DD210217A5 - Verfahren zur herstellung stabiler plurilamellarer blaeschen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren stabiler plurilamellarer Blaeschen, die in der Medizin als Transportmedium von Pharmaka eingesetzt werden koennen. Ziel der Erfindung ist eine Verbesserung der bisherigen technischen Loesungen im Hinblick auf das Transportvolumen und die Erweiterung auf viele wichtige Pharmaka. Erfindungsaufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines wesentlich verbesserten Typs von Lipidblaeschen, die als stabile plurilamellare Blaeschen bezeichnet werden, bereitzustellen. Erfindungsgemaess besteht das Verfahren darin, eine Dispersion aus mindestens einem amphipathischen Lipid in einem organischen Loesungsmittel zu bilden, die Dispersion mit einer waessrigen Phase zu kombinieren, um eine Zweiphasenmischung zu erhalten, in der die waessrige Phase vollstaendig emulgiert werden kann, die waessrige Phase zu emulgieren und das organische Loesungsmittel der Zweiphasenmischung zu verdampfen. Erfindungswesentlich ist es dabei, dass die hergestellten stabilen plurilamellaren Blaeschen im wesentlichen frei von multilamellaren Blaeschen, unilamellaren Schallblaeschen und Verdampfungsblaeschen mit Phasenumkehr sind.

Description

AP AbIK/249 304/4 -7~ 62 266 12/37 23.12,33

Verfahren zur Herstellung von stabilen plurilamellaren Bläschen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Liposome und deren Verwendungen als Trägerstoffe in Übertragungssystemen.' Speziell bezieht sie sich auf einen neuen Typ von Lipidbläsohen mit einzigartigen Eigenschaften, welches spezielle Vorteile wie etwa gesteigerte Stabilität und hohe Einschlu3-wirksamkeit überträgt.

Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren besitzen einen weiten Anwendungsbereich auf Gebieten wie etwa denen der Trägersysteme und der gezielten Übertragungssysteme. Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird hier anhand von Beispielen zur Behandlung der Brucellose, der Behandlung von Augeninfektionen sowie der Behandlung von Infektionen mit dem' ν ir al en Erreger der iymphosytären Meningitis demon- -,

n^^oVfan^-j-^v ·~_3Γ bekannten technischen iiösun.zen

Liposome sind vollständig geschlossene sweischichtige Membranen, die eine eingeschlossene ~ä3rige Phase enthalten, LiDOscme können jeglicher Art von unilamellaren Bläschen (eine einzelne 2iiembran-Doppelschioht enthalten) oder multilamellaren Bläschen (zwiebelartige Strukturen, durch konzentrische Membran-Doppelschichten charakterisiert, wobei jede Membran-Doppelschicht ποη der nächsten durch eine Wasserschicht abgetrennt ist) angehören.

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Bei den ursprünglichen ijiposom-Präparationen von 3-an gh am et al, (1965, J, Molo Biol. 13:238-252) werden Phospholipide in einem organischen Lösungsmittel suspendiert, welches sodann bis zur Trockne eingeengt Tjurde und damit eine ή achsartige Phospholipid-Ablagerung auf dem Beaktionsgefäß zurückließ, Sodann ^urde eine passende Menge v^äßriger Phase zugesetzt, man ließ die Mischung "quellen", und anschließend wurden die aus multilamellaren Bläschen bestehenden resultierenden Liposome (im folgenden als IuILB bezeichnet) unter Anwendung, von mechanischen Hilfsmitteln dispergiert, Der Aufbau der resultierenden Merabran-Doppelschicht ist dergestalt, daß die hydrophoben (nichtpolarenü ''Schwänze" des Lipids nach der Mitte der Doppelschicht hin ausgerichtet sind, -jährend die hydrophilen-(polaren) "Köpfe" aur wäßrigen Phase hin ausgerichtet sind. Diese Technik lieferte die Grundlage für die Entwicklung der kleinen beschallten unilamellaren Bläschen (im folgenden als SUB bezeichnet), wie sie von Papahadjapoulos und Miller (1967, Biochim, Biophys. Acta, 135:624-633) beschrieben ?;uräe* Diese "klassichen Liposome" diesen .jedoch eine Seihe von Nachteilen auf, so nicht zuletzt ein geringes Volumen von eingeschlossenem wäßrigen Saum pro Mol Lipid so^ie eine eingeschränkte Fähigkeit zur Einbettung großer Makromoleküle ,

Versuche zur Vergrößerung des eingeschlossenen Volumens bestanden zunächst in der Bildung von inversen Mizellen oder Liposom-Vorläufern, d» h. von eine wäßrige Phase enthaltenden Bläschen, die von einer Binaaischicht von Lipidmolekülen umgeben sind, ?jobei die polaren Zopfgruppen eine Ausrichtung zur wäßrigen Phase zeigen. Die Bildung der Liposom-Vorläufer erfolgt durch Zusetzen der einzuschließenden wäßrigen Lösung zu einer Lösung von Oolarem Lιόid in einem organischen

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Lösungsmittel sowie durch Beschallung* Die Liposom-Vorläufer werden dann in Anwesenheit von überschüssigem Lipid eingedampft, Die resultierenden Liposome, die aus einer durch eine Lipid-Doppelschicnt eingeschlossenen wäßrigen Phase bestehen, werden in wäßriger Phase dispergiert (US-PS 4 224 179, M. Schneider, veröff. 23. September 1980),

In einem anderen Versuch zur Maximierung der Sinschließungswirksamkeit beschreibt Papahadiopoulos (US-PS 4 235 871 _f ' veröff* 25 November 1980) einen "Uskehrphasen-Verdampfungsverfahren" zur Herstellung von oligoiamellaren Lipidbläschen, auch als Umkehrphasen-Verdampfungsbläschen bekannt (im folgenden als USB bezeichnet)« Bei dieser Vorgehensweise wird das einzuschließende wäßrige Material einem polaren Lipidgemisch in einem organischen Lösungsmittel zugesetzt. Sodann wird eine homogene Wasser-in-öl-lmulsion gebildet, worauf das organische-Lösungsmittel abgedampft wird;,, bis-sich ein Gel bildet, Das Gel wird sodann in eine Suspension überführt, indem die eelarti^e Mischung in einem vjäßrisen Medium dispergiert wird, Die produzierten USB bestehen zum größten G?eil aus unilamellaren Bläschen sowie einigen oligolamelia— ren Bläschen_} welche durch lediglich einige wenige konzentrische Doppelschichten mit einem großen wäßrigen Innsnraum charakterisiert sind« 7on bestimmten Permeabilitätseigenschaften der USB wurde berichtet, daß sie denen der MLB und der ZJJB ähneln (siehe Szoka und Papahad,jopoulos₃ 1978, Proc.» Natl. Acad. Sei. USA 75:4194-4198).

3s ist möglich} Liposome herzustellen", die eine 3eihe von Verbindungen einschließen, nichtsdestoweniger ist die Stabilität der LiOoscns "Während der Lagerung invariabel begrenzt, Dieser Stabilitätsverlust: führt zu einem Heraussickern der eingeschlossenen Verbindung aus den Liposomen in das umgebende Medium, es kann darüber hinaus zu einer Kontamination

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des iiiposoniinhaltes dare la. eindringen von Stoffen aas dem umgebenden Medium in das Liposom selbst führen. Im Ergebnis dessen ist die Lagerungsfähigkeit von traditionellen Liposomen sehr begrenzt,, Versuche zur Stabilitätsverbesserung bestehen im Einbauen bestimmter Substanzen (im folgenden als "Stabilisatoren¹* bezeichnet) in die Liposoamenbran, welche die physikalischen Eigenschaften der Lipid-Doppelschichten (z, B, Steroid-Gruppen) beeinflussen. Viele dieser Substanzen sind jedoch verhältnismäßig teuer, und die Herstellung derartiger Liposome ist mithin nicht rentabel*

Zu den Lagerungsproblemen von traditionellen Liposomen kommt hinzu, daß in diese 31äschen eine Anzahl von Verbindungen nicht eingearbeitet werden kann, ML3 können lediglich unter Bedingungen hergestellt '«erden, welche über der Phasentjbergangstemperatur der Lipidmembrane liegen, Dies schlieBt die Einarbeitung ,jener hitzelabilen Moleküle in die Liposome aus, welche aus Phospholipiden zusammengesetzt sind, die zwar wünschenswerte Eigenschaften aufweisen, die aber lange und hochgesättigte Seitenketten-besitzen.

Die Verwendung von Liposomes zu therapeutischen Zwecken ist beschrieben in Liposomes; Prom Physical Structures To Therapeutic Applications j Knight, Herausg. Elsevier, North-Holland Biomedical Press, 1931, Hinsichtlich der Möglichkeiten zur Nutzung dieser Membranbläschen für Arzneimittel-Übertragungssysteme ist viel geschrieben worden, nichtsdestoweniger bleibt eine Anzahl der mit derartigen Systemen in Verbindung stehenden Probleme ungelöst. Siehe hierzu beispielsweise die OffAnlegungen in der US-PS 3 993 75^ sowie in der ^TJ3~?S 4 145 410. Bei einen Liposom-Arzneimittel-Übertragungssystem wird das Medikament während der Liposom-

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bildung eingeschlossen und dann dem zu behandelnden Patienten verabreicht. Das Medikament kann in Wasser oder in einem nichtpolaren Lösungsmittel löslich sein, 'Typisch dafür sind die US-P3 4 235 871 sowie 4 224 179,

Einige wünschenswerte Eigenheiten von Arzneimittel-Übertra- ' gungssystemen bestehen in der Hesistenz gegenüber einer raschen umsetzung des Arzneimittels, ή as von einer verlangsamten Freisetzung des Arzneimittels begleitet v^ird, wodurch die Arsneimittelvsirkung verlängert ?,'ird, Dies steigert die Wirksamkeit des Arzneimittels und gestattet eine Verringerung der Anzahl von Verabreichungen. Einige der Probleme die beim in-vivo-Einsatz von Liposom-Präparaten auftreten, sind die folgenden: (1) Liposom-eingeschlossene Stoffe sickern.durch, wenn die Liposome in Körperflüssigkeiten inkubiert werden» Dies ist - unter anderen Gründen - für den Abbau der liposcmalen Phospholipide durch hochdichte Plasma-Lipoproteine (HDL) oder auch für den Abbau der Liposcmmembran durch Phcspholipasen verantwortlich gemacht worden. Sin Ergebnis des Abbaus der Liposome in vivo besteht darin, da3 nahezu sämtliche liposomalen Inhalte in einer kurzen Zeitspanne freigesetzt ?jerden, wodurch eine längeranhaltende Freisetzung so-Bie eine Resistenz des Arzneimittels gegenüber rascher Umsetzung nicht erreicht wird« (2) 3s ??ird andererseits ein sehr stabiles Liposom in vivo eingesetzt (a* Lu Liposome, die beim Inkubieren in Sorperflüssigkeiten nicht durchsickern), dann kommt es zu keiner bedarfspeisen Freisetzung der liposomalen Inhalte, Im Ergebnis dessen eignen sich diese stabilen Liposome nicht als Iräger therapeutischer Substanzen in vivo, da die langanhaltende Freisetzung oder die Fähigkeit zur bedarfspeisen Freisetzung des liOosomalen inhaltes nicht erreicht 'fli

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.beim Behandeln einer intrazellulären Infektion stellt .jedoch die Erhaltung der Stabilität in biologischen ,Flüssigkeiten bis zu jenem Punkt, an dem das Liposom durch die infizierte Zelle vereinnahmt wird, eine kritische Phase dar, (3) Die Hentabilität der in Übertragungssystemen verwendeten Liposom-TLrägerstoffe* Ein verbessertes Verfahren zur Chemotherapie von Leishmania-lnfektionen unter Einsatz einer liposome Inge-betteten Anti-Leishmania-Droge ist beispielsweise von Steck und Alving- in der US-PS 4 186 183 offenbart worden. Die bei der Chemotherapie verwendeten Liposome enthielten eine Anzahl von Stabilisatoren, welche die Stabilität der Liposome in vivo vergrößerten* Wie bereits erwähnt> sind ,jedoch derartige Stabilisatoren teuer, und die Herstellung von Liposomen₃ welche derartige Stabilisatoren enthalten, ist nicht rentabel, (4) Schließlich besteht ein bei der Verwendung von Lipοsomen als Trägerstoffen in Arsneimittel-Übertragungssystemen angetroffenes Problem darin, daB es unmöglich ist, eine Heilung der au behandelnden Krankheit herbeisufuhren, Zusätzlich zur Unfähigkeit, einer schnellen Umsetzung zu widerstehen sowie eine länger anhaltende Freisetzung 'zu ge- ?jährleisten₅ Iä3t sich eine Anzahl anderer Erklärungen für das Unvermögen zur Krankheitshellung finden. Werden beispielsweise die Liposome in Zielzellen oder phagozytische Zellen (&« h* retikuloendotheliale Zeilen) vereinnahmt, so werden sie rasch vom Sj'stem abgezogen, wodurch die eingebettete Droge gegenüber Krankheiten, weiche andere Zellen als die des retikuloendothelialen Systems befällt, in groBem MaBe unwirksam gemacht wird. 5"ach der Phagozytose wird der liposomale Inhalt in den Lysosomen der phagozytischen Zeile verpackt* Sehr häufig kommt es vor, daß die im Lysosom enthaltenden abbauenden Enzyme die eingebettete Verbindung abbauen oder sie durch Veränderung ihrer Struktur bzw. So alt uns an ihrer aktiven Stelle unwirksam machen·. Darüber

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ainaus sind aie liposome nicrrc Limner uns-uanae, eine wirksame Dosis au liefern; der Grund hierfür liegt in der geringen Effizienz der Einbettung der wirksamen Verbindung in die Bläschen, ?jenn diese hergestellt werden.

Liposome sind von Forschern des 73eiteren als Liodellmembransysteme verwendet sovvie als die "Zielzelle" in komplement~ vermittelten Immunoassays benutzt worden. Bei 'verwendung in derartigen Bestimmungen ist es jedoch nichtig, daß die Liposommembran bei Inkubation in Seren keine undichtigkeit zeigt, da diese Bestimmungen die Freisetzung des Liposom» inhaltes in Abhängigkeit von der Seruinkomplementaktivierung durch ImmunkomDlexbildung messen, wobei bestimmte Immunoglo^· buiin-Slassen (2. B. IgM- und bestimmte IgG-Moleküle) einbezogen werden.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, ein wirksames übertragungssystem für Arzneimittel zu entwickeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein 7erfahren zur Herstellung von stabilen plurilamellaren Bläschen bereitzustellen *

Die Erfindung betrifft somit die Herstellung eines neuen und wesentlich verbesserten Typs von Lipidbläschen, welche im folgenden als stabile plurilamellare Bläschen (3PL3) bezeichnet werden* Abgesehen von der 'Tatsache, da3 die SPLB strukturell von multilameIlaren Bläschen (MLB) verschieden

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sind j werden sie au oh in einer gegenüber den MLB unterschiedliehen Weise hergestellt; sie besitzen im Vergleich zu den MLB einzigartige Eigenschaften und bieten gegenüber den ULB eine Heihe verschiedener Vorteile, Im Ergebnis dieser Unterschiede lösen die .SPLB eine Vielzahl jener Probleme, die mit den bislang verfügbaren herkömmlichen Lipidbläschen verknüpft sind*

Bei der Synthese von SPLB entsteht ein heterogenes Gemisch von Lipidbläschen. Dabei sind die Lipide in den SPLB nachweislich in einer neuartigen supramolekularen Struktur organisiert.

Viele der Lipidbläschen besitzen eine große Anzahl von Doppelschichten, gelegentlich bis zu einhundert Schichten,. Ss kann möglich sein_} daß dieser hohe Schichtungsgrad für viele der von den SPLB bezeigten überraschenden Eigenschaften verantwortlich ist, wenngleich die hierauf zielenden Erklärungen nur theoretischer Natur sind.

Zu den Eigenschaften der SPLB gehören: (1) die. Fähigkeit zur Heilung bestimmter Krankheiten, die vermittels anderer Verfahren nicht geheilt werden können; (2) eine in hohem MaBe gesteigerte Stabilität der 3PL3 "Während der Lagerung im Puffer; (3) die gesteigerte Fähigkeit der SPLB₅ rauhen physiologischen ümvjeltbedingungen zu widerstehen; (A-) die Einbettung von Stoffen in einer hohen Wirksamkeit; (5) die Fähigkeit, über verlängerte ZeitsOannen hinges an Gegeben und Zellen haften zu können; (6) die Fähigkeit, eingebettete Materialien langsam in Körperflüssigkeiten abgeben.zu können; (7) die Lieferung und letztendliche Dispergierung des liposomalen Inhalts über die Zellflüssigkeit der Zielzelle

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hinweg; (S) die verbesserte Rentabilität der Herstellung; und (9) die in-vivo-Freisetzung von Verbindungen in deren bioaktiven formen.

Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der SPLB eignen sich diese speziell als Trägerstoffe in in-vivo-Übertragungssyste&en, da sie gegenüber rascher Umsetzung widerstandsfähig und zu langanhaltender Freisetzung fähig sind« Im folgenden «erden Verfahren zur Nutzung von SPLS zur Lieferung von bioaktiven Verbindungen in vivo so^-ie die Behandlung von Erkrankungen ^ ie etv?a von Infektionen beschrieben»

in der folgenden Beschreibung der Erfindung -raird auch auf die Figuren Bezug genommen.

Fig. 1: veranschaulicht grafisch den Unterschied hinsichtlich der-Membranstabilität (dargestellt als prozentualer Lockverlust) zwischen MLB und SPLB₃ die mit variierenden Harnstoffkonzentrationen behandelt wurden;

Fig. 2: ist eine grafische Darstellung der Betention sowohl der Lipidphase als auch der haarigen Phase von SPLS in Ausenlidge?;eben ^7on Mäusen ??ie auch die langanhaltende Freisetzung von Gentanrjain aus den SPLB in vivo;

Fig. 3J zeigt das Elektronenspinresonanz-Absorptionsspektrum von SPLB (A) ira Vergleich zu ,jenem von ML3 (3) ;

Fig., 4: demonstriert grafisch den Unterschied in der Fähigkeit von Askorbat, Doryl-Spinsenden in-SPLB und MLB zu reduzieren;

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jj'ig, 5 3 zeigt grafisch die Wirksamkeit einer Zweistufsnbehandlung v-es- BruceIla canis - Infektionen bei Mäusen unter Verwendung von SPL3-eingebettetem 3treptomyzin₅ wobei·die Infektion auf 3, csnis beruht, das aus der Milz von infizierten Mäusen zurückgewonnen werden kann;

Fig, 6: zeigt die Wirksamkeit einer Zweistufenbehandlang von B. canis - Infektionen bei Mäusen unter Einsatz von SPLB-eingebettetem Streptomyzin, wobei die Infektion auf B, canis beruht, das aus Organen ~7on infizierten Mäusen zurückgewonnen werden kann;

Fie» 7: zeiart grafisch die Wirksamkeit einer Zweistufenbe— handlung von Bruceila abortus bei Meerschweinen unter Einsatz von SFLB-eingebettetem Streptonryzin*

sind Lap idb läse hen, die zvjiscaen einigen wenigen bis über einhundert Lipid-Dop'pelschichten besitzen. Die Membran-Doppelschiont setzt sich aus einer biomolekularen Schicht eines amphipathischen Lipids zusammen, bei der die nichtpo— laren hydrophoben Kohlenwasserstoff-"Schwänze" einwärts zum Zentrum der Doppelschicht gerichtet sind und die polaren, hydrophilen "Köpfe" in Hichtung der wä3rigen Phase zeigen» "on den Doppelschichten wird ein wäiriges Kompartiment um~ schlossenj wobei ein 'Heil dieses Kompartiments das Lumen des Bläschens ausmacht_? während ein anderer Teil zwischen den benachbarten Schichten liegt, Mit den Lipid-Doppelschichtenim Komplex verbunden kann eine/Heihe von Proteinen, Glvkoproteinen₅ Glykolipiden, Mucopolysacchariden sowie jeglichen anderen hydrophoben und/oder amphipathischen Substanzen vorliegen.

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3P.U3 werden folgendermaßen hergestellt: Sin anphipathisch.es Lipid oder eine Mischung aus Lipiden wird in einem organischen Lösungsmittel aufgelöst. Zahlreiche organische Lösungsmittel sind geeignet, bevorzugt werden jedoch Diethylether, fluorierte Kohlenwasserstoffe sowie Ether, Dieser Lösung .",'erden eine τ-äßrige phase sowie der einzubettende aktive 3e~ standteil zugesetzt. Diese biphasische Mischung wird zu SPLB umgewandelt, indem während des Bvaporierens des Lösungsmittels das wäßrige Material innerhalb des Lösungsmittels emulgiert wird. Die Evaporation kann während oder nach der Be-SGhallung unter Anwendung einer beliebigen ZvaOorationstechnik vollzogen werden, so beispielsweise durch Hinwegleiten eines inerten Gasstromes über die Mischung, durch Erhitzen oder durch Vakuum. Das Volumen an eingesetztem Lösungsmittel muß das Volumen der wäßrigen Phase in einer ausreichenden Menge übersteigen, damit das wäßrige Material vollständig in der Mischung emulgiert werden kann. Praktisch kann ein Minimum von grob gerechnet 3 Volumina Lösungsmittel bei 1 · Volumen wäßriger Phase verwendet werden, Tatsächlich kann das Verhältnis von Lösungsmittel zu wäßriger-Phase in einem Bereich von bis zu 100 und mehr Volumina Lösungsmittel zu 1 Volumen wäßriger Phase variieren. Die Lipidmenge muß so reichlich bemessen sein, daß sie Jene Menge übersteigt, welche zur ummantelung der Emulsionstropfchen benötigt wird (etwa 40 mg Lipid pro ml wäßriger Phase), Die obere Grenze wird allein durch Hentaoilitätserwägungen gezogen, wobei SPLB auch mit 15 g Lipid pro ml wäßriger Phase hergestellt werden können.

Das Verfahren erzeugt Lipidbläschen mit einer gegenüber konventionellen Liposomes unterschiedlichen eupermolekularen Organisation* Srfindungsgemäß kann dergesamte Prozeß in einem 'Temperaturbereich von 4..,60 ⁰G durchgeführt werden,

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ungeachtet; der- Phasenübergangstemperatur des verwendeten Lipids» Der Vorteil dieses letztgenannten Punktes besteht darin, daß hitzelabile Produkte mit viüns ο hen s^ert en Eigenschaften vj'ie beispielsweise leicht zu denaturierende Proteine in 3PL3 inkorporiert werden können, welche aus einem Phospholip id. v?ie etwa Distearoylphosphatidylcholin hergestellt TJurdden₃ während sie in herkörnsllohe Liposome lediglich bei Temperaturen eingebaut werden können, die über deren Pnasenübergangstemperatur liegen, Das Verfahren ermöglicht es im allgemeinen, daß mehr als 20 % des verfügbaren wasserlöslichen Materials so^ie mehr als 40 % des verfügbaren lipidlösiichen Materials eingebettet werden, Bei ?£LB übersteigt die Einbettung der wäßrigen Phase gewöhnlich nicht die Grenze von 10 %,

Die meisten amphipathischen Lipide können Bestandteile von SPLB sein* Geeignete hydrophile Gruppen sind unter anderem Phosphato-j Earbo-jyl-, Sulphate- und Aminogruppen, Geeignete hydrophobe Gruppen sind unter anderem gesättigte und ungesättigte aliphatische Kohlemsasserstoffgruppen so^ie aliphatisch^ Kohlenwasserstoffgruppens die durch zumindest eine aromatische und/oder cycloaliphatische Gruppe substituiert sind* Bei den bevorzugten Amphipathiachen Verbindungen handelt .es sich um P'nospholipiae und eng verwandte chemische Strukturen, Beispiele hierfür sind unter anderem Lezithin, Phosphatidylethonolamin, Lysolezithin, Lysophatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Sphingomyelin, Gardiolipin, Phosphatidsäure so^ie die Zerebroside, Spezifische Beispiele für zur Herstellung von SPLB geeignete Lipide sind Phospholipide und darunter die natürlichen Lezithins (z, B, Si-Lezithin oder Sojabohnen-Lezithin) und synthetische Lezithine vile etna gesättigte synthetische Le sifa ine (z, 3.

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Diniyristoyiphosphatidylcholin oder Dipalmitoy!phosphatidylcholin oder Distearoylphosphatidylcholin) sowie ungesättigte synthetische Lezithine (z. 3, Dioloylphosphatidylchoiin oder Dilinoloylphosphatidylcholin), Die SPLB-Doppeischichten können einen Steroidbestandteil wie etwa Cholesterol} Coprostanol, Cholestanol, Cholestan und dgl. enthalten. Bei 7er-· wendung von Verbindungen mit asidischen hydrophilen Gruppen (Phosphat-, Sulfatgruppen usw,) werden die gewonnenen SPLB anionisch sein; bei alkalischen Gruppen -sie etwa bei Äminogruppen werden kationische Liposome gewonnen; bei Polyethylen oxy- oder GIy c ο !gruppen werden neutrale--Liposome· gewonnen, Die Gro3e der SPLB variiert in weiten MaJSe. Der Bereich erstreckt sich von etwa 500 mn bis zu. etwa 10 OGO nm (10 Mikron) , gewöhnlich reicht er von etwa 1 000 nm bis zu etwa 4 000 na,

Im wesentlichen kann, jede bioaktive Verbindung in ein,SPLB eingebettet werden (als eingebettet wird hier die Einbettung in das wäBrige Kospartiment oder in die Membran—Doppe!schicht definiert). Su derartigen Verbindungen gehören unter anderem Nukleinsäuren, Polynucleotide, antibakterielle Verbindungen, antivirale Verbindungen, antipilzliche Verbindungen, antiparasitäre Verbindungen, tumorabtötende Verbindungen, Proteine, Toxine, Snzyzne, Hormone, ITeurotransmitter, Glycoproteine, Immunoglobuline, Imiiiunomodulatoren, Farbstoffe, radioaktive Markierungsstoffe, strahlenundurchlässige Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, Polysaccharide. Zeilre— zeptor-bindende Moleküle, entzündungshemmende Stoffe, Antiglaukom-Präparate, pupillenerweiternde Verbindungen, Lokalanästhetika usw».

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Im folgenden wird ein Beispiel für die Proportionen gegeben, die bei der SPLB-Synthese Anwendung finden können: SPLB können gebildet werden, indem 50 Mikromol Phospholipid zu 3 ml Diethylether zugesetzt werden, welcher 5 Mikrogramm DBPC (2,6-Di-tert-butyl-p-kresol) enthält, worauf 0,3 ml der wäßrigen Phase zugesetzt werden, welche die einzubettende aktive Substanz enthält, Die das einzubettende Material wie auch das einbettende Lipid umfassende resultierende Lösung wird beschallt, während ein inertes Gas über das Gemisch hinwegstreicht und auf diese TJeise den größten Teil des Lösungsmittels beseitigt. Diese Verkörperung erzeugt teilweise stabile SPLB₅ teilweise stabil aufgrund der Inkorporation von DBPC in die Bläschen,

Siehe hierzu auch Lenk et al», 1932, Eur, J, Biochem, 12I₁: a.95—4S2, der ein Verfahren zur'Herstellung von liOOSomeinge— betteten Antikörpern durch Beschallung und Abdampfen einer Lösung aus Cholesterol und Phosphatidylchclin in einem Gemisch aus Chloroform und Ether mit zugesetzter wäßriger Phase beschreibt, der indes die relativen Proportionen von Lipid zu wäßriger Phase nicht angibt,

5„2- Charakterisierung von SPLB

SPLB unterscheiden sich in ihren Eigenschaften deutlich von LiOOSomen mit einer einzelnen oder nur mehreren Lamellen (z, 3. KTJB und USB)*· Die Gefrierfraktur-Slektronenmikroskopie weist aus, daß SPLB-Präparate im wesentlichen frei von HUB und "JEB sind, d. h,, weniger als 20 % der Bläschen sind unilamellar. Nichtsdestoweniger sind sie mittels elektronenmikroskopischen Techniken nicht von MLB zu unterscheiden, obwohl sie in vielen ihrer physikalischen Eigenschaften differieren. Der folgende detaillierte Vergleich richtet

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sich daher auf dis Unterscheidung von SPijB gegenüber iiuB, 5,2.1. Stabilität von SPL3 bei Lagerung

Die Stabilität eines Lipidbläschens besieht sich auf die Fähigkeit des Bläschens, den von ihm eingeschlossenen Haua über eine lange Zeitspanne hinweg abzuschließen» Pur ein brauchbar sein sollendes Lipidbläschen ist daher von höchster Bedeutung, ob es bei Lagerung und Handhabung- stabil ist» Bei einigen Anwendungen ist es hinwiederum wünschenswert, daß die Bläschen seinen.. Inhalt während seines Einsatzes- langsam abgibt. Pur anderweitige Anwendungsgebiet ist es wiederum wünschenswert j daß das Bläschen nach seiner Verabreichung solange intakt bleibt, bis es die vorgesehene Stelle seiner Wirkungsentfaltung erreicht hat. Zs wird sich zeigen, daß SPLB über diese wünschenswerten Sigenschaften aufweisen, während, dies bei üIL3 nicht der Pail- ist »<

Zwei Paktcren rufen das ündicctsein von Bläschen hervor. Der eine ist die Autosydaticn der Lipide, wodurch die Kohlenwasserstoffketten Peroxide bilden, welche ihrerseits die Dcppeischichten destabilisieren. Diese Oxydation kann durch Zusetzen von Antio^dations stoffen wie etwa von 2,6-Di-tertbutyl-p-kresol (DBPC) zun Bläschenpräparat drastisch verlangsamt werden. Die Bläschen kennen auch deshalb Undichtigkeiten zeigen, weil Agenzien in der äußeren Umgebung die Doppelschicht-Organisation der Lipide dergestalt aufreißen, daß die Lipide zwar intakt bleiben, aber die Membrane eine Pore entwickelt,

3rstmals hergestellte Lipidbiäscnen-Präparate sind von weißer Parbe. Im Verlauf der Autosydation verfärbt sich das Präparat (bräunlich), 3in Vergleich von aus dem gleichen

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Lipid sowie den gleichen wäßrigen Bestandteilen hergestellten JiELB und SPLB zeigt3 daS sich die MlB innerhalb von ein bis zwei Wochen verfärben, -wohingegen die SPLB nhej: mindestens zwei Monate hinweg wei3 bleiben, Diese Erkenntnis wird durch Befunde der Dünnschichtohromatografischen Untersuchung der beteiligten Lipide gestützt_} welche eine Degradation der Lipide in den MLB, nicht aber eine Degradation der Lipide der SPLB zeigte, Werden diese Bläschen unter Zusatz von DBPG bei ansonsten gleichen Bestandteilen hergestellt, so erscheinen die IvCLB innerhalb von einem Monat leicht verfärbt, wohingegen die SPL3 weis bleiben und mindestens 6 Monate oder noch länger stabil erscheinen,

Bei Einbringung in. eine Puffer enthaltende isotonische Salzlösung bsi neutralem pH-^ert bleiben - wie aus 2abeil8 1 hervorgeht - antibiotikahaltige SPLB über sehr als vier Monate hinweg stabil» Diese Daten weisen aus, da£ nichts von dem ursprünglich in die SPLB eingebetteten Antibiotikum während der Dauer des Versuches durchgesickert ist.

Desweiteren ist nachgewiesen, daß SPL3 in der Lage sind, ein eingebettetes Agens aus Molekülen so klein wie Calcium!cnen über mehr als sechs Monate hinweg eingeschlossen zu halten, Arsenaso III ist ein Farbstoff, der bei Vorhandensein kleinster Mengen von zweiwertigen Sationen einen Farbumschlag von rot zu blau hervorruft. Durch Einbetten des Farbstoffes in SPLB sowie Zusetzen von Calciumcnlorid zum Puffer ist es" möglich, die Stabilität der Bläschen durch Beobachtung hinsichtlich eines Farbumschlages zu messen. Die Färbung bleibt über mindestens 5-,5 Monate hinweg dieselbe, ohne da3 eine Farbabweichung nachgewiesen werden kann, woraus hervorgeht, da3 weder der Farbstoff heraussickerte noch Ionen hinein— sickerten.

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Diese Versuche demonstrieren, daß SP .üB hinreichend stabil sind, am Lagerungs- und BehandlungsschTJierigkeiten standzuhalten. Wenngleich es auch möglich ist, MLB herzustellen, die über eine gleiche Zeitspanne hinweg stabil sind, so müssen diese -doch aus synthetischen Lipiden 7>ie et?<a aus DSPG erzeugt werden, wodurch die Herstellung unvertretbar teuer Ti ird,

Tabelle I

Stabilität von Z'i-Phosphatioylcholin-SPLB nach 4,5-EKmatiger.

Lagerung in verschlossenen Behältern bei 4 ⁰C ⁵^

Jüingeschlossene Anfängliche Sickerung in die Bioverfügbarkeit Droge Einschiie- überstehende , > der eingeschlos- ßung Flüssigkeit ^! ' senen Droge (%)

Streptomycin- 34,1 0 97

sulfat

Spectinomycva 3.7,2 0 . 84

Chloramphenicol 35_}2 0 89

Csytetracyclin 18,8 Q .91

Srythromycin 0,4 0 97

Sulfamerazin 6,3 0 93

°~^J Die SPLB wurden unter Ter^^enduns von 127 /UM 3i~PhosOhatidylcholin (2PC) und 25/^;-iM Droge hergestellt» Am 3nde der .4 i/2-monatigen Lagerung bei 4 ⁰G wurden die SPLB vermit- tels Zentrifugation vom Lagerungspuffer getrennt» Periodische Verdünnungen des SPLB-Inhaltes sowie der überstehenden flüssigkeit wurden auf Bakterienrasen ausgebracht, um die Bioaktivität im Vergleich zu Standard-Verdünnungen des Antibiotikums zu bestimmen,

* *' 0 verweist auf unterhalb der ITachvieisgrenze liegende Werte,

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!3.2»2, Stabilität von SP.LB in anderen Umgebungen

Das Einbringen von Lipidbläschen in ein Medium, welches menibranzerstörende Agenzien enthält, ist ein Weg, verschiedene molekulare Anordnungen zu prüfen» In Abhängigkeit von der Organisation der Membrane werden verschiedene Bläschen unterschiedlich auf derartige Agenzien-reagieren,

In den folgenden Experimenten wurden Bläschen hergestellt, die innerhalb des eingeschlossenen ^äBrigen Kompartimentes ein radioaktives 'Tracermolekül enthielten (-li-Inulin) , Inulin, ein Polysaccharide verteilt sich in der "«äBrigen Phase und kann somit, 7ienn es radioaktiv markiert wird, zum Nachweis des wäßrigen Inhaltes von Lipidbläschen dienen, Nach einem passenden Zeitraum der Exposition, gegenüber einem bestimmten Agens wurden die Bläschen mittels Zentrifugation vom Medium getrennt, vorauf jene relative Menge an Radioaktivität', bestimmt' warde, die von den Bläschen in das Medium entpichen TJar» Diese Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt; die Werte geben die prozentuale Sickerung .an, womit der Anteil an radioaktivem Material im 'umgebenden Medium relativ zu der in den Bläschen eingebetteten Anfangsmenge, gemeint ist,

Tabelle II

Stabilität von SPLB in anderen Umgebungen

a)

Inkub ati onsmedium

% dickerung

MLB

Salzsäure 0,125 M Harnstoff .1 M Guanidin 0,5 M-1,0 M Ammon i umac e t at 0,5

oerum

90	j	D	5532
21	j	7	4^,8
C j	j	7
3	j	3	Λ ."> Λ I1Jj 1
27	5	r\ .	67,0
--Ί Γ" t— J.	5	9	54,7...63,1
75	S	2	57,3

- 19 - 62 266 12

23.12.83

^w Die Inkubationszeit.· beträgt 2,.,4 h_? lediglich die Inkubation in HGI dauerte nur 1 h.

In Salzsäure sind die SFLB stabiler als die ML3» Tabelle II zeigt, da3 sowohl ML3 als auch SPL3 bei Herstellung aus Bi-Lezithin destabilisiert werden, -nenn sie eine Stunde lang 0,125 M Salzsäure ausgesetzt werden. Ss ist jedoch bemerkenswert, daß die 3PL3 beträchtlich weniger als die MLB gegenüber der Säure .anfällig sind. Vermutlich reflektiert diese unterschiedliche Reaktion einen innewohnenden Unterschied in der Art und Weise, in der die Lipide, mit ihrer Umgebung in Wechselwirkung stehen.

Darüber hinaus reagieren SPLB anders als MLB, wenn sie Harnstoff ausgesetzt werden (Abbildung 1 und Tabelle II). Harnstoff ist ein Molekül sowohl mit einer chaotropischen Wirkung (die Struktur des Wassers zerstörend) wie aucrTmit einem starken Dipolmoment. 3s hat sich gezeigt, daß SPLB weif empfänglicher für Harnstoff als für ein osmotisches Agens 7vie et?;a IT atriumchlor id in der gleichen Konzentration sind (Abbildung 1). üL3 sickern nicht wesentlich stärker in Harnstoff, als sie es in Ji atriumchlorid tun bürden. Wenn auch die Erklärungen für dieses unterschiedliche Verhalten theoretischen Charakter tragen, so könnte es doch sein, da£ diese Heaktionsweise eher auf die Dipolwirkung als auf eine chaotropische Eigenschaft zurückzuführen sind, da Guanidin, ein dem Harnstoff ähnliches Molekül, keine destabilisierends Wirkung auf 3PL3 ausübt (Tabelle II^N , Obwohl Guanidin.ebenfalls streng chaotropisch ist, so weist es doch kein starkes DiDο!moment auf.

2C - 62 266 12

23,12,83

SPJjB sind darüber hinaus gegenüber Ammoniumacetat empfanglich, während dies bei IvILB nicht der Fall ist (Tabelle II). Weder Ammoniumionen (in "Ammoniumchlorid) noch Acetat (in Natriumacetat) sind jedoch speziell wirksam im Sinne einer Destabilisiarung von SPLB, Mithin könnte angenommen werden, daß nicht das Ion an sich, sondern vielmehr die Polarität des Ammoniumacetats für die Herbeifuhrung von Sickererscheinungen verantwortlich ist.

Anfänglich erscheinen diese Befunde überraschend, da beim Inkubieren in KorOerflüssigkeiten τ/ie etvja Seren oder Blut die SPLB sehr viel stabiler als MLB sind, nichtsdestoweniger kann eine theoretische Erklärung für diese Ergebnisse vorgeschlagen werden (selbstverständlich sind auch andere Erklärungen möglich), Wenn die Stabilität der SPLB insofern auf die einzigartige Struktur ihrer Membran-Doppeischichten zurückzuführen ist, als die polaren Gruppen der Membran-Lipide durch eine Wolke von ausgerichteten Wassermoiekülen oder eine Hydrationshüllse hydratisiert werden, dann ist es auch möglich, daB irgendein diese Hydrationshülle angreifendes Agens Veränderungen der strukturellen Festigkeit der Membran und damit ein Heraussickern fördern könnte«

Unabhängig von der dichtigkeit der theoretischen Erklärungen für die Destabilisation von SPLB in Harnstoff dienen die Ergebnisse der Veranschaulichung von charakteristischen Unterschieden zwischen dam Aufbau von MLB und SPLB, Diese Unterschiede dienen einem außerordentlich nützlichen An7jendungs— zvjeck. Wie reiter unten beschrieben, werden SPLB allmählich undicht, wenn, sie dem Auge verabreicht werden* Vermutlich ist diese erwünschte langsame Freisetzung des Inhaltes auf eine ähnliche Destabilisier

- 21 - 62 266 12

23.12,83

in Serum sind SPLB stabiler als MLB, Yiele Anwendungsformen von Lipidbläschen schlieSen deren intraperitoneale Verabreichung ein, so etna bei der Behandlung der Brucellose. Um wirksam werden zu können, müssen die Bläschen für eine zur Erreichung ihres gewünschten Zieles ausreichende Zeitspanne überleben. SPLB und MLB, jeweils aus Ei-Lezithin hergestellt, wurden fetalem Hinderserum ausgesetzt, welches aktives Komplement enthielt (Tabelle II). Nach 48-stündiger Exposition bei 37 ⁰C waren die SPLB nachweisbar stabiler als die MLB,

2,3» Sennzeichen von in vivo verabreichten SPLB..

SPLB aeigen eine Anzahl von Merkmalen, die sie speziell-als ¹Ir ag er s-

lassen:

Irägerstoffe für in-vivo-Liefersjsteme geeignet erscheinen

(A) SPLB-sind widerstandsfähig gegenüber Clearance:,-Werden·. SPLB einem Organismus verabreicht, so -«erden sowohl die LipidkomOonente als auch der eingeschlossene wirksame Bestand teil in den Geweben sowie durch die Zellen, denen sie verab reicht werden, zurückgehalten j

(3) 3PL3 können zur Gewährleistung einer langanhaltenden Jreisetzung manipuliert werden. Die Stabilität von SPLB ist insofern "einstellbar¹', als SPLB während der Lagerung sehr stabil sowie in Anwesenheit von Scrperflüssigkeiten stabil sind, werden sie indes _in vivo verabreicht, dann gestattet ein langsames Ausfliegen des aktiven Bestandteiles die fort

1.-1.1..' —3j_l -I^^CuU.^g

22 - 62 266 12

23.12,83

(D) Die Produktion von SPjlB ist insofern sehr kostengünstig₅ als die Stabilität der Bläschen erzielt wird., ohne daß teuere Stabilisatoren in die DoppeIsclaichten eingebaut werden müssen,

Die folgenden Beispiele demonstrieren einige dieser Charakteristika von SPLB bei örtlicher Verabreichung auf die Augen von Versuchstieren. Die in diesen Experimenten verwendeten SPL3 wurden in der bereits beschriebenen Weise hergestellt₃ eine Ausnehme bestand darin, daß sowohl die Lipid-Doppelschicht als auch der aktive Bestandteil radioaktiv markiert wurden, um diese Komponenten über eine Zeitspanne hinweg in den Augengeweben verfolgen au können.

Die Herstellung der 3PL3 erfolgte unter Verwendung von 1QO mg Si-Phosphatidylcholin (HPG) und 100 mg Gentamvcinsulfat» Der Lipidbestandteil wurde durch Inkorporation von SOurenmengen

λ ο c. 12 ^j ~ ^W

von ^I-Phosphatidylethanolamin ( -Ί-Ρ3) in die Doppelschichten radioaktiv markiert, vvohingegen der Wirkstoff in der wäßrigen Phase durch das Zusetzen von ^ώ^I-Gentamicin-

1 2 ^c 3 ulf at ( ^¹I-GS) radioaktiv markiert wurde. Die SPLB- wurden wiederholt mit Puffer gewaschen, um nicht inkorporierte oder nicht eingebettete Stoffe wirkungsvoll au entfernen.

Sin aliquoter ieil der SPLB-Präparation wurde abgeführt und extrahiert j um die organische Phase von der wäßrigen Phase au trennen- Die Radioaktivität ^eder Phase wurde gemessen, um das in die SPLB eingeführte anfängliche Verhältnis von ¹⁰Z-PS zu ^X^1-Qz& (Zählrohrimpulse pro Minuta in der Lip icphase ι Zählrohrimr>ulsen Oro Minute in der wäßrigen Phase) au bestimmen,

- 23 - 62 266 12

23.12,83

Die Extraktion wurde folgendermaßen vorgenommen: 0,8 ml 0,4 M NaCl (wäßrig) , 1 ml Chloroform sovvie 2 ml Methanol wurden kS Bildung einer homogenen Phase vermischt» Sodann wurden

4/Ul der radioaktiv markierten 3PL3 zugesetzt und eingemischt; beim Auflösen der SPLB-Bestandteile in der organischen Phase und in der vjäßrigen Phase wurde die anfängliche trübe Mischung klar. Die Phasentrennung erfolgte durch Zusetzen und 3inmischen von 1 ml 0,4 M ITaCl (vjäBrig) sowie 1 ml Chloroform, sodann wurde die Mischung 5 min lang bei 2 800 :r g zentrifugiert, 3in aliquoter Teil (1 ml) von jeder Phase wurde abgeführt, die Hadioaktivität (in Zählrohrimpuls en) wurde gemessen. (Das Anfangsverhältnis von ^t"^I-?3 : ""T-Go betrug 1,55 5 1).

15 ausgewachsene weibliche Swiss Webster Mäuse wurden anästhesiert und fixiert (um sie am Augenv.ji3ch.en zu hindern). Jedem Auge· wurden gleiche- aliquote Mengen (2 >ui) der radioaktiv markierten SPL3 in Suspension örtlich verabreicht. Zu folgenden Zeitpunkten wurden sodann Gruppen von je drei 'lieren getötet j I, 2j 3, 18 und 24 h. ITeun weibliche Swiss Webster Mäuse (Sontro 11 Variante) wurden identisch behandelt, wobei aber gleiche aliquote Mengen (2,ul) einer wäBrigen Lösung von radioaktiv markiertem Gentamycinsulfat jedem Auge örtlich verabreicht wurden. Gruppen von je drei Kontrolltieren wurden nach jeweils 1, 4 und 8 Stunden getötet,

Unmittelbar nach dem (Töten wurden die Augenlider der Tiere oben beschriebenen Verfahrens), um die.wäBrigen KomOonenten

solchen Phase 7-rarde bestimmt (wie auch die Gesamtzahl der radioaktiven ZählimOulse)« Die in der Lipidphase gemessene Radioaktivität ist ein Kennseichen für die Setention von

~ 24 ~ 62 266 12

23,12,83

von 3PL3-Lipiden durch das Augengewebe, während die in der wäßrigen Phase gemessene Radioaktivität ein Kennzeichen für die Betention von Gentamycin im Augengewebe darstellt» Abbildung 2 veranschaulicht grafisch die Retention von jeder Komponente im Augenlidgewebe (ausgedrückt als Prozent der dem Auge ursprünglich verabreichten Anzahl von Zählrohrimpulsen pro min),

Abbildung 2 veranschaulicht deutlich die Betention der S?L3-Lipidkomponente im Augenlid über eine 24stündige Zeitspanne vjie auch die fortgesetzte Freisetzung von Gentamycin aus den 3PL3 über eine 24-sttLn.dige Zeitspanne (wie sich dies in der GentamycLn-Hetention im Augenlidgewebe während dieser Zeitspanne widerspiegelt). Abbildung 2 zeigt auch, daß nicht eingebettetes Gentamicin (örtlich verabreichtes wäßriges Gentamicin) rasch vom Aug.enlidgewebe abgestoßen wird* So wurde beispielsweise in Lösung befindliches Gentamycin (Zontrolle) innerhalb' von 4 Stünden vom Augenlidgewebe abgegeben (weniger als 5 % des Gentamycins verblieben im Augenlidgewebe). Andererseits wurden in dieser vierstündigen Periode . mehr als 50 % des SPLB-eingebetteten Gentamycins durch das Augenlidgewebe zurückgehalten; in der Tat: am Snde der 24stündigen Zeitspanne waren mehr als 15 % des SPLB-eingebetteten Gentamycins durch das Augenlidgewebe zurückgehalten worden« Dies weist darauf hin, daß annähernd 85 % des SPL3-eingebetteten Gentamycins über eine 24stündige Zeitspanne hinweg freigesetzt wurden j während 95 % des nicht eingebetteten Gentamycinsulfats innerhalb einer Zeitspanne von 4 h abgestoßen wurden.

Tabelle III vergleicht das Verhältnis von SPLB-Lipidphase au wäßriger Phase, wie es über die Zeitspanne hinweg im Augenlidgewebe gehalten wurde» Ein Ansteigen dieser 7erhäl^r.issahl verweist auf die Freisetzung von Gentamycin aus den

*~Λ ζΖ

62 266 12 23.12.83

SPlB,

Desgleichen ~;urde die Bioaktivität des von den Augenlidge^eben zurückgehaltenen 3PL3-eingebetteten Gentamycinsulfats bewertet. Dabei wurde Gentamycinsulfat aus den Augenlidgevve-ben ξ urüc kg e tonnen, indem eine aliquote Menge ;jsner wäßrigen Phase der Augenlidestrakte entnommen vjurde, welche 3 k nach Verabreichung des SPL3-eingebetteten Gentamycinsulfats an das Äuge hergestellt vjorden ή ar. Die wäßrige Phase xurde seriell verdünnt, und 2- ,ul-Aliquote wurden aus St arhy loc oc cusaureus ~ P.asen ausgebracht, die sich auf Agarplatten befanden; nach 24stündiger Bebrütung wurden die Zonen; der Hemmung gemessen, Das Gentamycinsulfat, welches von den Augenlid-Gewebe extrakt en der mit SPL3-eingebettetem Gentamycinsulfat behandelten Tiere zurückgewonnen worden war, hatte seine Bioaktivität vollständig zurückgehalten.

Tabelle III

Anhaltende Freisetzung von 3?L3-eingebettetem Gentasycin

nach lokaler Anwendung in Augen von Musen

Zeit nach der Verabreichung Stunden

Aus den Augenlidern zurückgewonnene Gesamt-SPLB-Bestandte ile

Verhältnis von SP.l3~ Lipid : wäßriger Phase, in den Augenlidern zurückgehalten

(% Anfangsdosis) 100 100 100

94

35,1

1,55

2,1

2,82

5,69

7,17

- 26 - 62 266 12

23.12,33

5.2*4, ^lektronensOJnresonanz

Wenn auch die.SPLB und die ML3 im Elektronenmikroskop identisch erscheinen_s so offenbart doch die 3SE (Slektronenspinresonanz-Analyse) unterschiede ihres supramolekularen Aufbaus. SPL3 können von ML3 auf der Grundlage ihrer molekularen Architektur unterschieden vjerden, dies in bezug auf ihre höhere molekulare Ordnung, eine gesteigerte Molekularbe^egung so^ie eine größere Durchdringbarkeit für Ascorbat. Wahrscheinlich tragen diese Unterschiede in der molekularen Architektur su den ermähnten unterschiedlichen biologischen Wirkungen bei,

3ei der Blektronenspinresonans—Spektroskopie ?Jird eine Spin— sonde wie et'sa 5-Dosylstearat (5DS) in die Lipia-Doppelschicht eingeführt. Das unpaarige Siektron der Doxyi-Gruppe absorbiert Mikro'-jellenenergie, ^enn die Probe in ein magnetisches Feld eingesetzt TJird» Das Absorptionsspektrum gestattet die Bestimmung von drei empirischen Parametern: S, den Ordnungs-Parameter5 A . die hyperfeine Kopplungskonstante;

W Qj. — —

und Tau, die Hotationskorrelaticnszeit, Zine typische Able-Signal und 3 dem ML3-Signal entspricht und "iobei beide mit 5-Doxylstearat markiert sind. Die Spektren wurden bei Haumtemperatur und einem Abtastbereich von 100 Gauss bestimmt. Der/die Ordnungsparameter, der sich in Abhängigkeit sowohl von 2¹H₁ als auch von 21· „ befindet, mi3t die Abweichung des beobachteten 3SH-3ignals vom Fall einer vollständig gleichförmigen Ausrichtung der Probe, Für eine gleichförmig ausgerichtete Probe gilt 3 = I₃OO, für eine sufallsweise Probe gilt'S =0, Die hyoerfeine Kopolungskonstante A^₅ die aus

j'i J»^;sJ,Oj» O ' ' ' T-i ^. T^ \ I '

27 - 62 266 12

23.12.83

Hotationskorrelationszeit (die von ΐί , h_ry h-1 abhängt), kann als ^ene Zeit angesehen werden, welche die Moleküle benötigen, um ihre vorangegangenen räumlichen Ausrichtungen zu "vergessen". 3ine typische 33E-Bestimmung, der Unterschiede zwischen SPL3 und MLB mit 5-D3 als Spinsonde ist in Tabelle IY zusammengefaßt.

Obwohl in beiden Fällen die Spinsonde aus der gleichen Tiefe in der Doppelschicht berichtet, besitzen 3PL3 einen signifikant größeren Grad an molekularer Ordnung und molekularer Belegung, als IiLB,

3ine weitere Illustration der Unterschiede zwischen S?L3 und ML3 zeigt sich in der Fähigkeit von Ascoroat, Doxyl-Spinsonden zu reduzieren. 3s ist bereits seit einiger Zeit bekannt, daß Ascorbat-Dc-ryl-Zoaponenten reduziert, dies vermutlich zu deren Hydroxylamin-Analoga, Vielehe in einem magnetischen Feld keine Mikro^ellenenergie'- absorbieren, In.wäßrigen -Lösungen tritt die Reduktion rasch mit gleichzeitig einhergehendem "verlust von 3S?.-Signal auf. Befindet sich die Spinsonde in einem geschützten Umfeld ?Jie et?)a in einer Lipid-Doppel- schicht, so kann es sein, daß sie'langsamer oder auch garnicht durch das hydrophile Ascorbat reduziert Tiird.

labeile IY

3?L3 2,65 - 10"*^ s 0,614 3,65 * 10"⁹ s 0,595

- 28 - 52 266 12

23-12.83

Mithin kann die Geschwindigkeit der ITitrosid-Hsduktion dazu verwendet werden, die Geschwindigkeit des Sindringens von Ascorbat in die Lipid-Dcppelschichten zu untersuciien« Abbildung 3 zeigt den in Abhängigkeit von der Zeit verbleibenden SpSn-Prοzent3atz für SPLB smd MLB, die in einer Ascorbatlosung suspendiert sind. 2Tach 90 min hat das Ascorbat 25 % der in MLB eingebetteten Sonde, aber 60 % der in SPlB eingebetteten Sonde reduziert, SPLB lassen Ascorbat in weitaus stärkerem Maße eindringen, als dies bei MLB der Fall ist«

5*2«.5» lOinsohließimg yen aktivem Material duroh SPLB

Sin weiteres eindrucksvolles Beispiel für die Überlegenheit ύοώ. SPLB gegenüber den traditioneilen MLB ist die Tatsache, daß SPLB einen größeren Prozentsatz des verfügbaren aktiven Materials einschließen und auf diese Weise Wirkstoff konservieren (siehe Tabelle Y)₁

5 «2«6, Wechselwirkung von SPL3 alt Zellen

Hoch ein anderer ITutzen der SPLB besteht darin, daß sie dergestalt mit Zellen in Wechselwirkung treten _} daß ein relativ großer Teil der innerhalb des Bläschens eingebetteten Stoffe im Zytoplasna der Zellen dispergiert wird, bevor eine J2inschränkung auf die phagozytischen Bläschen erfolgt,

Tabelle V

Vergleich von.MLB und SPLB

% Verfügbares eingeschlossenes Materia] 3inbettuns von: MLB SPLB

-L-i-i U-J. i.i-i. V, '< ' CLJ^J- ig"i d«»»a cL\J » · > JU

Haum—Merker)

Bovines Seruaalbunin 15 20«,,50

62 266 12 23.12.33

Tabelle Y (-i'ortsetaung)

Streptomycin

Polyvinylpyrrolidon (wäßriger P.aum)

12..,15

20...A-O 25...35

Werden 3P.L3 mit Zellen vermischt, so kommt es zwischen diesen beiden Komponenten zu Koaleszenz, Bei Koaleszenz weisen 3PL3 - anders als ML3 - _in vitro Wechselwirkungen mit Zellen auf, so daß alle Zeilen schließlich einen Teil der-ursprünglich in den 3PL3 eingeschlossenen Materialien enthalten. Dieses Material scheint über .jede der Zeilen hinweg verteilt und nicht ausschließlich auf die phagozytischen Bläschenbeschränkt zu sein. Dies kann durch Inkorporieren von l?erri— tin in die 7väßrige Phase eines SPLB-Präparates demonstriert werden. DTach Koaleszenz mit einer in Kultur befindlichen Zelle weist die Ultrastrukturanalyse aus, daß das Perritin iXoei: das gesamte Zytosol hinweg verteilt und nicht durch intrazellulare' Membranen gebunden.wird» Wenngleich dieses Phänomen auch bei MLB nachgewiesen werden kann, so erweist sich doch, daß durch 3PL3 eine größere Stoffmenge übertragen werden kann.

5.2.7« Auftriebsdichte von SPLB

Hinzu kommt, daß SPLB eine geringere Auftriebsdichte als 2;IL3 aufweisen. Dies läßt sich durch Bänderung in einem Ficol-Gradienten messen (siehe Tabelle YI).

Tabelle YI Auftriebsdichte

In Ficol In g/ml

Schichten über 1 1,071

SPLB

Schichten über 0,5 %

ichte 1,0274

- 30 - 62 256 12

23.12*83

Beim Zasamraenfassen in einem Pellet durch. Zentrifugation von-1 000 bis 100 000 χ g bilden desTseitersn die SPLB ein Pellet, welches bei ansonsten gleicher Phcsphoiipid-Konzentration beträchtlich, größer als ein aas MLB gebildetes Peilet ist» Bei einer Kraft von 16 000 zz g bilden die SPLB ein Pellet, welches gegenüber den ML3 'am ungefähr ein Drittel größer ist*

5,2,9» Ossetische Eigenschaften von 3PL3

Da PhosOhoÜDid—DoOOelschichten für Wasser durchlässig sind, bewirkt das Einbringen von };E3 in eine hypertonische Umgebung infolge der osmotischen Kraft ein Heraustreiben des eingeschlossenen Wassers. SPLB schrumpfen stärker als MLB. Hinzu kommtj da£ nach 16-stündigeni Schrumpfen in einem Puffer von einer gegenüber der inneren Salzkonzentration Zwanzigfach höheren Konzentration die SPLB nicht auf das gleiche 3ndvolumen schrumpfen, si ie dies bei den IvILB der Fall ist (SPLB-Pellets bleiben um ein Drittel größer als MLB-Pellets)* Dies zeigt, da£ der Unterschied in der PeiletgröBe nicht auf Unterschiede des eingeschlossenen wäßrigen Toiuaens zurückgeführt werden kann,

g»3, Anwendungen von SPLB

SPJjB sind speziell in solchen Systemen braucnbar, In denen die folgenden Paktoren eine \vicatige Solle spielen: Stabilität während der Lagerung und bei Kontakt mit Körperflüssigkeiten; ein verhältnismäßig hoher Grad der Einbettung; Kostenrentabilität; und die Freisetzung der eingeschlossenen Yerbindun.2 in ihrer biologisch aktiven Fora,

- 31 - 62 26β 12

23.12.33

Des weiteren können SPLB je nach Art der Verabreichung in vivo gegenüber schneller Glesrance widerstandsfähig sein (z. 3. dort,' VJO es auf eine anhaltende Anlieferung ankommt), oder sie können an die Zellen des HES geliefert «erden.

Daraus ergibt sich, daB die erfindungsgemäßen SPL3 in einer reiten Yielfalt von Systemen nutzbringend Anwendung finden können. Sie sind einsetzbar zur Förderung der therapeutischen Wirksamkeit von Medikationen, zur Heilung von Infektionen, zur örtlichen Verabreichung von Drogen, zur !Förderung der Enzymsubstitution, zur oralen Verabreichun

von Drogen, zur

Einführung von genetischen Informationen in Zellen Ln vitro

I=L IiTl) ^Slir Herstellung von Vakzinen, zur Einführung von rekombinantan Desoxyribonukleinsäure-Segmenten in Zeilen oder als diagnostische Heagenzien für klinische iests nach Freisetzung von eingeschlossenen "Heporterⁿ-Molekülen. Darüber hinaus können die SPLB zur Einbettung von kosmetischen Präparaten, Pestiziden sowie von Verbindungen verwendet 7Jerden, die über eine anhaltende langsame Freisetzung das Wachstum von pflanzen und dgl. beeinflussen sollen.

Die im folgenden unter Bezugnahme auf SPLB beschriebenen Verfahren unterstellen die Verwendung von SPLB oder rjedvjeder anderer Liposom- oder Lipidbläschen mit funkt ionellen Eigenschaften ähnlich denen der SPLB*

Die Abgabe von Verbindungen an Zeilen in-vitro (z, 3. tierische Zellen, Pflanzenzellen, Protisten ustj,) erfordert im allgemeinen das Zusetzen der die Verbindung enthaltenden 3PL3 zu den in Kultur befindlichen Zellen. SPL3 können indes

32 - 62 266 12

23.12.83.

auch dazu verwendet vjerdsn, Verbindungen in vivo .in 'i'ieren (einschließlich des Menschen), Pflanzen und Protesten abzugeben. Je nach Z^eck der Abgabe können die SPLB über eine Anzahl von Wegen verabreicht werden; bei Menschen und Tieren beinhaltet dies, aber begrenzt sieht nicht auf Injektion (z, '3, intravenös, intraperitonal, intramuskulär, subkutan, intraaurikularj intramammal, intraurethral usv;,)} örtliche Anwendung (3. B. auf befallenen Flächen) sowie durch Absorption über epitheliale oder inukokutane Auskleidungen (z, 3» okulare Spithelien, Mundschleimhaut, rektale und vaginale epitheliale Auskleidungen, die Auskleidungen des Atmungs-? fees, die nasopharyngeale Mukosa, die intestinale Mukosa ); bei pflanzen !und Protisten beinhaltet dies - aber begrenzt sich nicht auf - die direkte Aufbringung auf den Organismus, die Dispergierung im Habitat des Organismus, das Zusetzen zur Umgebung oder zu umgebendem Wasser US^₈.

Die Art der Anwendung kann auch die Stellen und Zellen im Organismus bestimmen, an die die Verbindung abgegeben ~,'erden Tvird» Beispielsweise kann die Abgabe an eine spezifische Infektionssteile am leichtesten durch eine örtliche Verabreichung (sofern es sicn um eine äu3ere Infektion handelt) realisiert werden, Die Abgabe .an das Kreislaufsystem (und damit an retikuloendotheliale Zellen) kann am leichtesten durch intravenöse, intrax>eritonals, intramuskuläre oder subkutane Injektionen realisiert werden,

" Ά,'+J+i*m -ί. Wj.,* U'w i-i W J- ™ OuJ -M jO*iiij.iD — i-l ">-> iii w -L 'J Uv ^. iliw I_nL. w .«! ^J~J, Iw- CvW ^. -^ +m **· i~± *-Λ»Α ^ C^i

ken bürden,

- 33 - ^{δ2 26δ} I

23,12.33

in den folgenden Abschnitten werden einige allgemeingültige Schemata des Einsatzes von SPLS beschrieben; diese Schemata demonstrieren den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, grenzen ihn aber nicht ein.

5,3,2, Behandlung von Krankheiten

Eine Seihe von bei Menschen, Tieren und Pflanzen auftretenden "oathologischen Zuständen kann wirkungsvoller behandelt .vier— den, ~;enn die hierfür geeignete Verbindung bzvj, die hierfür geeigneten Verbindungen in 3PL3 eingebettet werden. Zu diesen pathologischen Zuständen zählen u. a» Infektionen (intrazellular und estrazellular) , Zysten, 'Tumoren und Tumorzellen, Allergien us??, .

5¹Ur den Einsatz von SPLB bei der Behandlung derartiger Erkrankungen sind zahlreiche Strategien möglich; einige wenige allgemeine Scaemata werden im folgenden ausgeführt. Diese sind insofern besonders zweckdienlich, als sie die Tatsache, nutzen, daß SPL3 bei m-vivo-Verabreichung durch Ivlakraphagen internaiisiert werden.

In einem der Schemata 7.^:erden 3PL3 zur Abgabe von therar>eutisehen Agenzien -an Stellen intrazellularer Infektionen genutzt. Bestimmte Erkrankungen beinhalten eine Infektion von Zeilen des Hetikulcendotheiiaien Systems, so beispielsweise die Brucellose. Diese intrazellularen Infektionen sind aus einer Heihe von Gründen schwierig zu heilen; (1) aufgrund der Tatsache, da3 sich die infektiösen Organismen in den Seilen des re-uikuloendothelialan Systems aufhalten; sie v;erden von den zirkulierenden therapeutischen Agenzien abgeschlossen, welche die Zellmembran nicht in therapeutisch ausreichenden iionzentraticnen zu durchdringen vermögen, woraus sich eine

- 34 - 52 2ββ 12

23*12,83

hochgradige Resistenz gegenüber der Behandlung ergibt; (2) häufig macht sich die Verabreichung von toxischen Mengen therapeutischer Stoffe erforderlich, um derartige Infektionen zu bekämpfen; und (3) inu3 die Behandlung vollständig wirksam, sein, da ied'sede ?.e st Infektion nach der Behandlung des Witts» Organismus reinfizieren und die Infsktion auf andere Wirte übertragen kann,

Einer der erfindungsgemä3an Verkörperungen entsprechend werden die eine geeignete, biologisch aktive Verbindung enthaltenden SPLB dem Wirtsorganismus oder dem potentiellen Wirtsorganismus (bei !ierherden können sowohl die nichtinfizierten als auch die infizierten Tiere behandelt v;erden) .verabreicht (vorzugsweise intraperitonal oder intravenös). Da phagozytische Seilen die SPLB internalisleren, ?>ird die Verabreichung einer gegenüber dem infizierenden Organismus biologisch aktiven SPLB-eingebetteten.Substanz in der Hinleitung der bioaktiven Substanz zur Infektionsstelle resultieren, Mithin kann das erfrndungsgema3e Verfahren zur Bekämpfung von Infektionen eingesetzt werden, die durch eine Vielzahl von Mikroorganismen, Bakterien, Parasiten, Pilzen,, Mycoplasmen und Viren hervorgerufen werden» Derartige Erreger sind unter anderem BruceIla sp_o. , Mycobacterium sp_p_. , HistoOlasma SO_p_₄ , Corynebacterium so ρ, , Coccidiodes spO., und das Virus der lymphczytären Choriomeningitis„

Das ausgewählte therapeutische Agens 7?ird von dem die Infektion hervorrufenden Organismus abhängen, Bakterielle Infektionen können beispielsweise durch Einbettung eines Antibiotikums eliminiert werden. Das Antibiotikum kann in der wäßrigen' flüssigkeit des 3PLB enthalten und/oder in die Bläschen-Doppelschicht eingelagert sein. Geeignete Antibiotike sind u, a. Penizillin^ Ampizillin, Hetaziliin, Zarbenzillinj

35 - 62 266 12

23.12.83

'Tetrazyklin, letrazyklinhydrochlorid, Q:cytetrazyklinhydrochlorid, Chlortetrazykiinhyarcchloride 7-Ghloro-6-diinethyltetrazyklin, Doxyzyklinnionohydrat_} Methyzykiinhydrochlorid, Minozyklinhydrochloridj Soiitetrazyklin, Dihydrostreptomyzin, Streptomyzin_} Gentamizin, Kanamyzin, ITeomyzin, Iryturooiyzin, Karbomysin, Clenadonyzinj Iroieandomysin, Polymyxin 3 collistin, Zephalothinnatriura, Zephaloridin, Zephaloglysindihydrat und Zephaiexininonohydrat,

77ir haben die Wirksamkeit derartiger Behandlungen bei der Heilung der Brucellose demonstriert (siehe Ausführungsbeispiei vielter unten), Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die Effektivität und die Dauer der Behandlung verlängert, 3s überrascht, daß dieses System bei der Behandlung von Infektionen wirksam ist, die gegenüber bekannten Behandlungsverfahren ?;ie etv;a der Behandlung mit iiL3-eingebetteten Antibiotika nicht reagieren, Sine erfolgreiche Behandlung v)ird^: nicht--arv;·artetV da sich irgendwelche-kleinen verbleibenden Infektionen ausbreiten werden und der Infektionskreislauf erneut beginnen v7ird« Darüber hinaus haben wir eine erfolgreiche Behandlung der lymphozytären Choriomeningitis Virusinfektion demonstriert«

Selbstverständlich ist die vorliegende Zrfindiong nicht nur auf die Behandlung von intrazellulären Infektionen begrenzt, Die S?L3 können zu einer Vielzahl von Stellen geleitet werden, ob es sich nun ua intrazelluläre oder extrazelluläre Infektionsstellen handelt. In einer anderen Verkörperung der vorliegenden Erfindung werden beispielsweise ilakrophagen dazu verwendet, einen Wirkstoff an die Stelle einer systemischen

52 266 12 23.12.S3

in vivo (vorzugsweise intraperitonal ^uv^ Intravenös) verabreicht werden» Die Makrophagen werden mit den SFL3 koalesaieren und dann mit der therapeutischen Substanz "geladen" werden j die Makrophagen werden die Substanz im allgemeinen über ungefähr 3 bis 5 lage hinweg halten* Erreichen sodann die ^iTgeladenen^H Makrophagen die Inf akuionsstelle. dann vvird aas Pathogen durch die Makrophagen internalisiert werden, lsi Ergebnis dessen wird das Pathogen mit der im Makrophagen ent-' haltenen therapeutischen Substanz in Berührung kommen und zerstört werden*. Diese Verkörperung der vorliegenden Erfindung eignet sich insbesondere zur Behandlung der Staphylococcus aureus - Mastitis bei Mensch und Hind»

Ist die Infektions— oder Erkrankungsstelle äußerlich oder zugänglich} dann kann das SPLB-eingeschlossene therapeutische Agens örtlich appliziert werden. Sine insbesondere nützliche Anwendung betrifft die Behandlung von Augenerkrankungen* Im Falle von Augenkrankheiten können einen oder mehrere geeignete Wirkstoffe enthaltende SPLB dem betroffenen Auge örtlich appliziert Werden. Eine Heihe von Organismen rufen bei -nieren und Menschen Augeninfektionen hervor, Derartige Organismen sind unter anderem; Morazella spp_. , Clostridium soo- , Corynebacterium spjo« , Drolococcus stop, , Plavobacterium soo, , Hemo~ philus s_do« , Kleb.siella §22.» j Leptospira sp_p_. , Mycobacterium soo♦5 Heiseeria spp♦, ProOionibacterium spp,_} Proteus spp,, pseudomonas spo* _} S err at la sp_p_. , Sscherichla svo, , Staphylococcus spp«, Streptococcus sop* so^ie bakterienähnliche Organismen einschließlich Myco-plasma soo, und Pickettsla so

ttsl

Diese Infektionen sind bei Anwendung herkömmlicher Verfahren schwer zu eliminieren.₃ da irgendeine nach der Behandlung zurückbleibende Hestinfsktion über die Tränensekretionen eine Eeinfaktion hervorrufen kann. Wir haben den Einsatz von SPLB

3? - 62 266 12

23*12.83

bei der Heilung von AugenInfektionen demonstriert, die durch Morase11a bovis hervorgerufen wurden (siehe Ausführungsbeispiele reiter unten)«

Da SPLB gegenüber Clearance resistent sind und ihren Inhalt in anhaltender Weise freizusetzen vermögen, eignen sie sich darüber hinaus zur Behandlung irgendwelcher Erkrankungen, die einen verlängerten Kontakt mit der aktiven behandelnden Substanz erfordern. So handelt es sich beispielsweise bei dem Glaukom um eine Krankheit, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß ein allmählicher Anstieg des Augeninnendruckes· einen fortschreitenden Verlust des periphere^ Sehens bewirkt; .unbehandelt kommt es reiter zum Verlust des zentralen Sehens und schließlich zur ErblirLdung, Die zur Behandlung des Glaukoms eingesetzten Drogen können örtlich als Augentropfen verabreicht ν,¹ er den. In einigen Pällen erfordert die Behandlung aufgrund der raschen Abführung der Droge von der Augenhöhle jedoch alle 15 min ein Verabreichen von Tropfen. Wird nun eine Erkrankung vvie- etwa das Glaukom in der erf in dungs gemäß en Weise behandelt, so können therapeutische Substanzen rsie etua Pilocarpin, Jloropryl, Physostigmin, Garcholin., Acetazolamid, Ethozolamid, Diehlorphenamid, Carbachol, Demecariuinbromid, Diisopropylphosphofluoridat, Scothioplatiodid, Physostigmin oder iTeostigmin usv?» in SPLB eingeschlossen werden, welche dann dem betroffenen Auge verabreicht 7-;erden,

Weitere Agenzien, die in SPL3 eingebettet 'und örtlich verabreicht 79erden können, sind unter anderem; iivdristika (s, 3,

Atropin, Homatropin, Scopolamin, Zyklopentolat, üropikamid, Encatropin us¹?;.); Lokalanästhetika; antivirale Agenzien (z, Idosuridin, Adeninarabinosid ustj,); antimykotische Agenzien

- 38 - 62 266 12

23.12.83

(ζ* 3» Amp hoterazin B₅ Hat any sin,, PiHLarisLn^ .u'luzytosin, ilystantin, Thimerosal, SuIfamerazin, 2hiobendazol₃ Tolnaftat, Gridiofulvin usv.¹«) > antiparaeitäte Agenzien (z, B* Sulfonamide j Pyrimethamin, Glindamyzin us^O; und entzündungsbekämpfende Agenzien (ζ, 3* Kortikosteroide ?Jie etrsa ACTH, Hydrokortison_? Prednison, Medryson, 3eta-üiethason₃ Dexamethason, Eluoromethalon, Triainainalon usvj«).

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen der Yeranschaulichung, keinesfalls aber der Eingrenz^ong des Geltungsbereiches der vorliesenden Erfindung,

6, Aasfüririingsbei.spieli Herstellung von SPi3

Wie bereits in Abschnitt 5»1. erläutert 'surde, besteht das Grundverfahren der Hersteilung von SPL3 im Auflösen eines Lipids oder eines Lipidgesiisches in einem organischen Lösungsmittel, im Zusetzen einer wäßrigen'Phase soviie des einzubettenden Materials und im Beschallen der Mischung, In der bevorzugten Verkörperung wird aas Lösungsmittel während der Beschallung entfernt; das organische Lösungsmittel kann aber auch während oder nach der Beschallung durch irgendeine Svaporationstechnik abgeführt werden. Die in sämtlichen der hier aufgeführten Ausführungsbeispiele verwendeten SPL3 wurden .gemäß der in den folgenden Unterabschnitten beschriebenen Weise hergestellt (nichtsdestoweniger kann jedwedes andere

c¹

SPLB hsrvorbrineend.e Verfahren anae-^endet vjerden) * 6,1, Antibiotika enthaltende SPL3

Hergestellt Tjurde eine Lösung von 100 mg Lezithin in 5 2.2. Diethylether. Das Gemisch wurde ' in einen Bundkoiben eingebracht, In den die-Diethylether-Lcsung des Lipids enthalten-

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23.12,83

den Glasbehälter ^jurde sodann mi tree Is Pipette eine Lösung (0,3 sil) eingebracht, die aus 1GO mg Streptoinysinsulf at bei pH 7,4 in 5 mM HBFES (4-/2Viydro:^yethy.l7piperazino-2-ethansulfonsäure) / 0,0725 M NaGI / 0,0725 M KCl bestand, Das Gemisch wurde für mehrere Minuten in einen Bad-3escaallungsapparat (Laboratory Supplies Co,., Inc) des Typs 10536 (80 KHz Frequenz: Ausgangsleistung 80 Watt) eingebracht, während es durch Darüberhinv;egleiten eines sanften Stickstoff stromes zu einer viskosen Paste getrocknet vjurde,

Der verbleibenden viskosen Paste wurden 10 ml 5 ^M HSPES zugesetzt, Das so entstandene otreptomyzin enthaltende SPL3— Präparat -surde in der Pufferlösung suspendiert, mehrere Minuten lang auf einen Vortes-Mischer geschüttelt und durch Zentrifugieren bei 12 COO χ g über-/10 min hinweg bei 20 ^UC von nichteingebettetera Streptomyzin befreit. Der resultierende Kuchen Tvurde in 0,5 al 5 sM HEPBS suspendiert,

Die oben beschriebene Yorgehens^eise ^urde beibehalten, 7Jobei anstelle von Streptomyzin ",e^eils eine der folgenden Substanzen eingesetzt wurdet Dihydro streptoayzin. Ge nt aiay ζ in sulfat, ÄffiOLzillin, 'üetrazyklinhydrochlorid und Kanamyzin.

Der in Abschnitt 6,1,: beschriebene Prozeß -surde beibehalten, allerdings mit dem 3i-Lezithin irgendeine der folgenden

Substanzen zugesetzt Tjurde; (1) P'aosphatidsäure zwecks Erlangung eines molaren Verhältnisses von 3 : 2 (Lezithin ί Dicetyiphosphat); (2) Stearylamin zwecks Erlangung eines molaren Verhältnisses von 3 t 2 (Lezithin % Stearylamin); Cholesterol und Stearyiamin z?;ecks Erlangung eines molaren Verhältnisses von 7 ; 2 : 1 (Lezithin ; Cholesterol : 3tea-

- 40 - _a ' 62 266 12

23.12,83

ryiamin); und (3) Phosphatidsäure und Cholesterol zwecks Erlangung eines molaren Verhältnisses von 7 J 2 j 1 (Lezithin Phosphatidsäure s Cholesterol).

6«3. Pilokarpin enthaltende SPL3

Die 7örgebensoeise aus Abschnitt 6.1, vsurde beibehalten, wobei allerdings anstelle des Antibiotikums Streptomyain Pilokarpin eingesetzt ¹SUr de,

5,4» Mit und ohne D3PC hergestellte SPL3

Undestiilierter Ether enthält zu Lagerungszraecken ein Antioxydationsmittel, 1 /Ug/ml Butylhydroxytoluen (3ΞΓ), Die in Abschnitt 6.1, beschriebene Yorgehens^eise -surde beibehalten, vüobei- als Lösungsmittel undestiilierter Ether ve^jendet "jurde, um'3HI in das 3?L3~?räparat zu inkorporieren,

Um SPL3 ohne Sinverieibung von BEI herzustellen, vvurde die in Abschnitt 6.1. verfolgte "orgehens'seise beibehalten, v;c-

7» Aüs^ührungsbeiapiel: SPL3'vermittelte Abgabe in vitro

Im folgenden Ausführungsbeispiel vjurde die SPifB-veriaittelte Abgabe von Antibiotika an in Kultur befindliche Makrophagen demonstriert,

Peritonale Makrophagen wurden durch peritonale Auswaschung

aus Cr-r-3jLK erwachsenen männlichen Mäusen oOTJie durch SusOen 5/

dierung in minimal essentiellem Medium (M.^-M.) mit pH 7₃2, gewonnen. Die Zellen tjorden in einer Konzentration von 1 Ί. 10° Zellen pro Milliliter in Gewebekulturschalen mit ySer

41 - 52 266 12

23.12,83

Bohrung suspendiert. Den Kulturen, welche anhaftende peritonal3 Makrophagen enthielten, ?rarde 3« canis in Konzentrationen von 1 2 10° koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zugesetzt· Each 12 Stunden wurden die nicht von peritonalen Makrophagen verschlungenen Halfterien durch wiederholte Waschungen mit Μ,Ξ,Μ. beseitigt. IT ach der Waschung der peritonalen Makrophagen-Kulturen wurden diese in 5 Gruppen unterteilt, Tjobei jede Gruppe 12 Wiederholungskulturen enthielt, Gruppe 1, als Kontrolle bezeichnet, ?mrde keiner Behandlung unterzogen, Gruppe 2 erhielt ?;ä3riges Streptornyzinsulf at in einer Konzentration von 1 mg/al, Gruppe 3 erhielt puffergefüllte SPL3, Gruppe 4 erhielt vsäiBriges Streptonryzinsulf at (1 mg/ml) plus vorgefοrate puffergefüllte SPLB. Gruppe 5 erhielt SPLB, "/eiche Streptom-rzinsulf at (1 sg/ml) enthielten, rlach 24 Stunden «orden die Überstände durch wiederholte Waschungen, entfernt, die peritonalen Makrophagen wurden durch 7iiederholtes· Einfrieren und Auftauen, zerrissen.» Aufeinander— folgende Verdünnungen von zerrissenen Makrophagen wurden auf Brucelie-Agar plattiert, und naca 4 Tagen wurden die überlebenden 3, canis durch Grsnzverdiinnungstechniken bestimmt. Die in Tabelle 711 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß SPL3-eingeschlossenes Streptosyzln eine totale Wirksamkeit hai f·. ρ ti ifThn-frii^o· ',Τ"·.η ΤΠ ί ^₁-! ηί ^τίιγ^ ίαη ί ^-ΠΤΌ/^Ι 1 ill Ht"="

3,-canis-lnfektlon in vitro bewies«

Das Experiment Tvurde in genau der gleichen obigen Weise unter Verwendung von B« abortus wiederholt, wobei die peritonalen

YII dargestellt.

- 42 - 62 266 12

23.12,83

3. Ausführungsbeispiel: Behandlung intrazellulärer. Infektionen

Die folgenden Ausführungsbeispiele demonstrieren, ?3ie bei der Behandlung von intrazellulären Infektionen verwendet werden können. Die aufgeführten Daten demonstrieren: (1) die .Wirksamkeit des Einsatzes von in SPLB eingebetteten Antibiotika bei der Krankheitsbeaandlung und (2) die größere Wirksamkeit, die durch Verabreichung von Mehrfachdosierungen des SFL3~?räparates erzielt ?jird. Sin "vergleich der in den Versuchsanordnungen als Bläschen verwendeten 3PL3 und MLB ?Jird beschrieben.

gabeile VII

Zoloniebildende Einheiten von intrazellulärer Bruceila, die nach Behandlung von infizierten Makrophagen mit Streptomyzin enthaltenden SPL3 isoliert wurden

3, canis^a B, abortus⁰

Sontrolivarianten 2,6 + 1,13 s 10^J 3,1 ± 0,31 :; 10⁴ Puffergefüllte 5PL3 2,82 + 0,10 ζ 10³ 2,9 + 0,17.s ΙΟ⁴ freies Streptomyzin⁰ 3,11 + 0,40 χ 10^ 3,3 ± 0,25 χ ΙΟ⁴

Stre-otomyzin _n ^

puffergefüllte 3PL3'^J 2,?β τ 0,20 s 10" 2,3 + 0,42 2 10 SPL3-eingeschlossene

3treptomyzin^c . 0 '0

* üoloniebildende Einheiten von 3» canis (Mittelwert _+ Standaraab'seiGhung von 12 Wiederholungen) , die von gleichen Anzahlen zuvor infizierter peritonaie Makrophagen von Mäusen (C^r₇BIk) isoliert wurden,

⁰ Soloniebildende Einheiten von 3, abortus (lütte 1-jer~ + Standardab^eichung von 12 Wiederholungen), die von gleichen Anzahlen zuvor infizierter Oeritonaler MakroOhasen von

- 43 - 62 2β6' 12

23.12.83

Meerschweinen isoliert wurden» ° Streptomysin-Konsentration 1 mg/ml,

Die Brucellose verursacht weltweit wirtschaftliche and gesellschaftliche GesundheitsOrobleme. Brucellose wird durch Bruce11a spjo. hervorgerufen. Sie hat sich zahlreichen Säugetier ar ten, darunter dem Menschen, Haustieren und einer Seihe von Wildtieren ansepaSt, Die Brucellose der Tiere wird von sechs Bruce 11 a soo. hervorgerufen; es sind dies 3-, abortus, 3« canis, 3, melitensis, 3» naotomae, 3» ovis und B-, suis. Sowohl Haustiere als auch Wildtiere dienen als Heservoir für die potentielle Ausbreitung der Brucellose auf .andere Tiere und den Menschen.

Derartige Infektionen können mit Antibiotika nicht ausgeräumt werden, da sich die infektiösen Organismen in den Zellen des retikuloendothelial^n Systems aufhalten und gegenüber den bakteriziden Wirkungen von Antibiotika in hohem MaBe widerstandsfähig sind«- Die Menge der erforderlichen Antibiotika sowie die Behandlungsdauer führen entweder zu tonischen Auswirkungen auf das Tier oder aber zu einer unannehmbar hohen Konzentration des Antibiotikums in den Gegeben des Tieres. Die weitere Schwierigkeit bei der Behandlung dieser Krankheit besteht darin, daS eine solche Behandlung vollständig wirksam sein muB, da jedwede verbleibende Infektion sich einfach ausbreiten wird, wodurch der Zyklus erneut besinnt. Die ökonomische Belastung infolge derartiger Erkrankungen aeigt sich an

ben verlorengehen. Der einzige mögliche 7/sg zur Bekämpfung der.artii:9r infektiöser Ausbrüche besteht darin, die -Tiere in Quarantäne zu bringen und dann zu schlachten.

- 44 - 62 266 12

23.12,33

Die folgenden Ausfiihrungsbeispiele befassen sich, mit Einverleibung eines Antibiotikums in 3PL3 sowie mit der darauffolgenden Verabreichung des eingebetteten Wirkstoffes an die Tiere durch intraperitonale Inokulation der infizierten Tiere,

8,1, Wirkung einer Sinzsibehandlung einer 3,-canis-Infektion •unter Verwendung eines SPLB-eingeschlossenen Antibiotikums _; ___„

Achtzig er^acnaene männliche Schweizer Mäuse wurden intraperitonal (i.?O mit 3. canis ATCG 23365 (1 2 10' koloniebil-' dende Einheiten) infiziert und in S Gruppen zu rje 10 Mäusen unterteil-» Sieben Tage nach der Inokulation mit 3* canis wurden die Grurroen ioiss

enderaaSen b

Kontrollgruppe bezeichnet, erhielt keine Behandlung; Gruppe 2 erhielt puffergefüllte S?L3 (0₃2 ml i.p«); Gruppe 3 erhielt 'SäBriges Streptomyzinsuif at (1 mg/kg Zörpermasse in einer Gesamtverabreichimg von 0,2 ml i.p,)} Gruppe 4 erhielt wäßriges 3 tr ep to my ζ ins ulf at (5 mg/kg Körpernasse) in einer Ges-amtverabreichung von 0,2 ml i.p,; Gruppe 5 erhielt -säSriges Streptomyzinsulfat (10 mg/kg Körpermasse)in einer Gesamtverabreichung von 0j2 ml i,D,; Gruppe 6 erhielt ötreptomyzin-

saiitverabreichung von 0,2 ml i*p. ; Gruppe 7 erhielt Streptomyzinsulfat'enthaltende 3PL3 (5 mg/kg Korpermasse) in einer Gesamtverabreichung von 0,2 ml i.p,; und Gruppe 8 erhielt Streptomyzinsulfat enthaltende SPL3 (10 mg/kg Körpermasse) in einer Gesamtverabreichung von 0,2 ml i,p.« Am 14, Tag nach der Inokulation mit 3. oanis wurden sämtliche Tiere getötet, und die Milz der Tiere Tvurde aseptisch entnommen, Die Milzen wurden homogenisiert und aufeinanderfolgend auf

3ruceIla-Agar verdünnt, um die Anzahl der nach der Behandlung in den Milzen überlebenden 3« oanis zu ermitteln* Die nach 4tägiger Bebrütung zutage getretenen Ergebnisse sind in Tabelle VTIl dargestellt.

8,2, 77irkung einer Mehrfachbehanclung einer B.canis-Lufek— tion unter Verwendung eines 3PL3~eingeschlossenen Antibiotikums

männliche Schweizer Mäuse wurden mit

3. canis ATCG 23365 (1 χ 10? koloniebildende Einheiten, i,p·) infiziert und in 3 Gruppen zu je IC Mäusen unterteilt. Sieben Tage und 10 lage nach der Inokulation mit 3, canis wurden die Gruppen folgendermaßen behandelt: Gruppe 1, als Kontrollgrupoe bezeichnet, τ/urde keiner Behandlung unterzogen; Gruppe 2 erhielt puffergefüllte S?L3 (0,2 ml i.pO; Gruppe 3 er-Melt wäßriges Streptosiyzinsulfat (1 mg/kg Sörpermasse) in . einer Gesarrtverabreichung von 0₃2 mlj.i.p*·, Gruppe 4 erhielt wäßriges Streptosysinsulfat (5 mg/kg Sörpernasse) in einer Gesasitverabreichung von O₃2 nl, i^P»; Gruppe 5 erhielt 7)ä3ri~ ges Streptoniyz in sulfat (10 mg/kg Körpermasse) in einer Gesamtverabreicr-ung von 0,2 si, i.p, «,Gruppe 6 erhielt Streptoniyzinsulfat entnaltende 3PL3 (1 mg/kg Kcrpersasse) in einer

tomyzinsulfat enthaltende SPL3 (5 ng/kg Sc-rt;ermasse) in einer Gesaatverabreichung von 0,2 ml, i.p»5 und Gruppe 8 erhielt Streptooyzinsulfat enthaltende 3FL3 (10 mg/kg Körpermasse) in einer Gesamtverabreichung von 0,2 ml, i.p,.

52 26 β 12 23.12.83

Tabelle VIII

Wirkung einer -Sinzelbehandlung¹* von 3.-can is-Infizierten Mäusen mit verschiedenen Konzentrationen von freieia oder SPLB-eingeschlossenem Streptomyzin

Koloniebiidenda 3inheiten 3, oanl όγο Milz ^D

V₁^_n j. ^_n η _{Ί ο} keine Behandlung Puff er gefüllte 5PL3

2,7 x 1Ο^δ Ο,βδ 3 10^b

StreptomyainKonzentrat ion Freies SPL3—eingeschlossenes (sig/kg ZörOermasse^ Strebtom~sin StreOtoryysin

' ' 1 ' 1,5 ± 0,45 :r IQ^ 1,01 l 0,25 ;r 1G^j

'— -'Il

10 ¹^ 66 ~ ^ ^8 ^ν IC""" 1 32 — 1 00 "ί 10"

^α Ι,ρ.-Insektion in einer Gesamtmenge von· 0,2 ml (sterile physiologische Kochsalzlösung).,

^u Überlebende B-, canis wurden als die Anzahl der pro Milz isolierten koloniebildenden Einheiten bestimmte ihre Anzahl TJird als Mittelwert + Standardab^eichung von 10 Tieren pro Es Ό s 3? "i ment ^^iUoerimente "^n 'dreifacher 7/iederholim2^N: darse— stellt,

Am 14« Ta^ nach der Inokulation mit 3, canis wurden sämtli-

tötet ihre Mil

entnommen

che Tiere getötet, ihre Milsen vvurden aseptisch ent Die Milzen wurden homogenisiert und aufeinanderfolgend auf

ιζψ -

62 266 12 23.12,83

Die in Abbildung 5 dargestellten Ergebnisse verschiedener Z^eistuf en-Behajadlungsregiines von 3,-canig-Infektionen in vivo veranschauliche^ daB bei jenen Gruppen_? die 7 unä. IO Tage nach der Inokulation wäBriges Strep tour/ζ in erhalten, nur eine sehr geringe Verminderung der in den Milzen überlebenden 3« canis beobachtet wurden, Lediglich bei jenen Gruppen, die 3?L3-eingeschlossenes Streptomyzin in einer Konzentration von 10 mg/kg Eörpermasse am '?· und 10. Tag nach der Inokulation verabreicht bekamen, v^aren sämtliche lebensfähigen Bakterien aus den Milzen indizierter 'Tiere eliminiert»

Zusätzlich sum. oben beschriebenen Scperiment wurden verschiedene Gewebe von 3 . -c an Is- infiziert en Mäusen nach znei Behandlungen mit S?LB—eingeschlossenem Streiotomyzin folgender-

maRpp, ,s rj-r 71 ρ rrrrn ja η «

7 —

23365 (1 :ϊ 10· koloniebildende Einheiten, i*p»)

beimpft. Sieben Tage nach der Impfung wurden die Tiere in drei Gruppen zu je 10 Mäusen eingeteilt. Gruppe 1₃ als Zontrolle bezeichnet, ^urde keiner weiteren Behandlung unterzo-· gen; Gruppe 2 erhielt (am 7· und 10. Tag nach der Impfung) wäEriges Streptomysinsulfat (10 mg/kg Sörpermasse) in je einer

ι ¹^J. CU- ν« U LJ. I, i j I. S^ «^ Lj. '-ί -^-*!~; ^w ' w^J. Wai— w« « *. * -^> a % ^«. <_*. ^^^ ^' C ^¹ ^/ J^ » ^. w j. O \^ CU^

' ^ ^ ?5~ΡΤ·!3 /ΊΠ ""if /Vo* TH^r>A'P^2 5cp') "ia^oi " = ϊτι λ-! r:iST> TJ μ5-η ο η ~i es-J flhH¹*!^*

^m. ν ^¹J. ' ' ' ^ 1 --ν* ^J.^/ £-jz- j_w J^. v^-«— xi^C^^J i^^y J'v ;V vdaMM w.*J. ¹W 3^J_nI ^ w. « wJ.<_vi,v-J>'-^rJ.^ Ί ^:. '.U ', von 0,2 ml j i,p.. Zwischen dem 14, 'und 75- Tag nach der Impfung mit 3» canis wurden sämtliche Tiere getötet; die im folgenden genannten Organe 7,'urden aseOtisch entnommen₃ homogenisiert und aufeinanderfolgend auf Bruceiia—Ag.ar zur Isoia—

J i. Wii vOii αν » 's/ CU-ί J. J " ~ ' i ' ' '.'' *

7ιϊ7 11 ^ -^ O 'ι T ^ -7 T ^ V^ ^ ^^ T ii ^ CL

Zoden, Die Ergebnisse hinsichtlich der nach viertägiger Bebrütung pro Organ überlebenden 3. canis sind in Abbildung 5

Vj ^ ' ^^uUV^J^U4

ü-g ~ 62 266 12

23.12,83

Ci 1 "j "j™ p T] "'T^i-'hr-i C'^g "TT C _:*"ΐ i-J '*"* ^, ¹Q Λ O ,C5 H^ Ä >-i

"73X¹SGiIX-¹¹^CIwIi₁Or vj"vJο0Θ OcI -w < -~*'^ HJlXip—'^n.i- -LΌ =i.^?j., I¹Cu₁ .-UCi.u.w'cix-ί ij,ci'-j i-i

Γ7ΤΤΪ Δ ί .STTi ΟτΛ Τ" . **< V)TT f? ^i V-\ «,"r^ -^ΟΟμΠΙ t"l?v~:q νια ^T TTPc; Τ". P ^ C* P- ϊ*> Λ PS K "θ ^ *1 ί^ΛΓΐ τη -ΐ 4"

ώ W tZ j. W Oi υ ^ υ ^v-d, ί ώ -LXi i-> S^ i-l.clfc-i.^J- U^^jj-, J^ wr i.iiiW Ϊ3 ώ^*ί-Ο*Αΐ \-l CLi* Uw^ UvU iUJ-U SPLB-eingeschlosseneni Streptomycin behandelten fieren sämtliche zwischen dem ^ΛΛ» und dem 75-» -ag nach der Impfung mit anis_ gesogenen Ge^ebeprooen vollständig frei von irgendoaiii

welchen lebensfähigen 3.₈-canis-0rganismen ?;aren, Demgegenübe: konnten bei unbehandelten Tieren oder fieren_} die mit TJäBrigem. Streptonrjain bei in bezug auf dessen Konzentration und Terabreichungsvjeissn gleichen Vorgehen ">ie im Falle des S?L3-

werden, deren Probenahme zwischen dem. 1-4·» und 75 der Beimpfuns mit B. canis erfolgte_a

b,3· wirüsamKei- von ^enanaiungen mi" üsrijh gegenuoer Behandlungen mit ML3

i on er"j ac n s en e 2,

-, 4 — ^ Γ\\i^Γ* O Q O CZ U f Λ -.? λ ~\. ' 1 -^ "; — v^ ^ _ο ν, ^ 1 A ^y> A Cu -i* ^ ^ ^Γ-^ ^i ; ~ ^ir^ ή ^™·

geimpft» Sieben Sage nach der _mpfung wurden die 'Hiere in 3 Gruppen zu je 5 Mäusen aufgeteilt* Gruppe 1, als lontroiigru-ΌΌβ' bezeichnet₅ τ/urde keiner weiteren Behandlung unterzogen; Gruppe 2 erhielt (am 7* U£d 10, Tag nach der Inokulation) Strep-omyain enthaltende 2£L3 (10 mg/kg Zörpermasse^ i.ps). Die ML3 wurden unter Anwendung herkömmlicher Techniken unter Einsatz von 100 mg Zi-Phosphatidylcholin (3PC) und

sulfat betrug 100 mg ZIrC zu 23 mg Streptomjzinsulfat in den 2 ml der finalen MLB-Suspension; Gruppe 3 erhielt (am 7, und

üQ 62 2ββ 12

23 »12/33

Abschni~~ 5,1», allerdings mit; den folgenden Modifikationen hergestellt worden ',-Varen; verwendet wurden 100 mg 5IPC sowie 0,3 SiI HEP33, Vielehe 100 mg Streptomyzinsulfat enthielt. Das Verhältnis von Lipid zu Strept01272insulfat in- den SPLB betrug 100 ag 3? C zu 28 mg Streptomvzinsulf at in einer finalen Suspension von 2 ml, An 14» -Tag nach der Impfung mit 3* ο an is wurden sämtliche 'Tiere getötet, ihre Milzen "orden aseptisch' entnommen, homogenisiert und zur Isolation von 3, canis aufeinanderfolgend auf 3rucella-Agar verdünnt, Die Ergebnisse hinsichtlich der nach viertägiger 3eorütung pro Organ über— 1 90·3γι^9^ 3j can"'3 sind ^n CD^bslle "^"L dargestellt»

•I'abelle IX

Scntrolle 2,7 + I₅O ζ 1θ"

' ' ι', I ' -* ' J λ ο ~Γ O * M" — i 1 >_

S?L3^C O

" Intraperitonaie In^eirticnen, 10 mg/kg Scrpermasse, wurden in dreitägigem Abstand verabfolgt» Die Sonörollgruppe >;ur-

Überlebende 3. oanis wurden als die Anzahl der Oro Milz

^ioniebildenden Einheiten bestimmt; ihre Anzahl -Ls Mittelwert + 3tand.ardab~;eichung von 5 Heren oro

7»ircL als llittelv.ert

Da^ "erhältnis 3i-?ho5p.:atid7lci2oiin \ Strep-omysinsuif at betrug 100 mg. Lipid t 23 mg otrep-omyzinsulfat·

- 5D - 62 266 12

23.12.83

8.4, Wirkung verschiedener SP-uB-eingeschlossener Antibiotika auf die Behandlung der Infektion

Fünfzig ausgewachsene männliche Schweizer Mäuse wurden mit B₃ .canis AI¹CC 233^5 O ^ 10 koloniebildende Einheiten, i*p») geimpft. Sieben Tage nach der Inokulation wurden die Tiere in 10 Gruppen ζα je 5 Mäusen unterteilt, Gruppe 1, als Eontrolle bezeichnet, ?mrde keiner weiteren Behandlung unterso-

O^!if f e^sefüllte SPIiB ^O 2 ⁷^l *' ,^ ^ · die G^'iO^en ~ τ- 5 un^ 6 erhielten am 7* und IQ. lag nach der Inokulation wäßrige Injektionen (0,2 ml i*p«) von^: Dihydrostreptcmyzin, Gentamy— zin, Kanamyzin oder Streptosiyzin (10 mg_y ^/kg Sörpermasse, i»p.) (P.S₁ - Jedes dieser Antibiotika hat sich als imstande er^ie^senJ B, canis in vitro abzutöten), Die Gruppen 7₃ S₃ 9 und 10 erhielten' am 7, und 10, lag nach der Inokulation 3PL3, weiche Dihydrostreptomysin, Gentamyzin, Eanamyzin oder Streptomysin in einer Dosierung von 10 mg/kg Kör"oermasse enthielten. Am 1^» lag nach der Impfung mit 3> c en is wurden sämtliche Here getötet, ihre Milzen wurden aseptisch entnommen, homogenisiert und zur Isolation von 3, canis aufeinanderfolgend auf Bruceila-Agar verdünnt. Die Ergebnisse hinsichtlich Λορ ""Sfh ^7 i » ~^~T~, ä ~r η sari "^p r\ -pi ϊ"Π"" '" α" ^Τ"~·. P-i^ccn iioa^¹" a'nar.na>i

schiedener Antibiotika an 3,-canis-inf!zierten Hausen zeigen, daß Antibiotika_s die 3,· canis in vitro (d, h, in Suspensionskultur) abtöten können, 3.~canis-Infektionen in ViVO ₁ nur dann abtöten können₃ ^enn sie in S?L3 eingebettet sind, Die entweder mit wäßrigen Antibiotika, mit οuffergefüllten 3PL3 versorgten oder aber unbehandelt gebliebenen Here ?)-aren in keinem PalIe frei von überlebenden 3, canis in-den isolierten

~ 7% - 62 266 12

23,12.83

3.j. Behandlung von mit 3. canis infizierten Hunden

Ausgewachsene weibliche Seagle-Hunde wurden oral und vaginal mit 3. canis ATCC 23365 (1 s 10' koloniebildende Einheiten) beimpft. Sieben Tage nach der Impfung -wurden die Hunde in drei Gruppen !unterteilt. Gruppe 1, als Kontrollgruppe bezeichnet, wurde keiner weiteren Behandlung unterzogen; Gruppe 2 erhielt (am 7. und 10. Tag nach der Inokulation) wäßriges Streptomyzinsulfat in einer Dosierung von 10 mg/kg Körpermasse (jede der Verabreichungen umfaßte 5,0 ml, i.p.). Gruppe erhielt (am 7· und 10. Tag nach der Inokulation) Streptomyzinsuifat enthaltende SPL3 in einer Dosierung von IC mg/kg Körperaasse (jede Verabreichung umfaßte 3*0 Eil, i.p.).

Tabelle 2 .

Vergleich verschiedener Antibiotika hinsichtlich der Abtötun_t ^c von 3. canis in vivo nach zvjei Behandlungen⁰¹

Soloniebildende Einheiten 3, canis pro Mils'

Wäßrige Lösungen SPLS-eingeschlosse-

nes Antibiotikum

!!^behandelt 3,93 + 1,51 s 10° 4,66 + 0,87 s 10⁶ Antibiotikum"

Dihydrostrepto-

my ζ in ~ 1,13 + 0,30 χ 10-⁷ 0

Gentamyzin 7,06 + 2,53 s 1C-⁷ 0

—— ,—

Strept02372in 1,01 τ 0,1? χ 'ΊΟ⁵ 0

^ lntraperitonale Behandlungen, 10 mg/kg AÖrpermasse, wurden in dreitägigem Abstand verabfolgt. Die Zontrollgruppe erhielt keine Behandlung.

Pro Organ überlebende 3. canis 7,'urden als die Anzahl- der r>ro Milz isolierten koloniebildenden Einheiten bestimmt und

52. - S2 266 12

23,12,83

als Mittelwert + Standardabweichung von 5 Tiersn pro Gruppe (Doppelbestimmungen pro Tier) ausgedrückt.

^G Antibiotika _} die 3, canis in Suspensionsiiultor abtöten.

Vor und während der Untersuchung sowie nach deren Abschluß wurden in regelmäßigen Abständen von den Versuchshunden Vaginalabstriche und heparinis ierte Blutproben gesammelt. Diese wurden auf Brucella-Agar kultiviert, um 3, canis zu isolieren« Dia Ergebnisse sind in Tabelle XI dargestellt. Desgleichen warden vor und während der Untersuchung sowie nach deren Beendigung Serumproben zur Bestimmung des Serum-Anti-' körpers gegen 3, canis gesammelt. Diese Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle ICE aufgeführt,

Tabelle ig

Ergebnisse der Kulturen und serologischen Prüfung bei B.canis-inf!.zierten Hunden, die einer antibiotischen Doppelbehandlung ausgesetzt wurden⁰"

Tage nach der Kontrolle Streptomyzin SPLB-eingeschlos-

Infektion mit senes Strepto-

B. canis 372in^G

hmbvh'mbvhmb'v

Vor Behandlung

0	0	0	0
	ITB	ITB	-U
iX	ITB	ITB	"f
ITach Behan
8	0	0	0
10	0	0	0
21	1.5	2

0	0	0	r\	0	0	0	0
O	IT3	+	0	ITB	ITB	+	-l·
S3	IT3	-r	+	ITB	ITB	-ί-	-ί-
0	0	+	0		0	0	0
0	0	0	-r	0	0	0	0
,-1 ί	IV)			0	0	0	0

- 53 - 62 266 12

23.12,83

"~ ?i (Qbiektträger-Agglutinations-Schnelltest) bezeichnet den Kehrwert des Serumtiters gegenüber 3.-canIs-Antigen (x 10~); 0 = kein nachweisbarer Titer.

M (2-üierkaptoethanol-Höhrenagglutinationstest) bezeichnet den Kehrwert des Serumtiters gegenüber B,-canis-Antigen (x 10²);

0 = kein nachweisbarer Titer.

In 3 (Blutkultur) und 7 (Yaginalkultur) auf 3rucella-Agar; -r = JTachweis von einer oder auch mehr als einer koloniebildenden Einheit;

0 = keine Kolonien nachweisbar. Die Kontrolltiere erhielten keine Behandlung.

⁰ Streptomyzinsulfat (wäBrig) 10 mg/kg Körpermasse, i,p.

^G Streptomyzinsulfat enthaltende SPLB (10 mg/kg Körpemasse, i.p,) !TB = keine Bestimmung

Sinundswanzig Tage nach der Beimpfung mit 3. canis wurden sämtliche Tiere eingeschläfert. Die folgenden Gewebe -wurden aseptisch entnommen, homogenisiert und zur Isolation von 3. canis aufeinanderfolgend auf 3rucella-Agar verdünnt % heparinisiertes Blut, Scheidenessadat, Lungen, Milz, Synovialflüssigkeit, Uterus, Ovarium, poplitale Lymphknoten, Speicheldrüsen, Tonsillen₃ mediastinale Lymphknoten, Lymphknoten des Mesenteriums, Knochenmark, oberflächige zervikale Lymphknoten und Achseilymphknoten. Die Ergebnisse hinsichtlich der nach viertägiger Bebrütung pro Gewebe überlebenden 3, canis sind in Tabelle XII gezeigt,

In Tabelle XI sind die Hesultate der Suiturversuche sowie der serologischen Tests an mit 3. oanis infizierten Hunden aufge-', vvie sie vor. während und nach einer in zwei Stufen

62 266 12 23.12.33

erfolgenden Verabreichung von Antibiotikum gewonnen wurden, Sämtliche 'Tiere waren hinsichtlich einer etwaig vorangegangenen Exposition gegenüber 3* can is serologisch negativ₅ wie dies aus den negativen Serumtitern hervorgeht: desgleichen waren sie kulturnegativ_s wie dies aus den Blutkuituren and den mit Vaginalabstrichen -angefertigten Kulturen hervorgeht, Dein gegenüber waren sämtliche (Eiere vor den Behandlungen am 7. und 10, Tag kulturpositiv sowohl hinsichtlich der Blutkulturen als auch hinsichtlich der Vaginalabstrichkulturen. Hunde, die mit wäßrigem Streptomyzin behandelt oder überhaupt keiner Behandlung unterzogen wurden, blieben hinsichtlich der Blut- und Vaginalkulturen während der Perioden nach der Behandlung und vor der Versuchsbeendigung am 21, '!ag kulturpositiv, Gruppe 3i welche streptomjzlnhaltige Liposome erhielt, wurde einen (Tag nach der ersten Behandlung kulturnegativ und blieb negativ über die ganze der Behandlung folgende Zeitspanne hinweg, ITicht behandelte oder mit wäBrigem Streptomyzin behandelte Hunde entwickelten zum 21 ♦ 'lag nach der Infektion nachweisbare Serumtiter gegen 3,-canis-Antigene, während die am 7» ¹^Q. 10, lag nach der Inokulation mit Antibiotika enthaltenden SPLB behandelten Tiere keinerlei nachweisbaren Antikörper gegen 3,-canis-Antigen entwickelten.

Tabelle XIl

Resultate aus Kulturen von Gewebeproben υοώ. 3,~canis-infisierten Hunden, die einer antibiotischen Zweistufenbehandlung unterzogen wurden³"

Gewebe Streptcmyzin Streptomyzin^ Kontrolle⁰"

enthaltende

QT3T ^G

Gesamtblut ' 0 + ' -r

Vaginalabstrich 0 + -f

Lungeü 0 -r +

62 266 12 23,12.83

Tabelle XII (Fortsetzung)

Milz	0
Synovialflüssigkeit	N,3,
üterus	O
Ovarium	0
PoTDütaler Lymphknoten Speicheldrüse	E.B. 0
I1 ons i He	O

0 0

+ 4·

Mediastinaler

Lymphknoten O Ή.Έ>₉

7~ i'S	«3.
/~\ U
	,3.
0

Lymphknoten des

Mesinteriums Ή*Β. 0 0

Knochenmark

Oberflächlicher zervi-

kaler Lymphknoten IT,3. IT.3»

Achsellymphknoten

^a Die Tiere wurden am 7* und am 10, Tag nach der Infektion behandelt,

Die bei der Leichenöffnung entnommenen Proben wurden aufeinanderfolgend auf Bruoella-Agar verdünnt; -r = eine oder auch mehr als eine koloniebildende Einheit; 0 = keine Kolonien,

^J Streptomyzinsulfat enthaltende SPLB₃ 10 mg/kg Körpermasse, i.p.

^α Streptomyzinsulfat OäBrig), 10 mg/kg Körpermasse, i.p.

Die Kontrolltiere eraielt;en keine Behandlung ⁷T,3, = keine Best^mmuns

Die in Tabelle IGII dargestellten P.esultate der Isolation von 3, canis aus mit einer zweistufigen intibiotikumverabreichuni behandelten infizierten Runden zeigen, daJä bei'Hunden lediglich die Behandlung mit Strep-omysin enthaltenden SPL3 be-

- 5% - 62 266 12

23.12,83

wirkte, da3 sämtliche lebensfähigen 3, canis aus allen Gegeben sämtlicher Organproben eliminiert wurden.

8,6 Behandlung "on A. abortus bei Meerschweinen

Fünfzehn ausgewachsene weibliche Meerschweine wurden mit 5, abortus geimpft (A(ECC 234,51, 1 χ 10*⁷ koloniebildende Einheiten, i.p.)-· Sieben 'lage nach der Infektion wurden die Tiere in drei Gruppen zu je 5 Tiern aufgeteilt, Gruppe 1₅ als Kontrollgruppe bezeichnet, ?;urde keine weitere Behandlung auteil. Gruppe 2 erhielt T/äSrigesStreptomyzinsulfat, i.p.-Injelctionen (0,2 ml) von 10 mg/kg Sörpermasse am 7- und 10» Tag nach der Infektion mit 3'» abortus« Gruppe 3 erhielt i,p,-In.jektionen von Streptomyzinsulf at enthaltenden SPL3 (O₅2 ml) von 10 mg/kg Sörpermasse am 7* ¹^Id 10, 'lag nach der Inokulation mit 3, abortus. Am 14. üag nach der Inokulation mit 3, abortus wurden sämtliche Tiere getötet; die Milzen- wurden aseptisch entnommen, homogenisiert und zwecks Isolation von 3. abortus ,aufeinanderfolgend auf Brucella-Agar verdünnt. Die Ergebnisse hinsichtlich der nach viertägiger Bebrütung pro Milz überlebenden 3, abortus sind in Abbildung 7 dargestellt. Lediglich Streptomyzinsulfat enthaltende SPLB erwies sich als wirksam, die sich in der MeersGhiveinmilz aufhaltenden B, abortus zu eliminieren, Bei Tieren, die -wäßriges Streptomyzin oder keinerlei Behandlung erhalten hatten, wurden lebensfähige 3»-abortUS-Bakterien identifiziert,

8.7. Behandlung einer B.-abortus-Infektion bei Sühen

Im Hahmen dieses Experimentes wurden neun schwer infizierte Tiere verwendet, ITach einer Behandlung mit Streptomyzin enthaltenden 3PL3 wurden bakterielle Isolationen aus Milch und Scheidenabstrichen 3,-abortus-negativ und blieben auch über

62 266 12 23-12*83

6 '.vochen nach der Behandlung hinweg negativ; bei Wiederauftreten der Infektion in diesen Tieren wurden bakterielle Isolationen lediglich in ,jenen Sutervierteln gefunden, die vor der Behandlung erregeroositiv vjaren*

Verwendet wurden neun eingekreuzte (Hereford-Jersey-Brangus), 22 Monate alte, nichttragende, nachweislich 3.-abortus-kulturpositive Kühe. Mindestens 4 Monate vor Beginn der Untersuchung wurden die Tiere experimentell per conjunctivuin mit 1 : : 10' koloniebildenden Einheiten des 3.-abortus-St.aimaes 23OS 3ur Zeit der Trächtigkeitsmitte provoziert, dies resultierte im Verkalben und/oder in hinsichtlich 3» abortus^: kulturpositiven Sekretionen der Milchdrüse oder des Uterus und/oder kulturpositivsn fetalen Gegeben.

Die Zühe wurden in Sinselisolationsstallen gehalten und in drei Gruppen unterteilt. Die Behandlung umfaßte eine in Abstand von drei Tagen, erfolgende Verabreichung von_:z7iei Dosierungen in der nachstehenden Weise: (1) 3 Kühe wurden intra™ peritoneal mit physiologischer Kochsalzlösung gespritzt, (2) 3 Sähen vTurde »äßriges Antibiotikum (3treptom3"3in₅ 10 mg/kg AÖrpermasse) plus νorgeformte, puffergefüllte SPLB intraperitoneal injiziert, (3) 3 Kühen vsurde SFLB-eingeschlo'ssenes StreptonTj-zin (10 ag/kg Sörpermasse) intraperitonal inciisiert. Das Gesamtvolumen pro Injektion betrug 100 nil pro Tier»

Während der ersten 2 Monate wurden in zweifacher Wiederholung TJöchentiiGh bakteriologische Kulturen von Sekretionen der Milchdrüse und des Uterus angelegt, sofern Sekretionen gewonnen werden konnten-, Sodann wurden sämtliche Sähe mit einer überdosis ITatriumpentabarbitol eingeschläfert, worauf die folgenden Organe zweifach für bakteriologische,Kulturen entnommen wurden: (1) Lymphknoten: links und rechts atIahtal,

62 265 23.12,33

links und rechts suprapheryngeal, links und rechts mandibular, links und rechts parotidj links und rechts präscapular links und rechts popliteal, links und rechts präfemoral., links und rechts asillar, links und rechts internal iliac ₃ links und rechts supramammal, links und recats renal, bronchial, mediastinalj mesenterisch und hepatisch; (2) Drüsen: alle vier Viertel der Milchdrüse, links und rechte Bauchspeicheldrüse und die Thymusdrüse (sofern vorhanden)5 (3) Organe und andere Gewebe; Milz, Leber, linkes und rechtes Uterushorn, Gebärmutterhals_s Vagina, Niere und Tonsille»

UaGh der-Nekropsie wurden sämtliche Gewebe eingefroren und

den sodann aufgetaut_? lait Alkohol abgeflannst und vor den Wiegen aseptisch zugeschnittene ITacnd-sm. die Massen bastiiimit isaren (O52.,, .1,0 g) ₃ -wurden die Gewebe in 1 ml steriler Saline homogenisiert und ebenfalls' mit steriler Saline aufeinanaerfolgend auf 1 i 10- ^w der anfänglichen Homogenisat— Suspension' verdünnt,' Aliquote Mengen (20 -ul) von jeder Yer~ dünnuni.· aus den seriellen Suspensionen wurden auf Bruceila— Agar plattiert und bei 37 ⁰G bebrütet* An jedem Gewebe flurdsi Doppeibestimnungen vorgenoimnen»

Die Platten wurden täglich abgelesen und hinsichtlich Bakterien-Wachstum registriert, Sämtliche vor Ablauf von 'drei Tagen erscheinenden Kolonien wurden isoliert, einem Durchlauf unterzogen, und specks Peststellung der Identität einer Gramfärbung ausgesetzt. Am ;,, 6, und 7· '2ag während der Bebrütung wurden jene Kolonien, die hinsichtlich Morphologie, Wachstum und Gramfärbung alt' 3,· abortus übereinstimmten, gezählt 5 die koloniebildeaden Einheiten pro Gramm Gewebe wurden sodann bestimmt. !Repräsentative Solcnien wurden zur bakteriellen Bestätigung von B* abortus einem weiteren DuTcu-

CQ _

62 265 12 23.12,83

Die bakteriologischen Isolationen erfolgten an sämtlichen Gevve beprob en, die Bakterienmenge pro Grama Gewebe ^urde errechnet. Die Ergebnisse von vier Tieren - ein Placebo-Kontrolltier and drei mit 3PLB-eIngeschlossenem. Streptcmysin behandelte -Tiere - sind in Tabelle 2ZII dargestellt.

Tabelle

Ergebnisse von Kulturen mit Gev;ebeproben von 3,-abortusinfisierten Kühen

Ge^eoe

ünbehan- SPLB-eingeschlossedelte nes Streptomycin Kontrolle

Bauchspeicheldrüse L (links) Bauchspeicheldrüse 3 (rechts Lymphknoten atlantal H Lymphknoten atlantal L Lymphknoten aziilar 2 Lymphknoten a^iillar L Broncaiailymphknoten

Hepatisoher Lymphknoten

UteruBtLom 2

jjympniZLO-en inx;, iliac ±d

mac l.

Milchdrüse L vorn

Milchdrüse L hinten Milchdrüse H vorn

O	O	O	C
	O	O	_!.
"i—r	+	O
O	O	O	+
.; „ ;„.!„	O	+	O
A. J.		O
O	Q	O	O
O	O	O	O
-r-f-r+	O	O	O
O	O	rs	-f
O		O	O
	O	O	O
	O	-τ-	O
	η	0	O
α	O	O	O
Q	O	ο	O
O	-ί-	-ί-	O
O	0	0
	O	O	O

- e-φ - 52 266 12

23.12.S3

TI ~ Vs al 1 a VTTT ''Ti ^ -,i-i . ~

Milchdrüse H hinten Lymphknoten mandibular H Lymphknoten mandibular L Lymphknoten mediastinal Lymphknoten mesenterisch Lymphknoten perotid L Lymphknoten perotid H Lymphknoten popliteal L Lymphknoten popliteal P Lymphknoten präfemoral L Lymphknoten präiemoral 3 Lymphknoten präscapular L Lymphknoten präscapular Lymphknoten renal MiIa

Lymphknoten supramammal L Lymphknoten suprasiammal H Lymphknoten siiprapharyngeal L Lymphknoten suprapharyngeal H 'Thymus Tagina

-)—i-	0	0	0
τ+~	0	0	0
+ T +	0	0	Q
TT	0	τ-	0
TTT	0	0	0
..ι ?- ...?..	0	0	0
H-T	0	0	0
T	0	0	0
J.	0	0	0
+	0	0	0
0	0	0	0
0	0	0	T
	0	0	r\ U
0	0	0	0
J j J.	0	0	0
TTT	4.	0	0
ο	0	0	0
-ί-	0	0	0
0	0	0	0
0	Q	0	0
TTT	0	0	0

0 keine nachweisbaren Bakterien durch Kultur von 0,3·..1 g Gewebe,

τ Weniger als 200 Zolonien/g Gewebe»

+τ Mehr als 300 Kolonien/g*

-τ-·++ Mehr als Λ OCO Zolonien/g,

TT-H- Mehr als 100 000 Solonien/g,

62 266 12 23.12.33

9« AusführungsbeisOiel: Behandlung von Augenkrankheiten

Bakterielle und ähnliche Infektionen wie auch zahlreiche andere Erkrankungen des Auges verursachen weltweit ökonomische und gesellschaftliche Gesundheitsprobleme, v^obei diese Erkrankungen j sofern sie nicht oder nur unzureichend behandelt werden, zum Verlust des Sehvermögens und möglicherweise auch zum Tod infolge Sepsis führen können. Bakterielle Infektionen des Auges bei Mensch und Tier «erden von einer Heihe von Erregern hervorgerufen; hierzu gehören unter anderem: Clostridium s-p-Q,, Cor~/nabacterlum sp_o. ,' L ept 0 so ir a spp, , Marasella spp, , Mycobacteriusi spp, , ITeisseria sp_o, , Pro-ci'ö.nlbacterium SOO* j Proteus soo,, Pseudomonas spp._s Serratla spps*, Staphylococcus soo« , Streptococcus spo. so^ie bakterienähnliche Organismen 7;ie et?ja M"/CO"lasma soo . und Hickettsia spp_,, 3o?)ohl -Tiere als auch der Mensch dienen als Heservoire für die potentielle Weiterverbreitung der infektiösen Bakterien*

Derartige bakterielle Infektionen kennen bei Einsatz von Antibiotika nicht ohne langwierige und hinderliche Behandlung; formen behandelt werden, die e.nt"?jeder häufige Behandlung ~ bei einigen Infektionen beim Menschen alle zwanzig Minuten oder aber unannehmbar hohe Konzentrationen des Antibiotikums in den Gegeben zur Folge haben. Die derzeitigen Behandlungsmethoden sind auch aus zahlreichen anderen Gründen problematisch. In einigen Fällen ist der infektiöse Organismus in den Oberfiächengeviieben des Auges in hohem MaBe gegenüber den bakteriziden Wirkungen von Antibiotika resistent, des-seiteren kann die örtliche Verabreichung von Antibiotika eine rasche Wegführung der Droge von der Augenhöhle und damit variierende Sontaktzei~en zur Folge haben» Grundsätzlich muß die Behandlung von infektiösen Augenerkrankungen vollständig T/irksan sein, da ,jegliche verbleibende Infektion schlichterdings zu einer Reinfektion über das Iränensekret führen TJird, worauf

„61- 62 266 12

23*12,33

der Zyklus aufs neue beginnt. Hinzu kommt, daß in vielen Fällen die zur Sliminierung der Infektion benötigten Drogenkonzentrationen eine Beeinträchtigung des Sehvermögens hervorrufen können, die in bestimmten Fällen eine vollständige Erblindung zur Folge haben kann. Die durch derartige Erkrankungen bei Haustieren bewirkte wirtschaftliche Belastung drückt sich in den Millionen Dollar aus, die jährlich verlorengehen, da der einsig aussichtsreiche Weg zur Bekämpfung derartiger Infektionskrankheiten in einer anhaltenden therapie und in Q,uarantänemaJBnahmen besteht,

Die folgenden Experimente bewerten die Wirksamkeit von Behandlungen der M«-bρyis-Infektion des Auges₅ ?jobei in Glyzerin vorliegendes freies Antibiotikum im Vergleich zu SPLB-eingaschlossenem Antibiotikum verwendet Tiurde,

M, bovis verursacht die infektiöse Keratokcnrjunktivitis beim Hind» Dieser Zustand ist charakterisiert durch BlepharosOas— mus, ü}ränenflu3₅ Konounktivitis sowie variierende Grade von. Trübung und Ulzeration der Sornea* Ausgewachsene Kühe können im Verlauf der Erkrankung leichtes Fieber mit leicht vermindertem Appetit und eingeschränkter Milchproduktlon zeigen» Obwohl eine Seihe von Antibiotika gegenüber M, bovls wirksam ist, so müssen diese doch rechtzeitig und in vielfacher Wiederholung örtlich appliziert oder durch subkonjunktivale Injektion verabreicht «erden.

Den im folgenden beschriebenen AusführungsbeisOielen gemäß wird die Wirksamkeit und Wirkungsdauer der therapeutischen Substanz verlängert. Überraschenderweise vsirkt dieses System bei nur einer oder z^ei Verabreichungen, zumal derartige Infektionen normalerweise nicht auf eine einfache Behandlung mit Antibiotika ansprechen. Die-üblichen Behandlungen lassen

c% - 62 256 12

23*12,33

häufig kleine Infektionsherde zurück, welche wiederum das Auge reinfisieren, so da3 der Infektionszykius aufs neue beginnt, sofern nicht die Infektion durch zahlreiche Wiederholungen der Behandlung vollständig ausgerottet wurde₃

9.1» Behandlung der infektiösen Seratokonjunktivitis bei Mäusen

C57-scmvar3e Mäuse (160 Mäuse) wurden in 3 Gruppen unterteilt, Die halbe Anzahl der Versuchstiere jeder Gruppe -jurde auf .jeweils beiden Augen üV-bestrahlt (um Hornhautläsionen hervorzurufen) . Sämtliche Tiere wurden sodann mit II, bovis ino~ kullert^ Kelchs in Konzentrationen von 1 :z 10° Bakterien pro Auge jeweils auf das reGhte Auge getröpfelt viurde« Tierund-Z7?anzig Stunden nach der Inokulation wurden sämtliche Tiere hinsichtlich des Grades der eingetretenen Hornhauttrübung untersucht.» Die acht Gruppen durch örtliche Applikation der folgenden Dosierungen an ,jedem. Auge behandelt: Gruppe 1 und 2 erhielt lO^ul SPL3-eingeschlossenes Streptomycin (30 mg/ml); Gruppe 3 und 4- erhielt 10/ul Streptomycin (100 ins/ml) ; Gruppe 5 und 6 erhielt 10 ,ul in '^äiBrigem Streptomysin (100 mg/ml

suspendierte puffergefüllte SPLB; und Gruppe 7 und 8 erhielt 10,ul sterile physiologische Kochsalzlösung (?«3·; Das nicht infizierte linke Auge vvurde mit den gleichen örtlich ansüßen-τι TuH^ \~~n ja»i hflha^noi 'h '"irr iacrijn^si lan rih ^ "i — iTC-T.'P λ a <5

i lan

-~— j ———

Sinuial täglich -rturden die Tiere hinsichtlich Fortschritt oder Rückgang der Eornhautläsionen untersucht; as 3·> 5» ^£ 7· Tag nach der Behandlung wurden bei repräsentativen Tier-en Abstriche vom rechten Auge vorgenommen und Isolationen hinsichtlich M, bovis angefertigt, 3.-bovis-Kolonien -wurden anhand ihrer Zclonie-Momohologie so^ie anhand ihrer Heaktivi— tat gegenüber Fluoreszent markiertem-Antikörper gegen

69 62 266 12

23*12.83

Μ,· bo vis pill ermittelt. Die in tabelle X±v^T aufgeführten jütgebnisse zeigen, daß lediglich das SPLB-eingeschiossene Streptcmyzin die Infektion zu eliminieren vermochte.

9.2» Behandlung der Kaninchen-Eon-junktiva unter Verwendung eines SPLB-eingeschlcssenen Antibiotikums

M, bovis, ASGC-Stannn 10900, «urde in steriler Kochsalzlösung (0,065 % NaCl) auf eine Sonζantration von 1 ζ 10^'Zellen pro Milliliter verdünnt. Aliquote Mengen (0,1 ml) der bakteriellen Suspensionen wurden örtlich in die Augen von zehn ausgewachsenen Tseiblichen. Kaninchen inokuliert, Täglich wurden zur Bildung von Kultaren Proben durch Ausfischen der Koniunk-

agarplatten "plattiert· Brei Sage nach der Inokulation ?;urden die Kaninchen in drei Gruppen 'unterteilt; 2 -Diere (Kcntrollfiere) erhielten keine Behandlung; 4 -Tiere erhielten Streptocr/zin. Ln steriler physio.logis.oher Kochsaislösung (Konzentration 10 mg/kg Körperinasse) ; und A- !Tiere erhielten SPLB-eingeschlossenes Streptomyzin in einer sterilen physiologischen Kochsalalösung (Konzentration 10 mg Streptoinyzin/kg Körperniasse). Sämtliche Lösungen wurden örtlich in jedes Auge verabreicht« Nach 24 Stunden ?;urde das Ausfischen der Konjunktivae bei sämtlichen Kaninchen mieder aufgenommen und über 7 lage hinweg täglich fortgesetzt, Die !Resultate der Μ,-bovis-Isolation auf 31 Utas ami att en sind in Tabelle TY

9*3« Behandlung der aus subkutanen uafektionen resultierenden Keratokonrjunktivitis

M, DQVJs ₁ Al'CC-Stamzn 1090O₃ wurden in steriler physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 1 :-: IG ^ Zellen pro Milliliter verdünnt, Aliquote Mengen (0,1 ml) der

6if - 62 266 12

23,12.83

bakteriellen Suspensionen wurden in die Augen von ausgewachsenen Kaninchen geimpft, "/eiche zuvor in der in Abschnitt 9.2. beschriebenen Weise infiziert und nicht mit SPLB behandelt worden waren. Die rechten Augen aller neun Kaninchen wurden mit 0,1 nil M, bovls subkutan in das 3indehautge^T3ebe beimpft, und die linken Augen sämtlicher Kaninchen wurden mit 0,1 ml M. bovis örtlich inokuliert, T'äglich wurden von den Bindehäuten beider Augen sämtlicher Kaninchen Kulturen entnommen und zwecks Isolation von M. bovis auf Blutagarplatten plattiert* Drei Tage nach der Inokulation wurden die Kaninchen in drei Gruppen unterteilt; 2 Tiere erhielten keine Behandlung? 3 Tiere erhielten Streptomycin in einer ophthalmologischen Standard-Glyserinsuspension (Konzentration: 10 mg Streptomysin/kg Körpermasse); und ^- Tiere erhielten eine Saline-Suspension von SPLB-eingeschlossenem Streptomycin (10 mg Streptomyzinsulfat pro kg Körpermasse).

Tabelle ZlY

Ergebnisse der Behandlung von infektiöser Keratokonjunktivitis nach ckularen M.-bovis-Infektionen bei Mäusen

Anzahl der Mäuse pro Zvvanzigergruppe M-bovis-

_^ ~ . Kulturen

Tor d. Behandlung Nach d* Behandig, i'age nac Hornhauttrübung^ Hornhauttrübung3 der Be- . handluns

0123^3 5

nicht bestrahlte Mäuse

Kontrolltiere 15 3 0 1 0 16 2 0 0 0 V5 V5.

jJ j. v_- ^ -^ -S Ou- ^ W "*

toaryzin- " 18 1 1 O O 18 2 O O O 2/5 2/5

?uffergefülltes

.3PLB -j-^freies

Streptomycin⁰ 17 2 1 O O 18 1 10 0 2/5 3/5

Q^-QT" "^ e^Ä ί i-*i ^¹0 C f> h "ι ^ Q BM

senes StSeptSmj- 1? 3 O CO 20 O O O O 0/5 0/5 ein⁰

62 266 23*12,33

^Fortsetzung)

MS.US β

Kontrolltiere 115 9 4 IO 3 1 2 A- 5/5 5/5

tomyzino 0 4 9 7 0 14 3 2 10 3/5 4/5

Puffergefüllte SPL3 + freies

0 35102 11 2 430 3/5 3/5

SPL3-6ingeschlossenes Streptomyzin^G 0 1 5 11 3 19 1 0 0 0 0/5 0/5

^a Augenkultur hinsichtlich des Vorhandenseins von M„ bovis positiv; ermittelt durch Fluoreszenz-Antikörperfärbung.

⁰ Bonitur der normalen Hornhautί 1 =. Verlust des normalen Glanzes; 2 = kleine Trübungsherde; 3 = teilweise Trübung der Hornhauts 4 = vollständige Trübung der Hornhaut,

⁰ Gesamtverabreichung 10/um (1,0 mg Streptomyzin pro Aage),

Tabelle TT

Ergebnisse der Isolation von Ksninohen-Konjunktivae nach örtlicher Infektion mit M, bovis und Behandlung mit ^äBrigen oder SFIS-eingebettetem Streptomyzin

M«-bovis-Kulturen^a Tai?e nach 3ehano,luns

2 3

Kontrolle 1 O -r -f + -f

Streptomycin^' 1 O + + + +

2 OO _{+ +} +

3 O + ^ _{+ 4}-

62 266 12 23.12,8.3

(Fortsetzung)

S?LB-eingeschlossenes _a Streptomysin"

0 r\

ο ο

0	0	0	0
0	0	0	0
0	0		0
0	0	0	0

^a Hinsichtlich des Vorhandenseins von M,-bovis-Kolonien auf 31utagarplatten nach 24 Stunden bei 37 ⁰G untersuchte Kulturen. Plus (+) entspricht dem Vorhandensein von einer oder

- mehr als einer koioniebildenden Sinheit M» bovis pro !so-lat; 0 = keine nachweisbaren Kolonien*

" sämtliche Tiere mit 1 2 10^ koloniebildenden Einheiten M. bovis örtlich in jedes Auge inokuliert.

Tiere, die mit 0,1 ml Lösung bei Örtlicher Verabreichung in

es Auge behandelt wurden.

Streptoniysin (10 mg/kg Körpermasse) in steriler physiologischer Kochsalzlösung.

SPLE-eingeschlcssenes Streptoinyzln (10 sg/kg SÖrpermasse) in steriler physiologischer Zochsalslösung,

Die Suspension oder Losung vvurde örtlich (0,1 ml) in jedes Auge verabreicht, Nach 24 Stunden so'flie ^an .jedem der darauffolgenden fünf Tage wurden von sämtlichen Kaninchen Konjunktiva—Abstriche genommen,, Die Resultate in bezug auf die Isolation von M, bovis auf Blutagarplatten sind in Tabelle ZTI dargestellt« Am Znde der untersuchung wurden sämtliche Tiere einer Leichenöffnung unterzogen, ebenfalls bei sämtlichen Tieren wurden die Augenbindehäute entnommen, Diese wurden hinsichtlich Taskularisation untersucht, sodann zerkleinert, homogenisiert und auf Elutagraplatten plattiert, um M« bovis zu isolieren* Die Ergebnisse sind in Tabelle ICTII dargestellt,

60 — 62 266 12

23.12.83

9,4, Bewertung dsr ivirksainkeit von 22L3 in Vergleich zu Liposompräparaten bei der Behandlung von Augeninfektionen

M* bovls (ASGO-Stamm 10900) wurden in steriler ohysiolosischer Kochsalslcsung auf eine Konsentration von 1 -i 10' Zellen pro Milliliter verdünnt. Aliquote Mengen (0,1 si) der bakteriellen Suspensionen wurden in jeweils beide Augen von ausgewachsenen Kaninchen subkutan in die konjunktivalen Gewebe inokuliert, !Täglich wurden von den Bindehäuten beider Augen sämtlicher Kaninchen Abstriche entnommen und zwecks Isolation von M. bovis auf Blutagarplatten plattiert, 'S Uni Tage nach, der Inokulation wurden die Kaninchen in 6 Gruppen unterteilt: 2 Tiere erhielten keinerlei Behandlung (Kontroiltiere); 3 Tiere erhielten eine Suspension von 5?L3-eingebettetes Streptomysin (10 ng Streptoiayzinsuif at pro kg Körperinasse) , reiches in-der Verdünnung, von 1 : 100 eine 0-,Do^p₀ (optische Dichte bei 430 ns) von 0₃923 aufwies-; 3 Tiere erhielten eine Suspension von SPLB-eingebestetem Streptoinyain (10 mg Streptoiirysinsulf at pro kg Körpermasse), welches bei Yerdünnung auf 1 s 100 eine 0,D_5Zio_Q von 0,449 aufwies5 3 Tiere erhielten eine Suspension von SPL3-eingebettetem Streptomyain (10 mg Streptoinyzinsuifat pro kg Körpermasse), welches in einer Verdünnung von 1 : 100 eine O,D,_ag_Q von 0,242 aufwies; 3 Sie-— » «-*a. ^j. — '-^ ^- u -^i_i 'W ,ι»__ί, S-- JvJ '-νί.α *J vjj,^ w. w.-U, V w—j. *-L·. J-J--^^ ^„—.,x ¹S-- w w ν ij sv yv IXl .v -» J-. _ w ν w nTysin (10 Eis Stret)toiu?yzinsulfat oro ks ^örOerniasse), 7,'elches in einer Yerdünnung von 1 j 100 eine 0,D₅^q von 0,119 aufwies; und 2 Tiere erhielten eine Suspension von Streptomjsin (10 mg StreptoEiyzinsulfat pro kg Körpernasse) enthaltenden

Herstellung der MLB erfolgte nach dem "erfahren von Mountain et al. Gurr, Micro, 6 : 373 (1981) durcia Zusetzen vcn Strsptomysinsulfat zum getrockneten Lipicf iln, der sodann ver*nir-belt und über ZTiei Stunden hinweg gequollen ?:urde; das nicht

- ζβ 52 266-12

'23*12.83

eingeschlossene Streptomycin v?urde durch wiederholte Zentrifugat i on ab g eführt,

Die Suspensionen wurden örtlich in jedes Auge verabreicht, 2^- Stunden danach und daran anschließend täglich über 9 Tage hinweg wurden Bindehaut abstriche von sämtlichen Kaninchen entnommen und auf Blutagar plattiert» Die 3esuitate der Isolation in bezug auf M, bovis auf Blutagarplatten sind in Tabelle XYIII dargestellt, Sämtliche Tiere wurden einer Nekropsie unterzogen. Diese wurden hinsichtlich der Tränendrüsensekretionen kategorisiert; die Xon;jimktivae wurden aseptisch von allen Tieren entnommen, Die Konrjunktivae wurden hinsichtlich Taskularisierung kategorisiert, zerkleinert₃ homogenisiert und zwecks Isolation von M« bovis auf Biutagarplatten plattiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIX aufgeführt ·

Isolationsresultate von Kaninchenbindehäuten nach Inokulation von M. bovis in Sonjunktiva-Membranen so??ie Behandlung mit Streptomycin in ophthalmologischer Glyzerinlösung oder mit SPL3-eingebettetem Streptomycin in physiologischer Kochsalzlösung

M«—bovis-Kulturen^

Ti er* β

Kontrolle 1

7*0.2? 3eb.3nd.luii^ ^Tecq 3eb.ezicLi.iiii

Giyserinlösung ^α 1

2 3

62 265 12 23*12,33

(Fortsetzung)

SPlB-eingebette-^ tes Streptomyzin

1 2

O	O	0
0	O	0
0	0	0
0	0	0

^a Hinsichtlich, des Vorhandenseins -/on M.-bovis-Solonien auf Biutagarplatten nach. 24 Stunden bsi 37 ⁰G untersuchte Kulturen , Plus (+) entspricht dem Vorhandensein von einer oder mehr als einer koloniebildenden Sinheit M, bovis pro Isolat; 0 = keine nachweisbaren Kolonien,

b 6

Sämtliche i'iers wurden örtlich in beide Au sen mit 1 1 10

koloniebildenden Sinheiten M. bovis inokuliert; koloniebiidende Einheiten IA, bovis wurden in die konjunkti-7alen Membranen der rechten Augen indiziert; und 1 s 10° koloniebildende Einheiten M« bovls wurden örtlich in die linken Augen appliz.iert«

^ -T^ *i — ""^ il -Ii ο τ-η τ 4" C^₁ Λ -τ* "? T '^HV¹ C na· 'A -n4— "] τ /-ι '-^. i^i --1 TT ^; "T^ «^ V^s T¹ ^ T *"* r"¹ ' ^ T"¹ D¹ ^Xiöi-ij- ÜJ.C lui U Uj I iJi-l·. jJVaUug ω C i. 'w -L -J J- J. >-/ i_i fe ^. ( ~- 3,Ui. viuLiuIig

in jedes Auge behandelt wurden,

^a -Tierej die mit Streptomyzin (10 mg/kg Körpermasse) in ophthaimologischer Giyserin-Grundsubstans bei örtlicher

Tiere j die mit in SPL3 eingebettetem Streptomycin (10 mg/ kg Körpermasse) in steriler physiologiscaar Kochsalzlösung Verabreichung: in riedes Au^e behandelt wurden.

bei örtlich

f/ 62 266

23,12.83

tabelle Σ7ΙΙ

Eesultate aus der liiekropsie der Crbita sowie der damit verbundenen Gewebe von Kaninchen nach Inokulation mit M, bovis in die Bindehautge^ebe und Behandlung entweder mit Streptomyzin in ophthalsologischer Glyzerinlösung oder mit SPLB-eingebettetem Streptomycin in steriler physiologischer Sochsalslösung ^a

Isolation von Yaskularisation M.-bovis-Sulturen des rechten Auges^ Eontrolle A 4-2+

B + 2+

Streptomycin in Glyaerinlösung

A -τ- 2+

3 + 1-i-

G +2+

D + .2+

SPLS-eingebettetes Str8ptom:/zin

A 0 0

3 0 0

C θ' 0

D 0 0

Infektion.

Die Yaskularisation wurde folgendermaßen kategorisiert: O GfäBe normal; 1 = einige Gefäße eindeutig erweitert

O = G

nicht ohne weiteres zu unterscheidenden einzelnen Gefäßen; 3 = diffuses Jleischigrot, vaskula sion von Blut in die Konjunktivae,

3 = diffuses Jleischigrot, vaskulare Undichtheit und

- 71- 52 266 12

23.12.83

10, Ausführungsbeispiel: Behandlung: von VirusInfektionen

Das Virus der lymphozytären Choriomeningitis CLC21TT), ein Mitglied der Arenavirus-GruOOS', ist dafür bekannt, daß es Erkrankungen des Menschen hervorruft; bsi r^äusen^ die mit diesem Virus intrazerebral inokuliert wurden, -erläuft die LCMV-Infektion tödlich, Der 2od der Mäuse TJird durch die Ismunzellen verursacht, die gegenüber den virusinfisierten Zellen reagieren. Das Virus tötet die Zellen, in denen es sich vervielfacht, niGht ab, daher nuß das bei Mäusen verwendete therapeutische Agens entweder die Virusmultiplikation hemmen, so daß die Immun se 11 en nicht aktiviert -n erden, und/oder es muß die Aktivierung von Imaunaellen hemmen.

Tabelle ΣΥΙΙΙ

Isolation von M* bovis aus Eon^unktivae infizierter Kaninchen nach Behandlung mit Verdünnungen von SPLB-eingebettetem Streptomyzin in physiologischer Zochsalslösung oder von' MLB-eingebettetem Streptomyzin in physiologischer Socasalslösung

Isolation von M, bovis^a 'lage nach Infektion

Anzahl Vor Behandlung Nach Behandlung Gruppe !'lere 1 2 3 4 5^6 7 8 9 10 11 12 13

Kontrolle 1 +-++++++++++++

MLB-e ingeb ettete s

Streptomyzin 1 + + + + + + + 00-!- + + Q +

2 + + + -τ- + -r 0 4- η- 0 0 η- + 0

SPL3-6 ingebettetes

Streptomyain 1 +++++000QOOOOO

vuü7-au^,; ρ + + + + +000000000

•3 + + + + +0000 00 000

62 266 23.12.83

3?L3-e ingebettetes Streptomyzin 1 (Verdiinnung 1:2) ₂

SPLB-eingebettetes Streptomvzin

3PL3-eingebettetes StreTDtomysin 1 (Vdü^ 1:5) ₂

+ + 0 + + + + + + + +oo + OOOOOO +OOOOh-0000

+++00000 0 0 ^.,000+0000

+00 + + + + + + + +OOOO 0 0000

" Säatlicae Tiere vmrden mit 1 s 10° koloniebildendan Einheiten Μ« bovis durch. Injection in die konjunktivalen Membranen beider Augen inokuliert. Die konjunktivalen Abstriche wurden auf Blutagar plattiert. Hinsichtlich des Vorhandenseins von M,-bovis-Eolonien auf Blutagarplatten nach 24 h bei 37 ⁰C kategorisierte Kulturent + = 1 bis mehr als 1 koioniebildende Einheit; 0 = keine nachweisbaren Kulturen,

tabelle ΊΊΧ

Gewebe von Saninchen nach Inokulation init M, bovis in die konjunktivaien Gewebe so^ie Behandlung entweder mit MLB-eingebettetera Strsptomyziii, S?L3-e ingebette tesi Streptomyzi oder Verdünnungen von .S?L3-e ingebettet ein Streptomycin⁰¹

Tier Isolation Vaskulari- Ir.änenvon M,bcvis sation der fluß ^

~eingebettetes Streptoüijsin

1+

1+

1+

1 + 0

62 266 23o12.83

(ü¹ ort setzung)

3PLB-6ingebettetes

Streptomyzin 10 0

(unverdünnt) _{2 Q} 1+

0 0

3?L3-e ingebettete:

Streptomycin 1 .4- 2~ 2»

(Verdünnung 1:2) _{o n}

1+ 0

1	0
2	0
3	0
Λ I	-τ-
2	0
^	0
1	0
2	0
3

B?L3-eingebettetes

Stre-ptomyz in 1 0

(Verdünnung 1 : 4) ,, ,._{+ (J}

1+ 0

SPL3—eingebettetes

-· ~ · η _{+ 1 +}

^{2 6}^ 2

^a Legenden ?jie in Tabelle XIV, .Ausführung am 14» Tag nach der Infektion*

⁰ Die Vaskalarisation ^urde folgendermaßen kategorisierti 0 = Gefäße normal; 1 = einige Gefäße erweitert und durch kleinere Gefäße infiltriert; 2 = diffuses 2ot mit nicht ohne weiteres zu unterscheidenden einseifen Gefäßen;. 3 = diffuses .Fleischigrot, vaskulare Undicatheit und Sffusion von Blut in die Sonjimktivae,

^w Der Tränenfluß ?.'urde folgendermaßen kategorisierti 0 = kein

cn ,^ i ρ T. ί pi g τ*¹ Ρ, H S ⁴^¹ θ ^ ^ 3 H ö.^¹ "^ "τΤρί2τ>ο· p — 'Ti*^¹ gj^ ^nf "1 !i!s ^^ij ^i feuoh^ung der Lider sovjie der .an die Augen angrensends

Das folgende Ausführungsbeispiel veranschaulicht die T^irksanir keit der Behandlung von Virusinfektionen durch Verabreichung

- 7$ - S2 265 12

23.12.83

einer .3pjj3~e ingebetteten antiviral en Verbindung.

10.1. Behandlung von letalen iymphosytären Choriosieningitis-VirusInfektionen bei Mäusen

Z-sei Monate alte Schweizer Mäuse wurden intrazerebral rn.it einer letalen Dosis LCM-Virus, d* Ii. nit 100 belagbiidenden Einheiten in 0,05 sil Inokulum pro Maus inokuliert, Die Mäuse wurden in 4 Gruppen su je 7 Tieren unterteilt und an 2·, 3» und 4. Tag nach der Infektion durch folgende intraperitonea-Ie Injektionen mit 0,1 ml/Dosis/Maus behandelt: (1) die ¹¹SPLB-B-GruOpe" ^urde mit einer 3 ^-g Hibavarin/ml enthaltenden Suspension von Ei—Phosphatidylchclin-SPLB behandelt. Die SPLB wurden unter Verwendung von IOC mg Lipiden und 0,3 al einer Lösung von 100 mg Droge in 1 si PB3-Puffer hergestellt; die Einbettung der Droge erreichte 10 %\ (2) die ^U?.-Gruppe" flurde mit einer Lösung von Sibavarin 3 sig/sl in PBs behan-,-HfSi-I-. /"5"¹I rl-i a ''S'^TTR.-G^U^rn.·='¹ '-'TT¹^e Pi't r,iT?f anca^i* T t«n '"3PLB

sXWwMUk \ ~s J \^.^.w >»-»J» ' '' ^} ^^v* — <-i vj ^J -»ί 'J '< wiu. wc W iii —» w \J ίΛ-1, J-^-Ό. >^ \-* -i- LA— —'J-w J_i, KU£T j ' ι¹

behandelt (d· h. in obiger Weise, aber ohne Hibavarin hergestellten SPLB) ; und (4) die ^MSo-ntrollgruppe^!t wurde mit PBS behandelt. Am 5· 'Tag nach der Infektion wurden jeweils 2 Mäuse aus jeder Gruppe getötet, ihre Milsen wurden homogenisiert (2 Milaen/Gruppe wurden in PBS bei 1/20 Masseanteil pro Volumen Puffer homosenisiert). Die belasrbildenden Einheiten pro Milliliter wurden für jede Suspension ermittelt. Die verbleibenden 5 Mäuse .leder GruO^e wurden hinsichtlich ihrer Letalität zweimal täglich über 30 Tage hinweg beobachtet. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Tabelle ZZ dargestellt»

62 266 12 23.12,33 ..

Tabelle ~JJL

Behandlung der' letalen lynrphosytärsn Choriomeningitis-Yiras Infekt ion bei Mäusen¹³"

laiitat^ Aus der Milz surückgeivonnenes Virus (beinbildende

iinhs-irp« -τ ·1Π5~/ ™.Ί ^S,C

Kontrolle 5PL3-Gruppe 2-Gruppe .3PLB-H-Gr uo

5/5 5/5 5/5 3/5

9 Q 5,2

^c~ Zviei Monate alte Mäuse wurden intrazerebral jeweils alt ν lüvi J-v ^ä-ΐώϋ ijvOJ-ΰ 4 'U. φ iJ. ·» "iW^O U w JL C^-:" O X-I-¹^i-e JH-u*. Cy ^J₁ jj-j^i^g^ üvH

a inokuliert,

^D ui

Die itetaiität ^ird als Anzahl der toten iiere/Ansahl der Iiere in der GruioOe angegeben.

Am 3

Am. j, Tag nacn aer. inieircion 75 or den oe?;eu.s <l Klause aus jeder Gruppe getötet, ihre Milzen wurden in einer Kon2en— tration von 1 g Mils/20 ml Homogenisat homogenisiert.

Tabelle TL zeigt deutlich einen Hückgang der Letalität so-sie

eine

ringerung der aurückgevjonnenen "irusm.enge bei den

infizierten

Vieren* Wir haben noch nicht ermittel

, ob diese

Ergebnisse auf die an~i"irale Wirkung des aus den SFLB freigesetzten Hibavarins oder aber auf eine Inmunοmodulation des Hauswirtes während der anhaltenden Preisetsuns von Hibavarin aus den 3PL3 zurückzuführen ist.

Claims (4)

1. 62 266 23.12,83

   ^rimaungsansprucn

   1. Verfahr en zur Herstellung von stabilen piurilaraellaren Bläschen, gekennzeichnet dadurch, daß

   a) eine Dispersion aus mindestens eines amphipathischen Lipid in einem organischen Lösungsmittel gebildet

   b) die Dispersion mit einer ausreichenden Menge einer wäßrigen Phase kombiniert wird, um eine Biphasenmischung zu bilden, in der die wäßrige Phase vollständig emulgiert werden kann und

   c) die wäßrige Phase emulgiert 73ird und das organische Lösungsmittel der Biphasenmischungen verdampft ?!ird,

   wobei die hergestellten stabilen plurilamellaren Bläschen im wesentlichen frei von multiiameilaren Bläschen (MLV) , unilameilaren Schailb läse hen (STJ7) und Ver-• dampfungsbläschen mit Phasenumkehr (237) sind*
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das y~3pHä2.tni3 ^es Volumens des Lösungsmitteis sum. Volumen der wäßrigen Phase von et^a 3 : 1 bis 100 t 1 reicht.

   ca. 4 ⁰G bis ca, 60 ⁰C liegt.

   iemOeratur, bei der das Verfahren abläuft, niedriger ist als die Phasenum^andlunzs^smreratur von mindestens einem der genannten Lipide.

   Lösungsmittel Pluorkohlen^asaerstoff oder Diethjiäther oder Mischungen daraus darstellt*

   τ

   xOo'on

   7» Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß das Antioxydationsmittel 2,6-Di-tert-butyl-p-kreson ist,

   8, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daB die Sniulgierung vor dar Verdampfung stattfindet,

   9* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch₃ da3 die Smulgierung und Verdampfung gleichzeitig stattfinden»

   10* Verfahren nach Punkt I₃ gekennzeichnet dadurch, daB die in die Bläschen einzuschließende Substanz mit der ^T3ä.3ri-
3. 11. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurcaj daß mindestens 20 % der genannten Substanz in den Bläschen eingeschlossen werden.

   genannte Stoff ein Protein ist*

   13, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet'dadurch, dai c Hauptlipidkotaponente der plurilamellaren Bläschen sir

   -ta « W W W ί. i^m. > 11 ι ί O <m liiiiiii ι ¹ i_L.. ''"^i j, ; ' S Js Ja Q₁ ^! ii ^v 4.J. J₁J¹ 1 L C3.-O ¹W *-l " J-J₁ W -.JL-I-,"^- 'ΐ* O ¹¹Wl iJ.-i« ^J iO ^ ~ Jj, [ J ^,

   62 266 12 23.12,S3

   15· Verfahren nach Punkt I₅ s:ekennzeicLinet dadQrGh₃ daß eine Verbindung im plurilameliaren Bläschen eingeschlossen "jird, die aus der aus antibakteriell=.!! Verbindungen, antifungalen Verbindungen, antiparasitären Verbindungen und antiviraien Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

   16, Verfahren nach Punkt 1, gekennseichnet dadurch, daß eine Verbindung im piuriiameliaren Bläschen eingeschlossen vjird, die aus der aus gsschwuisterregenden Verbindungen;

   bestehenden Gruppe ausgewählt v3ird,

   17« Verfahren nach Punkt I₃ gekennzeicnnet dadurch, daß eine Verbindung im ρlur!lamellaren Bläschen eingeschlossen Tiird, die aus der aus antiinflammatorischen Verbindun-
4. 18. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine Verbindung im olurilamellaren Bläschen eingeschlossen wird, die aus der aus Snsymen, Hormonen, ITeurotransmit-

   "AC^ ^1λτΠΛ1^λλ-,^λ^?λΛ2·γ V> Ci d-f~ p 'r\ ^'^ /η a^ ?"1*^\-;—--^ O £ ι τ Q C £ii'j ö r; 1 4- :η ΐ -n^

   ^ β— ~ Alia. CU iicvii irU—i-^j ί ; ~ii^Oijja-jS ICuHc υ j

   "jird* die aus der aus J\--rbstoffen. ^luoreszsnsjverbindur·- gen, radioaktiven Verbindungen und strahlenundurchlässisen Verbindungen bestehenden Gruiroe aussewähit -^ird«