IT202100007304A1 - Metodo di applicazione di impulsi elettrici allo scopo di caricare molecole di varia natura in nanovescicole di origine vegetale - Google Patents
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Description
METODO DI APPLICAZIONE DI IMPULSI ELETTRICI ALLO SCOPO DI
CARICARE MOLECOLE DI VARIA NATURA IN NANOVESCICOLE DI ORIGINE
VEGETALE
DESCRIZIONE
Settore tecnico dell?invenzione
La presente invenzione ha per oggetto un innovativo metodo per caricare molecole di varia natura in nanovescicole di origine vegetale. In particolare, le nanovescicole sono estratte da vegetali biologici e il metodo, oggetto della presente invenzione, permette di caricare al loro interno sostanze di varia natura, ad esempio: vitamine, sostanze per uso cosmetico, farmaci e agenti per uso medico, veterinario, farmacologico ed alimentare.
Tecnica nota
Com?? noto, l?uso di nanostrutture in grado di trasportare molecole di varia natura nel sito di azione e facilitarne e migliorarne l?efficacia ? una dei principali ambiti di investimento dell?industria biotecnologica. Fino ad oggi si ? pensato di costruire artificialmente delle ?zattere lipidiche? che potessero inglobare la molecola e quindi proteggerla fino al sito di azione previsto. Queste strutture lipidiche sono state chiamate ?liposomi? e sono, ad oggi, l?unico presidio gi? testato in studi clinici.
I risultati ottenuti non sono stati in realt? incoraggianti per alcune problematiche legate alla natura artificiale dei liposomi che ne hanno favorito la tossicit? sistemica piuttosto che l?incremento di efficacia atteso. Alcune pubblicazioni della stessa scrivente hanno dimostrato la capacit? delle nanovescicole naturali, chiamate esosomi, di trasportare molecole di varia natura, da farmaci (Federici C. et al 2014, Iessi et al 2016) a nanomateriali (Logozzi et al 2020). Si ? quindi deciso di sperimentare varie metodiche allo scopo di favorire l?entrata e la permanenza di molecole di varia natura all?interno degli esosomi. Per entrare maggiormente nel merito, a differenza degli esosomi, che sono prodotti naturalmente, i liposomi sono prodotti sinteticamente e hanno una struttura lipidica a doppio strato. I liposomi sono progettati per consentire sia l'incapsulamento di molecole idrofile come siRNA, DNA e RNA, nel nucleo acquoso della vescicola, sia composti bioattivi idrofobici come proteine, peptidi, fenolici e anticorpi, nel doppio strato lipidico ( 2014).
Come ? noto allo stato della tecnica, i liposomi sono preparati per estrusione di membrana, sonicazione, microemulsificazione e congelamento-scongelamento e sono stati utilizzati nel ?delivery? di molti farmaci, ad esempio nella formulazione di anfotericina B, doxorubicina, verteporfina, citarabina, morfina solfato e daunorubicina ( 2013). La preparazione dei liposomi, tuttavia, pu? essere problematica in quanto richiede numerosi trattamenti e passaggi chimici per modificare la struttura del doppio strato lipidico usando proteine, ligandi ed anticorpi ( 1999; , 2016). Inoltre, l?uso clinico dei liposomi ha dimostrato un alto livello di tossicit?, dovuto al fatto che la gran parte dei liposomi entra nel sistema catabolico dell?organismo, venendo in gran parte sequestrati in organi cateretici come milza e fegato; questo ovviamente, oltre ad un alto livello di tossicit?, porta ad un bassissimo livello di efficienza.
Le informazioni sulle nanovescicole di derivazione vegetale stanno suscitando molto interesse sul loro possibile utilizzo come trasportatori di molecole a scopo terapeutico. Infatti, le nanovescicole naturali (?exosomes-like?) e i liposomi hanno propriet? fisico-chimiche simili ma a differenza dei liposomi, gli esosomi derivati dalle piante non entrano nel sistema catabolico degli organi filtro dell?organismo. Inoltre le intrinseche somiglianze biochimiche tra la superficie dell'esosoma e quella delle piante originarie rendono pi? fattibile, rispetto ai liposomi, indirizzare gli esosomi verso un target specifico ( 2006).
Inoltre, l?uso industriale delle nanovescicole derivanti da piante ? biorinnovabile e sostenibile. Queste osservazioni suggeriscono che l'uso di piante come sorgente industriale (nanofattorie) per la fabbricazione di nanoparticelle ad uso preventivo e terapeutico potrebbe rappresentare un nuovo approccio in nanomedicina. Si prevede infatti che la promozione di una attivit? di ricerca e sviluppo di nanovescicole per il trasporto di molecole terapeutiche contribuiranno in modo significativo allo sviluppo di nanomedicinali naturali. Quindi, le nanovescicole di origine vegetale hanno tutte le caratteristiche per consentire un adeguato trasporto di molecole terapeutiche con un basso livello di tossicit?, e non ultimo con un ridottissimo livello di inquinamento ambientale.
Tuttavia, la purificazione e concentrazione di nanovescicole di origine vegetale comporta un processo di produzione totalmente diverso da quello sintetico dei liposomi.
Non ? infatti noto un metodo efficiente ed in grado caricare molecole di varia natura in nanovescicole di origine vegetale. Un problema tecnico non ancora superato ? legato alla possibilit? di consentire un soddisfacente up-take delle molecole di interesse all?interno di nanostrutture integre, mantenendo l?integrit? delle strutture stesse.
Sintesi dell?invenzione
Oggetto della presente invenzione ? quindi un innovativo metodo per caricare molecole di varia natura in nanovescicole estratte da vegetali biologici. In particolare, il metodo consente di caricare in modo soddisfacente, attraverso elettroporazione, all?interno delle nanovescicole, ad esempio vitamine, sostanze per uso cosmetico, farmaci e agenti per uso medico, veterinario farmacologico ed alimentare.
Il metodo oggetto della presente invenzione prevede l?uso di una apparecchiatura per il caricamento delle nanovescicole con metodo fisico-chimico, attraverso la destabilizzazione transiente di tali nanovescicole. Secondo la metodologia vengono utilizzate combinazioni di impulsi elettrici singoli e come treno d?onda, a voltaggio variabile tra i 20 e i 400 volts, e durata variabile, in modo da utilizzare la sequenza pi? efficiente per il caricamento. I treni d?onda applicati inducono una permeabilizzazione transiente della nanovescicola o esosoma, che ritorner? dopo un tempo variabile e comunque inferiore ai trenta minuti allo stadio iniziale di inerzia elettrica.
Vantaggiosamente, tale periodo di permealizzazione porter? ad un aumentato traffico transmembranario che permetter? il caricamento esosomiale con varie molecole a seconda della finalit? necessaria.
Vantaggiosamente i parametri elettrici e chimico fisici (ad esempio il pH) vengono costantemente misurati durante la permeabilizzazione ed il caricamento allo scopo di migliorare l?efficienza della procedura.
Le nanovescicole estratte da vegetali di origine biologica, sono ottenute attraverso una metodologia per la quale ? stata richiesta una parallela domanda di brevetto dalla scrivente, che consiste in centrifugazioni ed ultracentrifugazioni seriali, come previsto dalle procedure standard condivise a livello internazionale ( Extracell Vesicles. 2018;7(1):1535750). Vantaggiosamente le nanovescicole sono state estratte da succo spremuto da vegetali biologici, quali ad esempio Citrus paradisi, Citrus Lemon (L.), Citrus Reticulata, Citrus Bergamia, Actinidia Chinensis, Mangifera Indica, Carica Papaya Linn, Citrus Sinensis, Malus domestica.
Pertanto, secondo la presente invenzione, ? definito un innovativo metodo per caricare molecole di varia natura in nanovescicole di origine vegetale, come specificato nella rivendicazione indipendente annessa.
Le rivendicazioni dipendenti delineano particolari e ulteriormente vantaggiosi aspetti dell?invenzione.
Breve descrizione dei disegni
Questi ed altri vantaggi dell?invenzione saranno ora descritti in modo dettagliato, con riferimento ai disegni allegati, che rappresentano una forma di attuazione esemplificativa dell?invenzione, in cui:
- la Figura 1 mostra il grafico del caricamento, mediante il metodo oggetto della presente invenzione, di Arancio di Acridina (AO) a concentrazioni crescenti in un numero crescente di nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica; - la Figura 2 mostra il grafico del caricamento, mediante il metodo oggetto della presente invenzione, di Arancio di Acridina (AO) in nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e il confronto con i liposomi commerciali;
- la Figura 3 mostra il grafico del caricamento, mediante il metodo oggetto della presente invenzione, di Vinblastina (VBL) in nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e il confronto con i liposomi commerciali;
- la Figura 4 mostra il grafico del caricamento, mediante il metodo oggetto della presente invenzione, di un anticorpo legato ad una sonda (AlexaFluor 488) in nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e il confronto con i liposomi commerciali;
- la Figura 5 mostra l?analisi al Nanosight di nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica secondo il metodo oggetto della presente invenzione per il caricamento di Arancio di Acridina (AO);
- la Figura 6 mostra il grafico dell?intensit? dell?indice di rifrazione di Arancio di Acridina (AO) in Nanovesciole isolate da un mix di frutta biologica, secondo il metodo oggetto della presente invenzione;
- la Figura 7 mostra le immagini a microscopio a fluorescenza dell?effetto del trattamento di Arancio di Acridina caricato in Nanovescicole estratte da un mix di frutta biologica su cellule di melanoma umano e il confronto con i liposomi commerciali;
- la Figura 8 mostra il grafico della valutazione della citotossicit? sulla linea cellulare leucemica (CEM) e sulla linea cellulare leucemica farmacoresistenti (CEM/VBL100) da parte di nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e caricate secondo il metodo oggetto della presente invenzione;
- la Figura 9 mostra il grafico della valutazione della citotossicit? sulla linea cellulare di melanoma umano da parte di nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e caricate con di Arancio di Acridina, secondo il metodo oggetto della presente invenzione e il confronto con Arancio di Acridina da solo e con i liposomi commerciali;
- la Figura 10 mostra il grafico delle prove di stabilit? della ritenzione del farmaco caricato nelle nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica, secondo il metodo oggetto della presente invenzione;
- la Figura 11 mostra il grafico dell?impedenza delle nanovescicole estratte da succo di limoni biologici rispetto all?impedenza registrata nei liposomi.
Descrizione dettagliata
Secondo la presente invenzione le nanovescicole utilizzate dal metodo oggetto della presente invenzione, estratte da vegetali di tipo biologico, cio? senza l?utilizzo di pesticidi chimici, fertilizzanti sintetici, antibiotici e altre sostanze che sono soggette a rigorose restrizioni.
Le figure allegate mostrano i risultati dei test effettuati sulle nanovescicole caricate attraverso l?innovativo metodo oggetto della presente invenzione.
Il metodo per caricare molecole di varia natura in nanovescicole di origine vegetale comprende le seguenti fasi:
- le nanovescicole isolate( da 1x 10<6 >a 1x10<12>) sono state sospese in un tampone fosfato salino 1x (PBS, (Phosphatebuffered Saline) a pH 7.4, senza calcio e magnesio; il PBS ? una soluzione salina acquosa che contiene cloruro di sodio, fosfato di sodio e cloruro di potassio;
- le nanovescicole risospese in PBS 1x sono state analizzate con la tecnica Nanoparticle Tracking Analysis mediante il Nanosight per la valutazione della concentrazione e della distribuzione dimensionale;
- da 10<6 >a 10<13 >nanovescicole risospese da 400 a 1000 ?l di PBS 1x sono state trasferite in cuvette sterili da 0,4 cm per elettroporazione ed ? stato aggiunto il composto chimico fluorescente da caricare (es. Arancio di Acridina) a concentrazioni da 0,1 a 100 ?g/mL;
- le cuvette contenenti le nanovescicole ed il composto da caricare sono state sottoposte ad elettroporazione mediante un elettroporatore, utilizzando treni di impulsi di seguito elencati: ? 300 V con otto impulsi
? 300 V con un primo impulso
- una serie di otto impulsi da 20 V, oppure 50 V, oppure 80 V, oppure 100 V;
- le nanovescicole caricate con la molecola desiderata sono state trasferite in tubi per ultracentrifugazione e sottoposte ad ultracentrifugazione a 110.000 g per novanta minuti per eliminare il composto che non ? entrato;
- il pellet contenente le nanovescicole ? stato risospeso in PBS (da 50 a 1000 ?l) e il sovranatante ottenuto dall?ultracentrifugazione ? stato conservato come controllo per analisi successive;
- le nanovescicole sono risospese in PBS 1x per procedere ai test.
Vantaggiosamente i voltaggi utilizzati nel presente metodo sono stati derivati sulla base di esperienze di veicolazione di molecole all'interno di cellule, tenendo in considerazione la minore dimensione e la differente stabilita' della membrana esosomiale. Gli impulsi sono stati generati con la seguente funzione: primo impulso con funzione di destabilizzare la membrana rendendola permeabile, il treno successivo serve a facilitare il transito ionico (o molecolare) transmembranario.
Gli strumenti utilizzati per i test sono:
- lo spettrofluorimetro, per la valutazione del caricamento del composto fluorescente ottenuto in seguito ad elettroporazione. Il caricamento di Arancio di Acridina, negli esosomi ? stato valutato allo spettrofluorimetro come emissione di fluorescenza a 535 nm in seguito ad una eccitazione a 485 nm. Le concentrazioni finali caricate nelle nanovescicole vegetali sono state calcolate mediante la costruzione di una curva di taratura ottenuta dalla lettura della fluorescenza emessa dal farmaco o anticorpo contestualmente allo stesso esperimento;
- il Nanosight (Nanoparticle Tracking Analysis), per la valutazione della concentrazione, della distribuzione dimensionale e dell?indice di rifrazione delle nanovescicole caricate (controllo di qualit?).
Le stesse fasi del metodo sopra descritto sono stati utilizzati per caricare nei liposomi commerciali (da 10<6 >a 10<13 >liposomi) il composto (ad es. Arancio di Acridina,) a concentrazioni da 0 a 100 ?g/Ml, per poter essere utilizzati come controllo del caricamento e dell?effetto sulle cellule target.
I test effettuati sulle nanovescicole trattate secondo il metodo sono mostrati nelle Figure allegate 1-11.
In particolare, la Figura 1 mostra le prove di caricamento mediante il metodo descritto nella presente invenzione di Arancio di Acridina (AO) a concentrazioni crescenti in un numero crescente di nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica. Quantit? crescenti di nanovescicole (da 10<10 >a 2x10<11>) isolate da un mix di frutta biologica (vedi protocollo sperimentale) sono state caricate, mediante lo stesso impulso di elettroporazione (300 V con 1? impulso bifasico seguito da una serie di impulsi, da 20V a 100 V), con concentrazioni crescenti di AO (da 1 a 100 ?g/mL). I risultati rappresentati in Figura 1 mostrano come le nanovescicole vegetali riescano a caricare una concentrazione di AO progressivamente maggiore all?aumentare della dose di AO e del numero di nanovescicole fino al raggiungimento di una saturazione.
La Figura 2 mostra il caricamento secondo il metodo descritto nella presente invenzione, di Arancio di Acridina (AO) in nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica: confronto con i liposomi commerciali. Lo stesso numero di nanovescicole (da 10<6 >a 10<11>) isolate da un mix di frutta biologica (vedi protocollo sperimentale) e di liposomi commerciali ? stato caricato, mediante lo stesso impulso di elettroporazione (300 V con 1? impulso bifasico seguito da una serie di impulsi, da 20V a 100 V), con una concentrazione iniziale di 100 ?g/mL di AO. I risultati rappresentati in figura 2 mostrano come le nanovescicole vegetali riescano a caricare una concentrazione di AO significativamente superiore (> 5 volte) rispetto ai liposomi.
La figura 3 mostra il caricamento secondo il metodo descritto nella presente invenzione, di Vinblastina (VBL) in nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e il confronto con i liposomi commerciali. Lo stesso numero di nanovescicole (da 10<6 >a 10<11>) isolate da un mix di frutta biologica e di liposomi commerciali ? stato caricato, mediante lo stesso impulso di elettroporazione (300 V con 1? impulso bifasico seguito da una serie di impulsi, da 20V a 100 V), con una concentrazione iniziale di 10 ?g/mL di VBL. I risultati rappresentati in figura mostrano come le nanovescicole vegetali riescano a caricare una concentrazione di AO significativamente superiore (21 volte) rispetto ai liposomi.
La figura 4 mostra il caricamento secondo il metodo descritto nella presente invenzione, di un anticorpo legato ad una sonda (AlexaFluor 488) in nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e il confronto con i liposomi commerciali. Lo stesso numero di nanovescicole (da 10<6 >a 10<11>) isolate da un mix di frutta biologica e di liposomi commerciali ? stato caricato, mediante lo stesso impulso di elettroporazione (300 V con 1? impulso bifasico seguito da una serie di impulsi, da 20V a 100 V), con una concentrazione iniziale di 50 ?g/mL di un Anticorpo legato ad una sonda fluorescente (AlexaFluor 488). I risultati rappresentati in figura mostrano come le nanovescicole vegetali riescano a caricare una concentrazione di Anticorpo significativamente superiore (3 volte) rispetto ai liposomi.
Vantaggiosamente, il caricamento di Arancio di Acridina, Vinblastina e di anticorpi negli esosomi ? stato valutato allo spettrofluorimetro come emissione di fluorescenza a 535 nm in seguito ad una eccitazione a 485 nm. Le concentrazioni finali caricate nelle nanovescicole vegetali sono state calcolate mediante la costruzione di una curva di taratura ottenuta dalla lettura della fluorescenza emessa dal farmaco o anticorpo contestualmente allo stesso esperimento.
La figura 5 mostra l?analisi al Nanosight di Nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica secondo il metodo oggetto della presente invenzione, per il caricamento di AO. Lo stesso numero di nanovescicole (da 106 a 1011) isolate da un mix di frutta biologica e di liposomi commerciali ? stato caricato, mediante lo stesso impulso di elettroporazione (300 V con 1? impulso bifasico seguito da una serie di impulsi, da 20V a 100 V), con una concentrazione di 82 ng/mL e 140 ng/mL di AO. Le nanovescicole sono state controllate al Nanosight per la distribuzione dimensionale, la concentrazione e l?indice di rifrazione. Il caricamento con AO ha indotto una distribuzione a doppio picco delle nanovescicole vegetali (B1 e C1), a differenza delle nanovescicole di controllo (A1) la cui distribuzione ? pi? uniforme. Gli indici di rifrazione delle nanovescicole caricate con il farmaco (B2 e C2) presentano una leggera diminuzione nell?intensit? rispetto alle nanovescicole di controllo (A2).
La Figura 6 mostra il caricamento, secondo il metodo oggetto della presente invenzione, di AO in nanovesciole isolate da un mix di frutta biologica induce una diminuzione dell?intensit? dell?indice di rifrazione. In (A) e in (B) vengono rappresentati gli indici di rifrazione tra nanovescicole di controllo e nanovescicole caricate con una concentrazione di AO pari rispettivamente a a 82 ng/mL (A) e 140 ng/mL (B). L?intensit? delle nanovescicole caricate con il farmaco diminuisce rispetto al loro controllo.
La Figura 7 mostra l?effetto del trattamento di Arancio di Acridina caricato in nanovescicole estratte da un mix di frutta biologica su cellule di melanoma umano e il confronto con i liposomi commerciali. Lo stesso numero di nanovescicole (da 10<6 >a 10<11>) isolate da un mix di frutta biologica e di liposomi commerciali ? stato caricato, mediante lo stesso impulso di elettroporazione (300 V con primo impulso bifasico seguito da una serie di impulsi, da 20V a 100 V), con AO [200 ng/mL]. Le cellule di melanoma sono state trattate e l?up-take di AO ? stata valutata mediante microscopio invertito a fluorescenza. I risultati rappresentati in figura mostrano come le nanovescicole vegetali riescano a trasferire una concentrazione di AO significativamente superiore (maggiore fluorescenza) rispetto ai liposomi e all?arancio di acridina da sola.
La Figura 8 mostra il grafico della valutazione della citotossicit? sulla linea cellulare leucemica CEM e sulla linea cellulare leucemica farmacoresistenti CEM/VBL100 da parte di nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e caricate mediante elettroporazione con VBL. Concentrazioni crescenti di VBL da sola e caricata nelle nanovescicole vegetali sono state utilizzate per valutare l?effetto citotossico su cellule leucemiche CEM e CEM/VBL100 mediante Trypan blue assay, rispettivamente dopo 48 e 24 h di incubazione. A) L?effetto citotossico su cellule CEM comincia ad essere evidente alla concentrazione di 1000 ng/mL e risulta essere potenziato nella VBL caricata nelle nanovescicole vegetali (superiore di 2,6 volte rispetto alla VBL da sola). B) L?effetto citotossico su cellule CEM/VBL100, resistenti al farmaco, comincia ad essere evidente (18,1 % di mortalit?) a basse concentrazioni di VBL (0,1 ng/mL) quando il farmaco ? caricato nelle nanovescicole vegetali, superiore di 26 volte rispetto alla VBL 0,1 ng/mL da sola, che induce una mortalit? pressoch? assente (0,7 %).
La Figura 9 mostra la valutazione della citotossicit? sulla linea cellulare di melanoma umano da parte di nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica e caricate mediante il metodo oggetto della presente invenzione con AO e il confronto con l?arancio di acridina da solo e con liposomi commerciali. Cellule di melanoma umano coltivate in terreno di coltura a diversa forza ionica sono state trattate con una concentrazione di AO pari a 0,1 ?g/mL da solo e caricato nello stesso numero di nanovescicole isolate da frutta e di liposomi. L?arancio di acridina non ? stata attivata con luce blu. L?effetto citotossico ? risultato evidente (55,7 %) soprattutto su cellule coltivate in terreno non tamponato quando AO ? caricato nelle nanovescicole da frutta, mentre alcun effetto citotossico ? stato rilevato alla stessa concentrazione di AO (0,1 ?g/mL) quando il farmaco viene usato da solo o in combinazione dei liposomi. La percentuale di AO trasferita alle cellule tumorali ? risultata notevolmente superiore (59%) quando l?AO ? caricata nelle nanovescicole da frutta e le cellule sono coltivate in condizioni di terreno non tamponato. La quantit? di AO in grado di entrare nelle cellule di melanoma ? notevolmente ridotta quando il farmaco ? stato usato da solo o in combinazione con i liposomi.
La figura 10 mostra le prove di stabilit? della ritenzione del farmaco caricato mediante il metodo oggetto della presente invenzione nelle nanovescicole isolate da un mix di frutta biologica. Prove di stabilit? del farmaco (AO e VBL) e dell?anticorpo (AlexaFluor488) caricati nelle nanovescicole vegetali sono state condotte dopo una settimana e dopo un mese dal caricamento mediante elettroporazione. I risultati ottenuti mediante lettura della fluorescenza allo spettrofluorimetro hanno indicato che le nanovescicole vegetali sono perfettamente in grado di ritenere il farmaco senza che vi sia alcun tipo di dispersione nel mezzo in cui le nanovescicole sono disperse.
La figura 11 mostra il grafico dell?impedenza delle nanovescicole estratte da succo di limoni biologici, che si dimostra notevolmente inferiore all?impedenza registrata nei liposomi. L?impedenza ? stata misurata in seguito ad elettroporazione (300 V con 1? impulso bifasico seguito da una serie di impulsi, da 20V a 100 V) dello stesso numero (da 106 a 1011) di nanovescicole e di liposomi.
Vantaggiosamente ? stata registrata l?impedenza (?) ottenuta per mezzo del metodo di caricamento delle nanovescicole per Arancio di Acridina (AO).
Vantaggiosamente sono stati confrontati differenti tamponi a diversa forza ionica per valutare il caricamento per mezzo del metodo oggetto della presente invenzione dei composti, come ad es. Arancio di Acridina, in nanovescicole purificate dal succo estratto da frutta biologica.
Vantaggiosamente sono state eseguite prove di stabilit? della ritenzione del farmaco caricato mediante elettroporazione all?interno delle nanovescicole di origine vegetale, lasciate in PBS 1x Tali prove sono state condotte fino ad un mese dall?elettroporazione mantenendo le nanovescicole caricate a temperatura ambiente e a 4C?. Le prove di stabilit? sono state condotte allo spettrofluorimetro nelle stesse condizioni sopra descritte.
Vantaggiosamente, le nanovescicole caricate con il composto desiderato sono state utilizzate per il trattamento in vitro di cellule tumorali (es. Mel 501, CEM, CEM/VBL-100). L?effetto citotossico del composto caricato nelle nanovescicole ? stato valutato dopo un periodo di incubazione da 1 h a 168 h al microscopio ottico mediante trypan blue assay. Il trasferimento del composto fluorescente alle cellule ? stato valutato allo spettrofluorimetro (nelle condizioni descritte in precedenza) in seguito alla risospensione delle cellule in PBS (da 50 a 1000 ?L). Contestualmente le cellule sono state trattate anche con il composto da solo e caricato nei liposomi, permettendo di confrontare l?effetto citotossico e di trasferimento del composto quando questo ? caricato nelle nanovescicole.
Anche se almeno una realizzazione esemplificativa ? stata presentata nella descrizione sommaria ed in quella dettagliata, deve essere compreso che esiste un grande numero di varianti rientranti nell?ambito di protezione dell?invenzione. Inoltre, deve essere inteso che la realizzazione o le realizzazioni presentate sono solamente esempi che non intendono limitare in alcun modo l?ambito di tutela dell?invenzione o la sua applicazione o le sue configurazioni. Piuttosto, la descrizione sommaria e quella dettagliata forniscono al tecnico esperto del settore una conveniente guida per implementare almeno una realizzazione esemplificativa, essendo ben chiaro che numerose varianti possono essere apportate nella funzione e nell?assemblaggio degli elementi quivi descritti, senza fuoriuscire dall?ambito di protezione dell?invenzione come stabilito dalle rivendicazioni allegate e dai loro equivalenti tecnico-legali.
Claims (6)
1. Metodo per caricare molecole di varia natura all?interno di nanovescicole di origine vegetale, comprende le seguenti fasi:
a. sospendere le nanovescicole isolate in un tampone fosfato salino; b. analizzare le nanovescicole sospese con tecnica denominata ?Nanoparticle Tracking Analysis? mediante un ?Nanosight? per la valutazione della concentrazione e della distribuzione dimensionale; c. risospendere le nanovescicole in un tampone fosfato salino;
d. trasferire le nanovescicole in cuvette sterili;
e. aggiungere il composto chimico fluorescente da caricare;
f. sottoporre le nanovescicole contenute in cuvette contenenti ad elettroporazione mediante un elettroporatore, utilizzando treni di impulsi;
g. trasferire le nanovescicole caricate con la molecola desiderata in tubi per ultracentrifugazione;
h. risospendere il pellet contenente le nanovescicole in un tampone fosfato salino e conservare il sovranatante ottenuto dall?ultracentrifugazione come controllo per analisi successive;
i. risospendere le nanovescicole in un tampone fosfato salino e procedere ai test.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, laddove la fase f. di elettroporazione delle nanovescicole ? caratterizzata dai seguenti treni di impulsi;
- 300 V con otto impulsi,
- 300 V con un primo impulso,
- una serie di otto impulsi da 20 V, oppure 50 V, oppure 80 V, oppure 100 V.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, laddove la fase d. di trasferimento delle nanovescicole ? caratterizzata da una quantit? di nanovescicole compresa tra 10<6 >a 10<13>.
4. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, laddove la fase e. di aggiunta del composto chimico da caricare ? caratterizzato da una concentrazione compresa tra 0,1 a 100 ?g/ml.
5. Metodo secondo la rivendicazione 4 laddove i composti chimici da realizzare sono vitamine, sostanze per uso cosmetico, farmaci e agenti per uso medico, veterinario, farmacologico ed alimentare.
6. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, laddove le nanovescicole sono ottenute da almeno uno dei vegetali biologici tra Citrus paradisi, Citrus Lemon (L.), Citrus Reticulata, Citrus Bergamia, Actinidia Chinensis, Mangifera Indica, Carica Papaya Linn, Citrus Sinensis, Malus domestica.
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BOKKA RAMESH ET AL: "Biomanufacturing of Tomato-Derived Nanovesicles", FOODS, vol. 9, no. 12, 11 December 2020 (2020-12-11), pages 1852, XP055869912, DOI: 10.3390/foods9121852 * |
| DAD HASEEB ANWAR ET AL: "Plant Exosome-like Nanovesicles: Emerging Therapeutics and Drug Delivery Nanoplatforms", MOLECULAR THERAPY, vol. 29, no. 1, 1 January 2021 (2021-01-01), US, pages 13 - 31, XP055869922, ISSN: 1525-0016, DOI: 10.1016/j.ymthe.2020.11.030 * |
| DI GIOIA SANTE ET AL: "Biological properties and therapeutic effects of plant-derived nanovesicles", OPEN MEDICINE, vol. 15, no. 1, 9 November 2020 (2020-11-09), pages 1096 - 1122, XP055869914, DOI: 10.1515/med-2020-0160 * |
| THERY C. ET AL., J EXTRACELL VESICLES., vol. 7, no. 1, 2018, pages 1535750 |
| XIAOYING ZHUANG ET AL: "Treatment of Brain Inflammatory Diseases by Delivering Exosome Encapsulated Anti-inflammatory Drugs From the Nasal Region to the Brain", MOLECULAR THERAPY, vol. 19, no. 10, 1 October 2011 (2011-10-01), US, pages 1769 - 1779, XP055432747, ISSN: 1525-0016, DOI: 10.1038/mt.2011.164 * |
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