IT201700016726A1 - Frazioni arricchite in terpeni esenti da politerpeni estratte dal mastice di chios, dispositivi cosmetici, nutraceutici e medici, e composizioni farmaceutiche che le contengono - Google Patents

Frazioni arricchite in terpeni esenti da politerpeni estratte dal mastice di chios, dispositivi cosmetici, nutraceutici e medici, e composizioni farmaceutiche che le contengono

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Ezio Abbiati
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Description

“FRAZIONI ARRICCHITE IN TERPENI ESENTI DA POLITERPENI ESTRATTE DAL MASTICE DI CHIOS, DISPOSITIVI COSMETICI, NUTRACEUTICI E MEDICI, E COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE CHE LE CONTENGONO”
SOMMARIO
L’invenzione si riferisce a frazioni isolate di mastice di Chios arricchite di monomeri terpenici e oligomeri e sostanzialmente prive di polimeri poli-terpenici con un grado di polimerizzazione maggiore di 8 e un peso molecolare medio nell’intervallo da circa 1000 a circa 100000 come pure a un processo per la loro preparazione. L’invenzione si riferisce anche a composizioni comprendenti una frazione isolata di terpeni monomerici e oligomerici estratti e purificati mediante cromatografia a fase inversa ed essenzialmente prive di polimeri. La frazione arricchita di terpeni monomerici e oligomerici ottenuta da mastice di Chios presenta attività biologiche in applicazioni cosmetiche, nutraceutiche, di dispositivi medici e farmaceutiche.
CONTESTO DELL’INVENZIONE
Il mastice di Chios è una resina generata dalla pianta Pistacia lentiscus var. chia, generalmente coltivata nei paesi del Mediterraneo e in particolare nella parte meridionale dell’isola greca di Chios. Il P. lentiscus è una pianta molto antica e la relativa gomma è stata utilizzata da molti secoli. Infatti, il riferimento più antico al mastice si fa risalire a Erodoto nel 5° secolo a.C. I greci hanno utilizzato il mastice di Chios in diverse applicazioni, come nella cucina, in preparazione di bevande, cosmetici e vernici, e per il trattamento di malattie gastriche [1]. Recenti studi hanno associato specifiche proprietà farmaceutiche del mastice di Chios ai suoi particolari componenti molecolari [2].
Il mastice di Chios è una resina avente un aspetto simile a una lacrima sullo stelo e sui rami della pianta che si forma in siti di incisioni. Inizialmente, il mastice di Chios è secreto come un liquido colloidale trasparente che solidifica dopo 15-20 giorni a temperatura ambiente acquisendo un aspetto cristallino opaco simile a una stalattite, caratterizzato da un odore simile a un balsamo. Questo materiale è raccolto e ulteriormente lavorato. La durezza del mastice di Chios dipende da diversi fattori, come la temperatura, il tempo di esposizione in natura e la sua dimensione.
Sono disponibili evidenze scientifiche crescenti sull’attività terapeutica del mastice di Chios. La sua attività gastro-intestinale, antiossidante, antiinfiammatoria, anti-diabetica, antimicrobica e antitumorale, così come i suoi effetti benefici nell’igiene orale e nella cura della pelle sono ampiamente documentati [2]. In particolare, è utilizzato come condimento nella cucina mediterranea, nella produzione di gomma da masticare, in profumeria, in odontoiatria e per il sollievo del dolore epigastrico e la protezione contro l’ulcera peptica [2].
Il mastice di Chios è sostanzialmente insolubile in acqua e solubile in differenti solventi organici, compresi metanolo, dimetil-solfossido (DMSO), acetone e cloroformio. I costituenti non polari sono stati analizzati ed è stata caratterizzata la composizione dei vari estratti dal mastice di Chios, il cosiddetto olio di mastice derivato dal mastice di Chios, e i diversi costituenti isolati e identificati in varie frazioni [3-9]. Sono stati trovati fino a più di 70 componenti del mastice di Chios e più di 60 sono stati identificati. Sei componenti, ossia α-pipene, β-pipene, β-mircene, linalolo, trans-cariofillene e canfene, rappresentano dal 65% all’80% del peso del mastice di Chios.
Le attività biologiche del mastice di Chios possono essere attribuite a vari composti. I componenti attivi che contribuiscono ai suoi effetti terapeutici appartengono alla classe dei terpeni (mono e sesquiterpenoidi, acidi triterpenici e triterpenoidi) [8]. Esempi di detti componenti includono acido oleanonico, acido moronico, acido 24Z-masticadienonico, acido 24Z-isomasticadienonico, acido 24Z-masticadienolico, acido 24Z-isomasticadienolico, tirucallolo, dammaradienone, 28-norolean-12-en-3-one, aldeide oleanonica e aldeide oleanolica.
Il mastice di Chios contiene β-mircene polimerico che non solo ha un beneficio terapeutico [8], ma è anche dannoso per alcune attività biologiche attribuite a estratti e preparazioni del mastice grezzo.
I terpeni costituiscono solo una della principali classi di prodotti naturali vegetali, con più di 20000 specie differenti riportate. La grande maggioranza di diversità terpenica si verifica nel regno vegetale, sebbene anche altri organismi producano questo tipo di molecole. Più di 100 differenti scaffold terpenici sono attualmente noti nei vegetali. Il serbatoio naturale di terpeni rimane in gran parte sconosciuto, nonostante il notevole interesse commerciale e terapeutico verso questi composti per una gamma di applicazioni [10].
Gli acidi triterpenici, in particolare, possiedono varie capacità biologiche come effetti anti-infiammatori, antiossidanti, antiaterogenici, anti-iperlipidemici, antitumorali, antidiabetici e epatoprotettivi [11]. È stato dimostrato che il mastice di Chios contiene molte di queste molecole attive come acido oleanonico, acido moronico, acido 24Z-masticadienonico, acido 24Z-isomasticadienonico, acido 24Z-masticadienolico, acido 24Z-isomasticadienolico [2].
GR 1,003,541 divulga azione antimicrobica e antimicotica dell’olio di mastice di Chios estratto da foglie, rami e frutti di Pistacia lentiscus. GR 1,003,868 divulga l’uso di un prodotto derivato dalla stessa pianta come antiossidante, induttore di guarigione delle ferite e agente citostatico.
US 2005/0238740 divulga che varie frazioni estratte dal mastice possiedono attività antimicrobica e antiproliferativa cellulare. Un primo estratto (chiamato “frazione totale” o “estratto intero”) contiene tutti i composti del mastice eccetto la resina polimerica. Un secondo estratto è una frazione acida contenente tutti gli acidi triterpenici della frazione totale e un terzo estratto è una frazione neutra contenente tutti gli altri terpeni della frazione totale.
EP 1520585 divulga l’uso di oli essenziali distillati da diverse parti di specie Pistacia contenenti un gran numero di composti terpenici monomerici in proporzioni variabili che possiedono attività contro linee cellulari tumorali.
WO 2005/112967 divulga la purificazione da mastice di Chios di un composto anti-proliferativo trovato in una frazione solubile ottenuta sospendendo il mastice in un solvente selezionato da un idrocarburo alifatico non acido, una soluzione acquosa contenente almeno il 25% di idrocarburo alifatico idrosolubile, non acido, o una combinazione e rimuovendo la frazione insolubile.
US 5,506,406 divulga l’olio di mastice prodotto sciogliendo il mastice in olio o in ambiente grasso con l’ulteriore aggiunta opzionale di una sostanza anfipatica come chitina o chitosano che è efficace per eliminare e inibire l’Helicobacter pylori e per ridurre l’odore delle feci.
US 5,637,290 descrive un prodotto per l’igiene orale comprendente la combinazione di un dentifricio e un ingrediente selezionato da mastice naturale, olio di mastice estratto e agenti sintetici di olio di mastice.
US 6,623,728 divulga composizioni cosmetiche in emulsione per la cura della pelle, comprendenti da circa lo 0,001% a circa il 10% di mastice solubilizzato, un solvente volatile miscibile in acqua e un veicolo cosmeticamente accettabile. Secondo la divulgazione, sono utilizzati solventi per ottenere il mastice solubilizzato, compresi etanolo, metanolo, propanolo, alcool isopropilico e miscele.
US 6,811,769 divulga una composizione orale comprendente un estratto di olio di mastice preparato con olio di oliva o olio di palma, avente un’azione antibatterica contro batteri correlati alla malattia parodontale e batteri correlati alla carie.
Paraschos et al. [8] hanno riportato una preparazione di un estratto di mastice totale privo di polimeri preparato mediante estrazione con solvente polare di mastice di Chios grezzo e rimozione del poli- �-mircene insolubile, ulteriormente separato in frazioni acide e neutre per mezzo di ripartizione liquido/liquido con solventi organici e soluzioni acquose neutre e acide. Secondo la pubblicazione, la somministrazione dell’estratto privo di polimeri a topi infettati con Helicobacter pylori ha comportato una riduzione di 30 volte della colonizzazione batterica, in gran parte attribuibile a un particolare composto purificato dalla frazione acida. Gli autori affermano che l’estratto privo di polimeri è stato preparato perché si è ipotizzato che l’alta percentuale di poli-�-mircene in preparazioni di mastice grezzo ostacolasse la potenziale attività in vivo durante la somministrazione orale. Gli autori affermano inoltre che la rimozione del poli-�-mircene potenzia l’attività anti-Helicobacter pylori. Non è fatta nessuna menzione di altri polimeri trovati nel mastice di Chios aventi un grado di polimerizzazione maggiore di 8 e un peso molecolare Mn variabile da 1000 a 100000. Inoltre l’estratto divulgato da Paraschos et al. contiene solo acidi triterpenici, cioè la frazione acida.
WO 2010100651 si riferisce a composizioni comprendenti una frazione isolata di mircene polimerico da mastice e formulazioni che mantengono l’attività biologica del polimero attivo.
La tecnica nota pertanto non insegna o suggerisce alcun frazionamento dell’intero estratto di mastice di Chios per mezzo di resine idrofobiche e cromatografia a fase inversa per purificare e arricchire il componente di terpeni attivi ed eliminare il polimero poli-�-mircene e altri polimeri dal mastice di Chios.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
Si è ora trovato che una frazione attiva particolarmente efficace dal punto di vista farmacologico essenzialmente costituita da tutti i terpeni presenti nel mastice di Chios e sostanzialmente priva di poli-beta-mircene e di altri terpeni polimerici può essere convenientemente ottenuta sottoponendo il mastice grezzo a un semplice e conveniente procedimento cromatografico a fase inversa.
Detto procedimento si è rivelato più efficiente rispetto ai metodi della tecnica nota basati sull’estrazione con solventi o tecniche di ripartizione liquido-liquido.
La frazione ottenuta, comprendente sia i terpeni neutri che l’acido triterpenico, oltre a piccole forme oligomere di mircene, è particolarmente attiva contro l’Helicobacter pylori e quindi è utile per il trattamento di infiammazione gastrica e ulcera peptica, come pure per la gastrite cronica attiva.
In una prima forma di realizzazione, l’invenzione fornisce quindi una frazione isolata di mastice di Chios arricchita di monomeri terpenici e oligomeri e sostanzialmente priva di polimeri poli-terpenici con un grado di polimerizzazione maggiore di 8 e un peso molecolare medio nell’intervallo da circa 1000 a circa 100000.
La frazione isolata dell’invenzione è caratterizzata da un contenuto di monomeri terpenici e oligomeri maggiore del 98% in peso.
La frazione isolata contiene acidi terpenici che includono acido oleanonico, acido moronico, acido 24Z-masticadienonico, acido 24Z-isomasticadienonico, acido 24Z-masticadienolico, acido 24Z-isomasticadienolico, tirucallolo, dammaradienone, 28-norolean-12-en-3-one come pure come aldeide oleanonica e aldeide oleanolica.
L’invenzione riguarda anche un processo per la preparazione delle frazioni terpeniche, comprendente le fasi di:
(a) trattare il mastice di Chios con metanolo o una miscela di metanolo ed acetato di etile;
(b) sottoporre la soluzione ottenuta in a) a cromatografia su resina a fase inversa ed eluire con metanolo per dare una frazione ricca di monomeri terpenici e oligomeri;
(c) rigenerare la resina a fase inversa con acetato di etile;
(d) rimuovere il metanolo dalla frazione solubile ottenuta nella fase (b). L’invenzione fornisce anche composizioni farmaceutiche e nutraceutiche comprendenti le frazioni ottenute mediante il processo menzionato sopra. La composizione dell’invenzione può essere utile per una varietà di applicazioni terapeutiche.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Come utilizzato nel presente documento, il termine terpeni racchiude una famiglia eterogenea molto grande di composti comprendenti emiterpeni, costituiti da una singola unità isoprenica, monoterpeni, costituiti da due unità isopreniche, sesquiterpeni, costituiti da tre unità isopreniche, diterpeni, costituiti da quattro unità isopreniche, sesterterpeni, terpeni aventi 25 atomi di carbonio e cinque unità isopreniche, triterpeni, costituiti da sei unità isopreniche nelle loro forme neutre e acide (i cosiddetti acidi triterpenici), sesquarterpeni, costituiti da sette unità isopreniche, tetraterpeni, contenenti otto unità isopreniche. La frazione attiva isolata dell’invenzione contiene anche monomeri mircene e forme oligomere di mircene aventi un grado di polimerizzazione minore di 8.
Come utilizzato nel presente documento, il termine “grado di purezza” si riferisce al contenuto di terpeni attivi, comprendenti emiterpeni, monoterpeni, sesquiterpeni, diterpeni, sesterterpeni, triterpeni, nelle loro forme neutre e acide, sesquarterpeni, tetraterpeni, espresso in percentuale in peso sulla base del peso.
Il processo comprende le fasi di:
(a) trattare il mastice con metanolo o una miscela di metanolo e acetato di etile;
(b) preparare una colonna cromatografica con una resina a fase inversa; (c) caricare la colonna con la soluzione ottenuta nella fase (a);
(d) eluire con 100% di metanolo una frazione ricca di monomeri terpenici e oligomeri dalla cromatografia a fase inversa;
(e) rigenerare la colonna rimuovendo dalla colonna la frazione ricca di polimeri poli-terpenici con il 100% di acetato di etile;
(f) rimuovere il solvente dalla frazione solubile ottenuta nella fase (d), per esempio per mezzo di evaporazione rotante o metodi equivalenti, liofilizzazione o una loro combinazione.
La frazione ottenuta nella fase (d) è sostanzialmente ricca di monomeri terpenici e oligomeri aventi un grado di polimerizzazione minore di 8, sono solubili in metanolo e insolubili in acetato di etile. Il terpene appartiene alle famiglie degli emiterpeni, monoterpeni, sesquiterpeni, diterpeni, sesterterpeni, triterpeni, nelle loro forme neutre e acide (i cosiddetti acidi triterpenici), sesquarterpeni e tetraterpeni.
La composizione della frazione ottenuta nella fase (d) è sostanzialmente priva di polimeri poli-terpenici che sono insolubili in metanolo e solubili in acetato di etile.
Come alternativa al mastice di Chios da Pistacia lentiscus, possono essere utilizzati altri mastici derivati da una pianta della famiglia delle Anacardiaceae come materiale di partenza, in particolare da Pinus, Picea, Juniperus, Alsies, Larix, Antirrhinum, Boswellia, Citrus e Gynura. Specie Pistacia adatte includono Pistacia atlantica, Pistacia palestina, Pistacia saportae, Pistacia terebinthus, Pistacia vera e Pistacia integerrima.
Il processo dell’invenzione è divulgato in dettaglio di seguito nel presente documento:
Fase 1. Scioglimento della materia prima mastice di Chios in un appropriato
La materia prima mastice di Chios è sciolta in una miscela 40% di acetato di etile/60% di metanolo o 100% di acetato di etile, preferibilmente, in 80% di acetato di etile/20% di metanolo.
i. La materia prima mastice di Chios è sciolta nel solvente del punto (i) a una concentrazione peso/volume da 1 mg/mL a 50 mg/mL, tipicamente a una concentrazione di 10 mg/mL.
ii. La soluzione di mastice di Chios del punto (ii) è mescolata sotto agitazione a una temperatura da 15°C a 25°C, preferibilmente da 20°C a 23°C. La soluzione è agitata per un periodo da 6 a 12 ore, preferibilmente da 8 a 10 ore. La materia prima mastice è preferibilmente sciolta in un bagno a ultrasuoni a temperatura controllata e con una potenza da 50 a 150 Watt, preferibilmente di 100 Watt.
iii. La soluzione al punto (iii) è centrifugata per rimuovere il materiale insolubile tra 5000 e 10000 g, preferibilmente 7000 g, a una temperatura da 18°C a 25°C, preferibilmente di 20°C, per 30 e 90 minuti, preferibilmente 60 min. La soluzione al punto (iii) può essere filtrata o ulteriormente filtrata dopo centrifugazione su filtri di cellulosa a una temperatura da 18°C a 25°C, preferibilmente di 20°C.
FASE 2. Frazionamento su cromatografia a fase inversa
i. Le colonne cromatografiche sono preparate mediante impaccamento con resine a fase inversa disponibili sul mercato, preferibilmente resine BioSil C18 HL90 40-63 e resine Sephadex LH20.
ii. Le resine del punto (i) sono delicatamente sciolte in una soluzione comprendente dal 15% al 30% di metanolo, preferibilmente al 20% di metanolo. Le resine in soluzione sono delicatamente mescolate a temperatura ambiente per 30120 min., secondo il tipo di resina. La soluzione con le resine disciolte è degassata in un bagno a ultrasuoni per 10-20 min. e le colonne sono delicatamente impaccate.
iii. Il volume delle colonne e la quantità di resina a fase inversa del punto (ii) sono strettamente correlati alla concentrazione della soluzione ottenuta nella FASE 1. La quantità preferita di resina e la concentrazione dei rapporti di soluzione sono tra 10 mg/mL di soluzione/10 mg di resina fino a 30 mg/mL di soluzione/10 mg di resina.
iv. La soluzione preparata nella FASE 1 è caricata sulla parte superiore della colonna impaccata con la resina e la soluzione recuperata è ricaricata sulla stessa colonna. La soluzione recuperata ottenuta dalla seconda eluizione viene scartata. Tutto il materiale estratto dal mastice di Chios mediante la procedura riportata nella FASE 1 composto dalla frazione attiva di terpeni che possiedono attività biologiche, ma anche poli-terpeni, in particolare il polimero poli-�-mircene, sono ora adsorbiti sui gruppi idrofobi della resina.
v. Si aggiunge una soluzione al 100% di metanolo sulla colonna preparata secondo il punto (iii). In una forma di realizzazione preferita, sono aggiunti 10 mL di metanolo per 10 mg di resina e la soluzione eluita recuperata e analizzata per la presenza della frazione di terpeni attivi e polimeri poli-terpenici.
vi. Una soluzione al 100% di acetato di etile è ora aggiunta sulla colonna dopo il trattamento come illustrato nel punto (v). In una forma di realizzazione preferita, sono aggiunti 20 mL di acetato di etile per 10 mg di resina e la soluzione eluita recuperata e analizzata per la presenza dei terpeni attivi e polimeri politerpenici.
FASE 3. Essiccazione della soluzione di frazione attiva ricca di terpeni i. La soluzione della FASE 2 in metanolo è essiccata per mezzo di un evaporatore rotante a una temperatura variabile tra 30°C e 50°C, preferibilmente a 40°C, poiché temperature più elevate inducono la degradazione di terpeni, o liofilizzata. In una forma di realizzazione preferita, è utilizzata la liofilizzazione.
Le due soluzioni ottenute nella FASE 2, eluite con il 100% di metanolo e il 100% di acetato di etile, sono state testate mediante HPLC-ESI-MS (massa per ionizzazione elettrospray) per il contenuto e la presenza di terpeni, e mediante HPSEC (cromatografia a esclusione dimensionale ad alte prestazioni) per il contenuto e la presenza di polimeri poli-terpenici.
L’HPLC-ESI-MS, mediante l’utilizzo di colonne analitiche a fase inversa, è in grado di separare i terpeni sulla base della loro struttura e idrofobicità e rilevati mediante ESI-MS. Inoltre, l’ESI-MS e la massa tandem sono in grado di identificare le diverse molecole sulla base dei loro valori di massa e pattern di frammentazione.
Come esaurientemente descritto negli esempi, la frazione eluita dalla colonna impaccata con resine a fase inversa e costituita dal 100% di metanolo, contiene esclusivamente terpeni, con un titolo maggiore del 98% e monomeri e oligomeri mircene aventi un grado di polimerizzazione minore di 8 e sostanzialmente priva di poli-terpeni con un grado di polimerizzazione nell’intervallo da almeno circa 8 a circa 1800 e un peso molecolare medio nell’intervallo da circa 1000 a circa 100000.
La frazione eluita dalla colonna con il 100% di acetato di etile contiene esclusivamente poli-terpeni con un grado di polimerizzazione nell’intervallo da almeno circa 8 a circa 1800 e un peso molecolare medio nell’intervallo da circa 1000 a circa 100000, confermando che è stata ottenuta una separazione preferenziale mediante l’utilizzo di metanolo e acetato di etile.
Le frazioni ottenute mediante il processo descritto sopra possono essere opportunamente formulate, in miscela con un veicolo accettabile in una forma adatta per la somministrazione mediante via orale, topica, parenterale o transdermica, per applicazioni cosmetiche, dermatologiche, farmaceutiche o nutraceutiche.
Una formulazione topica può essere adatta per la somministrazione dermica, vaginale, rettale, per inalazione, intranasale, oculare, auricolare o buccale. Esempi di veicoli adatti includono un olio minerale o un olio vegetale o una loro combinazione. Il veicolo può inoltre comprendere almeno una cera, come cera d’api, cere vegetali, cere di canna da zucchero, cere minerali e cere sintetiche.
Esempi di forme adatte includono capsule, compresse, liposomi, supposte, sospensioni, pomate, creme, lozioni, soluzioni, emulsioni, nanoemulsioni, microemulsioni, film, cementi, polveri, colle, aerosol, spray.
Le frazioni dell’invenzione sono attive contro l’Helicobacter pylori e sono quindi utili per il trattamento di infiammazione gastrica e ulcera peptica, come pure per gastrite cronica attiva, atrofia gastrica, adenocarcinoma gastrico e linfoma del tessuto linfoide associato alle mucose. Le frazioni e le composizioni dell’invenzione sono anche utili per il trattamento di disturbi della pelle, in particolare per indurre la riparazione dei tessuti e la guarigione delle ferite, per eczema, psoriasi, cheratosi seborroica, seborrea e ferite della pelle comprese ulcere venose dell’arto inferiore, ulcere da pressione, ulcere diabetiche del piede, ustioni, ulcere da decubito (decubiti), innesti donatori split-pelle, siti donatori di innesto pelle, siti di impianto di dispositivo medico, ferite da morso, ferite da punture, dermoabrasioni, contusioni, ferite da infezioni e ferite chirurgiche.
La quantità terapeuticamente efficace delle frazioni dell’invenzione può variare secondo il soggetto destinatario, la via e la frequenza di somministrazione. In generale, la quantità può convenientemente essere nell’intervallo da circa lo 0,1% a circa il 50% p/p rispetto al peso totale della composizione.
Le composizioni farmaceutiche o nutraceutiche dell’invenzione possono essere prodotte per mezzo di processi di miscelazione convenzionale, granulazione, incapsulamento di softgel, dissoluzione, estrazione o liofilizzazione.
L’invenzione è descritta in maggior dettaglio nei seguenti esempi.
Esempio 1
La materia prima mastice di Chios avente un aspetto cristallino è sciolta a una concentrazione di 20 mg/mL in 100% di acetato di etile. La soluzione è mescolata con un agitatore a una temperatura di 20°C per 8 ore in un bagno a ultrasuoni con una potenza di 100 Watt.
Dopo questo, la soluzione risultante è centrifugata per rimuovere tutto il materiale insolubile a 7000 g a 20°C per 60 min.
Una colonna cromatografica è preparata mediante impaccamento con resina a fase inversa BioSil C18 HL90 40-63 in 20% di metanolo mescolando delicatamente alla temperatura ambiente di 22°C per 30 min. Dopo degasaggio in un bagno a ultrasuoni per 10 min., la resina è delicatamente impaccata nella colonna per semplice gravità. 10 mg di resina sono utilizzati e impaccati in una colonna di 1 cm x 20 cm.
La soluzione di 20 mg/mL di mastice di Chios in 100% di acetato di etile è caricata sulla parte superiore della colonna e la soluzione recuperata è ricaricata sulla stessa colonna solo una volta. Dopo questa fase, la soluzione recuperata ottenuta dalla seconda eluizione viene scartata.
10 mL di metanolo sono aggiunti alla colonna e la soluzione eluita è recuperata e analizzata per la presenza di frazione di terpeni attivi e polimeri politerpenici (Figura 1 e Tabella 1).
(m/z)<-1>SPECIE Numero di Picco Acido oleanonico
453, Acido moronico
47, 48, 57, 58 C30H46O3Acido 24Z-isomasticadienonico
Acido 24Z-masticadienonico
Acido oleanolico
455,
Acido 24Z-masticadienolico 46, 52 C30H48O3
Acido 24Z-isomasticadienolico
Acido enoxolone
22, 30, 31, 33, 35, 469, Acido albasapogenina
36, 37, 40, 41, 44, C30H46O4 Acido coleonolico
50
Acido glicirretinico
Acido ederagenico
471,
Acido maslinico 55
C30H46O3 Acido corosolico
Se analizzata in massa tandem, il
501,
pattern di frammentazione appartiene a 9, 10, 16, 32 C30H46O6
isomeri strutturali di acidi terpenici
Tabella 1. Specie del mastice di Chios presenti nella soluzione metanolica utilizzata per eluire terpeni dalla colonna impaccata con BioSil C18 HL90 40-63 e separate mediante HPLC-ESI-MS illustrato in Figura 1. Gli acidi terpenici sono stati caratterizzati e identificati in modo non ambiguo per mezzo di massa tandem e modello di frammentazione,
20 mL di acetato di etile sono quindi aggiunti alla colonna e la soluzione eluita recuperata e analizzata per la presenza di terpeni attivi e polimeri politerpenici (Figura 2).
La soluzione ottenuta eluendo con metanolo è essiccata utilizzando un evaporatore rotante a una temperatura di 40°C. 7,6 mg di materiale sono ottenuti in forma secca, con un recupero di circa il 38%.
La Figura 1 illustra il cromatogramma HPLC-ESI-MS della soluzione di metanolo utilizzata per eluire terpeni dalla colonna impaccata con BioSil C18 HL90 40-63. Come evidente, sono presenti molte specie aventi basso peso molecolare con un grado di polimerizzazione minore di 8. Utilizzando i valori di massa e di massa tandem con il pattern di frammentazione, molte specie terpeni appartenenti a emiterpeni e/o monoterpeni e/o sesquiterpeni e/o diterpeni e/o sesterterpeni e/o triterpeni, nelle loro forme neutre e acide, e/o sesquarterpeni e/o tetraterpeni, sono state identificate (Tabella 1). Inoltre, in dettaglio, il procedimento oggetto della presente invenzione era in grado di arricchire la frazione attiva con l’acido terpenico considerato il componente più attivo contro l’Helicobacter pylori [8] (Tabella 1).
Al contrario, è stato trovato che la soluzione eluita con acetato di etile mancava di tali specie con conseguente cromatogramma HPLC-ESI-MS che non mostra alcun picco (non mostrato).
L’HPSEC è stato utilizzato per verificare la presenza di polimeri politerpenici con un grado di polimerizzazione maggiore di 8 e un peso molecolare medio nell’intervallo da circa 1000 a circa 100000. Nessun picco è stato rilevato nella soluzione di metanolo (non mostrato) fornendo un titolo di terpeni del 99,2%, al contrario dell’estratto con acetato di etile che mostra un grande picco appartenente a poli-terpeni aventi un grado di polimerizzazione compreso tra circa 10 e 500 (Figura 2).
In conclusione, la soluzione di metanolo ottenuta dalla colonna impaccata con BioSil C18 HL90 40-63 era essenzialmente composta da monomeri terpenici e oligomeri con un grado di polimerizzazione minore di circa 8 con una purezza maggiore del 98%. Inoltre, la soluzione di metanolo recuperata mostra la presenza di un grande contenuto dell’acido terpenico considerato il componente più attivo contro l’Helicobacter pylori [8]. I polimeri poli-terpenici presenti nel mastice di Chios sono tutti recuperati in soluzione di 100% di acetato di etile.
Esempio 2
La materia prima mastice di Chios avente un aspetto cristallino è sciolta a una concentrazione di 30 mg/mL in 50% di metanolo e 50% di acetato di etile. La soluzione è mescolata con un agitatore alla temperatura di 25°C per 10 ore in un bagno a ultrasuoni con una potenza di 150 Watt.
Dopo questo, la soluzione risultante è centrifugata per rimuovere tutto il materiale insolubile in una centrifuga a una forza di 10000 g a 22°C per 90 min. e ulteriormente filtrata su filtri di filtri di cellulosa a una temperatura di 22°C.
Una colonna cromatografica è preparata mediante impaccamento con resina in fase inversa Sephadex LH20 in 25% di metanolo mescolando delicatamente alla temperatura ambiente di 24°C per 60 min. Dopo degasaggio in un bagno a ultrasuoni per 10 minuti, la resina è delicatamente impaccata sulla colonna per semplice gravità. 10 mg di resina sono utilizzati e impaccati in una colonna di 1 cm x 20 cm.
La soluzione di 30 mg/mL di mastice di Chios in 50% di metanolo e 50% di acetato di etile è caricata sulla parte superiore della colonna e la soluzione recuperata è ricaricata sulla stessa colonna solo una volta. Dopo questa fase, la soluzione recuperata ottenuta dalla seconda eluizione viene scartata.
Sono aggiunti 10 mL di metanolo alla colonna e la soluzione eluita è recuperata e analizzata per la presenza della frazione di terpeni attivi e polimeri politerpenici (Figura 3 e Tabella 2).
20 mL di acetato di etile sono quindi aggiunti alla colonna e la soluzione eluita recuperata e analizzata per la presenza dei terpeni attivi e polimeri politerpenici (Figura 4).
La soluzione ottenuta eluendo con metanolo è liofilizzata.
La Figura 3 illustra il cromatogramma HPLC-ESI-MS della soluzione di metanolo utilizzata per eluire terpeni dalla colonna impaccata con Sephadex LH20. Anche utilizzando questa resina differente rispetto all’Esempio 1, sono presenti molte specie avente basso peso molecolare con un grado di polimerizzazione minore di 8. Utilizzando i valori di massa e di massa tandem con il pattern di frammentazione, molte specie terpeni appartenenti a emiterpeni e/o monoterpeni e/o sesquiterpeni e/o diterpeni e/o sesterterpeni e/o triterpeni, nelle loro forme neutre e acide, e/o sesquarterpeni e/o tetraterpeni, sono state identificate (Tabella 2). Inoltre, anche il procedimento adottato in questo Esempio è stato in grado di arricchire la frazione attiva con l’acido terpenico considerato il componente più attivo contro l’Helicobacter pylori [8] (Tabella 2).
(m/z)<-1>SPECIE Numero di Picco Acido oleanonico
453 Acido moronico
42, 44, 52, 53 C30H46O3Acido 24Z-isomasticadienonico
Acido 24Z-masticadienonico
Acido oleanolico
455
Acido 24Z-masticadienolico 41, 47 C30H48O3
Acido 24Z-isomasticadienolico
Acido enoxolone
20, 25, 26, 30, 31, 469 Acido albasapogenina
32, 34, 35, 37, 38, C30H46O4 Acido coleonolico
41, 43
Acido glicirretinico
Acido ederagenico
471
Acido maslinico 50
C30H46O3 Acido corosolico
Se analizzata in massa tandem, il pattern
501
di frammentazione appartiene a isomeri 7, 8, 15, 27 C30H46O6
strutturali di acidi terpenici
Tabella 2. Le specie di mastice di Chios presenti nella soluzione metanolica utilizzata per eluire terpeni dalla colonna impaccata con resina Sephadex LH20 e separate mediante HPLC-ESI-MS illustrato in Figura 3. Gli acidi terpenici sono stati caratterizzati e identificati in modo non ambiguo per mezzo di massa tandem e modello di frammentazione
Al contrario, anche in questo caso, la soluzione eluita con acetato di etile mostra un cromatogramma HPLC-ESI-MS con nessun picco (non mostrato) che conferma l’assenza di specie terpeni aventi basso peso molecolare con un grado di polimerizzazione minore di 8.
L’HPSEC è stato utilizzato per verificare la presenza di polimeri politerpenici con un grado di polimerizzazione maggiore di 8 e un peso molecolare medio nell’intervallo da circa 1000 a circa 100000. Nessun picco è stato rilevato nella soluzione di metanolo (non mostrato) fornendo un titolo di terpeni del 98,7%, al contrario dell’estratto di acetato di etile che mostra un grande picco appartenente ai poli-terpeni aventi un grado di polimerizzazione determinato tra circa 15 e 700 (Figura 4).
In conclusione, la soluzione di metanolo ottenuta dalla colonna impaccata con resina Sephadex LH20 descritta in questo Esempio era essenzialmente costituita da monomeri terpenici e oligomeri con un grado di polimerizzazione minore di circa 8 con una purezza maggiore del 98%. Inoltre, la soluzione di metanolo recuperata mostra la presenza di un elevato contenuto dell’acido terpenico considerato il componente più attivo contro l’Helicobacter pylori. I polimeri poli-terpenici presenti nel mastice di Chios sono recuperati in soluzione al 100% di acetato di etile.
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Claims (9)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Frazione isolata di mastice di Chios arricchita di monomeri terpenici e oligomeri e sostanzialmente priva di polimeri poli-terpenici con un grado di polimerizzazione maggiore di 8 e un peso molecolare medio nell’intervallo da circa 1000 a circa 100000.
  2. 2. Frazione isolata secondo la rivendicazione 1, in cui il contenuto di monomeri terpenici e oligomeri supera il 98% in peso.
  3. 3. Frazione isolata secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui i monomeri terpenici includono acidi terpenici, emiterpeni, monoterpeni, sesquiterpeni, diterpeni, triterpeni sesterterpeni, nelle loro forme neutre o acide, sesquarterpeni, tetraterpeni.
  4. 4. Frazione isolata secondo la rivendicazione 3, in cui gli acidi terpenici includono acido oleanonico, acido moronico, acido 24Z-masticadienonico, acido 24Z-isomasticadienonico, acido 24Z-masticadienolico, acido 24Z-isomasticadienolico, tirucallolo, dammaradienone, 28-norolean-12-en-3-one, aldeide oleanonica e aldeide oleanolica.
  5. 5. Frazione isolata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, avente meno del 2% in peso di polimero β-mircene.
  6. 6. Processo per la preparazione delle frazioni terpeniche secondo le rivendicazioni da 1 a 5, comprendente le fasi di: (a) trattare il mastice di Chios con metanolo o una miscela di metanolo e acetato di etile; (b) sottoporre la soluzione ottenuta in a) a cromatografia su una resina a fase inversa ed eluire con metanolo per dare una frazione ricca di monomeri terpenici e oligomeri; (c) rigenerare la resina a fase inversa con acetato di etile; (d) rimuovere il metanolo dalla frazione solubile ottenuta nella fase (b).
  7. 7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui il metanolo nella fase (d) è rimosso mediante evaporazione, liofilizzazione o una loro combinazione.
  8. 8. Composizione farmaceutica, cosmetica o nutraceutica comprendente le frazioni secondo le rivendicazioni da 1 a 5.
  9. 9. Composizione secondo la rivendicazione 8, in forma di capsule, compresse, supposte, sospensioni, unguenti, creme, lozioni, soluzioni, emulsioni, film, polveri, colle, aerosol, spray.
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