれた。各抗体鎖の２つの突然変異フラグメントを形成するために、適切な突然変異オリゴヌクレオチドを含む５′および３′オリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。精製後にこれら２フラグメントを等割合で混合し、当該５′および３′領域オリゴヌクレオチドを用いる第２ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。これらの反応の生成物は、内部ＢａｍＨＩ部位を含まない全長ＦｄおよびＬ鎖フラグメントであった。一般に５μｌのｃＤＮＡを、下記を含有する反応物１００μｌに添加した：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ゼラチン、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各１．２５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、各１μＭの適切なオリゴ対、ならびに２．５ｕＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）、パーキン−エルマー・シータス）。各反応物に１００μｌの鉱油をのせ、９４℃で１．５分間、５０℃または５５℃で１．０分間、および７２℃で２．０分間の２５サイクル、ならびに７２ ℃で１０分間のインキュベーションを行った。ＤＮＡを含まない対照反応も設定した。各５μｌの試料を０．８％アガロース（シグマ・ケミカル・カンパニー社）ゲルに走行させることによりこのＰＣＲ反応物を分析し、次いでこれを１μｇ／ｍｌエチジウムブロミド（ＥｔｈｉｄｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ）（ＢＤＨラボラトリー・サプライズ）溶液中で染色し、ＤＮＡをＵＶトランスイルミネーターで視覚化した。Ａ５Ｂ７ｃＤＮＡが存在する適切な大きさのバンドがすべてのＰＣＲに見られ、Ｆｄ鎖およびＬ鎖のフラグメントの増幅に成功したことを示した。対照反応にＤＮＡバンドが存在しなかったことは、用いた試薬が汚染物質としてのＤＮＡを含有しなかったことを示した。各ＰＣＲ生成物をセントリコン１００（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１００、商標）微量濃縮装置（アミコン社）により精製した。各反応物を濃縮装置に添加し、２回蒸留水の添加により容量を２ｍｌに増加させた。次いでこのユニットを５００ ×ｇで５分間遠心し（ソルバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＴ６０００Ｂ（商標）卓上遠心機、Ｈ１０００Ｂローター付き）、“流動分（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）” を廃棄した。残留分を再び２ｍｌに希釈し、このユニットを再遠心した。このプロセスを３回繰り返した。この操作の結果、過剰のオリゴおよび緩衝液成分が増幅ＤＮＡから除去された。次いでこれらの精製ＤＮＡをそのまま後続ＰＣＲ反応に用いた。適切なフラグメント対を等割合で混合し、一定部分をそれぞれの５′ および３′オリゴヌクレオチドを用いる第２ＰＣＲ反応に用いた。ｄ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）中へのＰＣＲ生成フラグメントのサブクローニング第２ＰＣＲ反応の生成物は約７７５ｂｐおよび７３０ｂｐに、それぞれ全長Ｆｄ鎖およびＬ鎖に一致するバンドを示した。これらの生成物も上記と同様にセントリコン１００（商標）により精製した。次いで各ＤＮＡ生成物を、５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、５００μｌとなる量の蒸留水、および１ｍｌの無水エタノールを含有する１．５ｍｌの溶液中で沈殿させた。この溶液を氷上で少なくとも１０分間インキュベートしたのち、１１，６００×ｇで１０分間（ＭＳＥマイクロ・センタウル（ＭｉｃｒｏＣｅｎｔａｕｒ、商標））により遠心した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの７０％エタノール（ｖ／ｖ、蒸留水中）でさらに５分間遠心した。上清を廃棄し、ＤＮＡペレットを真空下で乾燥させた。各ＤＮＡペレットを蒸留水に再懸濁した。次いでＦｄＰＣＲ生成物を、２０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および各２５ｕのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ（プロメガ・コーポレーション）を含有する反応物２００μｌ中で、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。Ｌ鎖生成物を、９０ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｕのＥｃｏＲＩを含有する反応物３０μｌ中で、ＥｃｏＲＩにより消化した。消化物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで消化したフラグメントを０．７５％シープラク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ、商標）ＧＣＧアガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ社）上での電気泳動により精製したのち、ゲルから適切なバンドを切り取った。このアガロースゲル切片を６５℃で２分間のインキュベーションにより再溶解し、蒸留水で最終容量４５０μｌに希釈し、５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加した。この溶液を等容量の液化フェノールで抽出し、１１，６００×ｇで２分間（ＭＳＥマイクロ・センタウル（商標））による遠心によりトリス緩衝液（ｐＨ７．６）（ファイソンズ・サイエンティフィック・イクイップメント）で平衡化して、水相とフェノール相を分離した。この水相をフェノール：クロロホルム混合物（５０：５０ｖ：ｖ）で再抽出し、再びクロロホルムで抽出したのち、上記に従ってエタノール沈殿させた。それぞれの精製ペレットを１０μｌの蒸留水に再懸濁し、１μｌの試料を０．８％アガロースゲル上での電気泳動により視覚化して、量および濃度を推定した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）（ストラタジーン・クローニング・システムズ）をＦｄおよびＬ鎖ｃＤＮＡの最初のクローニングに用いた。このファージミドベクターはユニークＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、アンピシリン耐性遺伝子、および二本鎖または一本鎖ＤＮＡの分離のためのＣｏｌＥＩとｆｌ両方の複製起点を含む。５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＫＳ −ＤＮＡを、３０ｕのＥｃｏＲＩ（プロメガ・コーポレーション）で［９０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌを含有する反応物１００μｌ中］、またはＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで［２０ｍＭトリス−酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および各２５ｕのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（プロメガ・コーポレーション）を含有する反応物１００μｌ中、３７℃において１時間、完全に消化した。２μｌのウシ腸アルカリフォスフアターゼ（２ｕ、ベーリンガー・マンハイム）をＥｃｏＲＩ消化プラスミドに添加して５′リン酸基を除去し、３７℃でさらに３０分間インキュベーションを続けた。３７℃で1０分間のインキュベーションによりフォスフアターゼ活性を分解した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断したプラスミドを、上記に従ってＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧアガロースゲルから精製した。消化したＦｄ鎖またはＬ鎖ＰＣＲ生成物２５〜５０ｎｇを、それぞれ５０ｎｇのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理またはＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、および１．５ｕのＴ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ・コーポレーション）を含有する溶液１０μｌ中で１６℃において２．５時間、連結反応させた。各反応物１μｌずつを２０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞（ライフ・テクノロジーズ社）の形質転換に用いた（この細胞と共に供給されたプロトコールを採用）。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％Ｘ−ｇａｌを添加したＬ−寒天上に接種し、３７℃で一夜インキュベートした。この培地上で母体プラスミドを含む細胞が産生する青色と比較して白色コロニーを形成することに基づいて、クローン化挿入配列を含むクローンを選択した。ｅ）ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析色彩選別により同定したこれらの潜在的Ｆｄ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡクローンを寒天平板から採取し、大規模ＤＮＡ調製に用いた。各クローンを、５００ｍｌ容三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬ−ブロス２００ｍｌへの接種に用いた。培養物を３７℃で一夜、振盪しながらインキュベートした。増殖後に各培養物から得た細胞をソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５Ｃ遠心機およびＧＳ３ローターによりオークリッジ試験管中で４℃において５０００×ｇで１０分間、遠心することによりペレット化した。各培養物から得た細胞ペレットを２０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、ソルバルＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターによりオークリッジ試験管中で４℃において２０００×ｇで１０分間、再遠心した。洗浄した細胞ペレットそれぞれを３ｍｌの氷冷２５％スクロース、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に再懸濁し、氷上に放置した。新鮮なリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌのもの１．０ｍｌ）を添加し、試験管を回転させて内容物を混合し、氷上でのインキュベーションを５分間続けた。エチレンジアミン四酢酸ナトリウム溶液（０．５ｍＭのもの１．０ｍｌ、ｐＨ８．５）を添加し、内容物を緩和に混合した。最後に５．０ｍｌの氷冷トリトンＸ（商標）溶液（０．１％トリトンＸ−１００、６２．５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）を添加し、内容物を緩和に混合し、氷上でのインキュベーションをさらに１０分間続けた。次いで細胞片をソルバルＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターにより４℃において３９，０００×ｇで３０分間遠心することにより、ペレット化した。プラスミドＤＮＡを含有する上清を１６ｇの塩化セシウム（ベーリンガー・マンハイム）および１５０μｌの臭化エチジウム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）に添加し、１８．５ｍｌのＴＥ緩衝液の添加により容量を増加させた。この溶液を１８．５ｍｌのクリンプ式蓋付きポリプロピレン製遠心管（ソルバル・インスツルメンツ）に移した。この試験管をシールし、ソルバルＴＶ８６５Ｂ（チタン、縦型）ローターおよびＯＴＤ６５Ｂ遠心機により１８℃において１８０，０００×ｇで１６時間遠心した。遠心後にプラスミドＤＮＡは、ＣｓＣｌ／ＥｔＢＲ密度勾配中に形成された明瞭なオレンジ色のバンドとして見えた。皮下注射器を試験管壁に突き刺して、このプラスミドＤＮＡを密度勾配から取り出した。密度勾配から採取した試料をＴＥ緩衝液で３〜４倍に希釈し、等容量のイソプロピルアルコールを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、氷上でのインキュベーションを１０分間続けた。沈殿したＤＮＡをソルバルＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターにより４℃において１７，０００×ｇで遠心することによりペレット化し、上清を廃棄した。得られたペレットを７０％エタノール（ｖ／ｖ）中で洗浄し、５分間、再遠心した。次いでペレットを真空下で乾燥させ、１．８ｍｌのＴＥ緩衝液および２００μ ｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液に再懸濁し、等容量のフェノールで抽出し、１７，０００×ｇで２分間の遠心により相を分離した。水相を等容量のクロロホルムで再抽出したのち、−２０℃で等容量のエタノールを添加し、氷上で１０分間インキュベートすることによりＤＮＡを沈殿させた。精製ＤＮＡを上記に従ってペレット化し、５ｍｌの７０％エタノール中で洗浄し、ペレットを真空乾燥させた。乾燥ペレットを５００μｌの２回蒸留水に再懸濁し、希釈試料をＵＶ分光光度計で３００ｎｍから２２０ｎｍまで走査し、吸光係数５０μｇ／ｍｌ／ＯＤ２６０を用いて、ＤＮＡ濃度を推定した。プラスミドＤＮＡ精製用として多数の適切なキット、たとえばキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ、商標）（ハイベイド社）も入手できる。次いでこの精製プラスミドＤＮＡを用いてＤＮＡ配列分析を行った。適切な配列決定用キット、たとえばユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・カンパニーが供給し、添付のプロトコールに従って使用されるシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、商標）を用いるＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，１９７７，Ｐ５４６３）のジデオキシ連鎖停止法によるＤＮＡ配列分析に、二本鎖ＤＮＡを使用できる。一定部分（２〜４μｇ）のＦｄ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡクローンプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列分析に用いた。各部分をまず、最終容量１００μｌ中の０．２ＭＮａＯＨ，０．２ｍＭＥＤＴＡと共に、室温で１０分間インキュベートすることにより変性させた。次いで変性ＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）１０μｌおよびエタノール２７５μｌの添加、ならびに氷上で１０分間のインキュベーションにより沈殿させた。沈殿したＤＮＡをプラスミドＤＮＡにつき上記に述べたと同様に回収した。次いでこの変性ＤＮＡをそれぞれ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するシーケナーゼ反応用緩衝液（４０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ）１０μｌ中で、０．５ｐｍｏｌの適切なプライマーと共に、６５℃で２分間インキュベートすることにより、配列決定のためにプライミングし、次いで３０℃より低い温度に徐々に冷却した。次いでこれらのプライミングした鋳型を、プロトコールに従って、ただし標識および停止用混合物に１０％ＤＭＳＯを添加して、配列決定反応に用いた。配列決定反応物を、６％ポリアクリルアミド：８Ｍ尿素変性用ゲル（ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ，１９７８，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．８７，ｐ１０７）上での高分解能電気泳動後に、オートラジオグラフィーにより分析した。クローン化ｃＤＮＡの完全なＦｄ鎖およびＬ鎖配列を後記に示す（タンパク質分解型のＦｄ鎖については配列番号：２５、Ｌ鎖については配列番号：２６）。タンパク質分解型のＦｄ鎖を含むプラスミドをｐＡＦ１、Ｌ鎖を含むものをｐＡＦ３と命名した。各フラグメント中にＢａｍＨＩ部位除去のための沈黙突然変異が存在することも確認された。このＤＮＡ配列は、公表されている定常部ＤＮＡ配列データ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｂｉｌｏｆｓｋｙ，Ｈ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｎｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．，１９８７，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第４版、ＮＩＨ、公衆衛生総局、ワシントンＤＣ）と比較してこの抗体がＩｇＧ１κイソタイプであることを示す。ｆ）骨髄腫発現ベクター中へのサブクローニング骨髄腫細胞においてＦｄ鎖とＬ鎖を同時に発現しうるベクターを形成するために、ＧＳ−システム（ＧＳ−Ｓｙｓｔｅｍ、商標）系（セルテック・バイオロジックス）を用いた（国際特許出願公開第ＷＯ８７／０４４６２号、第ＷＯ８９／０１０３６号、第ＷＯ８６／０５８０７号、第ＷＯ８９／１０４０４号）。この方法では、Ｆｄ鎖をベクターｐＥＥ６［これはｐＥＥ６．ｈＣＭＶの誘導体である−ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｃｋｅｔｔ（１９８９），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１７，７１１０−ここではｈＣＭＶプロモーターの上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位がＢｇｌＩＩ部位に変換されている」のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ領域に、またＬ鎖をｐＥＥ１２［このベクターはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，１６９− １７５に記載されたｐＳＶ２．ＧＳに類似するが、多重リンカー領域にユニーク部位を提供するために、ｐＳＶ２．ＧＳ中に本来存在していた多数の制限部位が部位特異的突然変異により除去されている］のＥｃｏＲＩ領域にクローニングする必要がある。次いでｐＥＥ６由来のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩＦｄ発現カセットを、ｐＥＥ１２のＢａｍＨＩ領域に挿入する。あるいはＦｄ発現カセットを含むＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、Ｌ鎖を含むｐＥＥ１２プラスミドのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ領域に挿入してもよい。これら個々のベクター（ｐＥＥ６中のタンパク質分解型Ｆｄ、およびｐＥＥ１２中のＬ鎖）を構築するために、前記のようにプラスミドｐＡＦ１およびｐＥＥ６をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、またｐＡＦ３およびｐＥＥ１２をＥｃｏＲＩで消化した。次いで適切なベクター、および各消化物から得た挿入フラグメントをシープラク（商標）ＧＴＧアガロースから単離し、互いに連結反応させて、同様に前記のようにコンピテントＤＨ５α細胞の形質転換に用いた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬ寒天平板に、形質転換細胞を接種した。形質転換体からのコロニーのスクリーニングをＰＣＲ法により行った。コロニーを２００μｌの蒸留水に移し、渦流撹拌により混合した。次いで懸濁細胞を１００℃に１分間加熱し、１１，６００×ｇで２分間遠心したのち、上清をＰＣＲ反応に用いた。各ＰＣＲ反応においては、ＣＭＶプロモーター内にプライミングするオリゴ（配列番号：２７）を用いた。このオリゴは適宜、Ｆｄ鎖（配列番号：１９）またはＬ鎖（配列番号：２０）の３′側領域に相補的である。それぞれの場合、ＣＭＶプロモーターの下流に発現可能な配向で挿入された抗体フラグメント遺伝子を含むクローンのみが、適切な２．０ｋｂｐの特異的ＰＣＲ生成物を産生するであろう。２０ｐｍｏｌの各オリゴ（配列番号：１９または２０を含む配列番号：２７）、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ゼラチン、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに０．５ｕのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アンプリタク（商標）、パーキン−エルマー・シータス）を含有する２０μｌの反応物を用意した。各反応物に２０μｌの鉱油を乗せ、９４℃で１．５分間、５０℃で１．０分間、および７２℃で２．０分間の２５サイクル、ならびに７２℃で１０分間、インキュベートした。母体プラスミドを含むクローン、およびＤＮＡを含まないクローンを用いた対照反応物も用意した。これらのＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動により分析し、有効クローンを２．０ｋｂｐのＰＣＲ生成物の存在により確認した。これらの使用可能なクローンを大規模なプラスミドＤＮＡ調製に用いた。これらをＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩによる制限酵素消化により解明し、挿入配列の配列を前記のＤＮＡ配列分析により確認した。これらの分離体をｐＡＦ４（ｐＥＥ６中のタンパク質分解型Ｆｄ）およびｐＡＦ６（ｐＥＥ１２中のＬ）と命名した。同時発現性ベクターを形成するために、５〜７．５μｇのＦｄプラスミドｐＡＦ４を各３０ｕのＢｇｌＩＩ（ファルマシア）およびＢａｍＨＩ（ニュー・イングランド・バイオラボズ）で、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＴＴを含有する溶液中で３７℃において１時間、消化した。アガロースゲル電気泳動により消化を確認した。５μｇのＬ鎖プラスミドｐＡＦ４を上記の溶液中で３７℃において１時間インキュベートすることにより、２５単位のＢａｍＨＩ（ニュー・イングランド・バイオラボズ）で消化した。次いで２ｕのＣＩＰを添加して３７℃で４０分間インキュベートすることによりＤＮＡを脱リン酸化し、続いて１０μｌのストラタクリーン（Ｓｔｒａｔａｃｌｅａｎ、商標）樹脂（ストラタジーン社）で３回抽出した。次いでＦｄ発現カセットフラグメントおよび主ｐＡＦ６プラスミドバンドをシープラク（商標）ＧＴＧアガロースゲルから精製し、適切な組合わせを互いに連結反応させ、この連結体を前記に従ってコンピテントＤＨ５α細胞の形質転換に用いた。ｇ）同時発現ベクターの同定上記の形質転換体から１００のコロニーを二重に５０ずつのバッチで、１００ μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬ寒天に乗せた９ｃｍのニトロセルロースディスク（シュライヘル・アンド・シュル）上に採取した。フィルターを用いない第３組の平板に画線培養して、選択したコロニーのマスターストックを作成した。３７℃で一夜インキュベートしたのち、ニトロセルロースフィルターを取り出し、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、第１章、ｐ１０２）の方法に従って処理して、その場で細菌細胞を溶解した。種々の試薬 −１０％ＳＤＳに２分間、３ＭＮａＯＨ、１ＭＮａＣｌに５分間、および１Ｍトリス（ｐＨ６．８）に２分間ずつ２回一に浸漬した３ＭＭ濾紙（ワットマン）にフィルターを乗せた。溶解した細胞を含有するフィルターを２０×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）で湿らせた３ＭＭ濾紙に移し、光学的架橋（１２０，０００μＪ）に設定したスペクトロリンカー（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ、商標）（スペクトロニクス・コーポレーション）ＸＬ１５００内で紫外線に照射することにより、ＤＮＡをフィルターに架橋させた。フィルターをプローブ法（後記参照）に用いる前に風乾した。マスターストック平板を必要になるまで４℃に保存した。Ｆｄ鎖およびＬ鎖に特異的なオリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号：２２および配列番号：２４）を用いて、Ｆｄ鎖およびＬ鎖を含むクローンに特異的なハイブリダイゼーションプローブを形成した。ハイブリダイゼーションプローブは合成オリゴヌクレオチドから、γ³²ＰＡＴＰ由来の放射性５′リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの作用によって付加することにより形成できる。２０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭスペルミジン、２０ｍＭＤＴＴ、７．５μＭＡＴＰ、０．５μＭ γ³²ＰＡＴＰ、および２．５ｕのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア・バイオテクノロジー社）を含有する２０μｌの反応物に添加した。反応物を３７℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベートしたのち、ハイブリダイゼーションに用いた。オリゴヌクレオチドからのハイブリダイゼーションプローブの形成法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ（第１１章）に示されている。１０μｌずつの放射性標識オリゴを、１０ｍｌの６×ＳＳＣ（１ＭＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および０．２５％マーベル（Ｍａｒｖｅｌ、商標）（脱脂粉乳）に添加し、これを次いでプローブ溶液として用いた。選択したクローン（前記参照）を含む処理済みフィルターを二重バッチで、それぞれ９０ｍｌの６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％マーベル（商標）中において６５℃で３時間、テクネ（Ｔｅｃｈｎｅ）ＨＢ−１ハイブリダイゼーションオーブン内で回転ガラス試験管を用いて予備ハイブリダイゼーションした。次いで二重の組それぞれを１０ｍｌのプローブ溶液（一方の組はＶＨプローブ、他方の組はＶＬを含む）中で６５℃において一夜、同じ装置内で処理した。インキュベーション後に、各フィルターを１００ｍｌの６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において６５℃で１５分間、１００ｍｌの３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において６５℃で１５分間、そして１００ｍｌの１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において６５℃で１５分間、同じ装置内で洗浄した。洗浄したフィルターを次いで風乾し、−７０℃で高速タングステン酸塩強化スクリーンと組み合わせたハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、商標）ＭＰ（アマシャム・インタナショナル）を用いてオートラジオグラフィー処理した。フィルムをコダック自動フィルム処理装置で現像したのち、両プローブのハイブリダイゼーションにより、潜在的なＦ（ａｂ'）₂発現クローンを同定した。Ｆｄ鎖およびＬ鎖特異的プローブの両方とのハイブリダイゼーションを示すクローンの頻度は著しく低かった（約２％）。潜在的な同時発現クローンをマスター平板から採取し、大規模のプラスミドＤＮＡ調製に用いた。酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化分析を用いて、各発現カセットの配向を確認した。縦列配向（集中的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ではなく）のＬおよびＦｄ発現カセットのみを含むクローンを同定した。同時発現ベクターｐＡＦ８（ｐＥＥ１２中のタンパク質分解型ＦｄおよびＬ）が形成された。ｈ）骨髄腫細胞のトランスフェクション真核細胞中にＤＮＡを導入するためにはいくつかの方法がある（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ２，ｐ１３６−１４５）。より最近では、リン酸カルシウム−ＤＮＡ同時沈殿法に代わって電気穿孔法が一般的に用いられる方法になってきた。ＮＳ０骨髄腫細胞（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８１，７３Ｂ，ｐ３−４６、ＥＣＡＣＣカタログＮｏ，８５１１０５０３）は、内部で分泌される抗体タンパク質がないため、この作業に好適な宿主細胞である。Ｆｄ鎖およびＬ鎖同時発現プラスミドをトランスフェクションしたのちグルタミン不含の培地中で生育する一定割合のコロニーが、機能性Ａ５Ｂ７抗体フラグメントを発現すると予想される。トランスフェクション前に、４０μｇのｐＡＦ８プラスミドＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＤＴＴおよび１００ｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡを含有する４００μｌの反応物中において、２００ｕのＳａｌＩ（ニュー・イングランド・バイオラボズ）で３７℃において１．７５時間消化することにより、線状にした。消化後に各ＤＮＡをエタノール中で沈殿させ、５０μｌの蒸留水に再懸濁した。ＮＳ０細胞を、５０ｍｌの非選択的増殖培地（ダルベッコ変更イーグル培地、ライフ・テクノロジーズ社、品質認定された供給源からのウシ胎児血清１０％を添加）を入れた１６０ｃｍ²容の組織培養フラスコ（ナンクまたはコスター）中で、３７℃において５％ＣＯ₂雰囲気内でインキュベートして、ほぼ集密状態になるまで増殖させた。トランスフェクション前に、フラスコを手または台に打ち付け、５０ｍｌ容の円錐形遠心管（ファルコン）に移すことにより、ＮＳ０細胞を再懸濁した。試料（４０μｌ）を採取し、１０〜２０μｍを計数するように設定したコールター・カウンターを用いて、細胞濃度を推定した。５００×ｇで５分間遠心することにより（ソルバルＲＴ６０００Ｃ卓上遠心機）細胞をペレットとなし、次いで４５ｍｌの氷冷したリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、再遠心した。洗浄した細胞を氷冷ＰＢＳに１．３×１０⁷個／ｍｌになるように再懸濁し、氷上に保存した。５０μｌずつのＳａｌＩ消化プラスミドＤＮＡ試料と８００μｌ（１０⁷個）のＮＳ０細胞を、光路０．４ｃｍの電気穿孔キュベット（バイオ−ラド・ラボラトリーズ社）内で泡立ちを避けながら混合し、キュベットを氷上で５分間インキュベートした。次いでキュベットをティッシュペーパーで拭いて乾かし、ジーン・パルサー（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ、商標）電気穿孔装置（バイオ−ラド・ラボラトリーズ社）に挿入し、製造業者の指示に従って３ μファラッドで１５００Ｖのパルスを連続２回付与した。電気穿孔後にキュベットを氷上に５分間戻したのち、３０ｍｌの予熱した非選択培地と混合した。この細胞懸濁液約２０ｍｌを、平底９６ウェル組織培養プレート（ナンク）４枚にウェル当たり５μｌで分配した。さらに１０ｍｌを３０ｍｌの非選択培地で希釈して、９６ウェルプレート５枚に接種した。この希釈した懸濁液をさらに非選択培地で希釈し（１０ｍｌを４０ｍｌ）、さらに９６ウェルプレート５枚に接種した。次いで細胞を３７℃において５％ＣＯ₂中で一夜インキュベートした。グルタミンを含有しない選択培地（１５０μｌ、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，１６９−１７５）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレートをインキュベーターに戻してグルタミンを徐々に枯渇させ、コロニーが肉眼で見えるようになるまで培養した。ｉ）細胞系の拡大９６ウェルプレートから、ウェル当たり１個のコロニーが存在するコロニーを選択した。ピペットで吸入排出することにより細胞を再懸濁し、１００μｌを２４ウェルプレートのウェルに移し、各ウェルに１ｍｌの選択培地を添加した。さらに１００μｌの選択培地を９６ウェルプレートの各ウェルに戻し、ここからコロニーを取り出して、細胞系のバックアップ源を得た。２４ウェルプレートを３７℃において５％ＣＯ₂中で、細胞増殖が約５０％集密状態になるまでインキュベートした。この段階で１００μｌの培養上清を取り出し、抗ＣＥＡ結合活性をＥＬＩＳＡアッセイ法により試験した（後記参照）。結合活性を示す細胞系をさらに拡大させた：ピペットで吸入排出し、１ｍｌを２５ｃｍ²の組織培養フラスコに移した。さらに１ｍｌの選択培地を各フラスコに添加し、フラスコを傾斜させてインキュベートして、細胞をフラスコの底に濃縮した。数日間インキュベートしたのち、３ｍｌの選択培地を各フラスコに添加し、次いでこれを水平にして５０〜７５％集密状態になるまでインキュベートした。この段階で細胞から培地を分離し、細胞を５ｍｌの選択培地で慎重に洗浄し、次いで培地を廃棄し、さらに５ｍｌの選択培地と交換した。次いでフラスコを２４時間、インキュベーターに戻しておいた。次いでフラスコをたたいて細胞を採集し、検出限界１０〜２０ μｍのコールター・カウンターを用いて、またはトリパンブルー溶液（ライフ・テクノロジーズ）で染色したのち血球計数器を用いて生育可能な（染色されていない）細胞を顕微鏡下に計数することにより、細胞密度を計算した。細胞を遠心（約３００×ｇで５分間）によりペレットとなし、上清を分離し、抗体フラグメント発現の分析（後記参照）に用いるために４℃で保存した。細胞を、５０％透析ウシ胎児培地、４０％グルタミン不含ＤＭＥＭおよび１０％ＤＭＳＯ中に、１〜２×１０⁶個／ｍｌの濃度で再懸濁した。次いで細胞を１ｍｌずつスクリューキャップ付き凍結用試験管（ｃｒｙｏｔｕｂｅ、ナンク）に移し、次いで長期保存用として液体窒素に移した。ウェスタンブロット分析ウェスタンブロット分析を下記に従って行った。一定部分（１５μｌ）の上清試料をそれぞれ、還元剤（５０ｍＭＤＴＴ）を含有する、および含有しない、等容量の試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１０％スクロースおよび０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合した。試料を１００℃で１５分間インキュベートしたのち、マルチフォア（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ、商標）ＩＩ装置（ＬＫＢプロダクターＡＢ）により製造業者の指示に従って、８〜１８％アクリルアミド濃度勾配ゲル（エクセル（Ｅｘｃｅｌ、商標）ゲル系、ファルマシア・バイオテクノロジー・プロダクツより）上で電気泳動した。電気泳動したのち、分離したタンパク質を、ナバブロット（Ｎａｖａｂｌｏｔ、商標）装置（ＬＫＢプロダクターＡＢ）により製造業者が添付したプロトコールに従って、ハイボンドＣ−スーパー（ＨｙｂｏｎｄＣ −ｓｕｐｅｒ、商標）メンブラン（アマシャム・インタナショナル）に移した。ブロッティングしたのち、メンブランを風乾した。抗体フラグメントの存在は、抗ネズミＦ（ａｂ'）₂抗体−ペルオキシダーゼ結合体（ＩＣＮバイオメディカルズ、製品Ｎｏ．６７−４３０−１）を用いて検出された。この一次抗体はネズミＦ（ａｂ'）₂に対して形成されたものであるが、主としてκＬ鎖に結合することが示されている。ネズミＡ５Ｂ７抗体の存在は、ＥＣＬ検出システム（アマシャム・インタナショナル）により、添付のプロトコールに従って視覚化された。これにより、細胞上清中に存在する物質の約９０％はＦ（ａｂ'）₂タンパク質であることが示された。ｋ）ＥＬＩＳＡ分析ＥＬＩＳＡアッセイの標準法は、“ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、編者Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．およびｖａｎＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｈ．、ｖｏｌ．１５、“酵素免疫アッセイの実際と理論”、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，１９８５（エルゼビル・サイエンス・パブリッシャーズＢ．Ｖ．）に示されている。他の情報源は“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ｐ．１９８８（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）である。細胞上清（前記参照）を使用し、下記のプロトコールに従って抗−ＣＥＡ結合性物質の存在を検出した：１）抗−ＣＥＡＥＬＩＳＡ１．コーティング用緩衝液（炭酸塩−炭酸水素塩緩衝剤１カプセル−シグマＣ −３０４１−１００ｍｌの２回蒸留水中）を調製する。２．必要な９６ウェルプレートそれぞれにつき、５μｌのＣＥＡ原液（０．２ｍｇ／ｍｌ、ダコ）を１０ｍｌのコーティング用緩衝液に添加する。３．１００μｌの希釈ＣＥＡを、ナンクの“マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、商標）”ミクロタイタープレートの各ウェルに添加する。４．プレートを４℃で一夜（または室温で２時間）インキュベートする。５．プレートを５分間ずつ４回、リン酸緩衝塩類溶液＋０．０１％ナトリウムアジド（ＰＢＳＡ）で洗浄する。６．プレート（たたいて乾燥させたのち）を、ウェル当たり１５０μｌのＰＢＳＡ中１％ＢＳＡ（シグマＡ−７８８８）でブロックする。室温で２時間インキュベートする。７．プレートを５分間ずつ４回、ＰＢＳＡで洗浄する。８．試料（培養上清）および標準品（タンパク質分解性Ａ５Ｂ７Ｆ(ａｂ')₂ の２倍希釈液）を適宜装填する。試料を増殖培地（またはＰＢＳ）中に希釈する。ＰＢＳＡ＋１％ＢＳＡおよび希釈剤をブランクとして含める。９．４℃で一夜インキュベートする。１０．プレートを５分間ずつ６回、ＰＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０で洗浄する。１１．二次抗体溶液（抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ'）₂、ヤギ由来、ペルオキシダーゼ結合−ＩＣＮ６７−４３０−１−４０ｍｌのＰＢＳＡ＋１％ＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０中に２０μｌ）を調製し、ウェル当たり１００μｌを添加する。１２．室温で２時間インキュベートする。１３．プレートを５分間ずつ６回、ＰＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０で洗浄する。１４．リン酸塩−クエン酸塩−過ホウ酸塩緩衝剤（シグマＰ−４９２２）１カプセルを２回蒸留水１００ｍｌに溶解することにより、現像液を調製する。緩衝液１００ｍｌ当たり３０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ、シグマＰ−８２８７）を添加する。ウェル当たり１００μｌを添加する。１５．室温で暗所において１５分間インキュベートする。１６．ウェル当たり５０μｌの２Ｍ硫酸の添加により反応を停止する。１７．プレート読取り装置でＯＤ４９０ｎｍを読み取る。ｍ）特異的生成率（ＳＰＲ）の算出各試料中の抗−ＣＥＡ結合活性量をソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）データ取扱いパッケージにより測定した。大部分の抗体Ｌ鎖（＞９０％）がＦ(ａｂ')₂ として存在することを示すウェスタンブロット分析データを考慮して、この数値は細胞上清中に存在するＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントの量についてのおおまかな数値を与えると推定した。次いでこの数値を用いて特異的生成率をμｇ／１０⁶細胞／２４時間として算出し、これを用いて生産性に従って細胞系を分類した。単離した最良の細胞系についてのＳＰＲ計算値は、一般に４〜１０μｇ／１０⁶細胞／２４時間であった。組換えＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂の精製組換えＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂材料を、骨髄腫培地上清から、ｒ−プロテインＡ５００ｍｇカートリッジ（たとえばナイジーンが製造するもの）により精製した。カートリッジをまずクエン酸緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ２．８）中で洗浄し、次いで１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化した（洗液のｐＨがこの平衡化用緩衝液のものに一致するまで）。緩衝液は両方とも、予めミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを用いて０．４５μｍで濾過された。組換えＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を含有する骨髄腫培地（１．８リットル）を同様に予め濾過し、平衡化用緩衝液で１：１希釈した。この希釈した培地を次いでプロテインＡカートリッジに装填し、結合しない洗液すべてを採集した。装填した時点で、平衡化用緩衝液により、２８０ｎｍにおける吸収が基準線に戻るまでカートリッジを十分に洗浄した。次いで緩衝液を、同様に予め濾過した１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）に交換した。溶出した緩衝液を４５ｍｌの画分として採集した。２８０ｎｍにおける吸収が再び基準線に戻った時点で、カラムを洗浄するために緩衝液を１００ｍＭクエン酸（ｐＨ２．８）に交換した。２８０ｎｍにおける光学濃度をこれらの画分につき測定し、有意の吸収を示すものをｐＨ７．０にまで滴定し、ＳＤＳＰＡＧＥにより分析した。組換えＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を含有する画分をプールした。この容量を濃縮し（アミコンＹＭ１０（ＡｍｉｃｏｎＹＭ１０、商標）メンブラン）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび３ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム塩(ｐＨ７.４）中へ透析し、４℃に保存した。合計７３ｍｇのＦ(ａｂ')₂ を、非還元性ＳＤＳＰＡＧＥにより判定して＞９０％の純度で得た。上記の精製に用いた骨髄腫細胞懸濁液は、本質的にＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，１６９−１７５の記載に従って得られた。ＧＳ培地（カタログＮｏ．５１４３５）および補充材料（カタログＮｏ．５８６７２）はＪＲＨバイオサイエンシズ（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＥｕｒｏｐｅ．ＨｏｐｈｕｒｓｔＬａｎｅ，ＣｒａｗｌｅｙＤｏｗｎ，Ｗ．Ｓｕｓｓｅｘ，英国、ＲＨ１０４ＦＦ）から入手される。発酵操作が終了した時点で、上清を０．４５ｍのフィルターにより濾過して粒状物を除去し、精製するまで４℃に保存した（一般に２４時間以内）。参考例６ウラシル系プロドラッグ類似体の合成（図９参照）化合物７（５ｍｇ）を０．５ｍｌの塩酸（０．１Ｎ）に溶解して、目的とする最終生成物を得た。２５℃で暗所に０．５時間置いたのち、この原液を氷上に保持し、一定部分を突然変異ＲＮアーゼにより試験するために緩衝液で希釈した。化合物（７）はウリジンから下記に従って製造された：２′，３′−Ｏ−メトキシエチリデンウリジン（化合物１）ウリジン（５ｇ）、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（１ｇ）およびオルト酢酸トリメチル（１５ｍｌ）を合わせて２０℃で１６時間撹拌した。反応混合物をメタノール性ナトリウムメトキシドでわずかに塩基性となし、次いで濃縮してガムを得た。目的生成物をシリカゲル（メルク９３８５）上で、溶離剤としてクロロホルム／メタノール混合物を最初に９６：４（容量比）、次いで９２：８の比率で用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）：（δ）11.38(s,1H); 7.75(d,1H); 5.95（d）および5. 80(d,計1H); 5.62(d,1H); 4.70-5.10(m,3H); 4.18（q）および4.04(q,計 1H); 3.60(m,2H); 3.15（s）および3.28(s,計3H); 1.57（s）および1.49(s,計3H ).５′−アジド−５′−デオキシ−２′，３′−Ｏ−メトキシエチリデンウリジン（化合物２）２′，３′−Ｏ−メトキシエチリデンウリジン（７．０ｇ，２３．３ｍｍｏｌ）の、乾燥ピリジン（８０ｍｌ）中における溶液に、０℃で塩化メタンスルホニル（１．９ｍｌ，２４ｍｍｏｌ）を添加した。４℃で１６時間撹拌したのち、真空中で溶剤を蒸発させ、残渣をクロロホルムに溶解し、水で洗浄した。有機層を分離し、乾燥させ、濃縮して、粗製メシラートを得た。粗製反応生成物を乾燥ジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）に溶解し、ナトリウムアジド（３．２５ｇ，５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８５℃で７時間撹拌し、次いで真空中で溶剤を蒸発させることにより仕上げ処理して、ガムを得た。これをクロロホルムに溶解し、炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。クロロホルム抽出液を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、粗製５′− アジド生成物を得た。この粗製アジド中間体を次の工程の出発物質として用いた。３′−Ｏ（および２′−Ｏ）−アセチル−５′−アジド−５′−デオキシウリジン（化合物３）粗製アジド（上記の化合物２）を酢酸（７０％）（１００ｍｌ）に溶解し、１５分後に溶剤を減圧下で除去した。残渣を繰り返し無水エタノールに溶解し、濃縮して、最後の微量の酢酸を除去した。この方法で目的生成物の粗製試料を２′ および３′−位置異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）の混合物として得た。ＮＭＲ；比率２：１の２′−アセトキシ：３′−アセトキシ；ＤＭＳＯｄ６中：３′−Ｏ（および２′−Ｏ）−アセチル−５′−アジド−５′−デオキシ−２′ −Ｏ（および３′−Ｏ）−テトラヒドロピラニルウリジン上記の反応で得た粗製アセテートを乾燥ジクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解した。ジヒドロピラン（６ｍｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（５００ｍｇ）を反応フラスコに添加した。この混合物を２５℃で３時間撹拌したのち、ＴＬＣは出発物質が消費されたことを示した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を乾燥させたのち、減圧下で蒸発させた。粗生成物（２′および３′−位置異性体の混合物）をシリカゲルカラム上で、溶離剤としてクロロホルム／メタノール混合物（最初に９７：３（容量比）、次いで９５：５）を用いるクロマトグラフィーにより精製した。５′−アミノ−５′−デオキシ−２′−Ｏ（および３′−Ｏ）−テトラヒドロピラニルウリジン（化合物４）上記の反応で得たアジド中間体をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）に溶解し、トリフェニルホスフィン（６．５ｇ，２５ｍｍｏｌ）、次いで水（０．４５ｍｌ）を添加した。２５℃で１６時間撹拌したのち、濃アンモニアを添加し、さらに２４時間、反応を続けた。反応混合物を濃縮乾固し、カラムクロマトグラフィー（最初にクロロホルム／メタノール９：１、次いでクロロホルム／メタノール１：１）により精製して、目的生成物を２′および３′−位置異性体の混合物として得た。５′−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシル）アミノ−５′−デオキシ−２ ′−Ｏ（および３′−Ｏ）−テトラヒドロピラニルウリジン（化合物５）５′−アミノ−５′−デオキシ−２′−Ｏ（および３′−Ｏ）−テトラヒドロピラニルウリジン（３ｇ）の、無水テトラヒドロフラン中における溶液に、Ｎ− ベンジルオキシカルボニルグリシンｐ−ニトロフェニルエステル（３．１ｇ，９．２ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を２５℃で１６時間撹拌し、濃縮してガムとなし、シリカ上で溶離剤としてクロロホルム／メタノール（９６：４）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的生成物を位置異性体の混合物（３．６ｇ，収率７５％）として得た。ＮＭＲ；ＤＭＳＯｄ６中：（δ）11.36(s,1H); 8.02(b,1H); 7.70(2d,1H); 7.32 (m,6H); 5.90（d）および5.70(d,計1H); 5.64(d,1H); 5.444（d）および5.20(d, 計1H); 5.02(s,2H); 4.75(m,1H); 3.20-4.25(m,9H); 1.35-1.80(m,6H). 質量スペクトル（ＦＡＢ）.ｍ／ｅ.５１９（Ｍ＋Ｈ＋）.Ｃ２４Ｈ３０Ｎ４０９: 理論値Ｍ＋．５１８上記生成物の３′−Ｏ（および２′−Ｏ）−ホスホルアミダイト誘導体上記反応で得た生成物（１．９ｇ，３．６７ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍｌ）の、乾燥ジクロロメタン（３０ｍｌ）中における溶液に、塩化Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホルアミドを添加した。２５℃で５時間撹拌したのち、反応物をクロロホルムで希釈し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。クロロホルム抽出液を分離し、乾燥させ、濃縮してガムを得た。粗製混合物を下記の溶離剤を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して（最初にクロロホルム／トリエチルアミン９８：２、次いでクロロホルム／トリエチルアミン／メタノール９６：２：２）、目的とするリン含有中間体（１．９ｇ）を得た。完全に保護されたホスフェート中間体（化合物６）上記反応で得たホスホルアミダイト（１．９ｇ，２．４ｍｍｏｌ）および４− ジプロピルアミノフェノール（０．７ｇ，３．６ｍｍｏｌ）の、乾燥アセトニトリル（４０ｍｌ）中における溶液に、テトラゾール（０．５ｇ，７．２ｍｍｏｌ）を添加した。２５℃で１６時間、暗所で撹拌したのち、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（７０％，０．４ｍｌ）を添加した。１５分後に反応混合物を濃縮し、クロロホルムに溶解し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。クロロホルム層を分離し、次いで濃縮してガムを得た。これをシリカ上で酢酸エチル、次いで酢酸エチル／メタノール（９３：７、容量）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切な画分を蒸発させて、生成物（１．５ｇ）を２′および３′ −位置異性体の混合物として得た。ＮＭＲ；ＤＭＳＯｄ６中：（δ）11.43(s,1H); 8.10(b,1H); 7.75(m,1H); 7.45( m,1H); 7.35(s,5H); 7.00(m,2H); 6.60(m,2H); 5.90(m,1H); 5.69(m,1H); 5.17 （m）および4.97(m,計1H); 5.02(s,2H); 4.69（bs）および4.57(bs,計1H); 4.53 （m）および4.23(m,計1H); 4.08(m,1H); 3.15-3.85(m.13H); 1.35-1.75(m,10H); 0.88(t,6H). 質量スペクトル（ＦＡＢ）.ｍ／ｅ.７８７（Ｍ＋）および７８８（Ｍ＋Ｈ＋）．Ｃ３７Ｈ５０Ｎ５Ｏ１２Ｐ：理論値Ｍ＋．７８７ＴＨＰ保護されたプロドラッグ類似体（化合物７）上記反応で得た完全に保護された中間体（１ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍｌ）／シクロヘキサン（１０ｍｌ）の混合物に溶解したのち、木炭上２０％パラジウム（１５０ｍｇ）を添加した。混合物を１時間還流し、次いで濾過したのち、減圧下で濃縮した。得られたガムをシリカ上でクロロホルム／メタノール（９：１）を溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離グリシル誘導体を得た。上記反応で得たメチル保護されたホスフェート（１ｍｍｏｌ）を、次いでｔ− ブチルアミン（３０ｍｌ）に溶解した。反応混合物を１６時間還流し、濃縮したのち、シリカ上でクロロホルム／メタノール（９：１）、次いでクロロホルム／メタノール（７：３）を溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的とするＴＨＰ保護されたプロドラッグ類似体を２′および３′−位置異性体の混合物として得た。高圧液体クロマトグラフィーによる２′−位置異性体と３′−位置異性体の分離分離は、パーティシル（Ｐａｒｔｉｓｉｌ）ＯＳＤ−２カラム上で６０：４０メタノール／ギ酸アンモニウム（０．１Ｍ）によりイソクラティク溶離するＨＰＬＣによって行われた。適切な画分をプールし、凍結乾燥して、目的とする３′ −結合中間体（７）を得た。図９の構造式参照。ＮＭＲ；ＤＭＳＯｄ６中：参考例７シチジンプロドラッグ類似体の合成（図１０の反応経路を参照）シチジンプロドラッグ類似体（化合物１３）は、参考例６に記載したウリジン化合物と同様にして製造された。参考例６に記載した方法に従い、ただし化合物７（図９）の代わりに化合物１２（図１０）を用いた。標準的仕上げ処理：反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をＣＨＣｌ₃に溶解し、溶液をＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、濃縮した。指示した溶剤混合物を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。化合物１２は下記により製造された（図１０の反応経路を参照）。Ｎ ⁴−ベンゾイル−２′，３′−Ｏ−メトキシエチリデンシチジン（化合物１）をＤ．Ｐ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈａｎ，Ｃ．Ｂ．ＲｅｅｓｅおよびＲ．Ｓａｆｆｈｉｌｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ２６，１０３１（１９７０）に従って製造した。Ｎ ⁴−ベンゾイル−５′−Ｏ−メタンスルホニル−２′，３′−Ｏ−メトキシエチリデンシチジン（化合物２）を下記により製造した：Ｎ ⁴−ベンゾイル−２′，３′−Ｏ−メトキシエチリデンシチジン（９．８５ｇ，２５．０ｍｍｏｌ）の、ピリジン（１００ｍｌ）中における溶液に撹拌しながら、塩化メタンスルホニル（１．９ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。２５℃で１６時間撹拌したのち、溶液を真空下で濃縮し、クロロホルムに再溶解し、有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄することにより、反応混合物を仕上げ処理した。クロロホルム層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、生成物を得た。３′−Ｏ−アセチル−５′−アジド−Ｎ ⁴−ベンゾイル−５′−デオキシシチジン（２′−Ｏ−アセチル異性体との混合物）（化合物３）を下記により製造した。粗製メシラート（化合物２）を無水ＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解した。ナトリウムアジド(３．２５ｇ，５０ｍＭｏｌ)を添加し、反応混合物を８０℃で７時間撹拌した。溶剤を濃縮し、クロロホルムに再溶解し、クロロホルム抽出液を炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄することにより、反応物を仕上げ処理した。乾燥したクロロホルム層を濃縮することにより得た残渣を、１２０ｍｌの７０％ＨＯＡｃに溶解した。１５分後に溶剤を真空中で除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（９５：５ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ、次いで９２：８ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ）により精製した。目的生成物の収量は６ｇであった。３′−Ｏ−アセチル−５′−アジド−Ｎ ⁴−ベンゾイル−２′−Ｏ−テトラヒドロピラニル−５′−デオキシシチジン（３′−Ｏ−テトラヒドロピラニル異性体との混合物）（化合物４）を下記により製造した。上記の例で得た化合物３（６ｇ）を塩化メチレン（１００ｍｌ）およびジヒドロピラン（４ｍｌ）に溶解した。０．５ｇのｐ−トルエンスルホン酸・１水和物を添加したのち、混合物を２５℃で１６時間撹拌した。上記と同様な仕上げ処理により粗生成物が得られ、これを９８：２ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨで溶離するカラムクロマトグラフィーにより精製して、目的生成物を得た。５′−アジド−５′−デオキシ−２′−Ｏ−テトラヒドロピラニルシチジン（３′−Ｏ−テトラヒドロピラニル異性体との混合物）（化合物５）を下記により製造した。アセテート（化合物４，９．０ｇ，不純）をメタノール（６０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（３．５ｇ）を添加した。２５℃で１時間撹拌したのち、反応混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量３．７ｇ。注釈：この段階で２′−異性体と３′−異性体をクロマトグラフィーにより分離することができる（以下の大部分の工程でも同じ）。５′−アジド−Ｎ ⁴−ベンジルオキシカルボニル−５′−デオキシ−２′−Ｏ −テトラヒドロピラニルシチジン（３′−Ｏ−テトラヒドロピラニル異性体との混合物）（化合物６）を下記により製造した。シチジン化合物（化合物５，３．７ｇ）を無水ビリジン（８０ｍｌ）に溶解し、触媒量のジメルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）および２ｍｌのＺ−Ｃｌを添加した。２５℃で１６時間撹拌したのち、反応物を仕上げ処理し、生成物をシリカ上で溶離剤として（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ，９５：５）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。２．３ｇの生成物を得た。５′−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−５′−デオキシ−２′−Ｏ −テトラヒドロピラニルシチジン（３′−Ｏ−テトラヒドロピラニル異性体との混合物）（化合物７）を下記により製造した。ＴＨＦ（３０ｍｌ）中のアジド（化合物６，３．０６ｇ）をトリフェニルホスフィン（１．７ｇ）と共に５０℃で２４時間撹拌した。水（５ｍｌ）を添加し、５０℃でさらに１時間、撹拌を続けた。反応混合物を濃縮し、シリカカラム上で (最初にＣＨＣｌ³／ＭｅＯＨ，９：１、次いで１：１、最後に１００％ＭｅＯＨ )により精製して、０．９ｇの生成物を得た。Ｎ ⁴−ベンジルオキシカルボニル−５′−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシル）アミノ−５′−デオキシ−２′−Ｏ−テトラヒドロピラニルシチジン（３′−Ｏ−テトラヒドロピラニル異性体との混合物）（化合物８）を下記により製造した。アミン（化合物７，０．９ｇ）を無水ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−カルボベンジルオキシ−グリシネート（７００ｍｇ）を添加した。２５℃で１６時間撹拌したのち、反応混合物を濃縮し、（ＣＨＣｌ₃ ／ＭｅＯＨ、最初に９７：３、次いで９５：５の比率）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。１ｇの目的物質を得た。Ｎ ⁴−ベンジルオキシカルボニル−５′−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシル）アミノ−５′−デオキシ−２′−Ｏ−テトラヒドロピラニルシチジル− ３′−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチル）ホスホンアミデート（３′−異性体との混合物）（化合物９）を下記により製造した。アルコール（化合物８，１ｇ）を無水ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、ＥｔＮ（ｉＰｒ）₂（１．７ｍｌ）を添加し、次いでＣｌ−Ｐ（ＯＭｅ）Ｎ（ｉＰｒ）₂（３４ｍｌ）を添加した。２５℃で６時間撹拌し、仕上げ処理したのち、混合物をシリカ上で（最初にＣＨＣｌ₃／Ｅｔ₃Ｎ，９８：２、次いでＣＨＣｌ₃ ／Ｅｔ₃Ｎ／ＭｅＯＨ，９７：２：１）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。１．１ｇの生成物を得た。リン酸（メチル）（４−Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノフェニル）［Ｎ ⁴−ベンジルオキシカルボニル−５′−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグリシル）アミノ −５′−デオキシ−２′−Ｏ−テトラヒドロピラニルシチジル−３′］（３′− 異性体との混合物）（化合物１０）を下記により製造した。ホスホンアミデート（化合物９，１．１ｇ）を無水アセトニトリル（３０ｍｌ）に溶解し、４−Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノフェノール（２００ｍｇ）を添加し、次いでテトラゾール（４２０ｍｇ）を添加した。２５℃で１６時間撹拌したのち、７０％，ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（０．３ｍｌ）を添加した。１５分後に反応混合物を仕上げ処理し、粗生成物をシリカ上で（最初にＥｔＯＡｃ、次いでＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，９７：３）により溶離するカラムクロマトグラフィーによって精製して、０．８５ｇの生成物を得た。リン酸（メチル）（４−Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノフェニル）（５′−デオキシ−５′−グリシルアミノシチジル−３′）（３′−異性体との混合物）（化合物１１）を下記により製造した。ビス−カルボベンジルオキシ保護した化合物(化合物１０，０．８５ｇ)をエタノール（３０ｍｌ）およびシクロヘキサン（１５ｍｌ）に溶解した。Ｐｄ−Ｃ２０％（４００ｍｇ）を添加し、混合物を撹拌しながら４時間加熱還流した。濾過したのち、溶液を濃縮し、ガムをシリカ上で（最初にＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ，９５：５、次いで５：１、最後に１００％ＭｅＯＨ）により溶離するカラムクロマトグラフィーによって精製した。１００ｍｇの生成物を得た。リン酸水素（４−Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノフェニル）（５′−デオキシ−５ ′−グリシルアミノ−２′−Ｏ−テトラヒドロピラニルシチジル−３′）（３′ −異性体との混合物）（化合物１２）を下記により製造した。ホスフェート（化合物１１，１００ｍｇ）をｔ−ブチルアミン（２５ｍｌ）に溶解し、８時間加熱還流した。濃縮したのち、生成物をＨＰＬＣにより精製した（マグネシウム２０逆相カラム、溶離剤ＭｅＯＨ／０．１Ｍギ酸アンモニウム、比率６０：４０）。質量スペクトルＦＡＢＭＳ［ＭＨ＋」６３９参考例８ＬｏＶｏ腫瘍異種移植体へのＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ＢＰ−ＲＮアーゼ結合体の局在化参考例４の記載に従って調製したＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ＢＰ−ＲＮアーゼ結合体を、アイオドゲン（ＩＯＤＯＧＥＮ、商標）（パース・アンド・ワリナー（英国）社、イギリス、チェスター）を製造業者の推奨する方法に従って用いて、無担体¹²⁵Ｉで放射性標識した。放射性標識後の免疫反応性のインビトロ保持率が＞５０％であることを、Ｌｉｎｄｍｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，７２，７７−８９，１９８４の方法でＬｏＶｏ腫瘍細胞に結合させることにより確認した。確定したＬｏＶｏ腫瘍異種移植体を保有する（１×１０⁷個のＬｏＶｏ腫瘍細胞を７日前に皮下注射）無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ：Ａｌｐｋ［非近交系］）に、１０μＣｉの¹²⁵Ｉを含有する結合体約１０μｇを静脈内注射した。結合体を注射したのち、マウス３匹の群を種々の期間後に屠殺し、腫瘍、血液試料、および一定範囲の他の組織を摘出し、秤量し、ガンマ計数管で計数した。結合体の腫瘍および組織への分布を下記に示す。腫瘍および組織へのＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ＢＰ−ＲＮアーゼ結合体の局在化この結果は、Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ＲＮアーセ結合体がＬｏＶｏ腫瘍異種移植体へ特異的に局在化することを明瞭に示す。２４時間以後、血液を含めた他の組織と比較して腫瘍組織の方が、組織１ｇ当たりの結合体の量が多かった。腫瘍内の結合体の量は、Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ＣＰＧ２結合体（Ｂｌａｋｅｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｃｅｒ，６９，補遺ＸＸ１，ｐ１４，１９９４）により達成されたものと同様であった。このＣＰＧ２結合体についてのこれらの量は、マスタードプロドラッグと組み合わせた場合にＬｏＶｏ異種移植体モデルにおいて腫瘍を退行させかつ長期的に増殖を遅延させるのに十分であることが示されている（Ｂｌａｋｅｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｃｅｒ，６９，補遺ＸＸ１，ｐ１４，１９９４；Ｂｌａｋｅｙら，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣａｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，３５，ｐ５０７，１９９４）。参考例９ヒプリル−Ｌ−グルタミン酸の合成（図２８参照）ヒプリル−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（化合物３）（２．０６ｇ，４．２×１０^-3ｍｏｌ）、およびＴＨＦ中の３０％Ｐｄ／炭素（水分５０％）（０．７７ｇ）を水素雰囲気中で１．５時間撹拌した。混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ、商標）で濾過し、濾液を蒸発乾固させた。ジエチルエーテルで摩砕処理して、目的とする最終生成物を白色結晶質固体１．０２ｇ（７８％）として得た。融点１６９〜１７１℃。２０Ｄ＝−２．５°。出発物質である化合物３は下記により製造された。馬尿酸（０．９０ｇ，５× １０^-3ｍｏｌ）およびＬ−グルタミン酸ジベンジルエステル（２．５０ｇ，５× １０^-3ｍｏｌ）の、ＤＭＦ（３５ｍｌ）中における溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．７３ｇ，５．５×１０^-3ｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．４ｍｌ，９．７×１０^-3ｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル） − ３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．０５ｇ，５．５×１０^-3ｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一夜撹拌し、水（４００ｍｌ）に注入し、酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。抽出液を合わせて飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水、２ＮＨＣｌおよび水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発させて、目的とする出発物質を黄色の油として得た。２．０６ｇ（８４％）。参考例１０ヒプリル−Ｌ−アスパラギン酸の合成ヒプリル−Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステル（１．２８ｇ，２．７×１０^-3ｍｏｌ）、およびＴＨＦ中の３０％Ｐｄ／炭素（水分５０％）（０．５１ｇ）を水素雰囲気中で３時間撹拌した。混合物をセライト（商標）で濾過し、濾液を蒸発乾固させた。ジエチルエーテルで摩砕処理して、灰白色の結晶質固体０．６２ｇ（７８％）を得た。融点２００〜２０２℃。２０Ｄ＝＋７．９°。出発物質は下記により合成された。馬尿酸（０．９０ｇ，５×１０^-3ｍｏｌ）およびＬ−アスパラギン酸ジベンジルエステル（２．３１ｇ，５×１０^-3ｍｏｌ）の、ＤＭＦ（３５ｍｌ）中における溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．７３ｇ，５．５×１０^-3ｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．４ｍｌ，９．７×１０^-3ｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．０５ｇ，５．５×１０^-3ｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、次いで水（４５０ｍｌ）に注入し、酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、水、２ＮＨＣｌおよび水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾固して、目的とする出発物質を黄色の油として得た。１．９０ｇ（８０％）。参考例１１Ｈｉｐｐ−Ａｒｇに対する組換えＨＣＰＢの酵素活性参考例２０の記載に従って製造した精製ヒトＣＰＢがヒプリル−Ｌ−アルギニン（Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ）を馬尿酸に変換する効力を、分光測光アッセイ法によりアッセイした。天然ＨＣＰＢのＫｍおよびＫｃａｔを、一定範囲のＨｉｐｐ−Ａｒｇ濃度（０．７５〜０．１２５ｍＭ）およびＣＰＢ酵素濃度１μｇ／ｍｌを用いて、２５４ｎＭのＨｉｐｐ−Ａｒｇを馬尿酸に変換する初速度の測定により判定した。測定は３７℃で０．２５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中において、光路１ｃｍにより総容量１．０ｍｌのキュベット中で、パーキン・エルマー、ラムダ２分光光度計を用いて行われた。ＫｍおよびＶｍａｘ値は、ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（商標）ソフトウェアプログラム（バイオソフト（Ｂｉｏｓｏｆｔ）、商標、パーキン・エルマー）により計算された。ＫｃａｔはＶｍａｘから、反応混合物の酵素濃度で割ることにより計算された。Ｈｉｐｐ−Ａｒｇに対するヒトＣＰＢの結果は以下のとおりであった：Ｋｍ＝０．１８ｍＭＫｃａｔ＝６５ｓ^-1 この結果は、上記の組換えＨＣＰＢが酵素活性を示し、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ中のアミド結合を開裂して馬尿酸を放出しうることを証明する。参考例１２アルギニンマスタードプロドラッグの合成（図２７参照）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝プロピオニルアミノ）−５−グアニジノ−ペント酸（化合物５ｃ，図２７）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝プロピオニルアミノ）−５−（２−ニトロ）グアニジノ−ペント酸ベンジルエステル（化合物４ｃ，図２７）（２７５ｍｇ；０．４４ｍｍｏｌ）の、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（１／１；ｖ／ｖ）（８ｍｌ）中における溶液−１０％Ｐｄ／Ｃ（２００ｍｇ）を含有−を、パル（Ｐａｒｒ）装置内で約５５２ｋＰａ（８０ｐｓｉ）において６時間、水素添加した。濾過したのち、有機相を蒸発させた。得られた油をＣＨ₂Ｃｌ₂／ジエチルエーテルで再結晶して、目的化合物５ｃを白色固体（１８０ｍｇ）として得た。収率８４％。出発物質である化合物４ｃは下記により製造された。（２Ｓ），２−アミノ− ５−（２−ニトロ）グアニジノ−ペント酸ベンジルエステル（化合物２ｃ）（６５４ｍｇ；１ｍｍｏｌ）の、ＣＨＣｌ₃（１０ｍｌ）中における溶液に、ジヒドロフラン−２，５−ジオン（化合物１）（１２０ｍｇ；２ｍｍｏｌ）、次いでトリエチルアミン（２０２ｍｇ；２ｍｍｏｌ）を滴加した。室温で２時間撹拌したのち、溶剤を蒸発させ、粗製残渣を水に溶解し、２ＮＨＣｌでｐＨを２．５に調整した。水層を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させて、（２Ｓ），２−（３−カルボキシ−プロピオニルアミノ）−５−（２−ニトロ）グアニジノ−ペント酸ベンジルエステル（化合物３ｃ）を得た。得られた固体をジエチルエーテルで摩砕処理し、濾別した；２８０ｍｇ（６８％）。化合物３ｃ（２０４ｍｇ；０．５ｍｍｏｌ）の、ＣＨＣｌ₃（５ｍｌ）中における懸濁液に、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノール（化合物６）（１３５ｍｇ；０．５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１９ｍｇ；０．５ｍｍｏｌ）、次いでＤＭＡＰ（１８ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で６時間撹拌したのち、溶剤を蒸発させた。残渣を酢酸エチルと水の間で分配し、水相を２ＮＨＣｌでｐＨ３に酸性化した。酢酸エチルで抽出したのち、有機相をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させた。残渣を溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂ ／ＭｅＯＨ（９５／５；ｖ／ｖ）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、目的とする出発物質４ｃを白色泡状物（２８１ｍｇ）として得た。収率９０％。参考例１３コハク酸モノ−｛４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝エステル（本明細書において、“中間体”とも呼ぶ）ＣＨＣｌ₃（１０ｍｌ）中の無水コハク酸（２２５ｍｇ；２．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、撹拌下で４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノール（化合物６，図２７；２０３ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌ）、次いでトリエチルアミン（７５ｍｇ；０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を一夜撹拌し、溶剤を蒸発させた。粗製残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ₂Ｏ／Ｈ₂Ｏに溶解し、撹拌下でｐＨを３に調整した。有機相を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させた。得られた油をＥｔ₂Ｏ／ヘキサンから結晶化し、白色固体を濾別し、真空下で乾燥させて、目的とする最終生成物（２１０ｍｇ；収率８３％）を得た。融点９８〜１００℃。参考例１４ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＣＰＢ）のクローニング標準的な分子生物学的方法、たとえば制限酵素消化、連結反応、キナーゼ反応、脱リン酸化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、細菌の形質転換、ゲル電気泳動、緩衝液の調製、ならびにＤＮＡの形成、精製および単離は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９）,ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ：第２版：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、の記載に従って、または個々の製品の製造業者が推奨する方法により行われた。大部分の場合、酵素はニュー・イングランド・バイオラボズから購入されたが、他の業者および均等な方法も採用できる。オリゴヌクレオチド配列は、アプライド・バイオシステムズ３８０ＡＤＮＡ合成装置で、５′−ジメトキシトリチル塩基保護したヌクレオシド −２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイトおよび０．２μｍｏｌの大きさの制御された細孔をもつガラス支持体に結合した保護されたヌクレオシドから、アプライド・バイオシステムズ社の提供するプロトコールに従って、調製された。ヒト膵臓カルボシペプチダーゼＢをコードする配列は、λｇｔ１０ベクター（クローンテク、ヒト膵臓５′ＳＴＲＥＴＣＨｃＤＮＡ、ＨＬ１１６３ａ）中へクローン化したヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により得られ、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＫＳ＋（ストラタジーン）中へクローン化された。一般に一定部分のｃＤＮＡライブラリー（＞１０⁸ｐｆｕ／ｍｌの力価のもの５μｌ）を、１００ｐＭｏｌの２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、ＢＰＴ１およびＢＰＢ１（配列番号：４６および配列番号：４７）、ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液、ならびに２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（最終容量１００μｌ中）と混合した。Ｔａｑ酵素を添加する前に、この混合物を９４℃に１０分間加熱し、９４℃で１．５分間、５０℃で２分間、および７２℃で２分間の３０サイクルのインキュベーションを行い、次いで反応終了時に７２℃で９．９分間のインキュベーションを１回行った。上記２種類のオリゴヌクレオチドプライマーは、図１８に示すように、ＢＰＴ１由来の遺伝子（配列番号：４６）の５′側のプレ配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の起点とプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の起点の間からのＰＣＲ延長、およびＢＰＢ１由来の遺伝子（配列番号：４７）の３′側からの逆ＰＣＲ延長が可能となるように設計される。またＢＰＴ１およびＢＰＢ１は、ユニーク制限部位、それぞれＳａｃＩおよびＸｈｏＩをＰＣＲ生成物に導入するように設計される。一定部分のＰＣＲ生成物を適正なサイズのＤＮＡ（約１２５０塩基対）につきアガロース電気泳動により分析して、主として適正なサイズのバンドを含むことが認められた。セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ、商標）１００微量濃縮カラム（アミコン）を用いて反応混合物から残りの生成物を精製し、過剰の試薬から分離し、次いでエタノール／酢酸ナトリウム沈殿法、遠心分離、真空乾燥および、蒸留水中への再懸濁によりＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡを酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで制限消化し、アガロースゲル電気泳動から適正なサイズのバンド（約１２５０塩基対）を切取り、ガラス−ミルク（ｇｌａｓｓ−ｍｉｌｋ）（ジェネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、商標）、ストラテク・サイエンティフィック、またはこれに類する他の製品）を用いて単離した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＫＳ＋二本鎖ＤＮＡ（ストラタジーン）をＳａｃＩ酵素で制限消化し、生成物をウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理して、５′ホスホリル基を除去し、再連結反応、および形質転換後のベクターバックグラウンドを低下させた。ＤＮＡ生成物をガラス−ミルクにより酵素反応の汚染物質から精製し、次いでＸｈｏＩ酵素で制限消化した。アガロースゲル電気泳動から適正なサイズのＤＮＡ（約２８５０塩基対）を切取り、ガラス−ミルク（ジェネクリーン（商標）、ストラテク・サイエンティフィック、またはこれに類する他の製品）を用いて精製および単離した。制限消化しかつ精製したＤＮＡ試料の一定部分につき、既知の標準品と比較したアガロースゲル電気泳動により純度および濃度を調べた。これらの推定値から、ＨＣＰＢ遺伝子をベクター中へクローニングするための連結反応混合物を、約１ベクター：２.５挿入配列（１ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋：２.５ＨＣＰＢＰＣＲ生成物）のモル比、および最終ＤＮＡ濃度約２．５ｎｇ／μｌで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１ｍＭＡＴＰおよび酵素緩衝液の存在下に調製した。連結反応後のＤＮＡ混合物を、大腸菌ＤＨ５α株（ギブコ−ＢＲＬ、最大効率コンピテント細胞）の形質転換に用いた。プラスミドベクターの選択として１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−寒天栄養培地に一定部分の細胞を接種し、３７℃で一夜インキュベートした。目的とする挿入配列をもつプラスミドを含むコロニーをハイブリダイゼーションにより同定した。約２００コロニーを採取し、プラスミドベクターの選択として１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−寒天栄養培地の平板上で予め湿らせた２枚ずつの無菌ニトロセルロースフィルター（シュライヘル・アンド・シュル）に乗せ、３７℃で一夜インキュベートした。２枚のうち１枚の平板を４℃で保存して、各コロニーの生存細胞源として用い、他方の平板を変性処理して個々のコロニーに由来するＤＮＡをニトロセルロースに固定した。ニトロセルロースフィルターを寒天平板から取り出し、下記のものに浸漬したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ、商標）濾紙に順に乗せた：１．１０％ＳＤＳ、２分間２．０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、７分間３．０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、４分間４．０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、２分間５．０．５Ｍトリス、ｐＨ７．４、１．５ＭＮａＣｌ、２分間６．２×ＳＳＣ（標準クエン酸塩類溶液）、２分間次いで１０×ＳＳＣに浸漬したワットマン（商標）濾紙にフィルターを乗せ、変性ＤＮＡを紫外線処理（スペクトロリンカー（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ、商標）ＸＬ−１５００ＵＶ架橋装置）によりニトロセルロースに架橋した。次いでフィルターを室温で風乾し、次いで６×ＳＳＣ溶液中において緩和に撹拌しながら６０℃で１時間、予備ハイブリダイゼーションした（たとえばテクネ（Ｔｅｃｈｎｅ）ＨＢ−１Ｄハイブリダイザーを使用）。予備ハイブリダイゼーションはフィルター上の非特異的ＤＮＡ結合部位を遮断する。目的とするＤＮＡ挿入配列を含むコロニーを判定するために、ニトロセルロースフィルターに架橋したＤＮＡを、膵臓ｃＤＮＡライブラリーのＨＣＰＢＰＣＲ生成物（前記）から調製した放射性標識³²Ｐ−ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア、Ｔ７クイックプライム（Ｑｕｉｃｋｐｒｉｍｅ）キット）を用いて、総容量５０μｌで、約５０ｎｇのＤＮＡを５０μＣｉの³²Ｐ−ｄＣＴＰ（約３０００Ｃｉ／ｍＭｏｌ）で標識し、反応を３７℃で１５分間進行させた。次いで標識プローブを９５℃に２分間加熱して二本鎖ＤＮＡを変性させ、直ちに１０ｍｌの６×ＳＳＣに６０℃で添加し、この溶液でフィルター上の予備ハイブリダイゼーション溶液を交換した。緩和に撹拌しながら、６０℃で約３時間、インキュベーションを続けた。次いでハイブリダイゼーション溶液を注ぎ出し、フィルターを６０℃で２回、２×ＳＳＣ中でそれぞれ１５分間洗浄した。次いでフィルターを緩和にブロッティングして乾燥させ、密着フィルム（サラン（Ｓａｒａｎ、商標）ラップまたはこれに類するもの）で覆い、Ｘ線フィルム（たとえばコダック、エクソマット（Ｘｏｍａｔ、商標）−ＡＲ５）に室温で一夜露光した。フィルムを現像したのち、目的とする挿入配列を含むコロニーはＸ線フィルム上に最も強い露光（最も濃いスポット）を与えるものとして同定された。この一連の実験で約１５％のコロニーが陽性ハイブリダイゼーションを示した。このうち１２コロニーをその後のスクリーニングのために選択した。これらのコロニーを２枚ずつのフィルターから採取し、１００ μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−寒天栄養培地上で画線培養および維持し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−ブロス栄養培地中で増殖させた。選択した分離体をＰＣＲにより、プライマーＢＰＴ１およびＢＰＢ１（配列番号：４６および配列番号：４７）を用いて適正なサイズの挿入配列につき検査し、また内部プライマーＢＰＴ２（配列番号：４８）およびＢＰＢ１によるプライミングにつき検査した。ＢＰＴ２は、プロ配列の終点で成熟遺伝子の起点前においてプライミングし、かつＸｂａＩ制限部位を導入するように設計される。ＰＣＲスクリーニングのために、選択した分離体のコロニーを採取し、２００ μｌの蒸留水に分散させ、シールしたエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、商標）試験管中で１００℃において１０分間加熱した。次いで懸濁液をマイクロフュージで１０分間遠心して細胞片をペレット化し、１μｌの上清をＰＣＲスクリーニングのＤＮＡ鋳型として用いた。一般に１μｌの上清を２０ｐｍｏｌの２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、ＢＰＴ１およびＢＰＢ１、またはＢＰＴ２およびＢＰＢ１、ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液、および０．５ＵのＴａｑポリメラーゼと、最終容量２０μｌ中で混合した。ＰＣＲインキュベーションを９４℃で１．５分間、５０℃で２分間、および７２℃で２分間の２５サイクルにより行い、次いで反応終了時に７２℃で９．９分間のインキュベーションを１回行った。ＰＣＲ生成物を適正なサイズのＤＮＡ（プライマーＢＰＴ１からＢＰＢ１まで約１２５０塩基対、またプライマーＢＰＴ２からＢＰＢ１まで約９００塩基対、図１８参照）につき、アガロースゲル電気泳動により分析した。１２中１０のクローンから適正なサイズのＰＣＲＤＮＡ生成物が得られた。次いで１０中６のクローンをプラスミドＤＮＡ調製用として採取した（キアゲン・マクシ（商標）キットを使用、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−ブロス中３７℃ で一夜の培養物１００ｍｌから）。次いでこれらのプラスミドＤＮＡ調製物を、ＵＳＢシーケナーゼ（商標）ＤＮＡ配列決定用キット（バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含む）を用いて、ＰＣＲ生成物挿入配列領域にわたって配列決定した。各クローンを８種類の別個のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち６７６、３３６、３３７、６７９、６７７、１２８０、１２７９および１２８１（配列番号：４８〜５５）により配列決定した。ＨＣＰＢ配列内のこれらの配列決定用プライマーの位置を図１９に示す。プライマー３３６、１２７９、６７６、１２８０、６７７、および１２８１は“前向き”であり、３３７および６７９は“後向き”である。６中５のクローンはＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含めてそれらの間に１２６３塩基対の等しい配列（配列番号：５６）をもつことが認められ、この配列をその後の実験に用いた。このＤＮＡ配列からそのポリペプチド配列への翻訳を配列番号：５７に示し、成熟タンパク質配列の起点から１と番号をつける。−９５と番号をつけたアミノ酸が推定プロ酵素配列の起点を表す。クローン化ＰＣＲにより生成したＤＮＡ中には酵素分泌リーダー配列（プレ配列）の一部しか存在しない。このポリペプチド配列は位置２５３にアスパラギン酸残基を示す。これは、全配列を他の哺乳動物カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ配列と並置した場合に、Ｂ型特異性を表す（ＣａｔａｓｕｓＬ．，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８７，２９９−３０３，１９９２により２５５の番号がつけられたアミノ酸，および考察を参照）。しかしクローン化配列中の位置１３５のシステイン残基は公表された他のヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢ中には見られない。これはＹａｍａｍｏｔｏら，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７，２５７５−２５８１，１９９２により強調され、そこには他の哺乳動物膵臓カルボキシペプチダーゼＢアミノ酸配列と並置した場合に２４４の番号の位置以後の配列にギャップがあることが示される。図１９にも示すように、アミノ酸アスパラギン酸残基のおおよその部位は酵素認識部位内にあり、システイン残基は成熟酵素の位置１３５にある。これらのクローンのうちの１つは、１９９５年１１月２３日に、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（２３Ｓｔ．ＭａｃｈａｒＤｒｉｖｅ，ＡｂｅｒｄｅｅｎＡＢ２１ＲＹ、スコットランド）に寄託され、寄託番号ＮＣＩＭＢ４０６９４をもつ。このクローン由来のプラスミドはｐＩＣＩ１６９８として知られる。参考例１５大腸菌からの成熟ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの発現成熟ＨＣＰＢを大腸菌から発現させるために、ｐＩＣＩ１６９８由来の成熟遺伝子を生成タンパク質を細菌の細胞周辺へ調節分泌させるプラスミドベクター中へ転移させた。調節発現に適した、細菌性宿主ＭＳＤ５２２中のｐＩＣＩ２６６として知られるこの分泌ベクターは、１９９３年１０月１１日に、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＡｂｅｒｄｅｅｎＡＢ２１ＲＹ、スコットランド）に寄託され、寄託番号ＮＣＩＭＢ４０５８９をもつ。ｐＩＣＩ２６６のプラスミド地図を図２０に示す。このプラスミドはテトラサイクリン耐性および誘導に関する遺伝子（ＴｅｔＡおよびＴｅｔＲ）、挿入遺伝子の発現のためのＡｒａＢオペレーターおよびプロモーター配列、ならびに発現調節のためのＡｒａＣ遺伝子をもつ。プロモーター配列に続いてＰｅｌＢ翻訳リーダー配列があり、これはそれ以後のポリペプチド配列を細胞周辺へ向かわせる。遺伝子クローニング部位はいくつかのユニーク制限部位を含み、それに続いてファージＴ４転写終止配列がある。この領域のＤＮＡ配列および遺伝子クローニングのための特色を図２１に示す。成熟ＨＣＰＢ配列をｐＩＣＩ２６６中へクローニングするために、ＨＣＰＢＤＮＡをＰＣＲ法により形成し、成熟遺伝子の起点におけるコドン利用性を若干変更して大腸菌嗜好性コドンを導入することに決定した。また発現構築体の検出および精製に役立てるために、（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃとして知られるＣ−末端ペプチド標識をこの酵素に付加した。この標識は６個のヒスチジン、トリペプチドリンカー（ＥＰＥ）、および抗体９Ｅ１０（Ｅｖａｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５，１２９−１３６，１９８５により発表、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズその他の抗体供給業者から入手できる）が認識するｃ−ｍｙｃ由来のペプチド配列（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）から構成される。Ｃ−末端はアスパラギンの付加により完結する。６個のヒスチジン残基は金属キレートカラム（たとえばＮｉ−ＮＴＡアガロース、キアゲンから）による発現タンパク質精製を可能にするはずである。さらに、ＰＣＲ生成物を発現ベクター中へ導入しやすくするために、ＰＣＲプライマーを用いてユニーク制限部位を遺伝子の５′側（ＦｓｐＩ）および３′側（ＥｃｏＲＩ）に導入する。ＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１として知られる２つのプライマー配列を、配列番号：５８および５９に示す。ｐＩＣＩ２６６中へのクローニングに用いる修飾遺伝子を形成するために、１００ｐＭｏｌのプライマーＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１を、約５ｎｇのｐＩＣＩ１６９８ＤＮＡ、ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼの存在下に、最終容量１００μｌ中で用いてＰＣＲを設定した。この混合物をＴａｑ酵素の添加前に９４℃に１０分間加熱し、ＰＣＲインキュベーションを９４℃で１．５分間、５０℃で２分間、および７２℃で２分間の３０サイクルにより行い、次いで反応終了時に７２℃で９．９分間のインキュベーションを１回行った。一定部分のＰＣＲ生成物を、適正なサイズのＤＮＡ（約１０００塩基対）につき、アガロースゲル電気泳動により分析し、主として適正なサイズのバンドを含むことを認めた。セントリコン（商標）１００微量濃縮カラム（アミコン）を用いて反応混合物から残りの生成物を精製し、過剰の試薬から分離し、次いでエタノール／酢酸ナトリウム沈殿法、遠心分離、真空乾燥および蒸留水中への再懸濁により、ＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡを酵素ＦｓｐＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、アガロースゲル電気泳動から適正なサイズのバンド（約１０００塩基対）を切取り、ガラス−ミルク（ジェネクリーン（商標）、ストラテク・サイエンティフィック、またはこれに類する他の製品）を用いて単離した。標準的なＤＮＡ技術（キアゲンプラスミドキットまたはそれに類するもの）を用いて製造したｐＩＣＩ２６６二本鎖ＤＮＡをＫｐｎＩ酵素で、確実に完全に消化されるようにきわめて慎重に消化した。次いで６５℃に１０分間加熱することによりこの酵素を不活性化し、次いで氷上で冷却した。次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼを供給業者（ニュー・イングランド・バイオラボズ）の推奨に従ってｄＮＴＰの存在下に添加し、１６℃で１５分間インキュベートすることにより、ＫｐｎＩで形成された３′側オーバーハングを酵素消化した。７０℃に１５分間加熱して酵素を不活性化することにより、反応を停止した。ガラス−ミルクによりＤＮＡ生成物を酵素反応の汚染物質から精製し、一定部分をアガロースゲル電気泳動により収率につき検査し、残りをＥｃｏＲＩ酵素で制限消化した。この場合も確実に完全に制限消化されるように注意をはらった。アガロースゲル電気泳動によって適正なサイズのＤＮＡ（約５６００塩基対）を切取り、ガラス−ミルク（ジェネクリーン（商標）、ストラテク・サイエンティフィック、またはこれに類する他の製品）を用いて精製および単離した。制限消化しかつ精製したＤＮＡ試料の一定部分をアガロースゲル電気泳動により既知の標準品と比較して、純度および濃度推定値を調べた。これらの推定値から、ＨＣＰＢ遺伝子をベクター中へクローニングするための連結反応混合物を、約１ベクター：２．５挿入配列（１ｐＩＣＩ２６６：２．５ＨＣＰＢＰＣＲ生成物）のモル比、および最終ＤＮＡ濃度約２．５ｎｇ／μｌで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１ｍＭＡＴＰおよび酵素緩衝液の存在下に、平滑末端ＤＮＡ（ＦｓｐＩからＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理ＫｐｎＩまで）の連結反応に適した条件を用いて調製した。連結反応後のＤＮＡ混合物を、大腸菌ＤＨ５α株（ギブコ−ＢＲＬ、最大効率コンピテント細胞）の形質転換に用いた。プラスミドベクターの選択として１００μｇ／ｍｌのテトラサイクリンンを含有するＬ−寒天栄養培地に一定部分の細胞を接種し、３７℃で一夜インキュベートした。目的とする挿入配列をもつプラスミドを含むコロニーをハイブリダイゼーションにより同定した。約３５０コロニーを採取し、プラスミドベクターの選択として１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−寒天栄養培地の平板上で予め湿らせた２枚ずつの無菌ニトロセルロースフィルター（シュライヘル・アンド・シュル）に乗せ、３７℃で一夜インキュベートした。２枚のうち１枚の平板を４℃で保存して、各コロニーの生存細胞源として用い、他方の平板を変性処理して個々のコロニーに由来するＤＮＡをニトロセルロースに固定した。ニトロセルロースフィルターを寒天平板から取り出し、下記のものに浸漬したワットマン（商標）濾紙に順に乗せた：１．１０％ＳＤＳ、２分間２．０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、７分間３．０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、４分間４．０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、２分間５．０．５Ｍトリス、ｐＨ７．４、１．５ＭＮａＣｌ、２分間６．２×ＳＳＣ（標準クエン酸塩類溶液）、２分間次いで１０×ＳＳＣに浸漬したワットマン濾紙にフィルターを乗せ、変性ＤＮＡを紫外線処理（スペクトロリンカー（商標）ＸＬ−１５００ＵＶ架橋装置）によりニトロセルロースに架橋した。次いでフィルターを室温で風乾し、次いで６×ＳＳＣ溶液中において緩和に撹拌しながら６０℃で１時間、予備ハイブリダイゼーションした(たとえばテクネＨＢ−１Ｄハイブリダイザー（商標）を使用) 。予備ハイブリダイゼーションはフィルター上の非特異的ＤＮＡ結合部位を遮断する。目的とするＤＮＡ挿入配列を含むコロニーを判定するために、ニトロセルロースフィルターに架橋したＤＮＡを、膵臓ｃＤＮＡライブラリーのＨＣＰＢＰＣＲ生成物（前記）から調製した放射性標識³²Ｐ−ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア、Ｔ７クイックプライム( 商標)キット）を用いて、総容量５０μｌで、約５０ｎｇのＤＮＡを５０μＣｉの³²Ｐ−ｄＣＴＰ（約３０００Ｃｉ／ｍＭｏｌ）で標識し、反応を３７℃で１５分間進行させた。次いで標識プローブを９５℃に２分間加熱して二本鎖ＤＮＡを変性させ、直ちに１０ｍｌの６×ＳＳＣに６０℃で添加し、この溶液でフィルター上の予備ハイブリダイゼーション溶液を交換した。緩和に撹拌しながら、６０ ℃で約３時間、インキュベーションを続けた。次いでハイブリダイゼーション溶液を注ぎ出し、フィルターを６０℃で２回、２×ＳＳＣ中でそれぞれ１５分間洗浄した。次いでフィルターを緩和にブロッティングして乾燥させ、密着フィルム（サラン（商標）ラップまたはこれに類するもの）で覆い、Ｘ線フィルム（たとえばコダック、エクソマット（商標）−ＡＲ５）に室温で一夜露光した。フィルムを現像したのち、目的とする挿入配列を含むコロニーはＸ線フィルム上に最も強い露光（最も濃いスポット）を与えるものとして同定された。この一連の実験で約５０％のコロニーが陽性ハイブリダイゼーションを示した。このうち１２コロニーをその後のスクリーニングのために選択した。これらのコロニーを２枚ずつのフィルターから採取し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ− 寒天栄養培地に画線培養して維持し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−ブロス栄養培地中で増殖させた。選択した分離体をＰＣＲにより、プライマーＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：５８および配列番号：５９）を用いて適正なサイズの挿入配列につき検査し、また内部プライマーＢＰＢ２（配列番号：５１）およびＦＳＰＴ１によるプライミングにつき検査した。ＢＰＢ２は、成熟遺伝子内でプライミングし、約４３０塩基対のフラグメントを導入するように設計される。ＰＣＲスクリーニングのために、選択した分離体のコロニーを採取し、２００ μｌの蒸留水に分散させ、シールしたエッペンドルフ試験管中で１００℃において１０分間加熱した。次いで懸濁液をマイクロフュージで１０分間遠心して細胞片をペレット化し、１μｌの上清をＰＣＲスクリーニングのＤＮＡ鋳型として用いた。一般に１μｌの上清を２０ｐｍｏｌの２種類のオリゴヌクレオチドプラマー、ＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１、またはＦＳＰＴＳ１およびＢＰＢ２、ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液、および０．５ＵのＴａｑポリメラーゼと、最終容量２０μｌ中で混合した。ＰＣＲインキュベーションを９４℃で１．５分間、５０℃で２分間、および７２℃ で２分間の２５サイクルにより行い、次いで反応終了時に７２℃で９．９分間のインキュベーションを１回行った。ＰＣＲ生成物を適正なサイズのＤＮＡ（プラマーＦＳＰＴＳ１から６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１まで約１０００塩基対、またプラマーＦＳＰＴＳ１からＢＰＢ２まで約４３０塩基対）につき、アガロースゲル電気泳動により分析した。１２クローンすべてが適正なサイズのＰＣＲＤＮＡ生成物を与えた。次いでそれらのうち６クローンをプラスミドＤＮＡ調製用として採取した（キアゲン、マキシ（商標）キットを使用、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−ブロス中３７℃で一夜の培養物１００ｍｌから）。次いでこれらのプラスミドＤＮＡ調製物を、ＵＳＢシーケナーゼ（商標）ＤＮＡ配列決定用キット（バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含む）を用いて、ＰＣＲ生成物挿入配列領域にわたって配列決定した。各クローンを数種類の別個のオリゴヌクレオチドプライマーにより配列決定した。あるいは、自動ＤＮＡ配列決定サービス（ＡＢＩ配列決定装置を使用）によりＤＮＡを配列決定した。いくつかの別個のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてこれらのクローンを配列決定した。１５０４、１５９０および１７３１として知られる３種類のプライマー（配列番号：６０、６１および６２）を用いて、発現ベクターと挿入遺伝子の間のクローニング結合を検査し、かつ挿入遺伝子の起点と終点からの配列データを得た。６７９、６７７、１８０２および１２８０として知られる他のプライマー（配列番号：５１、５２、６３および５３）を用いて、残りの挿入遺伝子配列を確認した。修飾した成熟ＨＣＰＢ遺伝子を含むこのプラスミドは、ｐＩＣＩ１７１２として知られる。アミノ酸翻訳を示す、確認されたクローン化遺伝子配列（ＰｅｌＢ配列の起点から（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識の終点まで）を配列番号：６４として示し、ＤＮＡ番号つけをＰｅｌＢの第１コドンの１から開始し、ペプチドの番号つけを成熟ＨＣＰＢの１から開始する。この修飾ＨＣＰＢを調節発現させるために、ｐＩＣＩ１７１２プラスミドＤＮＡを塩化カルシウム形質転換コンピテント大腸菌発現株中へ形質転換した。これらの菌株には、アラビノースを主要炭素源として増殖することができず、アラビノース（Ａｒａ）オペロンに対する染色体欠失であるものが多数含まれていた。好ましい菌株はＭＳＤ２１３として知られ（ＣａｓａｄａｂａｎらのＭＣ１０００株、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖ１３８，１７９−２０８，１９８０）、部分遺伝子型Ｆ−Ａｒａ △（Ａｒａ−Ｌｅｕ）△ＬａｃＸ７４ＧａｌＶＧａｌＫＳｔｒＲをもつ。他の好ましい菌株はＭＳＤ５２５として知られ（ＭＣ１０６１株）、遺伝子型ＡｒａＤ１３９ △（Ａｒａ−Ｌｅｕ）７６９７ △ＬａｃＸ７４ＧａｌＵＨｓｄＬＲｐｓＬをもつ。プラスミドｐＩＣＩ２６６においてＡｒａＢプロモーター由来の遺伝子を調節発現させるのに適した同様な遺伝子型の大腸菌株は、米国コネチカット州エール大学生物学部、大腸菌遺伝子保存センター（Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｒｅ）から入手できる。形質転換体の選択は、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−寒天栄養培地上で、３７℃において一夜行われた。形質転換用平板から単一コロニーを採取し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−寒天栄養培地に画線培養して維持し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−ブロス栄養培地中で増殖させることにより純粋にした。すべてのｐＩＣＩ１７１２形質転換発現株を同じ方法で処理して、クローン化ＨＣＰＢ遺伝子の発現につき試験した。１．２５ｍｌ容ユニバーサル容器内で１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−ブロス栄養培地１０ｍｌに単一コロニーを用いて接種し、３７℃で一夜、振盪しながらインキュベートした。２．２５０ｍｌ容三角フラスコ内で、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する３７℃に予熱したＬ−ブロス栄養培地７５ｍｌに、上記の一夜培養物０．７５ｍｌ（１％ｖ／ｖ）を接種した。３７℃で振盪しながらインキュベーションを続け、５４０ｎｍの吸光により増殖を監視した。培養物の指数関数的増殖期にクローン化タンパク質の発現を誘導する必要があり、これは５４０ｎｍで０.４〜０.６Ｏ．Ｄ．において行われ、一般に接種から９０〜１５０分間行われた。３．細胞が目的の光学濃度に達した時点で、フラスコを室温に３０分間置くことにより、培養物を放冷した。次いでアラビノースを最終濃度１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３０℃で振盪しながら４〜６時間、インキュベーションを続けた。４．インキュベーション後に最終的な光学濃度測定を行い、細胞を遠心により採取した。この最終光学濃度測定値を利用して、細胞ペレットの再懸濁に用いるタンパク質アクリルアミドゲル（レムリ）装填用緩衝液の容量を計算した。１未満のＯ．Ｄ．については０．１Ｏ．Ｄ．単位当たり１０μｌの容量を用い、１以上のＯ．Ｄ．については０．１Ｏ．Ｄ．単位当たり１５μｌの容量を用いた。レムリの装填用緩衝液は、２％ＳＤＳ、２％β−メルカプトエタノール、１０％グリセリンおよび０．１％ブロムフェノールブルーを含有する０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）からなっていた。５．再懸濁後に試料を１００℃に１０分間加熱することにより変性させ、次いで遠心して粘稠な細胞片を上清から分離した。通常は上清２０μｌの発現試料を、一般にタンパク質の電気泳動分離用の１７％ＳＤＳアクリルアミドゲルに装填した。一方を全タンパク質用に染色し（クーマシーまたはこれに類する染料、および標準条件を採用）、他方をウェスタン分析による個々の生成物の指示用に処理できるように、一般に２つのゲルを用意した。ウェスタン分析のために、半乾式電気泳動ブロッティング装置（バイオ−ラドまたはこれに類するもの）を用いて泳動済みゲル中のタンパク質をナイロン膜（たとえばプロブロット（Ｐｒｏｂｌｏｔ、商標）、アプライド・バイオシステムズ）に移した。処理の前および途中は、膜が湿っているように注意をはらった。タンパク質をゲルから移したのち、室温で５時間緩和に撹拌しながら、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の５％低脂肪粉乳（マーべル（Ｍａｒｖｅｌ、商標）またはこれに類するもの）溶液で、それ以上の結合を遮断した。次いで室温で３回、それぞれ５分間緩和に撹拌しながら、０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳ中で膜を洗浄した。次いで洗浄済みの膜を一次抗体、すなわち０．０５％ツイーン２０および０．５％低脂肪粉乳を含有するＰＢＳ中に適度に希釈した（一般に腹水については１：１０，０００、ハイブリドーマ培養上清については１：４０）モノクローナル９Ｅ１０マウス抗−ｃ−ｍｙｃペプチド（前記参照）と共に、室温で緩和に撹拌しながら一夜インキュベートした。次いで室温で３回、それぞれ少なくとも５分間緩和に撹拌しながら、０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳ中で膜を洗浄した。次いで洗浄済みの膜を二次抗体、すなわち０．０５％ツイーン２０および０．５％低脂肪粉乳を含有するＰＢＳ中に適度に希釈した（一般に１：１０，０００）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識−抗マウスＩｇＧ（一般にヤギにおいて産生されたもの、たとえばＡ４４１６、シグマから）と共に、室温で緩和に撹拌しながら少なくとも３時間インキュベートした。次いで室温で３回、それぞれ少なくとも１０分間緩和に撹拌しながら、０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳ中で膜を洗浄した。次いで膜をアマシャムＥＣＬ（商標）ウェスタン検出キット法で処理し、そしてアマシャム、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、商標）ＥＣＬにまず３０秒間、次いで発現タンパク質バンドの鮮明な像を得るのに適した時間、露光した。膜上のペルオキシダーゼ標識タンパク質の検出に関して同様な感度をもつ他の方法を用いてもよい。ｐＩＣＩ１７１２中へクローン化した標識ＨＣＰＢが大腸菌株ＭＳＤ２１３およびＭＳＤ５２５中において良好に発現することは、クーマシー染色ゲルがベクター（ｐＩＣＩ２６６）のみのクローンと比較して約３５，０００ダルトンに強い追加のタンパク質バンドを示したこと、およびｃ−ｍｙｃペプチド標識のウェスタン分析検出によって同じサイズのバンドが強いシグナルを示したことにより証明された。参考例１６大腸菌からの成熟ＨＣＰＢの発現成熟ＨＣＰＢを大腸菌にクローニングし、発現させる方法は、参考例１５に記載した方法ときわめて類似していた。この場合もｐＩＣＩ２６６をクローニングベクターとして用いたが、この場合は成熟ＨＣＰＢ遺伝子を得るためのＰＣＲの出発物質は、発現ベクター中の標識遺伝子であるプラスミドｐＩＣＩ１７１２であった。２２６４および２２６５として知られる２種類のオリゴヌクレオチド（配列番号：６５および６６）を（プライマーＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１の代わりに）、参考例１５と同様な条件でＰＣＲ反応に使用した。ただしｐＩＣＩ１７１２ＤＮＡをｐＩＣＩ６９８の代わりに用いた。第１の先頭鎖であるオリゴヌクレオチド２２６４は、ｐＩＣＩ１７１２においてプライミングし、ＰｅｌＢリーダー配列中にＮｃｏＩ制限酵素部位を含み、かつ挿入した成熟ＨＣＰＢ遺伝子の起点に続くように設計された（ＤＮＡ塩基３６〜６６、配列番号：６４に含まれる）。第２の末尾鎖であるオリゴヌクレオチド２２６５は、成熟ＨＣＰＢ遺伝子の終点において（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識配列（ＤＮＡ塩基９６５〜９８７に対して相補的、配列番号：６４に含まれる）の起点の前でプライミングし、この遺伝子の終点に翻訳終止コドン（ＴＡＡＴＡＡに対して相補的）を導入し、続いてＥｃｏＲＩ制限酵素部位（ＧＡＡＴＴＣ）およびフィルイン塩基を導入するように設計された。このオリゴは成熟遺伝子配列を単離するためのＰＣＲに際して、遺伝子中へプライムバックされる。ＰＣＲ生成物の一定部分を適正なサイズのＤＮＡ（約９７０塩基対）につきアガロースゲル電気泳動により分析し、主として適正なサイズのバンドを含むことが認められた。この反応混合物の残りの生成物を参考例１５と同様な方法で精製した。単離したＤＮＡを酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、適正なサイズのバンド（約９４０塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。参考例１５と同様な方法で調製したｐＩＣＩ２６６二本鎖ＤＮＡをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で、完全に消化するように十分に注意をはらって制限消化した。適正なサイズのＤＮＡ（約５６００塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。制限消化しかつ精製したＤＮＡ試料の一定部分につき、アガロースゲル電気泳動により既知の標準品と比較して純度および濃度推定値を調べた。これらの推定値から、ＨＣＰＢ遺伝子をｐＩＣＩ２６６ベクター中へクローニングするための連結反応混合物を参考例１５と同様な方法で調製した。連結反応後に、このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、参考例１５と同様な方法でコロニーを採取し、ハイブリダイゼーションにより試験した。次いで６クローンをプラスミドＤＮＡ調製用に採取し、次いで参考例１５と同様な方法でＰＣＲ生成物の領域にわたって配列決定した。これらのクローンは、１５０４、１８０２、６７９、１２８０、６７７および１７３１（配列番号：６０、６３、５１、５３、５２および６２）として知られる６つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定された。この配列決定の結果から、目的とする成熟ＨＣＰＢ遺伝子配列をもつプラスミドを含むクローンを選択した。これはｐＩＣＩ１７３６として知られる。確認されたクローン化遺伝子の、アミノ酸翻訳を示す配列を、ＰｅｌＢ配列の起点からＥｃｏＲＩ制限部位まで、配列番号：６７として示す。ＤＮＡの番号つけはＰｅｌＢの第１コドンにおける１から開始し、ペプチドの番号つけは成熟ＨＣＰＢにおける１から開始する。成熟ＨＣＰＢを調節発現させるために、ｐＩＣＩ１７３６プラスミドＤＮＡを参考例１５と同様な方法で、塩化カルシウム形質転換したコンピテント大腸菌発現株中へ形質転換した。クローン化ＨＣＰＢ遺伝子の発現を調べるために、ｐＩＣＩ１７３６形質転換発現菌株すべてを参考例１５と同様な方法で処理した。ただしこの場合は成熟ＨＣＰＢがＣ−末端標識をもたないので、ウェスタン分析にｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０モノクローナル抗体を用いることはできない。したがって一次抗体はウサギにおいて産生された抗−ウシカルボキシペプチダーゼＡ（バイオジェネシスから）であり、これは精製ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢと交叉反応することが予め示された。二次抗体は、ヤギにおいて産生された、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗−ウサギＩｇＧ抗体であった（シグマＡ９１６９またはこれに類するもの）。ｐＩＣＩ２６６中にクローニングした成熟ＨＣＰＢ（ｐＩＣＩ１７３６）の発現は、大腸菌ＭＳＤ２１３およびＭＳＤ５２５株において、クーマシー染色ゲルがベクター（ｐＩＣＩ２６６）のみのクローンと比較して約３４，０００ダルトンに追加のタンパク質バンドを示すことにより証明された。同じサイズのバンドが、抗−ウシカルボキシペプチダーゼＡを用いるウェスタン分析検出によりシグナルを示した。参考例１７ＣＯＳ細胞からの成熟ＨＣＰＢの発現ｐｒｅＨＣＰＢをコードする遺伝子を、ｐＩＣＩ６９８からＰＣＲにより形成した（参考例１４）。鋳型ｐＩＣＩ６８９（１０μｇ）、ならびに配列番号：３４および配列番号：３５のオリゴ（それぞれ１００ｐＭｏｌ）を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各０．１２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに２．５ｕのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アンプリタク、パーキン−エルマー・シータス）を含有する緩衝液（１００μｌ）中に用いて、ＰＣＲを設定した。反応物に鉱油（１００μｌ）を乗せ、９４℃で１分間、５３℃で１分間、および７２℃ で２．５分間の２５サイクル、ならびに７２℃で１０分間、インキュベートした。９８５ｂｐのＰＣＲ生成物を１％アガロース（アガロース、タイプＩ、シグマＡ−６０１３）ゲル上での電気泳動により分離し、次いでこのバンドをゲルから切り取り、ジェネクリーン(商標)(ジェネクリーンＩＩキット、ストラテク・サイエンティフィック社、またはバイオ１０１社)によりＤＮＡフラグメントを単離した。ジェネクリーンキットは下記のものを含む：１）６Ｍヨウ化ナトリウム；２）塩化ナトリウム／エタノール／水による洗浄を行うための、塩化ナトリウム、トリスおよびＥＤＴＡの濃厚溶液；３）ガラスミルク（Ｇｌａｓｓｍｉｌｋ、商標）−特別に配合された水中シリカマトリックス懸濁液１．２５ｍｌを入れた１．５ｍｌのバイアル。これはＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ（１９７９）Ｖｏｌ．７６，ｐ６１５に発表されたＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＧｉｌｌｅｓｐｉｅの方法に基づくＤＮＡ精製法である。あるいは“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ”第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８９）に記載されたいずれの方法も採用できる。要約すると、ジェネクリーン法は下記のとおりである。１容量のゲル切片に、キットのヨウ化ナトリウム溶液３容量を添加する。この配合物を５５℃に１０分間加熱することによりアガロースを溶融し、次いでガラスミルク（５〜１０μｌ）を添加し、十分に混合し、周囲温度に１０分間放置する。ガラスミルクを遠心沈殿させ、キットのニューウォッシュ（ＮＥＷＷＡＳＨ）（５００μｌ）で３回洗浄する。洗浄用緩衝液をガラスミルクから除去し、ガラスミルクを風乾する。乾燥したガラスミルクを水（５〜１０μｌ）と共に５５℃で５〜１０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離する。溶出したＤＮＡを含有する水性上清を遠心分離により回収する。溶離工程を繰り返し、上清を保存できる。ｐｒｅＨＣＰＢ遺伝子を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％トリトンＸ−１００、および各２５ｕのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ（ニュー・イングランド・バイオラボズ）を含有する反応液１００μｌ中で３７℃において１時間、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。消化したフラグメントを、前記に切断していないフラグメントにつき述べたようにアガロースゲル電気泳動およびジェネクリーンにより精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）（ストラタジーン・クローニング・システムズ）中へクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ＤＮＡ（５μｇ）を上記の反応液１００μｌ中において、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（各２５ｕ）で、完全に消化した。消化したプラスミドに、次いでウシ腸アルカリホスファターゼ（１μｌ；ニュー・イングランド・バイオラボズ、１０ｕ／μｌ）を添加して５′リン酸基を除去し、３７℃でさらに３０分間、インキュベーションを続けた。７０℃で１０分間のインキュベーションによりホスファターゼ活性を分解した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断したプラスミドを上記に従ってアガロースゲルから精製した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐｒｅＨＣＰＢ遺伝子（５０ｎｇ）と上記の切断プラスミドＤＮＡを、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、および４００ｕＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボズ社）を含有する溶液２０μｌ中で２５℃において４時間、連結反応させた。この反応液１μｌを、２０μｌのコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞（ＭＡＸ効率ＤＨ５αコンピテント細胞、ライフ・テクノロジーズ社）の形質転換に、この細胞に添付されたプロトコールにより使用した。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬ−寒天上で平板培養した。潜在的ｐｒｅＨＣＰＢクローンをＰＣＲにより同定した。各クローンをｐｒｅＨＣＰＢ遺伝子の精製につき上記に述べたと同様にＰＣＲ処理し、ただし細胞を含む配合物を２５サイクルのＰＣＲ前に９４℃で（高温開始法）５分間インキュベートし、かつオリゴ配列番号：３４および３５の代わりにオリゴ配列番号：３６および３７を用いた。ＰＣＲ反応の試料（１０μｌ）を１％アガロースゲル上での電気泳動により分析した。ｐｒｅＨＣＰＢ遺伝子を含むクローンは、１．２ｋｂのＰＣＲ生成物が存在することにより確認された。１．２ｋｂを産生するクローンを大規模なプラスミドＤＮＡ調製に用い、挿入配列の配列をＤＮＡ配列分析により確認した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）中にｐｒｅＨＣＰＢ遺伝子を含むプラスミドをｐＭＥ１５と命名した。真核細胞中でＨＣＰＢを発現しうるベクターを形成するために、ＧＳ系（ＧＳ −ｓｙｓｔｅｍ、商標）（セルテク・バイオロジックス）を用いた（国際特許出願公開第ＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号、第ＷＯ８６／０５８０７号、ＷＯ８９／１０４０４号）。この方法では、ｐｒｅＨＣＰＢ遺伝子をベクターｐＥＥ１２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ領域へクローニングする必要がある［このベクターはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，１６９−１７５に記載されたｐＳＶ２．ＧＳに類似し、ｐＳＶ２．ＧＳ中に当初存在していた多数の制限部位が、多重リンカー領域にユニーク部位を得るために部位特異的突然変異により除去されている］。この発現ベクターを構築するために、プラスミドｐＥＥ１２およびｐＭＦ１５を上記に従ってＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。各消化物から適切なベクター（ｐＥＥ１２から）および挿入配列（ｐＭＦ１５から）を１％アガロースゲルより単離し、互いに連結反応させてコンピテントＤＨ５α細胞の形質転換に用いた。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬ−寒天上で形質転換細胞を平板培養した。ＣＭＶプロモーター内（配列番号：３８）およびＨＣＰＢ遺伝子内（配列番号：３９）にプライミングするオリゴを用いて、上記に従ってコロニーをＰＣＲによりスクリーニングした。１．３６５ｋｂのＰＣＲ生成物を産生するクローンを大規模なプラスミドＤＮＡ調製に用い、挿入配列の配列をＤＮＡ配列分析により確認した。ｐＥＥ１２中にｐｒｅＨＣＰＢ配列を含むプラスミドをｐＭＥ４８と命名した。ｐｒｅｐｒｏＨＣＰＢのｐｒｅｐｒｏ配列を含む第２の真核発現プラスミドｐＥＥ１２を上記に従って形成した。ｐｒｅｐｒｏ配列の遺伝子をｐＭＥ１８から単離するために、最初のＰＣＲに配列番号：４０および４１のオリゴを用いた（参考例１９に記載）。この場合、配合物をまずＴａｑＤＮＡポリメラーゼなしに９４℃で５分間インキュベートすることによる高温開始法でＰＣＲを行った。次いでＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５ｕ）を添加し、前記に従ってＰＣＲを２５サイクル続けた。３６０ｂｐのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へクローニングしてｐＭＥ６６を得たのち、ｐＥＥ１２中へクローニングして（配列番号：４０および４１を用いるＰＣＲによりスクリーニング）ｐＭＥ６７を得た。真核細胞中で発現させるために、ｐｒｅＨＣＰＢを発現しうる遺伝子を含むベクターおよびｐｒｅｐｒｏ配列を含むベクターをＣＯＳ−７細胞中に同時トランスフェクションした。ＣＯＳ細胞は起点欠損性ＳＶ４０ウイルスで形質転換したアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ−１であり、ＳＶ４０複製起点を含む環状プラスミドをきわめて高いコピー数で複製しうるので、多様なタンパク質を一次的に短期間発現させるために広く利用されている。２種類の広く利用できるＣＯＳ細胞クローン、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７がある。ＣＯＳ細胞をトランスフェクションするための基本的方法はＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎのＭｅｔｈｏｄｓ：ＡＣｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９１）２，ｐ．１４１に記載されている。ＨＣＰＢを発現させるために、プラスミドベクターｐＭＦ４８およびｐＭＦ６７（各４μｇ）を用いて６ウェル培養プレート内で、熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）２ｍｌ中において、ポリヌクレオチドのリポフェクション−カチオン脂質仲介運搬法として知られる方法［Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡＣｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６７−７５］で、ＣＯＳ−７細胞（２Ｘ１０ｅ５）をトランスフェクションした。細胞を３７℃でＣＯ₂インキュベーター内において２０時間インキュベートした。無血清培地（２００μｌ：ＯＰＴＩ− ＨＥＭ低血清培地；ギブコＢＲＬ、カタログＮｏ．３１９８５）中のプラスミドＤＮＡ配合物をリポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）試薬（１２μｌ；ギブコＢＲＬ、カタログＮｏ．１８２９２−０１１）と緩和に混合し、周囲温度で１５分間インキュベートした。細胞を無血清培地（２ｍｌ；ＯＰＴＩ−ＨＥＭ）で洗浄した。無血清培地（６００μｌ；０ＰＴＩ−ＨＥＭ）をＤＮＡ／リポフェクチンに添加し、この配合物を細胞に乗せ、３７℃でＣＯ₂インキュベーター内において６時間インキュベートした。ＤＮＡを含有する培地を、１０％ＦＣＳを含有する普通のＤＭＥＭと交換し、上記と同様に細胞を７２時間インキュベートした。参考例１１の記載に従って細胞上清（２５０μｌ）を、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇに対するＨＣＰＢ活性につき分析した（５時間のアッセイ）。リポフェクチン試薬を用い、ただしプラスミドＤＮＡを用いずに処理したＣＯＳ細胞上清は基質の１．２％を加水分解したのに対し、ｐｒｅＨＣＰＢおよびｐｒｅｐｒｏ配列を発現するプラスミドの混合物でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上清はＨｉｐｐ−Ａｒｇ基質の６１％を加水分解した。ｐｒｅＨＣＰＢプラスミドのみでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は、リポフェクチン試薬のみで処理したＣＯＳ細胞にみられた量のＨｉｐｐ−Ａｒｇを加水分解した。リポフェクチン試薬は、メンブラン濾過した水中のカチオン性脂質Ｎ−［１− （２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム配合物である。それはＤＮＡと自然に結合して脂質−ＤＮＡ複合体を形成する−Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４，７４３１参照。参考例１８大腸菌からのｐｒｏＨＣＰＢの発現ｐｒｏＨＣＰＢを大腸菌にクローニングして発現させる方法は、参考例１５に記載した方法ときわめて類似していた。この場合もｐＩＣＩ２６６をクローニングベクターとして用い、ｐｒｏＨＣＰＢ遺伝子のＰＣＲの出発物質はプラスミドｐＩＣＩ１６９８であった（参考例１４の記載と同様）。２３１０および２２６５として知られる２種類のオリゴヌクレオチド（配列番号：６８および６６）を参考例１５と同様な条件でＰＣＲ反応に用いた（プライマーＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１の代わりに）。第１の先頭鎖であるオリゴヌクレオチド２３１０は、ｐＩＣＩ１６９８においてプライミングし、ＰｅｌＢリーダー配列（ＤＮＡ塩基５１〜６６、配列番号：６４に含まれる）から挿入ｐｒｏＨＣＰＢ遺伝子（ＤＮＡ塩基４０〜５７、配列番号：５６に含まれる）の起点までのＮｃｏＩ制限酵素部位を付加するように設計された。第２の末尾鎖であるオリゴヌクレオチド２２６５は、成熟ＨＣＰＢ遺伝子の終点において（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識配列（ＤＮＡ塩基９６５〜９８７に対して相補的、配列番号：６４に含まれる）の起点の前でプライミングし、この遺伝子の終点に翻訳終止コドン（ＴＡＡＴＡＡに対して相補的）を導入し、続いてＥｃｏＲＩ制限酵素部位（ＧＡＡＴＴＣ）およびフィルイン塩基を導入するように設計された。このオリゴは成熟遺伝子配列を単離するためのＰＣＲに際して、遺伝子中へプライムバックされる。ＰＣＲ生成物の一定部分を適正なサイズのＤＮＡ（約１２４０塩基対）につきアガロースゲル電気泳動により分析し、主として適正なサイズのバンドを含むことが認められた。この反応混合物の残りの生成物を参考例１５と同様な方法で精製した。単離したＤＮＡを酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、適正なサイズのバンド（約１２１０塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。参考例１５と同様な方法で調製したｐＩＣＩ２６６二本鎖ＤＮＡをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で、完全に消化するように十分に注意をはらって制限消化した。適正なサイズのＤＮＡ（約５６００塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。制限消化しかつ精製したＤＮＡ試料の一定部分につき、アガロースゲル電気泳動により既知の標準品と比較して純度および濃度推定値を調べた。これらの推定値から、ｐｒｏＨＣＰＢ遺伝子をｐＩＣＩ２６６ベクター中へクローニングするための連結反応混合物を参考例１５と同様な方法で調製した。連結反応後に、このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、参考例１５と同様な方法でコロニーを採取し、ハイブリダイゼーションにより試験した。陽性ハイブリダイゼーション単離体４つを、適正なサイズの挿入配列につきプライマー２３１０および２２６５（配列番号：６８および６６）を用いて、またプライミングにつき一対の内部プライマー１２７９（配列番号：５４）および６７９（配列番号：５１）を用いて、参考例１５と同様な方法でＰＣＲにより調べた。このＰＣＲ生成物を、適正なサイズのＤＮＡ（プライマー２３１０および２２６５由来の約１２００塩基対、ならびにプライマー１２７９および６７９由来の約５８０塩基対）につきアガロースゲル電気泳動により分析した。すべてのクローンが適正なサイズのＰＣＲＤＮＡ生成物を与えた。次いで６クローンをプラスミドＤＮＡ調製用に採取し、次いで参考例１５と同様な方法でＰＣＲ生成物の領域にわたって配列決定した。これらのクローンは、１５０４、１８０２、６７９、１２８１、１５９０および１５９２（配列番号：６０、６３、５１、５５、６９および７０）として知られる６つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定された。この配列決定の結果から、目的とするｐｒｏＨＣＰＢ遺伝子配列をもつプラスミドを含むクローンを選択した。これはｐＩＣＩ１７３８として知られる。確認されたｐＩＣＩ１７３８中のクローン化ｐｒｏＨＣＰＢ遺伝子の、アミノ酸翻訳を示す配列を、ＰｅｌＢ配列の起点からＥｃｏＲＩ制限部位まで、配列番号：７１として示す。ＤＮＡの番号つけはＰｅｌＢの第１コドンにおける１から開始し、ペプチドの番号つけは成熟ＨＣＰＢにおける１から開始する。ｐｒｏＨＣＰＢを調節発現させるために、ｐＩＣＩ１７３８プラスミドＤＮＡを参考例１５と同様な方法で、塩化カルシウム形質転換したコンピテント大腸菌発現株中へ形質転換した。クローン化ＨＣＰＢ遺伝子の発現を調べるために、ｐＩＣＩ１７３８形質転換発現菌株すべてを参考例１５と同様な方法で処理した。ただしこの場合はｐｒｏＨＣＰＢがＣ−末端標識をもたないので、ウェスタン分析にｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０モノクローナル抗体を用いることはできない。したがって一次抗体はウサギにおいて産生された抗−ウシカルボキシペプチダーゼＡ（バイオジェネシスから）であり、これは精製ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢと交叉反応することが予め示された。二次抗体は、ヤギにおいて産生された、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗−ウサギＩｇＧ抗体であった（シグマＡ０５４５またはこれに類するもの）。ｐＩＣＩ２６６中にクローニングしたｐｒｏＨＣＰＢ（ｐＩＣＩ１７３８）の発現は、大腸菌から、クーマシー染色ゲルがベクター（ｐＩＣＩ２６６）のみのクローンおよび標識ＨＣＰＢ産生クローン（参考例１５）と比較して約４０，０００ダルトンに追加のタンパク質バンドを示すことにより証明された。同じサイズのバンドが、抗−ウシカルボキシペプチダーゼＡを用いるウェスタン分析検出によりシグナルを示した。参考例１９ＣＯＳ細胞からのｐｒｏＨＣＰＢの発現ｐｒｅｐｒｏＨＣＰＢに対する遺伝子を、参考例１７の記載の従ってＰＣＲにより、鋳型としてｐＩＣＩ１６８９ならびに配列番号：３４および４０のオリゴを用いて１２７０ｂｐのＰＣＲ生成物を得ることにより調製した。遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、まず参考例１７の記載に従ってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中へクローニングし（ｐＭＦ１８を得る）、次いでＤＨ５αのｐＥＥ１２中へクローニングした（ｐＭＦ４９を得る）。プラスミドｐＥＥ１２を参考例１７の記載に従ってリポフェクチン試薬によりＣＯＳ−７細胞中へトランスフェクションし、参考例１１の記載に従って細胞上清（２５０μｌ）を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ中のトリプシン（７００μｇ／ｍｌ）で４℃において１時間活性化したのち、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇに対するＨＣＰＢ活性につきアッセイした（５時間のアッセイ）。これらの条件下でＨｉｐｐ−Ａｒｇ基質の完全な加水分解が達成されたのに対し、リポフェクチン試薬のみで（プラスミドＤＮＡなし）処理したＣＯＳ細胞をトリプシンで活性化した場合にはＨｉｐｐ−Ａｒｇ基質の３０％が加水分解された。参考例２０天然ＨＣＰＢの精製天然酵素および種々の突然変異酵素を２経路で初期精製する系を決定した。まず好ましい経路を記載する。組換え酵素を含む組換え大腸菌細胞ペーストを−７０℃の保存場所から取り出し、融解させた。細胞ペーストの重量をｇで測定し、細胞ペーストの初期重量と等しい容量の緩衝液Ａ（２００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣｌ）、２０％スクロース（Ｃ₁₂Ｈ₂₂Ｏ₁₁）、ｐＨ８．０）の添加によりペーストを再懸濁した。細胞懸濁液を室温で２０分間、ときどき緩和に混合しながらインキュベートしたのち、等容量の蒸留水を添加し、十分に混入させた。細胞懸濁液を再び室温で２０分間、ときどき緩和に混合しながらインキュベートした。得られた粗製の浸透圧ショック生成物を４℃において９８０００ ×ｇで９０分間の遠心分離により澄明にしたのち、上清をデカントしてペレット状の不溶性画分と分離した。デオキシリボヌクレアーゼ１を上清に添加して、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌにした。この混合物を室温で連続的に振盪しながら、カルボキシペプチダーゼ阻害薬ＣＮＢｒ活性化したセファロースアフィニティカラムに装填するのに十分な程度に粘度が低下するまでインキュベートした。このカラムは指示に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシアから）およびジャガイモ塊茎由来のカルボキシペプチダーゼ阻害薬（ｃ−０２７９、シグマ）を用いて調製された。上清をｐＨ８．０に調整し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）で予め平衡化したアフィニティカラムに装填した。上清を装填したのち、流出液の吸光度が基準線に戻るまでカラムを洗浄し、次いで結合した物質をカラムから溶離用緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ１１．４）で溶離した。溶出画分を−２０℃で凍結し、一方では抗−ｃ−ｍｙｃ標識抗体（９Ｅ１０）、次いで抗−マウス−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（ａ−９０４４）（４−クロロナフトールおよび過酸化水素に暴露すると呈色反応を示した）を用いるウェスタンブロット分析により、組換えカルボキシペプチダーゼを含有するものを判定した。組換えカルボキシペプチダーゼＢを含有する画分をプールし、濃縮し、ｐＨをｐＨ７．５に調整したのち、急速冷凍し、−２０℃に保存した。所望によりイオン交換およびゲル透過クロマトグラフィーなど既知の方法で、プールした試料をさらに精製してもよい。第２経路は、好ましい経路で採用した細胞周辺ショックとは異なり、大腸菌細胞の完全溶解によるものである。組換え酵素を含む組換え大腸菌細胞ペーストを採取し、細胞溶解用緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５％スクロース、ｐＨ８．０）に再懸濁した。リゾチームを１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、同時にドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を添加した（懸濁液２５ｍｌ当たり、２５％溶液８０μｌ）。懸濁液を氷上でときどき振盪しながら３０分間インキュベートしたのち、デオキシリボヌクレアーゼ１を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、再び懸濁液を氷上でときどき振盪しながら３０分間インキュベートした。次いで懸濁液を２００ｍｌ容量ずつに分け、３０秒間のバースト間隔で３０秒間１０回のバーストにより音波処理して、細胞を完全に破壊した。音波処理した懸濁液を４℃において９８，０００×ｇで９０分間遠心分離したのち、ペレット状の不溶性画分から上清をデカントした。上清をｐＨ８．０に調整し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）で予め平衡化したアフィニティカラムに装填した。上清を装填したのち、流出液の吸光度が基準線に戻るまでカラムを洗浄し、次いで結合した物質をカラムから溶離用緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ１１．４）で溶離した。溶出画分を−２０℃で凍結し、一方では抗−ｃ−ｍｙｃ標識抗体（９Ｅ１０）、次いで抗−マウス−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（ａ−９０４４）（４ −クロロナフトールおよび過酸化水素に暴露すると呈色反応を示した）を用いるウェスタンブロット分析により、組換えカルボキシペプチダーゼを含有するものを判定した。組換えカルボキシペプチダーゼＢを含有する画分をプールし、濃縮し、ｐＨをｐＨ７．５に調整したのち、急速冷凍し、−２０℃に保存した。所望によりイオン交換およびゲル透過クロマトグラフィーなど既知の方法で、プールした試料をさらに精製してもよい。両経路でプールした材料の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色ニトロセルロースブロットにより分析すると、組換えカルボキシペプチダーゼＢの適正な分子量の位置にクーマシー染色バンドが得られた。エドマン分解法を用いる自動タンパク質／ペプチド配列決定装置により配列決定したこれらのバンドは、精製した上記の組換えカルボキシペプチダーゼＢと一致した。参考例２１ＣＯＳ細胞からのネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ＨＣＰＢ融合タンパク質の発現この例は、Ａ５Ｂ７ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡの調製、ＰＣＲによる特異的Ｆｄ鎖およびＬ鎖フラグメントの単離、これらのフラグメントの完全ＤＮＡ配列の決定、続いてＦｄ−ＨＣＰＢ融合遺伝子、ならびに真核細胞においてＬ鎖およびＦｄ−ＨＣＰＢ融合タンパク質の両方を発現しうる同時発現ベクターの調製、ならびにＨＣＰＢ由来のｐｒｅｐｒｏ配列との同時トランスフェクションによるＣＯＳ細胞からのＦ（ａｂ'）₂−ＨＣＰＢの発現につき記載する。参考例５に記載した操作を項目（ｅ）に関して繰り返す。ｆ）Ｆｄ−ＨＣＰＢ融合ＤＮＡ配列の調製Ｆｄ配列のＣ末端領域をコードする遺伝子−配列番号：２５のＮｃｏＩ部位（位置４９７）に由来−をＰＣＲによりＨＣＰＢ配列に結合させた。この操作で８アミノ酸リンカー配列（ＶＰＥＶＳＳＶＦ）に対するＤＮＡが導入された。プラスミドｐＡＦ１（参考例５に記載）を、参考例１７に従って配列番号：４２および４３のオリゴを用いてＰＣＲ（高温開始法）処理して、３３８ｂｐの生成物を得た。同様にｐＩＣＩ１６９８を、配列番号：４４および３４のオリゴを用いてＰＣＲ処理して、９９８ｂｐの生成物を得た。両生成物を参考例１７の記載に従ってアガロースゲル電気泳動およびジェネクリーン（商標）により単離し、２回目の高温開始ＰＣＲ−９４℃で１分間および６３℃で４分間の１０サイクル、続いて９４℃で２分間−に用いた（各０．２ｎｇ、全容量５０μｌ中）。フランキングオリゴ（配列番号：４２および３４；各１００ｐＭ）を、アンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）（２．５ｕ）を含む緩衝液５０μｌに添加した。９４℃に３分間加熱したのち、混合物を９４℃で１．５分間、５５℃で２分間および７２℃で２分間の２５サイクル、続いて７２℃で１０分間、処理した。生成物は１３３６ｂｐのバンドであり、これを前記に従って単離し、次いでＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＨ５α中のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）中へクローニングして（オリゴ配列番号：３６および３７を用いるＰＣＲによりクローンをスクリーニングした）、ｐＭＦ３５を得た。完全なＦｄ−ＨＣＰＢ融合配列を形成するために、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸(ｐＨ７．９)、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、ＥｃｏＲＩ（４０ｕ）およびＮｃｏＩ（２０ｕ）を含有する緩衝液（１００μｌ）中で２時間、プラスミドｐＡＦ１およびｐＭＦ３５（各１０μｇ）をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。ｐＡＦ１由来のベクターフラグメント（３．４ｋｂ）を単離し、参考例１７の記載に従ってウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、ｐＭＦ３５由来の精製１．２ｋｂフラグメントに連結反応させた。得られたベクターをＤＨ５α中へクローニングして（オリゴ配列番号：３６および３７を用いるＰＣＲにより、１，９２２ｂｐの挿入配列につきスクニーニングした）、ｐＭＦ３９と命名した。ｐＭＦ３９由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＤＨ５α中のｐＥＥ６［これはｐＥＥ６．ｈＣＭＶの誘導体である−ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｃｋｅｔｔ（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１７，７１１０− これにおいてはｈＣＭＶプロモーターの上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位がＢｇｌＩＩに変換されている］中へクローニングして(オリゴ配列番号：３８および３９を用いるＰＣＲにより、約２，２００ｂｐの挿入配列につきスクニーニングした) 、ｐＭＦ４３を得た。同時発現ベクターを形成するために、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．９) 、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、およびＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液（１００μｌ）中において、ｐＭＦ４３（１０μｇ）をＢｇｌＩＩ（２０ｕ）およびＳａｌＩ（４０ｕ）で切断し、前記に従って４３４８ｂｐのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離し、ジェネクリーン（商標）で精製した。同様にｐＡＦ６（参考例５のｅ）に記載）をＢａｍＨＩ（４０ｕ）およびＳａｌＩ（４０ｕ）で切断し、７．８ｋｂのベクターフラグメントを単離し、ｐＭＦ４３由来のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩフラグメントに連結反応させ、ＤＨ５α中へクローニングした。２組のオリゴ（配列番号：１８と４５、および配列番号：１７と３９）を用いるＰＣＲにより、コロニーをスクニーニングした。それぞれ３６０ｂｐおよび１．３ｋｂのＰＣＲ生成物を与えるクローンをＤＮＡ配列決定法により解明した。適正な配列を含むクローンをｐＭＦ５３と命名した−ＤＨ５α中のＬ鎖／Ｆｄ−ＨＣＰＢ同時発現ベクター。ｇ）ＣＯＳ細胞におけるＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−ＨＣＰＢの発現参考例１７に記載したｐｒｅｐｒｏ配列をコードするプラスミド（ｐＭＦ６７）でＣＯＳ−７細胞を同時トランスフェクションするための方法を、ｐＭＦ４８の代わりにｐＭＦ５３を用いて繰り返した。参考例１１および１７の記載に従ってＣＯＳ細胞上清をＨＣＰＢ活性につき調べた。リポフェクチン試薬を用い、ただしプラスミドＤＮＡを用いずに処理したＣＯＳ細胞上清は１．２％の基質を加水分解したのに対し、Ｌ鎖／Ｆｄ−ＨＣＰＢおよびｐｒｅｐｒｏ配列を発現するプラスミドの混合物でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上清はＨｉｐｐ−Ａｒｇ基質の３４％を加水分解した。ｐＭＦ５３プラスミドのみでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は、リポフェクチン試薬のみで処理したＣＯＳ細胞にみられた量のＨｉｐｐ−Ａｒｇを加水分解した。Ｆａｂ'−ＨＣＰＢおよびＦ（ａｂ'）₂ −（ＨＣＰＢ）₂に対応するそれぞれ８０ｋＤａおよび１６０ｋＤａのバンドが、ウェスタン分析（下記のｈ参照）によりみられた。ＣＥＡＥＬＩＳＡアッセイ（下記のｉおよびｊ参照）において、細胞上清（上記参照）を用いてｊに示したプロトコールに従ってＣＥＡ結合性物質の存在を検出した。ｈ）ウェスタンブロット分析下記に従ってウェスタンブロット分析を行った。各上清試料の一定部分（２０μｌ）を、還元剤を含有するか、または含有しない等容量の試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１０％スクロース、および０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合した。試料を６５℃で１０分間インキュベートしたのち、マルチフォア（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ、商標）ＩＩ装置（ＬＫＢプロダクターＡＢ）で製造業者の指示に従って、８〜１８％アクリルアミド濃度勾配ゲル（エクセル（Ｅｘｅｌ、商標）ゲル系、ファルマシア・バイオテクノロジー・プロダクツから）上で電気泳動した。電気泳動後に、分離したタンパク質をノバブロット（Ｎｏｖａｂｌｏｔ、商標）装置（ＬＫＢプロダクターＡＢ）で製造業者が添付するプロトコールに従って、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ、商標）Ｃ−スーパーメンブラン（アマシャム・インタナショナル）に移した。ブロッティングしたのち、メンブランを風乾した。抗体フラグメントの存在を、抗−ネズミＦ（ａｂ'）₂抗体−ペルオキシダーゼ結合体（ＩＣＮバイオメディカルズ、製品Ｎｏ．６７−４３０−１）により検出した。ネズミＡ５Ｂ７抗体フラグメントの存在を、ＥＣＬ（商標）検出系（アマシャム・インタナショナル）により添付のプロトコールに従って視覚化した。ｉ）ＥＬＩＳＡ分析ＥＬＩＳＡアッセイの標準法は、“ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．およびｖａｎＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｈ．監修，ｖｏｌ．１５，“酵素免疫アッセイの実際と理論”，Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，１９８５（エルゼビル・サイエンス・パブリッシャーズＢ．Ｖ．）に記載されている。他の情報源は、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ＡＬａｂｏｒｏｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ｐ．，１９８８（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版）である。ｊ）抗−ＣＥＡＥＬＩＳＡ１．コーティング用緩衝液（炭酸塩−炭酸水素塩緩衝剤１カプセル−シグマＣ −３０４１−１００ｍｌの２回蒸留水中）を調製する。２．必要な９６ウェルプレートそれぞれにつき、５μｌのＣＥＡ原液（１ｍｇ／ｍｌ、ダコ）を１０ｍｌのコーティング用緩衝液に添加する。３．１００μｌの希釈ＣＥＡを、ナンクの“マキシソープ（商標）”ミクロタイタープレートの各ウェルに添加する−５０ｎｇ／ウェル／１００μｌ。４．プレートを４℃で一夜（または室温で２時間）インキュベートする。５．プレートを５分間ずつ４回、リン酸緩衝塩類溶液＋０．０１％ナトリウムアジド（ＰＢＳＡ）＋０．０５％トゥイーン２０で洗浄する。６．プレート（たたいて乾燥そせたのち）を、ウェル当たり２００μｌのＰＢＳＡ（０．０５％トゥイーン２０を含有）中１％ＢＳＡ（シグマＡ−７８８８）でブロックする。室温で２時間インキュベートする。７．プレートを５分間ずつ４回、ＰＢＳＡ（０．０５％トゥイーン２０を含有）で洗浄する。８．試料（培養上清）および標準品（タンパク質分解性Ａ５Ｂ７Ｆ(ａｂ')₂ の２倍希釈液）を適宜装填する。試料を増殖培地（またはＰＢＳ）中に希釈する。ＰＢＳＡ＋１％ＢＳＡおよび希釈剤をブランクとして含める。９．周囲温度で３時間インキュベートする。１０．プレートを５分間ずつ６回、ＰＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０で洗浄する。１１．二次抗体溶液（抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ'）₂、ヤギ由来、ペルオキシダーゼ結合−ＩＣＮ６７−４３０−１；４０ｍｌのＰＢＳＡ＋１％ＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０中に２０μｌ）を調製し、ウェル当たり１００μｌを添加する。１２．周囲温度で１時間インキュベートする。１３．プレートを５分間ずつ６回、ＰＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０で洗浄する。１４．リン酸塩−クエン酸塩−過ホウ酸塩緩衝剤（シグマＰ−４９２２）１カプセルを２回蒸留水１００ｍｌに溶解することにより、現像液を調製する。緩衝液１００ｍｌ当たり３０ｍｇのｏ−フェニレンドアミン二塩酸塩（ＯＰＤ、シグマＰ−８２８７）を添加する。ウェル当たり１５０μｌを添加する。１５．室温で暗所において１５分間インキュベートする。１６．ウェル当たり５０μｌの２Ｍ硫酸の添加により反応を停止する。１７．プレート読取り装置でＯＤ４９０ｎｍを読み取る。実施例１ウシＬｙｓ６６Ｇｌｕ膵臓リボヌクレアーゼの調製（ａ）組換えサークルポリメラーゼ連鎖反応（ＲＣＰＣＲ）によるコドン６６置換（Ｌｙｓ→Ｇｌｕ）を含むＲＮアーゼ遺伝子配列の構築ウシ膵臓ＲＮアーゼをコードするｐｒｅ配列を含むプラスミド（ｐＱＲ１６２：ＮＣＩＭＢＮｏ．４０６７８、Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら，Ｇｅｎｅ（１９９２）１１８，２３９−２４５に記載）を、ＰＣＲインキュベーションに際して鋳型として用いた。ＰＣＲインキュベーション用のプライマーを、サイクロン（Ｃｙｃｌｏｎｅ、商標）ＤＮＡ合成装置（ミリゲン／ミリポア）でシアノエチルホスホルアミダイトを用いてホスファイト−トリエステル法により合成した。これらのプライマーは、ＰＣＲインキュベーションに用いた場合に得られる生成物が二本鎖線状ＤＮＡ分子であって、これらを組合わせ、変性および再アニーリングすると、最初の平滑末端生成物のほかに異なる一本鎖状の付着末端をもつ二本鎖ＤＮＡを形成する。これらの末端はアニーリングしてＤＮＡの組換えサークルを形成するであろう。次いでこれらの分子をコンピテント大腸菌細胞中へ形質転換することができる。２つのＰＣＲインキュベーション、すなわち一方はオリゴヌクレオチド配列番号：１および配列番号：２（図８のプライマーＡおよびＢ参照）を用いるもの、他方はオリゴヌクレオチド配列番号：３および配列番号：４（図８のプライマーＣおよびＤ参照）を用いるものを、９２℃で１．５分間、５５℃で１．５分間および７５℃で６分間の２５〜３０サイクル、最後に７５℃で１０分間、テクネＰＨＣ−１サーマルサイクラーにより行わせた。反応液は鋳型としてのｐＱＲ１６２（１０ｎｇ）、５０ｐｍｏｌ／プライマー、５μｌの１０×緩衝液１［２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１００ｍＭＫＣｌ、６０ｍＭ（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、１％トリトンＸ−１００、および１００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼ不含ＢＳＡ］、および２．５Ｕのｐｆｕポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の熱安定性ポリメラーゼ、ストラタジーン）を５０μｌ中に含有し、蒸発を防ぐためにこれに等容量のパラフィン油を乗せた。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルで分析した。各ＰＣＲインキュベーションにより生成したＤＮＡフラグメント（約３．１ｋｂ）をゲルから分離し、遠心分離により（スピン−Ｘ、商標、コスター）アガロースからＤＮＡを分離した。抽出したこれら２つのＤＮＡフラグメントをエタノールで沈殿させ、２０μｌの水に再懸濁した。それぞれからの一定部分（１０μｌ）を、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭＮａＣｌ、および１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡを含有する総容量５０μｌ中で結合させた。結合したＤＮＡフラグメントを９２℃で５分間変性させ、５５〜５７℃で２時間再アニーリングした。こうして形成された組換えサークルを一定部分のコンピテント細胞の形質転換に用いた。プラスミドを単離するためのｍｉｎｉ−ｐｒｅｐを行い［Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー］、ジデオキシ連鎖終結法［Ｓａｎｇｅｒら（１９７７），Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．．ＵＳＡ７４，５４６３−５４６７］により二本鎖ＤＮＡ配列決定の鋳型として用いた。取込み誤りのない変化したコード配列を含むプラスミドをｐＱＲ１７６と表示した。これを、２０ＵのＥｃｏＲＩおよび反応緩衝液を含有する全容量２０μｌ中で消化した。変化したコード配列を含むＤＮＡフラグメントを前記に従ってアガロースゲルから採取し、予め消化しかつ脱リン酸化したｐＫＫ２２３．３［ファルマシア・バイオテク；このベクターはｔａｃプロモーターを含み、ｌａｃリプレッサーにより調節され、かつイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導される；ＢｒｏｓｉｕｓおよびＨｏｌｙ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，６９２９］と、２０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼおよび反応緩衝液を含有する総容量２０μｌ中で連結反応させた。この連結反応生成物を用いて一定部分の大腸菌コンピテント細胞を形質転換した。種々の組換えコロニーから得たプラスミドの制限酵素分析を行って、挿入配列のサイズおよびｔａｃプロモーターに対する配向を確認した。適正な構築体をｐＱＲ１７７と命名した（図１）。（ｂ）Ｌｙｓ６６Ｇｌｕウシ膵臓ＲＮアーゼの調製および精製工学的に形成した配列を調製および精製する方法は、大腸菌においてウシ膵臓リボヌクレアーゼＡを発現させるために開発されたプロトコールに従う（Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら，Ｇｅｎｅ，１９９２）。この系は、リボヌクレアーゼまたはその工学的突然変異体の産生を大腸菌の細胞周囲へ向かわせるウシ膵臓リボヌクレアーゼの天然シグナル配列を利用する。細胞周囲の酸化的環境がタンパク質の適正な折りたたみを促進し、完全に活性な組換えＲＮアーゼを発現させる。組換え体、すなわち工学的突然変異体の正味正電荷が高いため、内因性の細胞周囲タンパク質から迅速に精製できる。突然変異タンパク質を発現させ、続いて均質になるまで精製するのに要するのは、培地への接種から４８時間である。プラスミドｐＱＲ１７７は２つのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。一方はベクターのｔａｃプロモーターにより供給され、他方は第２シストロンの翻訳のために第１シストロンのコード配列内に含まれる。ｐＱＲ１７７を保有する大腸菌細胞のＩＰＴＧ誘導に際して形成されるｍＲＮＡは２シストロン型であり、ｔａｃプロモーターから開始する。第１シストロンは６−ａａペプチド（Ｍｅｔ −Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）をコードする。第１シストロンの終止コドンおよび第２シストロンの開始コドンは、リボソームがｍＲＮＡの翻訳を継続し、ＲＮアーゼを産生するようにオーバーラップしている。合成された前駆体形のＲＮアーゼは細胞周囲へ移動し、Ｎ末端配列決定によればシグナル配列が適正に開裂することが示された。完全に活性な酵素が回収されたことにより証明されるように、細胞周囲の酸化的環境がＲＮアーゼを適正に折りたたみ、天然酵素を形成するのを可能にする。大腸菌［ｐＱＲ１７７］細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する培地５リットル中で、２８℃において８時間増殖させた。細胞が対数増殖期に達したとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、細胞の増殖を２８℃で振盪しながら一夜続けた。細胞周囲タンパク質の放出を、変更スフェロプラスト／浸透圧ショック法により行った。一夜培養物（５リットル）で得た細胞を、１０℃において８３００×ｇで１０分間遠心分離することによりペレット化した。この細胞ペレットを６０ｍｌの２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／２０％（ｗ／ｖ）スクロース（ＲＮアーゼ不含）／１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡに再懸濁した。この懸濁液を室温に３０分間放置した。浸透圧ショックは、等容量の無菌水を添加して十分に混合することにより得られた。混合物を室温にさらに３０分間放置した。スフェロプラストを１０℃において１０００００×ｇ（平均）で９０分間遠心分離することによりペレット化した。カチオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−セファロース（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、商標）ＦＦ）を用いて、正に帯電したすべてのタンパク質を細胞周囲抽出液から得た。緩衝液Ａは５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．５）であり、緩衝液Ｂは５０ｍＭＭＥＳ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ６．５）であった。正に帯電したタンパク質のプールから、カチオン交換クロマトグラフィー（モノ−Ｓ（Ｍｏｎｏ−Ｓ、商標）、ファルマシア−ＬＫＢ）により１７．５ｍＭＮａＣｌ／分の濃度勾配で組換えＲＮアーゼを精製した。この方法の組合わせでタンパク質が均質に精製されたことが、ＰＡＧＥ−ＳＤＳ電気泳動および銀染色による組換えＲＮアーゼ純度評価により示される（図２参照）。シチジル−３′，５′−アデノシン（ＣｐＡ）およびシチジン−２′，３′−サイクリックモノホスフェート（Ｃ＞ｐ）の加水分解に対する組換え酵素のＲＮアーゼ活性を推定したところ、市販の酵素の活性と等しい特異的活性が示された（表参照）。ＯＤ２７８を測定することにより（ＯＤ２７８ｎｍ＝０．７１は１ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼに等しい）、タンパク質濃度を推定した。２８６ｎｍにおける経時的な吸光の増大を監視することにより（Ｃ＞ｐの加水分解）、反応速度測定を行った［ＷｉｔｚｅｌおよびＢａｒｎａｒｄ（１９６２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７，２９５−２９９］。初速度および基質濃度値を用いて、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（１９６１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８０，３２４−３３２に記載された分析法に基づく計算法により、パラメータ−Ｋ_mおよびｋ_catならびにそれらの標準誤差を判定した。異なるリボヌクレアーゼを用いて得たこれらのパラメーター間の差を、スチューデントｔ−試験により評価した。Ｃ＞ｐの加水分解速度は室温で、光路長さ０．１ｃｍのキュベット（ヘルマ）内で総容量２５０μｌにおいて測定された。反応液は０．１Ｍ（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ」プロパン）、ｐＨ７．０、５０ｍＭＮａＣｌ（Ｉ＝０．１）中に種々の濃度のＣ＞ｐを含有し、酵素の添加により反応が開始された（表参照）。このデータは工学的に形成したＬｙｓ６６ＧｌｕＲＮアーゼ酵素の反応速度論的特性が市販のウシ酵素のものと有意には異ならないことを示す。実施例２Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６Ｇｌｕヒト膵臓リボヌクレアーゼの調製プラスミドｐＡＴＦ３（参考例２に記載）はＡｒｇ４Ａｌａ,Ｌｙｓ６ＡｌａＨＰ−ＲＮアーゼ遺伝子を含み、プライマー配列番号：１５および１６（各５ｐｍｏｌ）、ヌクレオチド（０．２ｍＭ）、ＰＣＲ緩衝液、および２．５単位のｐｆｕポリメラーゼを含有するＰＣＲインキュベーション液中に鋳型（２ｎｇ）として用いられた。９２℃で３０サイクルの初期変性の５分後に、変性（９２℃ 、１分間）、アニーリング（５５℃、１分間）、および延長（７５℃、１分間）を行った。ＰＣＲフラグメントを実施例１の記載に従ってゲル抽出し、ＥｃｏＲＩ（１０〜１５単位）で３７℃において１時間消化した。酵素を熱不活性化したのち、ＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩ消化および脱リン酸化したｐＵＣ１８中へ連結反応させた。得られたプラスミドをｐＡＴＦＺ１と命名した。プラスミドｐＡＴＦＺ１を用いて、突然変異ＨＰ−ＲＮアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を確認した。Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼを形成するために、ｐＡＴＦＺ１を実施例１の記載に従ってＲＣＰＣＲインキュベーションに際して鋳型として用い、ただし配列番号：１〜４の代わりにそれぞれ配列番号：３０〜３３のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。得られたプラスミドをｐＡＴＦＺ３と呼んだ。Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼの遺伝子を、発現試験のためにｐＡＴＦＺ３からＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ（各１０〜１５単位）で消化することにより切り取り、予め消化し（ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ）かつ脱リン酸化したｐＩＣＩ２６６（ＮＣＩＭＢ４０５８９）に連結反応させた。連結反応、発現および精製を実施例１に記載した例に従って行い、ただしＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩの二重消化により上記ｐＡＴＦＺ３から上記フラグメントを切り取り、予め脱リン酸化しかつ消化した（ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで）ｐＩＣＩ２６６に連結反応させ、１％アラビノースで（ＩＰＴＧの代わりに）誘導した。得られた構築体をｐＡＴＦＺ４４と呼んだ（図５参照）。この突然変異酵素の発現および精製は実施例１の記載と同様であったが、ＩＰＴＧの代わりに１％アラビノースで誘導した。実施例３リン酸水素Ｏ−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（２−アミノアセトアミドメチル）−５−（２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン −１−イル）−４−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロフラン−３−イル］Ｏ−［４−（ビス［２−クロロエチル］アミノ）フェノキシ］（図７に最終生成物として示す）化合物４（図７；３１ｍｇ，０．０３４ｍＭ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の０．０１ＭＨＣｌに溶解し、炭素上３０％パラジウム触媒（６０ｍｇ）をジメチルホルムアミド中の懸濁液として添加した。この混合物を水素雰囲気下で２時間４５分撹拌した。セライト（商標）で濾過したのち、濾液を３０℃より低い温度で蒸発乾固させた。粗生成物を乾燥ジクロロメタンに懸濁し、混合物を遠心分離した。上清のジクロロメタン層を廃棄した。この操作を繰り返し、最後に固体残渣を乾燥させて、目的生成物９．４ｍｇ（化合物５、図７）を得た。ＮＭＲデータ DMSO d6,d4 酢酸化合物４は下記の方法で製造された。２′−Ｏ−ベンジル−５′−ブロモ−５′−デオキシウリジン（化合物１、図７）２′−Ｏ−ベンジルウリジン［Ｗａｇｎｅｒら（１９７４），Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ，３９，２４−３０］（３３４ｍｇ，１ｍＭ）、四臭化炭素（５００ｍｇ）およびＤＭＦ（４ｍｌ）の混合物に、２０℃でアルゴン下に５分間かけて、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（３４０ｍｇ）溶液を添加した。混合物を２０℃で２時間撹拌し、水（６０ｍｌ）に注入し、酢酸エチルで２回抽出した。有機抽出液を合わせて水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させて油を得た。この油を２０ｇのメルクシリカゲル（Ａｒｔ．９３８５）上でクロマトグラフィー処理した。トルエン中の５％メタノールで溶離して、２′−Ｏ−ベンジル−５′−ブロモ−５′−デオキシウリジン（１６０ｍｇ，４０％）を得た。５′−アジド−２′−Ｏ−ベンジル−５′−デオキシウリジン（化合物２、図７）２′−Ｏ−ベンジル−５′−ブロモ−５′−デオキシウリジン（４．３ｇ）をＤＭＦ（８６ｍｌ）に溶解し、ナトリウムアジド（７ｇ）を添加した。混合物を６０℃で４５分間、加熱撹拌した。冷却し、未反応のナトリウムアジドからデカントしたのち、ＤＭＦを蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、水で２回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をメルクシリカゲル（Ａｒｔ．９３８５）上でクロマトグラフィー処理した。トルエン中の１０％メタノールで溶離して、１．５ｇの純粋な５′−アジド−２′−Ｏ−ベンジル−５′−デオキシウリジンを得た。２′−Ｏ−ベンジル−５′−カルボベンゾキシグリシルアミノ−５′−デオキシウリジン（化合物３、図７）５′−アジド−２′−Ｏ−ベンジル−５′−デオキシウリジン（１．５ｇ）、テトラヒドロフラン（２５ｍｌ）およびベンジルオキシカルボニルグリシンＮ− ヒドロキシスクシニルエステル（１．３ｇ）の混合物に、炭素上１０％白金（水で５０％加湿）（１．５ｇ）を添加した。この混合物を水素雰囲気下で４時間撹拌した。セライト（商標）で濾過したのち、濾液を蒸発乾固させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、５％クエン酸溶液（２回）、水、炭酸水素ナトリウム溶液（２回）で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を１：１エーテル／酢酸エチルで摩砕処理して、固体（９６０ｍｇ）（４２％）を得た。化合物４の製造（図７）ａ）ベンジルオキシジクロロホスフィン［Ｓｃｏｔｔら（１９９０），Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ，５５，４９０４−４９１１］（１３５ｍｇ，０．６４ｍＭ）を乾燥ジクロロメタン（４．０ｍｌ）に溶解し、この溶液を−２０℃に冷却し、乾燥ジクロロメタン（２．０ｍｌ）に溶解したジイソプロピルアミン（０．０９１ｍｌ，０．６４ｍＭ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｍｌ，０．６４ｍＭ）の混合物を添加した。溶液を−２０℃で４５分間撹拌し、次いで３０分かけて室温にまで昇温させ、室温でさらに３０分間撹拌した。次いでこの溶液を２′−Ｏ−ベンジル−５′−カルボベンゾキシグリシルアミノ−５′−デオキシウリジン（２８０ｍｇ，０．５３ｍＭ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．３３６ｍｌ，２．１４ｍＭ）の、ジクロロメタン（３．０ｍｌ）中における溶液（０℃に冷却）に滴加した。この溶液を０℃で１０分間、そして室温で２時間撹拌した。次いで反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２回）で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させて油を得た。この油をトルエン（２回）と共沸蒸留し、次の反応にそのまま用いた。ｂ）前の段階で得た粗生成物を乾燥ジクロロメタン（２．５ｍｌ）に溶解し、４−Ｎ，Ｎ−ビス−（２−クロロエチル）アミノフェノール（１２５ｍｇ，０．５３４ｍＭ）の、乾燥ジクロロメタン（３．０ｍｌ）中における溶液を添加した。次いで乾燥アセトニトリル中の０．４６Ｍテトラゾール溶液（３．２ｍｌ）を添加し、溶液を室温で２時間撹拌した。次いで水中の７０％ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液（０．１１ｍｌ，０．８０１ｍＭ）を添加し、溶液を室温でさらに１時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１回）、希亜硫酸水素ナトリウム（１回）、飽和塩化ナトリウム（１回）で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させた。粗生成物をメルクシリカゲル（Ａｒｔ．９３８５）上で、ジクロロメタン中の２％メタノール、次いでジクロロメタン中の３．５％メタノールにより溶離するクロマトグラフィー処理して、純粋な５′ −アジド−２′−Ｏ−ベンジル−５′−デオキシウリジン１１８ｍｇを得た。ＮＭＲデータ DMSO d6（δ）ジアステレオマー混合物実施例４ネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−Ｌｙｓ６６Ｇｌｕウシ膵臓リボヌクレアーゼ結合体の合成および単離参考例４に記載した方法を繰り返し、ただしウシ膵臓リボヌクレアーゼの代わりにＬｙｓ６６Ｇｌｕウシ膵臓リボヌクレアーゼ（実施例１に記載）を用いる。実施例５ネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６Ｇｌｕヒト膵臓リボヌクレアーゼ結合体の合成および単離参考例４に記載した方法を繰り返し、ただしウシ膵臓リボヌクレアーゼの代わりにＡｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６Ｇｌｕヒト膵臓リボヌクレアーゼ（実施例２に記載）を用いる。実施例６ヒト化Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６Ｇｌｕヒト膵臓リボヌクレアーゼ結合体の合成および単離実施例５に記載した方法を繰り返し、ただしネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂の代わりにヒト化Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂を用いる。ヒト化Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂は下記の方法で調製される。参考例５に記載した方法の工程ｆ）から以後を実施し、ただしそれぞれ配列番号：２５および２６に示すＦｄ鎖およびＬ鎖のネズミ配列の代わりにそれぞれ配列番号：２８および２９に示すヒト化配列を用いる。配列番号：２８および２９に示すヒト化配列は、下記を含めた多様な方法で調製できる：Ｅｄｗａｒｄｓ（１９８７）Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌａｂ．，５，３８−４４；Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，４０８４−４０８８；ＦｏｇｕｅｔおよびＬｕｂｂｅｒｔ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３，６７４−６７５；ならびにＰｉｅｒｃｅ（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１６，７０８。実施例７実施例３のウラシル系プロドラッグ、対応する薬物、およびプロドラッグ＋ヒト酵素Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６Ｇｌｕヒト膵臓ＲＮアーゼ（ＨＰ−ＲＮアーゼ）のインビトロ細胞毒性ＲＮアーゼプロドラッグおよび対応する薬物の腫瘍細胞に対する細胞毒性の相異を、下記の方法で証明した。ＬｏＶｏ結腸直腸腫瘍細胞を、最終濃度範囲５× １０^-1〜５×１０^-8Ｍにわたるプロドラッグまたは薬物と共に、９６ウェル（２，５００細胞／ウェル）ミクロタイタープレート内で、３７℃において１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、３７℃でさらに３日間インキュベートした。次いでＴＣＡをウェルに添加し、洗浄して死細胞を除去したのち、プレートに付着した細胞タンパク質の量をＳＲＢ染料の添加により評価した：Ｐ．Ｓｋｅｈａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８２，１１０７（１９９０）の記載に従う。化合物の力価は、細胞の増殖を５０％阻害するのに必要な濃度（ＩＣ５０）により評価された。ＬｏＶｏ細胞を薬物で処理した場合、約１μＭのＩＣ５０がみられた。これに対しプロドラッグは細胞毒性がはるかに低く、約３０μＭのＩＣ５０を示した（図６）。したがってＲＮアーゼプロドラッグは腫瘍細胞に対して、突然変異ＲＮアーゼで開裂させることにより生成する薬物より細胞毒性が約３０倍低い。プロドラッグを含有するアッセイウェルに、遊離Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼ（酵素１０μｇ）またはＦ（ａｂ' ）₂−Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼ結合体（酵素１０μｇ）を添加すると、活性薬物のものに匹敵する細胞毒性がみられる。これは、プロドラッグが突然変異酵素により変換されて、より有効な薬物が放出されたことを証明する。これらの試験は、ＡＤＥＰＴ系において突然変異ヒトＲＮアーゼ結合体が比較的不活性なプロドラッグを、腫瘍細胞を殺すことができる有効な細胞毒性薬物に変換することを証明する。実施例８異種移植マウスにおけるＲＮアーゼプロドラッグおよび抗体−突然変異ＲＮアーゼ結合体の抗腫瘍活性ＲＮアーゼプロドラッグおよびＡｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼ結合体（またはＬｙｓ６６Ｇｌｕウシ膵臓ＲＮアーゼ）の抗腫瘍効力を、下記のモデルで証明できる。ＬｏＶｏ腫瘍細胞（１０⁷）を無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。腫瘍が直径４〜５ｍｍになったとき、結合体を１０〜１００ｍｇ／ｋｇの量で静脈内投与する。結合体が腫瘍に局在化し、残存結合体が血流および正常組織から清掃されるのに適した時間をおいたのち（１〜４日）、プロドラッグをマウスに１００〜１０００ｍｇ／ｋｇの量でマウスに静脈内または腹腔内投与する。結合体とプロドラッグの組合わせは、非処理対照腫瘍、または同一量の結合体のみもしくはプロドラッグのみで処理した腫瘍より、腫瘍の増殖を有意に低下させる。これらの試験は、Ａｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼ結合体をプロドラッグと組み合わせると抗腫瘍活性が生じることを証明する。実施例９患者における臨床投与癌療法において本発明の結合体とプロドラッグの最も有効な投与様式および用量計画は、疾病の程度、患者の健康状態および処置に対する反応、ならびに担当医の判断など、多数の要因に依存する。したがって結合体およびプロドラッグの投与量は、個々の患者に合わせるべきであるが、結合体の有効量は２０〜２００ｍｇ／ｍ²であると考えられる。プロドラッグの有効量は、用いる個々の薬物、および母体薬物の毒性に依存するであろう。プロドラッグは母体薬物より細胞毒性が低いので、母体薬物のＭＴＤが分かっている場合にはそれが出発点になるであろう。母体薬物についての臨床データがないフェノールマスタード系プロドラッグに関しては、療法用量がより不確実であり、動物における標準的な細胞毒性試験、および患者において低用量から出発する用量漸増試験によって判定する必要があろうが、療法用量は５００〜２０００ｍｇ／ｍ²あると思われる。実施例１０天然および突然変異Ｌｙｓ６６Ｇｌｕウシ膵臓ＲＮアーゼによる、実施例３のウラシル系プロドラッグ（ＲＮアーゼプロドラッグ）の酵素反応速度ＲＮアーゼプロドラッグおよび対応するフェノールマスタード系薬物の吸光度を、分光光度計（パーキン・エルマー、ラムダ２（Ｌａｍｂｄａ２））により２００ｎｍから３５０ｎｍまで走査し、プロドラッグと薬物の吸光度の差（ホスフェート結合の開裂による）が最大となる波長を選択した。この波長は２５６ｎｍであった。次いでこの波長で一定範囲のプロドラッグ濃度（０．２〜２ｍＭ）およびＲＮアーゼ酵素濃度（５〜８０μｇ／ｍｌ）を用いてプロドラッグ変換の初速度を測定することにより、ｋ_mおよびＶ_maxを判定した。測定は３７℃で、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ＋０．０１％Ｂｒｉｊ−３５緩衝液（ｐＨ７．５）中において、光路０．１ｃｍのキュベット（ヘルマ）内で、総容量２５０μｌにおいて行われた。Ｖ_maxから、反応混合物中のＲＮアーゼの量で割ることによってｋ_catを計算した。標準基質であるシチジン−２′，３′−サイクリックモノホスフェート（Ｃ＞ｐ）に対する両酵素の酵素活性を、一定範囲のＣ＞ｐ濃度（０．５〜６ｍＭ）およびＲＮアーゼ酵素濃度（５〜３５μｇ／ｍｌ）を用いて２８４ｎｍで吸光度の変化を測定することにより判定した。結果を下記に示す。ウシの天然および突然変異Ｌｙｓ６６ＧｌｕＲＮアーゼによる、ＲＮアーゼプロドラッグおよびＣ＞ｐに対する酵素反応速度ｋ_cat／ｋ_m この結果は、標準基質Ｃ＞ｐを天然および突然変異の両方のウシＲＮアーゼが同様な速度で代謝回転することを示す。これに対し、突然変異ＲＮアーゼはプロドラッグを天然酵素の場合よりはるかに速やかに加水分解する。このように、ＲＮアーゼにＬｙｓ６６Ｇｌｕの突然変異を導入してもウシ酵素がホスフェート結合を開裂する効力は破壊されず、ＲＮアーゼプロドラッグ（実施例３）を特異的に開裂させて有効薬物を放出させうる酵素が形成された。実施例１１天然およびＡｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６Ｇｌｕヒト膵臓ＲＮアーゼによる、実施例３のウラシル系プロドラッグ（ＲＮアーゼプロドラッグ）の酵素反応速度天然ＨＰ−ＲＮアーゼおよびＡｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼについての酵素反応速度測定を実施例１０の記載に従って行った。ただし用いた緩衝液は０．１Ｍ１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、ｐＨ７．０、５０ｍＭＮａＣｌであった。結果を下記に示す。天然ＨＰ−ＲＮアーゼおよびＡｒｇ４Ａｌａ，Ｌｙｓ６Ａｌａ，Ｌｙｓ６６ＧｌｕＨＰ−ＲＮアーゼによる、ＲＮアーゼプロドラッグおよびＣ＞ｐに対する酵素反応速度ｋ_cat／ｋ_m この結果は、標準基質Ｃ＞ｐを天然および突然変異の両方のヒト酵素が同様な速度で代謝回転することを示す。これに対し、突然変異ヒトＲＮアーゼはＲＮアーゼプロドラッグを天然酵素の場合よりはるかに速やかに加水分解する。このように、ヒト膵臓ＲＮアーゼに突然変異Ｌｙｓ６６Ｇｌｕを導入してもヒト酵素がホスフェート結合を開裂する効力は破壊されず、ＲＮアーゼプロドラッグを特異的に開裂させて有効薬物を放出させうる酵素が形成された。実施例１２シトシン系プロドラッグの合成（図１７の反応経路を参照）実施例３に記載した方法に従い、ただし化合物４（図７）の代わりに化合物６（図１７）を用いた。化合物６（図１７）は化合物４（図７）につき記載したと同様に、ただし２′−Ｏ−ベンジルウリジンの代わりにＮ ⁴−ベンジルオキシカルボニル−２′−Ｏ−ベンジルシチジンを用いて製造された。Ｎ ⁴−ベンジルオキシカルボニル−２′−Ｏ−ベンジルシチジン（化合物２、図１７）は２′−Ｏ−ベンジルシチジン［ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＢｒｏｏｍ（１９７２），Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ，３７，３３９８−３４０１］から、参考例７で化合物６の製造に用いた方法により製造された。実施例１３それぞれ参考例６および７のウリジン系およびシチジン系プロドラッグ類似体に対するウシＬｙｓ６６Ｇｌｕ膵臓ＲＮアーゼの酵素活性この実験は実施例１０に記載したものと同様な方法で行われ、ただしアッセイを２５℃で実施した。結果を下記に示す。ウシの天然および突然変異Ｌｙｓ６６ＧｌｕＲＮアーゼによる、ＲＮアーゼプロドラッグ類似体およびＣ＞ｐに対する酵素反応速度ｋ_cat／ｋ_m この結果は、標準基質Ｃ＞ｐを天然および突然変異の両方のウシＲＮアーゼが同様な速度で代謝回転することを示す。これに対し、突然変異ＲＮアーゼはプロドラッグ類似体を天然酵素の場合よりはるかに速やかに加水分解する。このように、ＲＮアーゼにＬｙｓ６６Ｇｌｕの突然変異を導入してもウシ酵素がホスフェート結合を開裂する効力は破壊されず、ＲＮアーゼプロドラッグ類似体（参考例６および７）を特異的に開裂させて適切なプロドラッグによる有効薬物放出を指示しうる酵素が形成された。実施例１４本発明のプロドラッグ化合物を含有する代表的な薬剤組成物Ａ：１カプセル当たり５０ｍｇの有効成分を含有する乾式充填カプセル化合物をＮｏ．６０粉末に粉砕し、乳糖およびステアリン酸マグネシウムをＮｏ．６０のブロッティング布を通してこの粉末に添加する。合わせた成分を次いで約１０分間混合し、Ｎｏ．１乾燥ゼラチンカプセルに充填する。Ｂ：錠剤代表的な錠剤は、化合物（２５ｍｇ）、予め糊化したデンプン（米国薬局方）（８２ｍｇ）、微晶質セルロース（８２ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウム（１ｍｇ）を含有する。Ｃ：坐剤直腸投与のための代表的な坐剤は、化合物（０．０８〜１．０ｍｇ）、二ナトリウムカルシウムエデテート（ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムキレート）（０．２５〜０．５ｍｇ）およびポリエチレングリコール（７７５〜１６００ｍｇ）を含有する。他の坐剤配合物は、たとえば二ナトリウムカルシウムエデテートの代わりにブチル化ヒドロキシトルエン（０．０４〜０．０８ｍｇ）を、またポリエチレングリコールの代わりに水素添加植物油（６７５〜１４００ｍｇ）、たとえばサポサイア（Ｓａｐｐｏｃｉｒｅ）Ｌ、ウェコビー（Ｗｅｃｏｂｅｅ）ＦＳ、ウェコビーＭ、ワイテプソールズ（Ｗｉｔｅｐｓｏｌｓ）などを用いて製造できる。Ｄ：注射剤代表的な注射用配合物は、化合物（１０ｍｇ）、ベンジルアルコール（０．０１ｍｌ）および注射用水（１．０ｍｌ）を含有する。実施例１５大腸菌におけるＤ２５３ＫＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃのクローニングおよび発現大腸菌におけるＤ２５３ＫＨＣＰＢのクローニングおよび発現のための方法は、参考例１５に記載した方法ときわめて類似する。この場合もｐＩＣＩ２６６をクローニングベクターとして用い、ｐｒｏＨＣＰＢ遺伝子のＰＣＲに用いる出発物質はプラスミドｐＩＣＩ１６９８であった（参考例１４に記載）。ただしこの場合は成熟遺伝子のアミノ酸の位置２５３のコドンをアスパラギン酸からリシンに（ＧＡＣからＡＡＡに）変更するために（Ｄ２５３Ｋ変化）、遺伝子のＰＣＲ増幅に際して部位特異的突然変異を採用した。参考例１５に記載した方法と同様にして２種類のＰＣＲ混合物を調製した。第１反応では、プライマーはＦＳＰＴＳ１（配列番号：５８）および１３９８（配列番号：７２）であった。第２反応では、プライマーは６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：５９）および１３９７（配列番号：７３）であった。両反応とも、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ１６９８であった。プライマー１３９８および１３９７（配列番号：７２および７３）は、アミノ酸コドン２５３の周りにアニールし、ＤＮＡ配列にＧＡＣからＡＡＡへの変更を導入し、２つのＰＣＲ生成物の末端に相補的配列を形成するように設計された。他の２プライマー、ＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：５８および５９）は参考例１５に記載されている。２つのＰＣＲ反応生成物の一定部分をアガロースゲル電気泳動によって適正なサイズのＤＮＡ（約７５０および２５０塩基対）につき分析し、濃度を推定して、主として適正なサイズのバンドを含むことが認められた。次いで１回目の２つのＰＣＲ反応生成物それぞれ約４ｎｇを、ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応用緩衝液、２ＵのＴａｑポリメラーゼの存在下に、最終容量８０μｌ中で用いて、もう一度ＰＣＲを設定した。混合物を９４℃に１０分間加熱したのち、Ｔａｑ酵素を添加し、９４℃で１分間および６３℃で４分間の１０サイクルを用いてＰＣＲインキュベーションを行った。これらのサイクルが完了した時点で、各１２０ｐｍｏｌの末端プライマー、ＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：５８および５９）、追加のｄＮＴＰ（さらに約１００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応用緩衝液、および４ＵのＴａｑポリメラーゼの添加により、反応配合物を１２０μｌに調製した。混合物を９４℃に１０分間加熱したのち、Ｔａｑ酵素を添加し、９４℃で１．５分間、５０℃で２分間、および７２℃ で２分間の３０サイクルのＰＣＲインキュベーションを行い、続いて反応終了時に７２℃で９．９分間のインキュベーションを１回行った。ＰＣＲ生成物の一定部分を適正なサイズのＤＮＡ（約１０００塩基対）につきアガロースゲル電気泳動により分析して、主として適正なサイズのバンドを含むことが認められた。反応配合物からの残りの生成物を参考例１５と同様な方法で精製した。単離したＤＮＡを酵素Ｆｓｐ１およびＥｃｏＲＩで制限消化し、適正なサイズのバンド（約１０００塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。参考例１５と同様な方法で調製したｐＩＣＩ２６６二本鎖ＤＮＡをＫｐｎＩ酵素で制限消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した平滑末端が完全に消化されるように十分に注意をはらった。次いで精製ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。適正なサイズのバンド（約５６００塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。制限消化しかつ精製したＤＮＡ試料の一定部分につき、既知の標準品と比較したアガロースゲル電気泳動により純度および濃度推定値を調べた。これらの推定値から、ＨＣＰＢ遺伝子を参考例１５と同様な方法でｐＩＣＩ２６６ベクター中へクローニングするための連結反応配合物を調製した。連結反応後に、このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、参考例１５と同様な方法でハイブリダイゼーションすることによりコロニーを採取し、試験した。６つの陽性ハイブリダイゼーション単離体を、適正なサイズの挿入配列につきプライマーＦＳＰＴＳ１および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：５８および５９）を用いて、また内部プライマーＦＳＰＴＳ１（配列番号：５８）および６７９（配列番号：５１）によるプライミングにつき参考例１５と同様な方法で調べた。ＰＣＲ生成物を適正なサイズの挿入配列につき（プライマーＦＳＰＴＳ１から６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１まで約１０００塩基対、およびプライマーＦＳＰＴＳ１から６７９まで約４３０塩基対）、アガロースゲル電気泳動により分析した。すべてのクローンが適正なサイズのＰＣＲＤＮＡ生成物を与えた。次いで６クローンすべてをプラスミドＤＮＡ調製用に採取し、２つを参考例１５と同様な方法でＰＣＲ生成物の領域にわたって配列決定した。これらのクローンを、１２８１、６７７、１５０４、６７９、１８０２、１５９０、１２８０および１７３１として知られる８種類の異なるオリゴヌクレオチドプラスミド（配列番号：５５、５２、６０、５１、６３、６１、５３および６２）を用いて配列決定した。配列決定の結果から、目的とするＤ２５３Ｋ−ＨＣＰＢ遺伝子配列をもつプラスミドを含むクローンを選択した。これはｐＩＣＩ１７１３として知られる。ｐＩＣＩ１７１３中にクローニングされた、アミノ酸翻訳を示す確認されたＤ２５３Ｋ−ＨＣＰＢ遺伝子の配列を、ＰｅｌＢ配列の起点からＥｃｏＲＩ制限部位まで、配列番号：７４として示す。ＤＮＡの番号つけはＰｅｌＢの第１コドンの１から開始し、ペプチドの番号つけは成熟ＨＣＰＢ中の１から開始する。Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢを調節発現させるために、ｐＩＣＩ１７１３プラスミドＤＮＡを、参考例１５と同様な方法で塩化カルシウム形質転換コンピテント大腸菌発現株中へ形質転換した。クローン化Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢ遺伝子の発現につき試験するために、すべてのｐＩＣＩ１７１３形質転換発現株を参考例１５と同様な方法で処理した。この場合、Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢはＣ末端（Ｈｉｓ）₆− ｃ−ｍｙｃ標識をもつので、参考例１５と同様にＣ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０モノクローナル抗体をウェスタン分析に用いた。ｐＩＣＩ２６６中におけるクローン化標識Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢ（ｐＩＣＩ１７１３）の発現は大腸菌から、ベクター（ｐＩＣＩ２６６）のみ、および標識ＨＣＰＢ産生クローンと比較して約３５，０００ダルトンに強いタンパク質バンドを示すクーマシー染色ゲルによって証明された（参考例１５）。同じサイズのバンドがｃ−ｍｙｃ標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを示した。実施例１６大腸菌におけるＤ２５３ＲＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃのクローニングおよび発現大腸菌におけるＤ２５３ＲＨＣＰＢのクローニングおよび発現のための方法は、参考例１６に記載した方法ときわめて類似する。この場合もｐＩＣＩ２６６をクローニングベクターとして用い、ｐｒｏＨＣＰＢ遺伝子のＰＣＲに用いる出発物質はプラスミドｐＩＣＩ１７１２であった（参考例１５に記載）。ただしこの場合は成熟遺伝子のアミノ酸の位置２５３のコドンをアスパラギン酸からアルギニンに（ＧＡＣからＣＧＣに）変更するために（Ｄ２５３Ｒ変化）、遺伝子のＰＣＲ増幅に際して部位特異的突然変異を採用した。参考例１５および１６に記載した方法と同様にして２種類のＰＣＲ混合物を調製した。第１反応では、プライマーは２２６４（配列番号：６５）および２０５８（配列番号：７５）であった。第２反応では、プライマーは６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：５９）および２０５４（配列番号：７６）であった。両反応とも、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ１７１２であった。プライマー２０５８および２０５４（配列番号：７５および７６）は、アミノ酸コドン２５３の周りにアニールし、ＤＮＡ配列にＧＡＣからＣＧＣへの変更を導入し、２つのＰＣＲ生成物の末端に相補的配列を形成するように設計された。他の２プライマー、２２６４および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：６５および５９）は参考例１５および１６に記載されている。２つのＰＣＲ反応生成物の一定部分をアガロースゲル電気泳動によって適正なサイズのＤＮＡ（約７５０および２５０塩基対）につき分析し、濃度を推定して、主として適正なサイズのバンドを含むことが認められた。次いで１回目の２つのＰＣＲ反応生成物それぞれ約４ｎｇを、ｄＮＴＰ（最終濃度２００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応用緩衝液、２ＵのＴａｑポリメラーゼの存在下に、最終容量８０μｌ中で用いて、もう一度ＰＣＲを設定した。混合物を９４℃に１０分間加熱したのち、Ｔａｑ酵素を添加し、９４℃で１分間および６３℃で４分間の１０サイクルを用いてＰＣＲインキュベーションを行った。これらのサイクルが完了した時点で、各１２０ｐｍｏｌの末端プライマー、２２６４および６ＨＩＳ９Ｅ１０Ｒ１ＢＳ１（配列番号：６５および５９）、追加のｄＮＴＰ（さらに約１００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応用緩衝液、および４ＵのＴａｑポリメラーゼの添加により、反応配合物を１２０μｌに調製した。混合物を９４℃に１０分間加熱したのち、Ｔａｑ酵素を添加し、９４℃で１．５分間、５０℃で２分間、および７２℃で２分間の３０サイクルのＰＣＲインキュベーションを行い、続いて反応終了時に７２℃ で９．９分間のインキュベーションを１回行った。ＰＣＲ生成物の一定部分を適正なサイズのＤＮＡ（約１０００塩基対）につきアガロースゲル電気泳動により分析して、主として適正なサイズのバンドを含むことが認められた。反応配合物からの残りの生成物を参考例１５と同様な方法で精製した。単離したＤＮＡを酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、適正なサイズのバンド（約１０００塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。参考例１５と同様な方法で調製したｐＩＣＩ２６６二本鎖ＤＮＡをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で制限消化し、完全に消化されるように十分に注意をはらった。適正なサイズのバンド（約５６００塩基対）を参考例１５と同様な方法で精製した。制限消化しかつ精製したＤＮＡ試料の一定部分につき、既知の標準品と比較したアガロースゲル電気泳動により純度および濃度推定値を調べた。これらの推定値から、ＨＣＰＢ遺伝子を参考例１５と同様な方法でｐＩＣＩ２６６ベクター中へクローニングするための連結反応配合物を調製した。連結反応後に、このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、参考例１５と同様な方法でハイブリダイゼーションすることによりコロニーを採取し、試験した。次いで３つのクローンをプラスミドＤＮＡ調製用に採取し、２つを参考例１５と同様な方法でＰＣＲ生成物の領域にわたって配列決定した。これらのクローンを、１２８１、６７７、１５０４、６７９、１８０２、１５９０、１２８０、１７３１および１５９２として知られる９種類の異なるオリゴヌクレオチドプラスミド（配列番号：５５、５２、６０、５１、６３、６１、５３、６２および７０）を用いて配列決定した。配列決定の結果から、目的とするＤ２５３Ｒ−ＨＣＰＢ遺伝子配列をもつプラスミドを含むクローンを選択した。これはｐＩＣＩ１７４６として知られる。ｐＩＣＩ１７４６中にクローニングされた、アミノ酸翻訳を示す確認されたＤ２５３Ｒ−ＨＣＰＢ遺伝子の配列を、ＰｅｌＢ配列の起点からＥｃｏＲＩ制限部位まで、配列番号：７４として示す。ＤＮＡの番号つけはＰｅｌＢの第１コドンの１から開始し、ペプチドの番号つけは成熟ＨＣＰＢ中の１から開始する。Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢを調節発現させるために、ｐＩＣＩ１７４６ブラスミドＤＮＡを、参考例１５と同様な方法で形質転換コンピテント大腸菌発現株中へ形質転換した。クローン化Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢ遺伝子の発現につき試験するために、すべてのｐＩＣＩ１７４６形質転換発現株を参考例１５と同様な方法で処理した。この場合、Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢはＣ末端（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識をもつので、参考例１５と同様にＣ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０モノクローナル抗体をウェスタン分析に用いた。ｐＩＣＩ２６６中におけるクローン化標識Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢ（ｐＩＣＩ１７４６）の発現は大腸菌から、ベクター（ｐＩＣＩ２６６）のみ、および標識ＨＣＰＢ産生クローンと比較して約３５，０００ダルトンに強いタンパク質バンドを示すクーマシー染色ゲルによって証明された（参考例１５）。同じサイズのバンドがｃ−ｍｙｃ標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを示した。精製は下記の実施例１７に述べたものと同様な方法で行われた。実施例１７大腸菌からの突然変異Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃタンパク質の精製まず細胞ペースト中のカルボキシペプチダーゼＢ類似体Ｄ２５３Ｋの２０リットル発酵法につき記載する。大腸菌Ｋ１２株ＭＳＤ１９２４をプラスミドｐＺｅｎ１７１３（ｐＩＣＩ１７１３；前記の実施例１５参照）で形質転換し、得られた株ＭＳＤ２２３０（ＭＳＤ１９２４ｐＺｅｎ１７１３）を凍結用グリセリン配合物中に−８０℃で保存した。ＭＳＤ２２３０を、Ｌ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1）寒天平板培地に画線し、３７℃で一夜増殖させたのち、単一コロニーを分離した。ＭＳＤ２２３０の単一コロニー６つをＬ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1）寒天の表面から分離し、１０ｍｌのＬ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1）ブロスに再懸濁し、この培養物１００μｌをただちに、７５ｍｌのＬ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1）ブロスを入れた２５０ｍｌ容三角フラスコ６個それぞれに接種した。往復振盪機（３００ｒｐｍ）上で３７℃において１５〜１６時間増殖させたのち、フラスコ内容物をプールし、図２３に記載した増殖培地１５リットルを入れた１個の発酵槽（Ｕ３０Ｄ反応器、Ｂ．ブラウン、ドイツ国メルスンゲン）への接種に用いた。発酵は３７℃の温度およびｐＨ６．７で行われ、ｐＨ６．７は６Ｍ水酸化ナトリウムまたは２Ｍ硫酸の添加によって自動的に設定点に制御された。溶存酸素張力（ｄＯＴ）設定点は５０％空気飽和であり、これは発酵槽撹拌速度を２００〜１０００ｐｐｍに自動的に調節することにより維持された。発酵槽への空気の流入は２０標準ｌ／分に維持され、これはチラン（Ｔｙｌａｎ）質量流量制御装置による１．３反応器容量／分（ｖｖｍ）に相当する。４．５時間のインキュベーション後に、酵母エキス（２２５ｇｌ^-1）の溶液を１９０〜２１０ｍｌｈ^-1の速度で２８．５時間供給した。酵母エキス供給を開始して１．５時間後に、発酵槽温度設定点を２５℃に低下させた。この温度に達した約１時間後に、５０％アラビノースを発酵槽中の最終濃度が０．５％となるように一度に添加することにより、カルボキシペプチダーゼ類似体Ｄ２５３Ｋの発現を誘導した。誘導の１〜２時間後に、グリセリン（７１４ｇｌ^-1）および硫酸アンモニウム（１４３ｇｌ^-1）を４５〜５５ｍｌｈ^ー1で発酵槽に収穫まで供給した。これらの条件下で、発酵槽接種の約７５時間後まで発酵を続け、この時点で発酵槽内容物の一定部分を１リットルの遠心ボトルに移すことにより培養物を収穫した。ソルバルＲＣ−３Ｂ遠心機（７，０００×ｇ、４℃、３０分）で遠心することにより細菌細胞から使用済み培地を分離した。この方法で一般に約２０ｇｌ^-1の最終乾燥重量が得られた。細胞ペーストを下記により精製した。組換え酵素Ｄ２５３ＫＨＣＰＢを含有する組換え大腸菌細胞ペーストを−７０℃の保存場所から取り出し、融解した。細胞ペーストの重量を測定し、３０９ｇであることが分かった。このペーストを緩衝液Ａ［２００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス −ＨＣｌ）、２０％スクロース、ｐＨ８．０］の添加により再懸濁して、再懸濁容量３２０ｍｌにした。細胞懸濁液を室温で２０分間、ときどき緩和に混合しながらインキュベートしたのち、室温の蒸留水を等容量添加し、十分に混入した。細胞懸濁液を再び室温で２０分間、ときどき緩和に混合しながらインキュベートした。得られた祖製の浸透圧ショック生成物を４℃において９８０００×ｇで９０分間遠心分離することにより澄明化したのち、ペレット状の不溶性画分から上清をデカントして、透明な２４０ｍｌ容量を得た。デオキシリボヌクレアーゼ１（２４ｍｇ）を蒸留水（５ｍｌ）に溶解し、上清に添加した。この混合物を室温で連続的に振盪しながら３０分間インキュベートして、カルボキシペプチダーゼ阻害薬ＣＮＢで活性化したセファロース（商標）アフィニティカラムに装填するのに十分な程度に上清の粘度を低下させた。カラムはＣＮＢで活性化したセファロース（商標）４Ｂ（ファルマシアから）およびジャガイモ塊茎由来のカルボキシペプチダーゼ阻害薬（ｃ−０２７９、シグマ）についての指示に従って調製された。上清を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）で１：１に希釈し、ｐＨ８．０に調整し、カルボキシペプチダーゼ阻害薬処理したアフィニティカラムに０．５ｍｌ／分で一夜装填した。カラムは４℃ の緩衝液Ｂで予め平衡化された。上清を装填したのち、流出液の吸光度が基準線に戻るまでカラムを洗浄し、結合した物質を次いで４℃の溶離用緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ１１．４）でカラムから溶離し、１ｍｌずつの画分を採集した。組換えカルボキシペプチダーゼを含有するものを判定するために試料を採取したのち、溶出画分を−２０℃で凍結した。判定は抗ｃ−ｍｙｃ標識抗体（９Ｅ１０）を用いるウェスタンブロット分析により、次いで抗−マウス−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（ａ−９０４４、シグマ）により（４−クロロ−ナフトールおよび過酸化水素に暴露すると呈色反応を示した）行われた。画分１１〜４４が組換えカルボキシペプチダーゼＢを含有すると判定された。これらをプールし、ｐＨをｐＨ７．５に調整し、ミリポア、センチフューガル・ウルトラフリー（ＣｅｎｔｉｆｕｇａｌＵｌｔｒａｆｒｅｅ、商標）−２０で濃縮したのち（分子量カットオフ１０，０００）、、急速冷凍し、−２０℃で保存した。ここに詳述した精製法により４．７ｍｇのＤ２５３Ｋ突然変異カルボキシペプチダーゼが８０％の純度で０．９５ｍｌの容量において得られた。実施例１８アスパラギン酸フェノールマスタードプロドラッグ（化合物５ａ、図２７）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝プロピオニルアミノ）コハク酸の合成参考例１２に述べたものと同様な方法を用いた。（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝プロピオニルアミノ）コハク酸ジベンジルエステル（４ａ）を５５２ｋＰａ（８０ｐｓｉ）で２時間加水分解して、目的とする最終生成物５ａを得た（収率：８６％）。出発物質である化合物４ａは下記により製造された。（２Ｓ），２−アミノ−コハク酸ジベンジルエステル（化合物２ａ）を化合物１と反応させ、ジエチルエーテル／ヘキサンで再結晶したのち、（２Ｓ），２− （３−カルボキシプロピオニルアミノ）コハク酸ジベンジルエステル（化合物３ａ）を得た（収率：８０％）。化合物３ａを反応させ、室温で３時間撹拌し続け、ジエチルエーテル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、目的とする出発物質４ａを得た（収率：７８％）。実施例１９グルクミン酸フェノールマスタードプロドラッグ（５ｂ、図２７）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝プロピオニルアミノ）ペンタンジカルボン酸の合成参考例１２に述べたものと同様な方法を用いた。（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝プロピオニルアミノ）ペンタンジカルボン酸ジベンジルエステル（４ｂ）を４１４ｋＰａ（６０ｐｓｉ）で３時間加水分解して、目的とする最終生成物５ｂを得た（収率：９３％）。出発物質である化合物４ｂは下記により製造された。（２Ｓ），２−アミノ−ペンタンジカルボン酸ジベンジルエステル（２ｂ）を反応させて、（２Ｓ），２−（３−カルボキシプロピオニルアミノ）ペンタンジカルボン酸ジベンジルエステル（３ｂ）を得た（収率：定量的）。３ｂを反応させて、目的とする出発物質４ｂを得た（収率：８２％）。実施例２０Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ｇｌｕプロドラッグ類似体に対する突然変異ヒトＣＰＢおよび天然ヒトＣＰＢの活性のアッセイ参考例２０の記載に従って製造したヒトＣＰＢの精製突然変異体（Ｄ２５３ＫおよびＤ２５３Ｒ；実施例１５〜１７）および天然ヒトＣＰＢが、ヒプリル−Ｌ −アスパラギン酸（Ｈｉｐｐ−Ａｓｐ−参考例１０）、ヒプリル−Ｌ−グルタミン酸（Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕ−参考例９）、またはヒプリル−Ｌ−アルギニン（シグマ・ケミカル・カンパニー−カタログＮｏ．Ｈ６６２５）を馬尿酸に転化する効力を、ＨＰＬＣに基づくアッセイ法によりアッセイした。反応混合物（２５０μｌ）は、４μｇのヒトＣＰＢ（天然または突然変異体）および０．５ｍＭのＨｉｐｐ−ＡｓｐもしくはＨｉｐｐ−Ｇｌｕを、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に含有していた。試料を３７℃で５時間インキュベートした。２５０μｌの８０％メタノール、２０％蒸留水、０．２％トリフルオロ酢酸の添加により反応を停止し、生成した馬尿酸の量をＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣ分析はヒューレット・パッカード１０９０シリーズ１１（ダイオードアレイ付き）ＨＰＬＣシステムにより行われた。試料（５０μｌ）をハイクロムハイ−ＲＰＢ（ＨｉｃｈｒｏｍＨｉ−ＲＰＢ）カラム（２５ｃｍ）に注入し、４０％メタノール、６０％蒸留水、０．１％トリフルオロ酢酸の移動相を１ｍｌ／分の流量で用いて分離した。得られた生成物（馬尿酸）の量を、既知量の馬尿酸（シグマ−Ｈ６３７５）につき作成した検量曲線から判定した。結果を表に示し、４μｇの酵素を用いて３７℃、５時間で基質が生成物に転化した％として表わした。突然変異および天然ヒトＣＰＢによるＨｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ｇｌｕの転化率このデータは、ヒトＣＰＢの位置２５３に、天然酵素中に存在するアスパラギン酸残基の代わりにリシンまたはアルギニン残基を導入すると、Ｈｉｐｐ−ＡｓｐまたはＨｉｐｐ−Ｇｌｕを転化しうるように酵素の基質特異性が変化することを示す。これに対し天然酵素はこれらの化合物を馬尿酸に転化できないが、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇを馬尿酸に転化する。最良の活性はＤ２５３Ｋ突然変異体とＨｉｐｐ−Ｇｌｕ基質にみられた。実施例２１Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−ＧｌｕについてのＤ２５３Ｋ突然変異ＨＣＰＢのＫ_mおよびｋ_catの測定実施例１７の記載に従って製造した精製Ｄ２５３ＫＨＣＰＢを、Ｈｉｐｐ− Ａｓｐ（参考例１０）およびＨｉｐｐ−Ｇｌｕ（参考例９）に対してアッセイし、これらの基質についてのＫ_mおよびｋ_catを測定した。Ｈｉｐｐ−ＧｌｕおよびＨｉｐｐ−Ａｓｐを、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中にそれぞれ０．２５〜８．０ｍＭおよび０．２５〜５．０ｍＭの範囲で希釈した。必要な場合には基質試料を１ＭＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ（Ｈｉｐｐ−Ａｓｐについては４μｇ／ｍｌ、Ｈｉｐｐ −Ｇｌｕについては０．５μｇ／ｍｌ）をこれらの基質に添加して（５００μｌの反応容量）、反応を開始した。試料を３７℃で５時間インキュベートした。０．２％のＴＦＡを含有するメタノール／蒸留水（８０／２０）５００μｌの添加により反応を停止した。実施例２０の記載に従って、生成した馬尿酸の量を定量した。Ｋ_mおよびＶ_max値をＥＮＺＦＩＴＴＥＲソフトウェアプログラム（バイオソフト、パーキン・エルマー）により計算した。ｋ_catは、Ｖ_maxから反応混合物の酵素濃度で割ることにより計算された（ＨＣＰＢについての分子量３４ＫＤａを使用）。結果を次表に示す。Ｄ２５３Ｋ突然変異ＨＣＰＢによるＨｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−ＧｌｕについてのＫ_mおよびｋ_catデータこれらのデータから、ヒトＣＰＢの位置２５３のアスパラギン酸をリシン残基で置換すると、Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ｇｌｕを妥当な酵素反応速度で馬尿酸に転化しうる酵素が得られることが確認される。ｋ_cat／Ｋ_mは、Ｈｉｐｐ−ＧｌｕについてはＨｉｐｐ−Ａｓｐと比較して約７倍である。実施例２２グルタミン酸プロドラッグに対する突然変異ＨＣＰＢおよび天然ＨＣＰＢの活性のアッセイ精製Ｄ２５３ＫＨＣＰＢおよび天然ヒトＣＰＢ（それぞれ実施例１７および参考例２０の記載に従って製造）がグルタミン酸プロドラッグからグルタミン酸（実施例１８）を酵素開裂する効力をアッセイした。開裂により中間体（参考例１３）が放出され、これが酵素によらずに自己分解して、有効なマスタード系薬物を放出する。グルタミン酸プロドラッグから中間体への転化をＨＰＬＣに基づくアッセイにより測定した。プロドラッグを、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に０．２５〜５．０ｍＭの範囲で希釈した。必要な場合にはプロドラッグ試料を１ＭＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。Ｄ２５３Ｋ突然変異ＨＣＰＢまたは天然ＨＣＰＢ（両者とも最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）をこれらの基質に添加して（２５０μｌの反応容量、３７℃に２分間予熱）、反応を開始した。試料を３７℃で４分間インキュベートした。２５０μｌの９８．８％ＭｅＣＮ、０．２％ＴＦＡを添加することにより反応を停止した。生成した中間体の量をＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣ分離を実施例２０の記載に従って、ただしプロドラッグ（保持時間４．９分）と中間体（保持時間８．４分）を分離するために、０．１％ＴＦＡを含有するＭｅＣＮ／蒸留水（５５／４５ｖ／ｖ）の移動相を用いた。既知量の中間体につき作成した検量曲線から、生成した中間体の量を定量した。天然および突然変異（Ｄ２５３Ｋ）ＨＣＰＢにより５．０ｍＭおよび０．２５ｍＭプロドラッグの二重試料において生成した中間体の量を次表に示す。天然および突然変異（Ｄ２５３Ｋ）ＨＣＰＢによるプロドラッグから中間体への転化突然変異酵素（Ｄ２５３Ｋ）およびプロドラッグについてのＫ_m、Ｖ_maxおよびｋ_cat値を、実施例２１に記載したＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（商標）ソフトウェアにより、一定範囲の基質濃度（０．２５〜５．０ｍＭ）にわたって生成した中間体の量から計算した。Ｄ２５３Ｋ突然変異ＨＣＰＢについての結果は下記のとおりであった：Ｋ_m＝１．２５ｍＭＶ_max＝１．１７×１０^-4ｍＭｓｅｃ^-1 ｋ_cat＝０．０１６ｓｅｃ^-1 これらのデータは、ヒトＣＰＢの位置２５３に天然酵素中に存在するアスパラギン酸残基の代わりにリシン残基を導入すると、グルタミン酸プロドラッグをその自己分解性中間体に転化しうるように酵素の基質特異性が変化することを示す。これに対し、天然酵素はプロドラッグをその中間体に転化できない。プロドラッグは比較的、非−細胞毒性であり（実施例２３）、かつこの中間体は酵素によらずに分解して、腫瘍細胞を殺すフェノールマスタード系薬物を放出するので（実施例２３）、これらの結果は、ＣＰＢの有効部位残基を突然変異させると比較的無毒性のプロドラッグを腫瘍細胞を殺すことができる有効な細胞毒性薬物に転化しうる突然変異ヒト酵素が得られることを証明する。実施例２３ＬｏＶｏヒト結腸直腸腫瘍細胞におけるグルタミン酸プロドラッグおよびフェノールマスタード系薬物の細胞毒性腫瘍細胞に対するグルタミン酸プロドラッグと対応するフェノールマスタード系薬物の細胞毒性の相異を、下記の方法で証明した。ＬｏＶｏ結腸直腸腫瘍細胞をプロドラッグまたは薬物と共に最終濃度範囲５× １０^-4〜５×１０^-8Ｍにわたって、９６ウェル（２，５００細胞／ウェル）ミクロタイタープレート中において３７℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、３７℃でさらに３日間インキュベートした。次いでＴＣＡをウェルに添加し、洗浄して死細胞を除去したのち、プレートに付着している細胞性タンパク質の量を、Ｐ．Ｓｋｅｈａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８２，１１０７（１９９０）の記載に従って、ＳＲＢ染料の添加により評価した。化合物の効力は、細胞の増殖を５０％阻害するのに必要な濃度（ＩＣ５０）により評価された。ＬｏＶｏ細胞をフェノールマスタード系薬物で処理した場合、約１μＭのＩＣ５０がみられた。これに対しグルタミン酸プロドラッグははるかに細胞毒性が低く、約５０μＭのＩＣ５０を示した（図２２）。したがって突然変異ＣＰＢグルタミン酸プロドラッグは、腫瘍細胞に対する細胞毒性がフェノールマスタード系薬物より約５０倍低い。実施例１７の記載に従って製造した突然変異ＨＣＰＢ（Ｄ２５３Ｋ）１００μ ｇを、グルタミン酸プロドラッグを含有するアッセイウェルに添加すると、有効薬物のものに匹敵する細胞毒性がみられ、これはプロドラッグが突然変異酵素によって転化して、より有効な薬物を放出したことを証明する。１００μｇの天然ヒトＣＰＢを各ウェルに添加してもグルタミン酸プロドラッグの細胞毒性は有意には高まらない。これらの試験は、突然変異ヒトＣＰＢ酵素（Ｄ２５３Ｋ）が比較的不活性なプロドラッグを腫瘍細胞を殺すことができる有効な細胞毒性薬物に選択的に転化しうることを証明する。実施例２４ヒト化Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ'）₂−Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ融合タンパク質の調製参考例２１に記載した方法を繰り返し、ただしネズミＡ５Ｂ７Ｌ鎖およびＦｄ配列の代わりにヒト化Ａ５Ｂ７を用い、ＨＣＰＢ配列の代わりにＤ２５３Ｋ配列を用いる。融合タンパク質を、参考例２１の記載に従ってＨＣＰＢｐｒｅｐｒｏ配列との同時トランスフェクションによりＣＯＳ細胞から発現させる。本質的に参考例２１の記載に従って、プラスミトベクター（各７５０μｇ）をＣＯＳ −７細胞（１１）中へ一時的に導入することにより、融合タンパク質の大規模発現を行う。固定化したプロテインＡに融合タンパク質を含有する上清を導通し、結合した融合タンパク質を高ｐＨ緩衝液で溶離することにより、または組換えカルボキシペプチダーゼ酵素の精製に用いた経路に従って、固定化したカルボキシペプチダーゼに融合タンパク質を含有する上清を導通し、実施例１２で酵素に用いたものと同じ高いｐＨで溶離することにより、生成物を精製する。これらの経路は両方とも、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを単独で、またはこれらを組み合わせて、融合タンパク質をさらに精製してもよい。参考例２１に記載した方法を繰り返し、ただしＦｄおよびＬ鎖に対するネズミ配列（それぞれ配列番号：２５および２６）の代わりにそれぞれ配列番号：２８および２９に示すヒト化配列を用いる。参考例２１においてＨＣＰＢ配列はＤ２５３Ｋ配列で置換される［実施例１５に記載、ただし（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃ標識を含まない］。参考例２１のＰＣＲの鋳型（ｐＩＣＩ１６９８）の代わりにｐＩＣＩ１７１３（実施例１５に記載）を用いる。配列番号：２８および２９に示すヒト化配列は、下記を含めた多様な方法で調製される：Ｅｄｗａｒｄｓ（１９８７）Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌａｂ．５，３８−４４，Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，４０４８−４０８８，ＦｏｇｕｅｔおよびＬｕｂｂｅｒｔ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３，６７４−６７５、ならびにＰｉｅｒｃｅ（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１６，７０８。実施例２５Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ調製のための振盪フラスコ発酵大腸菌株ＭＳＤ２１３をプラスミドｐＩＣＩ１７１３（実施例１５参照）で形質転換し、得られたＭＳＤ２１３ｐＺｅｎ１７１３株をグリセリンストックとして−８０℃で保存した。一定部分のＭＳＤ２１３ｐＺｅｎ１７１３をＬ−テトラサイクリンを含む寒天平板上に画線し、３７℃で一夜増殖させたのち、単一コロニーを分離した。ＭＳＤ２１３ｐＺｅｎ１７１３の単一コロニーを分離し、Ｌ−テトラサイクリンブロス７５ｍｌを入れた２５０ｍｌ容三角フラスコに接種した。往復振盪機上で３７℃において１６時間増殖させたのち、フラスコ内容物を用いて、Ｌ−テトラサイクリンブロス６００ｍｌを入れた２リットル容三角フラスコ９個に、それぞれＯＤ５５０＝０．１となるように接種した。次いでフラスコを往復振盪機上で２０℃において、培養物の光学濃度の測定により推定して増殖がＯＤ５５０＝０．５に達するまでインキュベートした。この時点で、培養物にＬ−アラビノースを最終濃度０．０１％ｗ／ｖとなるように添加して異種タンパク質の産生を誘導し、前記に従って２０℃でさらに４２時間、インキュベーションを続けた。使用済みの培地をソルバルＲＣ−３Ｂ遠心機で遠心分離することにより（７０００×ｇ、４℃、３０分間）細菌細胞から分離し、細胞ペーストを−７０℃に保存した。実施例２６自己骨髄移植におけるＡＤＥＰＴの利用自己骨髄移植においては、患者に集中放射化学療法を施す前に患者自身の骨髄の一部を取り出す。処置が完了した時点で骨髄を患者に戻す。ある種の癌、たとえば白血病ならびにＢ細胞系およびＴ細胞系のリンパ腫、ならびに乳腺、肺および結腸の癌では、悪性細胞が骨髄に浸潤するので、生存率を高めるためには骨髄を戻す前にそれらを排除しなければならない。従来、自己骨髄のためにこれらの腫瘍細胞を排除するには、抗体−毒素結合体が用いられていた（Ｂｌａｋｅｙ，Ｄ.Ｃ.ら，Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ，ｖｏｌ．４５，５０，１９８８）。ＡＤＥＰＴは、特に短命な反応性マスタード系アルキル化剤を薬物成分として用いる場合に、この目的に利用できる。たとえば腫瘍細胞を含む自己骨髄を適切な抗体−酵素結合体と共にインキュベートする。結合体が選択的に腫瘍細胞に結合したのち、残存する結合体を洗い流す。次いでプロドラッグを添加すると、抗原陽性腫瘍細胞に近接して薬物が生成し、その結果腫瘍細胞が死ぬ。正常な骨髄細胞は、腫瘍細胞上で薬物が生成する部位と骨髄細胞の間に十分な距離が確保されるように骨髄の希釈度を適正にし、これにより薬物が骨髄細胞に到達する前に化学分解によって不活性化されることによって、保護できる。反応性マスタード系薬物に対して求核性物質として作用するタンパク質を添加することも、正常な骨髄の損傷を最小限に抑えるために利用できる。実施例２７逆極性ＡＤＥＰＴへの突然変異グルクロニダーゼの利用ヒトグルクロニダーゼは、プロドラッグを開裂して有効薬物を放出させうる特異的ヒト酵素の形成に“逆極性”の概念を利用できる他の酵素である。Ｂｏｓｓｌｅｔら（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４，２１５１，１９９４）が既に天然ヒトグルクロニダーゼに対するアドリアマイシン−グルクロニドにつき述べており、一連の薬物を放出する一連の代替プロドラッグの合成を記載している（Ｂｏｓｓｌｅｔ、特許出願ＡＵ−５０２２５／９３）。血液および組織中に存在する内因性の天然グルクロニダーゼは、抗体−グルクロニダーゼ結合体の不在下でこれらのプロドラッグを代謝回転して有効薬物を放出し、したがってこの方法の特異性を低下させる可能性がある。ＣｈｅｎｇおよびＴｏｕｓｔｅｒ（Ｊ．Ｂ．Ｃ．２４７，２６５０，１９７２）は、グルクロニダーゼの活性部位には正に帯電したアミノ酸があり、これがグルクロニド環上の負に帯電したカルボキシル基と反応すると報告した。リンカーはグルクロニドと細胞毒性物質との直接結合であるか、またはたとえばＢｏｓｓｌｅｔら（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４，２１５１，１９９４、およびＡＵ−Ａ−５０２２５／９３）が記載した種類のリンカー（ｓｅｌｆｉｍｏｌａｔｉｎｇｌｉｎｋｅｒ）であってもよい。グルクロニド環上の負に帯電したカルホキシル基を正に帯電した基Ｒ）たとえばＲ＝Ｌ−ＣＨ₂−ＮＨ₂またはＬ −ＣＨ₂−ＮＨＲ′（ここでＲ′＝Ｃ₁ _〜4アルキルであり、Ｌ＝［ＣＨ₂］₀ _〜3または他の好適なリンカーである）と交換すると、正に帯電したプロドラッグはもはや天然グルクロニダーゼの基質ではないはずである。したがって、グルクロニダーゼの活性部位にある正に帯電した残基を負に帯電したアミノ酸、たとえばグルタミン酸またはアスパラギン酸に変換すると、この突然変異グルクロニダーゼは、ＲＮアーゼおよびＣＰＢなどのように、正に帯電したプロドラッグを選択的に代謝回転するであろう。このように逆極性の概念をヒトグルクロニダーゼおよび正に帯電したグルクロニド系プロドラッグにまで拡大できる。配列表に関する注釈本明細書において、明細書中で述べた配列番号は明細書に直接含まれる配列表に対応する（パテンティン（Ｐａｔｅｎｔｉｎ）ソフトウェアを用いて作成したものではない）。パテンティンで作成した配列表を提出する必要もあるが、これは本出願時にはなされておらず、その内容を特に援用する。パテンティンソフトウェアは余分な配列（アミノ酸配列のみを含む）を作成するので、核酸配列がコード領域（ＣＤＳ）を含む場合には、パテンティンで作成した配列番号とそうでないもの（非パテンティンで作成した配列番号）との間に不一致が生じた。パテンティンで作成した配列表と共に提出した表にはこれら２組の配列番号の比較を示す。配列表のディスケット版（ｄｉｓｋｅｔｔｅｖｅｒｓｉｏｎ）はパテンティンで作成したものに対応する。読者は、現在入手できるパテンティンソフトウェア１．３０版における下記の “バグ”も承知すべきである。ＣＤＳ領域を含む配列では、アミノ酸についての配列ナンバリングが前方のＣＤＳから継続する場合がときどきある（起点から開始するのでなく）。このバグはパテンティンで作成した配列表中の配列番号２７、３０および３２のアミノ酸ナンバリングに影響を及ぼす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 ＺＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者エッゲルテ，ヘンドリクス・ジョアネスイギリス国ミドルセックスエイチエイ２９ピーディー，ハーロウ，レイナーズ・レーン，オヴェスドン・アベニュー 52 (72)発明者ダラゴナ−フィオル，アントーニオイギリス国ロンドンダブリュー６８アールエフ，セント・ダンスタンズ・ロード，ザ・チャリング・クロス・アンド・ウエストミンスター・メディカル・スクール，ズィ・アドヴァンスト・バイオテクノロジー・センター，ルーム５エル 09 (72)発明者ラヴィン，ブライアン・ロバートイギリス国ロンドンイーシー４エヌ４ティーピー，クイーン・ヴィクトリア・ストリート 11，テンプル・コート，エルビーエル (72)発明者ボイル，フランシス・トーマスイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者ヘナム，ジョン・フレデリックイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者ブレイキー，デイヴィッド・チャールズイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者マーシャム，ピーター・ロバートイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者ヒートン，デイヴィッド・ウィリアムイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者デイヴィーズ，デイヴィッド・フーイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者スレイター，アンソニー・マイケルイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者エンヌカン，ローレン・フランスワ・アンドルフランス共和国95022 セルジ・セデックス，ボアット・ポスタル 127，リュ・デ・ショフール１，“ル・ガリアン”, ゼネカ−ファルマ・ソシエテ・アノニム

Claims

【特許請求の範囲】１．成分が宿主に使用するために設計した調和する２成分系であって、それらの成分が（ｉ）腫瘍に付随する抗原と結合しうるターゲティング部分である第１成分；該ターゲティング部分はプロドラッグを抗腫瘍性薬物に変換させうる突然変異酵素に連結している；および（ii）該酵素の作用下で抗腫瘍性薬物に変換しうるプロドラッグである第２成分を含み、それらにおいて突然変異酵素は宿主酵素の突然変異形であり、その天然の宿主酵素はイオン対相互作用により天然基質を認識し、この相互作用を突然変異酵素および相補的プロドラッグの設計に際して逆転させてあり（“逆極性”）；第１成分は宿主において実質的に非免疫原性であり；かつプロドラッグである第２成分は宿主において突然変異していない天然の宿主酵素によって有意には抗腫瘍性薬物に変換しえない、上記の系。２．第１成分がその系を使用する予定の宿主と同じ種に由来する酵素に基づく突然変異酵素を含むものである、請求項１記載の系。３．ターゲティング部分が抗体またはそのフラグメントである、請求項１または２記載の系。４．抗体フラグメントがＦ（ａｂ'）₂フラグメントである、請求項３記載の系。５．突然変異酵素が突然変異リボヌクレアーゼである、請求項１〜４のいずれか１項記載の系。６．突然変異酵素が位置６６に負に帯電したアミノ酸を含むヒトリボヌクレアーゼである、請求項１〜５のいずれか１項記載の系。７．位置６６の負に帯電したアミノ酸がＧｌｕである、請求項６記載の系。８．突然変異酵素が突然変異グルクロニダーゼである、請求項１〜４のいずれか１項記載の系。９．式１のマスタードーリボヌクレオチド：［式中：ＱはＯまたはＮＨであり；Ａは式−Ｘ−Ｙ−の基であり、ＹはＱの隣にあり、ここでＹはＳＯ₂、ＣＯまたは単結合であり、ただしＱが酸素である場合にはＹはＳＯ₂ではなく；Ｘは−（ＣＨ₂）_n−であり、ここでｎ＝１〜４であり、これは所望により任意の炭素原子においてＣ₁ _〜4アルキルで置換されていてもよく、またはＹがＣＯであり、かつｎ＝１である場合には、Ｘは炭素において所望によりアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンの側鎖で置換されていてもよく；Ｒ１はウラシルまたはシトシンであり；Ｒ２およびＲ３は独立してＨまたはＣ₁ _〜4アルキルを表し；Ｒ５およびＲ６は独立してＣｌ、メシルまたはトシルを表し；Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立してＨ、Ｃ₁ _〜4アルキル、Ｃ₁ _〜4アルコキシ、ＦまたはＣｌを表す］またはその塩である、請求項１記載の第２成分。１０．ＱがＮＨであり；Ｘが−（ＣＨ₂）_n−であり、ここでｎ＝１〜４であり；Ｙが−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｒ１がウラシルまたはシトシンであり；Ｒ２およびＲ３がＨであり；Ｒ５およびＲ６がＣｌであり；かつＲ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がＨである請求項９記載のマスタードリボヌクレオチドまたはその塩。１１．化合物リン酸水素Ｏ−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（２−アミノアセトアミドメチル）−５−（２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン −１−イル）−４−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロフラン−３−イル］Ｏ−［４−（ビス［２−クロロエチル］アミノ）フェノキシ］またはその塩である、請求項１記載の第２成分。１２．請求項１〜８のいずれか１項記載の第１成分を含む薬剤組成物。１３．請求項１または９〜１１のいずれか１項記載の第２成分を含む薬剤組成物。１４．無菌である、請求項１２〜１３のいずれか１項記載の薬剤組成物。１５．請求項１〜８のいずれか１項記載の第１成分。１６．請求項１、２、５、６、７または８のいずれか１項記載の突然変異酵素。１７．宿主において新生細胞の増殖を抑制する方法であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項記載の第１成分を宿主に投与し、第１成分を全身循環から実質的に消失させ、そして有効量の請求項１または９〜１１のいずれか１項記載の第２成分を投与することを含む方法。１８．寄託番号ＮＣＩＭＢ４０６７８として寄託されたプラスミドｐＱＲ１６２。１９．下記のうちのいずれか：請求項１〜８のいずれか１項記載の第１成分；および請求項１、２、５、６、７または８のいずれか１項記載の突然変異酵素をコードするポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列。２０．請求項１９記載のポリヌクレオチドを含むベクター。２１．請求項１９記載のポリヌクレオチドを含む細胞。