IT201700022111A1 - Metodo per ottenere N-acetil-D-amminoacidi da miscele raceme degli stessi - Google Patents

Description

Background dell’invenzione

La presente invenzione riguarda un nuovo procedimento per la preparazione di D-amminoacidi nacetilati a partire da miscele raceme degli stessi. Mentre per anni gli L-isomeri degli amminoacidi sono stati considerati gli unici fondamentali per la vita, i D-amminoacidi hanno attratto l'interesse dell'industria farmaceutica con diverse applicazioni. Antibiotici naturali e semi-sintetici, immunosoppressori, farmaci per il sistema nervoso centrale, agenti cardiovascolari, anti-ipertensivi o rimedi alla disfunzione erettile e, più in generale, le molecole che sono considerati tra i "farmaci essenziali" per la World Health Organization hanno una base costituita da un D-amminoacido. In questo contesto, I D-amminoacidi n-funzionalizzati sono di particolare importanza. Inoltre, i D-amminoacidi sono presenti nelle strutture di base di dolcificanti, agenti aromatizzanti ed additivi, pesticidi, deodoranti, componenti attivi di preparati cosmetici, marcatori fluorescenti e trovano applicazione in vari campi della chimica organica [S. Martínez-Rodríguez, CHEMISTRY & BIODIVERSITY, 7, 2010; X. Gao, Appl Microbiol Biotechnol., 99(8), 2015]. In natura, le racemizzazioni chimiche acido o base catalizzate occorrono per gli L-amminoacidi mediante tautomerizzazione cheto/enolica. D-isomeri singoli sono comunemente risolti utilizzando tecniche di cristallizzazione diastereoisomera, racemizzazione seguita dalla risoluzione chimica [US5679857], cromatografia chirale o la risoluzione enzimatica di derivati. Inoltre, e’ stato descritto l’utilizzo di idrogenazione asimmetrica catalitica per ottenere il amminoacidi da opportuni intermedi [WO2012041986A1]. In generale, acidi i D-amminoacidi possono essere preparati o isolati enzimaticamente, ad esempio utilizzando idrolasi, ossidoreduttasi, e amminotransferasi [X. Gao, Appl Microbiol Biotechnol., 99 (8) 2015]. Procedimenti per preparare N-alchil-L o D-amminoacidi a catena aperta enantiomericamente puri, (o N-acil-N-alchil-L o D-amminoacidi) sono stati precedentemente riportati [US5348882]. L'applicazione di questo metodo è molto limitata dalla necessità di avere una acilasi stereospecifica, che necessita di una miscela racema di N-acil-N-alchil-amminoacidi come substrato. La D-ammino acilasi è stata inoltre discussa come strumento per fornire i corrispondenti, otticamente attivi, D-amminoacidi da N-acil-amminoacidi [US6869788]. Un altro metodo per la preparazione di D-amminoacidi richiede la produzione di una cellula ricombinante, esprimente una D-ammino transferasi ed una L-ammino deaminase [US5728555]. E 'stato proposto che la separazione di D-amminoacidi da una miscela racema può essere perseguita usando un microrganismo avente la capacità di degradare asimmetricamente gli L-amminoacidi con evidenti ripercussioni su rendimenti e costi [US 5.783.427, US6015698]. E’ stato anche descritto l'uso di una D-amminoacido transferasi mutante su un substrato complesso contenente un primo D-amminoacido, un donatore aminico, un accettore aminico ed un primo cheto-acido per dare un secondo acido D-amminoacido e un secondo cheto-acido [US6337190]. Polipeptidi specifici sono stati rivendicati per catalizzare la conversione di un 2-cheto acido al corrispondente D-amminoacido, utilizzando quindi intermedi che spesso non sono facilmente disponibili [US2008182972A1]. Sebbene la letteratura sia ampia e comprenda numerosi esempi di preparazioni di D-amminoacidi e in particolare di N-alchil-D-amminoacidi, la potenziale applicazione industriale dei metodi descritti è molto limitata. In realtà, complicate operazioni multi-fase, spesso non convenienti, insieme con rese e/o gradi di purezza insoddisfacenti, evidenziano la necessità di nuove tecniche di preparazione.

Descrizione dell’invenzione

Per realizzare le fasi necessarie per ottenere la sintesi di D-amminoacidi N-acetilati da una soluzione acquosa di DL-amminoacidi, nella presente invenzione sono considerate due differenti classi di enzimi: racemasi (E.C. 5.1.1.X) ed N-acetil-transferasi (E.C. 2.3.1.X). In particolare, nella presente invenzione, sono considerate le serina racemasi (E.C. 5.1.1.18) e le D-ammino N-acetil transferasi (E.C. 2.3.1.36). Gli enzimi possono essere espressi e purificati in organismi adatti come ben noto agli esperti del ramo.

Gli organismi per l’espressione di enzimi ed i sistemi molecolari (vettori di espressione), nonché le tecniche di purificazione enzimatiche e le metodologie generali di biologia molecolare non sono considerate ai fini della presente invenzione. Ci sono molti modi in cui gli enzimi possono essere implementati per catalizzare le reazioni: a) gli enzimi possono essere utilizzati liberi o immobilizzati su un supporto adeguato; b) possono essere accoppiati con una adeguato polipeptide distanziatore ed espressi sotto forma di un multi-enzima, una proteina ibrida con due funzioni catalitiche; c) possono lavorare, espressi liberi o come multi-enzima, all'interno di una appropriata cellula vivente per evitare la rigenerazione cofattori e massimizzare l'economia del processo. Quest’ultimo scenario è chiamato "Whole Cell Catalysis", l'esecuzione di catalisi enzimatica all'interno di una cellula vivente, che è, per gli scopi della presente invenzione, molto efficace per risolvere il problema della rigenerazione cofattori.

a) racemasi; considerando l'attività racemasica, la presente invenzione considera:

a1) un polipeptide serina racemasi (E.C. 5.1.1.18) da Arabidopsis thaliana, o una delle sue varianti, come ad esempio quelle ottenute con tecniche di biologia molecolare, che condivida almeno l’86% di omologia con il tipo selvatico (SEQ ID No.1).

a2) una sequenza amminoacidica codificata da un acido nucleico che si ibrida, sostanzialmente per l'intera lunghezza, ad un acido nucleico che corrisponde ad una sequenza polinucleotidica complementare ad un polinucleotide che codifica un polipeptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No.1

b) N-acetil transferasi; considerando l'attività N-acetil transferasica, la presente invenzione prevede: b1) una N-acetil transferasi (EC 2.3.1.36) da Saccharomices cerevisiae, o una delle sue varianti, come ad esempio una forma mutante priva all’N-terminale di 26 amminoacidi o quelli ottenuti con tecniche di mutagenesi, che condivida almeno il 56 % di omologia con il tipo selvatico (ID SEQ No.2). b2) una sequenza amminoacidica codificata da un acido nucleico che si ibrida, sostanzialmente per l'intera lunghezza, ad un acido nucleico che corrisponde ad una sequenza polinucleotidica complementare ad un polinucleotide che codifica un polipeptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No.2.

c) racemasi / N-acetil transferasi multi-enzima; considerando l’attività racemasi / N-acetil transferasi come multi-enzima, la presente invenzione prevede:

c1) un polipeptide con attività di racemasi / N-acetil transferasi ottenuto accoppiando correttamente gli enzimi precedenti, o qualsiasi delle loro varianti, [come indicato ai punti a) e b)] con una opportuna sequenza polipeptidica di spaziatura (SEQ ID No.3).

c2) una sequenza amminoacidica codificata da un acido nucleico che si ibrida, sostanzialmente per l'intera lunghezza, ad un acido nucleico che corrisponde ad una sequenza polinucleotidica complementare ad un polinucleotide che codifica un polipeptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No.3.

d) polipeptide di spaziatura: la sequenza polipeptidica di spaziatura, che collega i due enzimi, può essere scelta fra qualsiasi combinazione di amminoacidi, preferibilmente il polipeptide è costituito da 0 a 102 residui amminoacidici, più preferibilmente da 3 a 24 residui, più preferibilmente da 4 a 12 residui. I residui amminoacidici possono essere scelti tra qualsiasi tipo di amminoacido, preferibilmente presentante gruppi laterali non carichi, più preferibilmente con gruppi laterali corti e non carichi, più preferibilmente i residui di amminoacidi sono costituiti da molecole di Glicina ed Alanina come illustrato in Figura 1.

Gli enzimi menzionati nella presente invenzione possono essere utilizzati per ottenere N-acetil-D-amminoacidi se applicati a una soluzione acquosa racema di DL-amminoacidi.

In una realizzazione della presente invenzione, la racemasi (SEQ ID No.1) e la N-acetilasi (SEQ ID No.2) vengono clonate ed espresse come proteine libere in un ospite adatto, come, ma non limitati a, standard E. coli ceppo BL21, usando metodi di biologia molecolare, ben noti agli esperti del ramo. Gli enzimi liberi possono essere purificati di conseguenza con metodi cromatografici comuni. L'aggiunta di particolari code, come code di istidine, al N o C terminale di entrambe le proteine non altera la loro funzione. In questa particolare forma, gli enzimi, una volta purificati, vengono aggiunti liberi in una soluzione acquosa di DL-amminoacidi. Co-fattori (acetil-CoA) e specifici ioni inorganici (Mg2+) dovrebbero essere aggiunti per promuovere e massimizzare le prestazioni catalitiche.

In un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, la racemasi (SEQ ID No.1) e la N-acetilasi (SEQ ID No.2) vengono clonate ed espresse come proteine libere in un ospite adatto, come, ma non limitati a, standard E.coli ceppo BL21, usando metodi di biologia molecolare, ben noti agli esperti del ramo. Gli enzimi liberi non vengono purificati, ma aggiunti direttamente dopo la lisi dell’organismo alla soluzione acquosa di DL-amminoacidi. In questa particolare forma, non è necessario aggiungere cofattori e ioni inorganici specifici, che sono già presenti nella miscela del lisato grezzo.

Un'altra forma della presente invenzione considera la racemasi (SEQ ID No.1) e la N-acetilasi (SEQ ID No.2), clonate ed espresse come multi-enzima (SEQ ID No.3), con una corretta sequenza spaziatrice in un ospite adatto, come ad esempio, ma non limitato a, ceppo standard di E. coli BL21, usando metodi di biologia molecolare, ben noti agli esperti del ramo. In questa particolare realizzazione, il multi-enzima, una volta purificato, viene aggiunto libero di una soluzione acquosa di DL-amminoacidi. Co-fattori (acetil-CoA) e specifici ioni inorganici (Mg2+) dovrebbero essere aggiunti per promuovere e massimizzare le prestazioni catalitiche.

Un’altra forma della presente invenzione, considera la racemasi (SEQ ID No.1) e la N-acetilasi (SEQ ID No.2), clonate ed espresse come multi-enzima (SEQ ID No.3), con una corretta sequenza spaziatrice un ospite adatto, come ad esempio, ma non limitato a, standard di ceppo E. coli BL21, usando metodi di biologia molecolare, ben noti agli esperti del ramo. L'enzima libero non è purificato e viene aggiunto direttamente dopo lisi dell’organismo d’espressione alla soluzione acquosa di DL amminoacidi. In questa particolare forma di realizzazione, non è necessario aggiungere cofattori e ioni inorganici specifici, che sono già presenti nella miscela di lisato grezzo.

Una forma di realizzazione della presente invenzione, riguarda l'uso della racemasi (SEQ ID No.1) e della N-acetilasi (SEQ ID No.2), espresse libere come singoli enzimi, o insieme come multi-enzima (SEQ ID No.3), all'interno di un ospite industriale adatto, come ad esempio, ma non limitato a, ceppi standard di E. coli. I terreni di coltura possono essere di qualsiasi tipo, ma per semplificare il processo, si preferisce utilizzare quelli definiti chimicamente. L'espressione degli enzimi viene innescata e dopo un tempo adeguato si aggiungono i DL-amminoacidi direttamente al mezzo di coltura (come solido o soluzione concentrata), con l’organismo d’espressione ancora intatto. In questo modo, ci si avvale delle vie metaboliche dell'organismo vivente, che sono ancora funzionali, per la rigenerazione dei cofattori. I DL-amminoacidi d’interesse vengono assorbiti dal brodo di coltura e trattati, all'interno della cellula, dagli enzimi espressi. Una volta che il D-amminoacido viene convertito nella forma N-acetilata (forma N-protetta), esso non può più essere utilizzato dalla cellula e quindi viene secreto all’esterno, di nuovo nel brodo di coltura, dove può essere recuperato con, ma non limitate a, tecniche cromatografiche standard o cristallizzazione differenziale. Le tecniche di recupero e purificazione non vengono descritte in questa invenzione. La concentrazione ottimale di DL-amminoacidi da utilizzare al fine di massimizzare le rese possono variare a causa delle condizioni e dei sistemi di processo. In generale, a seconda del tipo di amminoacido, si deve considerare un intervallo di concentrazione tra 0,01 mg/mL e 20 mg/mL, preferibilmente tra 0,1 mg/mL e 10 mg/mL, più preferibilmente tra 1 mg/mL e 3 mg/mL.

Esempi

Esempio 1

La serina racemasi (SEQ ID No.1) e la N-acetil transferasi (SEQ ID No.2) sono clonate insieme come multi-enzima (SEQ ID N. 3) in un opportuno vettore commerciale per l'espressione in ceppo standard di E.coli BL21 DE3. Il vettore di espressione commerciale porta una resistenza alla kanamicina. La molecola di induzione è l’IPTG. I parametri di coltura sono standard, e ben noti agli esperti del ramo. La composizione del terreno di coltura impiegato è descritta in Tabella 1. I batteri sono stati coltivati in beute in un volume totale di terreno pari a 100mL e ad una temperatura di 37°C. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.

Durante la fase di crescita esponenziale, l'espressione multi-enzima è stata indotta. Successivamente, sono state aggiunte diverse quantità di DL-serina ed L-serina, direttamente come solido (polvere) nel brodo. Gli esperimenti sono stati arbitrariamente arrestati dopo 6 ore dall'aggiunta della serina.

La biomassa batterica è stata separata per centrifugazione dal brodo di coltura. Il terreno di coltura è stato direttamente analizzato in HPLC usando una colonna Astec Chirobiotic T di Supelco (con rilevatore a serie di diodi settato a 200nm; metodo analitico standard, non riportato ai fini di questa invenzione). Nel grafico 1 sono riportati i profili di densità ottica delle culture durante i test.

Il miglior risultato è stato ottenuto aggiungendo 1 mg/mL di DL-serina al brodo di coltura.

Dopo 6 ore di processo: 0,63 mg/mL di N-acetil-D-serina e 0,04 mg/mL di N-acetil-L-serina sono stati ottenuti con un eccesso enantiomerico (ee) 88%. I risultati completi sono riportati nella tabella 2.

Esempio 2

Come esempio 1, ma in questo caso sono stati creati tre ceppi per esprimere rispettivamente:

Ceppo A): serina racemasi (SEQ ID No.1)

Ceppo B): N-acetil transferasi (SEQ ID No.2)

Ceppo C): serina racemasi (SEQ ID No.1) ed N-acetil transferasi (SEQ ID No.2) indipendentemente. La DL-serina è stata aggiunta ad una concentrazione iniziale totale di 2,3 mg/mL.I risultati sono riportati nella tabella 3.

Esempio 3

Come esempio 1, ma in questo caso diversi amminoacidi sono stati testati utilizzando un ceppo esprimente il multi-enzima.

Gli amminoacidi sono stati aggiunti ad una concentrazione iniziale pari a 2 mg/mL.

I risultati sono riportati nella tabella 4.

Claims (8)

1. Rivendicazioni 1. Un metodo per ottenere una soluzione arricchita di D-amminoacidi da miscela racemica degli stessi mediante una racemasi che presenti almeno l’86% di omologia di sequenza polipeptidica con il tipo naturale da Arabidopsis thaliana (SEQ ID No.1).
2. 2. Un metodo per ottenere una soluzione arricchita di N-acetil-D-amminoacidi da miscele raceme dei rispettivi DL-ammino acidi, mediante una N-acetil transferasi che presenti almeno il 56% di omologia di sequenza polipeptidica con il tipo naturale da Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID No.2).
3. 3. Un metodo per ottenere una soluzione arricchita di N-acetil-D-amminoacidi da miscele racemiche degli stessi amminoacidi mediante i due polipeptidi delle rivendicazioni 1 e 2 combinati in un polipeptide unico e continuo (SEQ ID N. 3) utilizzando una sequenza spaziatrice adatta.
4. 4. Un metodo in accordo con la rivendicazione 3 in cui la sequenza polipeptidica di spaziatura tra la racemasi e la N-acetil transferasi nel multi-enzima sia costituita da una sequenza di residui di glicina e alanina.
5. 5. Un metodo in accordo con le rivendicazioni 1, 2 e 3 in cui il substrato amminoacidico racemo da risolvere e n-acetilare viene aggiunto direttamente al terreno di coltura contenente gli organismi viventi in crescita ed in cui l’espressione dei polipeptidi ricombinanti come singole proteine o come multi-enzima sia stata indotta.
6. 6. Un metodo in accordo con le rivendicazioni 1, 2 e 3 in cui l'ospite che esprime gli enzimi ricombinanti di interesse è un organismo industriale adatto.
7. 7. Un metodo in accordo con le rivendicazioni 1, 2 e 3 in cui la risoluzione enantiomerica e N-acetilazione delle miscele racemiche di amminoacidi vengono realizzate in soluzione acquosa mediante impiego dei polipeptidi come singole proteine o multi-enzima estratte dall'organismo esprimente.
8. 8. Un metodo in accordo con le rivendicazioni 1, 2, 3 e 7, in cui i polipeptidi ricombinanti espressi come singole proteine o come multi-enzima vengono impiegati direttamente utilizzando il lisato cellulare grezzo o ulteriormente purificato.