IT202400000033A1 - Nuova combinazione di principi attivi, composizioni farmaceutiche e/o nutraceutiche che la contengono e loro utilizzo nella prevenzione e riparazione dei danni al sistema nervoso centrale e periferico - Google Patents

Nuova combinazione di principi attivi, composizioni farmaceutiche e/o nutraceutiche che la contengono e loro utilizzo nella prevenzione e riparazione dei danni al sistema nervoso centrale e periferico

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IT202400000033A1
IT202400000033A1 IT102024000000033A IT202400000033A IT202400000033A1 IT 202400000033 A1 IT202400000033 A1 IT 202400000033A1 IT 102024000000033 A IT102024000000033 A IT 102024000000033A IT 202400000033 A IT202400000033 A IT 202400000033A IT 202400000033 A1 IT202400000033 A1 IT 202400000033A1
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gastrodin
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Domenico Tiso
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Description

[0001] Descrizione dell'invenzione avente titolo:
[0002] "Nuova combinazione di principi attivi, composizioni farmaceutiche e/o nutraceutiche che la contengono e loro utilizzo nella prevenzione e riparazione dei danni al sistema nervoso centrale e periferico"
[0004] DESCRIZIONE
[0005] La presente invenzione si riferisce ad una nuova associazione o combinazione di principi attivi, utile nella prevenzione e riparazione dei danni neuronali, sia a livello centrale che a livello periferico. Pi? in dettaglio, la presente invenzione si riferisce ad una associazione o combinazione di i) un estratto di Gastrodia elata, preferibilmente gastrodina e ii) almeno un ingrediente scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di citicolina, L-acetilcarnitina e, preferibilmente, almeno una vitamina del gruppo B, e/o loro miscele. Inoltre, l?invenzione si riferisce anche a composizioni farmaceutiche e/o composizioni per dispositivi medici (Regolamento (UE) 2017/745) e/o composizioni nutraceutiche e/o composizioni alimentari che comprendono detta associazione o combinazione e al loro uso in terapia, in particolare nella protezione della funzionalit? del sistema nervoso e nella prevenzione e/o trattamento delle neuropatie centrali e periferiche.
[0006] STATO DELL'ARTE
[0007] Il dolore ? un segno frequente di molte malattie e tipicamente denota la presenza di un danno tissutale; al contrario, "dolore cronico" ? il termine usato per descrivere un dolore che dura per periodi prolungati, o come risultato di un processo patologico o dopo il tempo di guarigione tipico di un infortunio. Circa 1 giovane adulto su 9 nel mondo soffre di dolore cronico, pari all'11,6%. Questo aumentato dolore ha effetti drastici e costosi sulla popolazione per quanto riguarda le prestazioni lavorative e la qualit? della vita quotidiana. Di conseguenza, vi ? la necessit? di nuovi e pi? efficaci trattamenti e la scoperta di nuovi meccanismi e vie d'azione pu? offrire sviluppi futuri per nuove composizioni. Mentre gli studi iniziali sui meccanismi del dolore si sono concentrati sul ruolo dei neuroni, l'attenzione dei ricercatori si ? ora spostata sul ruolo delle cellule non neuronali. In questo contesto, la neuropatia periferica (PN, peripheral neuropathy) ? un disturbo causato dal malfunzionamento dei nervi periferici, compresi i neuroni sensoriali e motori, nonch? i loro assoni e guaine mieliniche. Grave disagio, debolezza muscolare e perdita di sensibilit? sono i sintomi clinici della PN. Le cause fondamentali del dolore prolungato sono l'iperattivit? e/o l'ipereccitabilit? neuronale, che insorgono in seguito a lesioni nervose. Tra le idee che spiegano i meccanismi associati alla neuropatia centrale vi sono la segnalazione intracellulare, l'attivazione microgliale, i fattori neurotrofici, gli elevati livelli di mediatori pro-infiammatori e infiammatori e lo stress ossidativo (OS, oxidative stress). In effetti, un numero crescente di ricerche suggerisce che l'OS ha un ruolo nel dolore neuropatico attraverso la sensibilizzazione periferica e centrale. L'eccesso di specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto (ROS, reactive oxygen species; RNS, reactive nitrogen species) danneggia i neuroni interagendo con proteine, carboidrati, lipidi e acidi nucleici. In questo contesto, SIRT3 ha un ruolo importante in diversi processi biologici, tra cui la funzione mitocondriale. Inoltre, l'OS induce le cellule infiammatorie, tra cui linfociti, monociti, neutrofili, basofili ed eosinofili, a produrre una gamma di sostanze (citochine proinfiammatorie, ammine e peptidi vasoattivi, eicosanoidi).
[0008] ? stato stabilito che il dolore neuropatico ? causato dalla sovraespressione di mediatori proinfiammatori (TNF-?, IL-1). In questo contesto, le composizioni e i metodi di trattamento attuali presentano e mostrano ancora molti limiti ed effetti collaterali quando vengono somministrati trattare questo dolore patologico, che ? un meccanismo disadattivo. Per questo motivo, l'ampia disponibilit? di terapie mirate per il dolore neuropatico, i nutraceutici (integratori alimentari e prodotti a base di erbe/naturali) stanno diventando sempre pi? popolari grazie al loro basso costo, alle elevate qualit? nutrizionali e terapeutiche e alla capacit? di legarsi a numerosi bersagli molecolari.
[0009] Ad oggi, l'acido lipoico ? emerso come una valida alternativa negli ultimi anni; i suoi meccanismi d'azione nella neuropatia diabetica sperimentale includono la riduzione dell?OS, il miglioramento del flusso sanguigno neurale, della velocit? di conduzione nervosa e di una variet? di altri indicatori della funzione nervosa. Ad oggi, ? noto che il sistema di fitoprotezione ha raccolto un gran numero di denunce di risposte avverse agli integratori alimentari a base di acido lipoico: tra queste vi sono casi di iperinsulinemia autoimmune. Questa malattia poco comune, nota anche come sindrome di Hirata, ? una risposta avversa grave caratterizzata da ipoglicemia estrema. Altrimenti, gli effetti avversi dell'acido lipoico sono correlati alla polineuropatia diabetica, che comprende anche sintomi gastrointestinali con un trattamento a dosi pi? elevate (>600mg/die). Pertanto, la ricerca scientifica ? alla ricerca di alternative per contrastare gli effetti negativi di questa sostanza.
[0010] Si comprende quindi la necessit? di trovare nuovi approcci terapeutici e nuove composizioni efficaci per mantenere il benessere del sistema nervoso, per limitarne i danni e possibilmente promuoverne la rigenerazione in caso di lesioni; detti nuovi approcci e nuove composizioni essendo efficaci, ben tollerati e privi di effetti collaterali e/o reazioni avverse.
[0011] Il problema tecnico che la presente invenzione affronta e risolve ? quindi quello di fornire una soluzione valida ed efficace mantenere la salute del sistema nervoso e per trattare il dolore neuropatico, in assenza di effetti collaterali e/o reazioni avverse.
[0012] La Richiedente, a seguito di un'intensa attivit? di ricerca, ha sviluppato e messo a punto una nuova associazione o combinazione di principi attivi e composizioni farmaceutiche e/o composizioni per dispositivi medici (Regolamento (UE) 2017/745) e/o composizioni nutraceutiche e/o composizioni alimentari (la/e composizione/i della presente invenzione) che sono efficaci, prive di effetti collaterali e dotate di elevata tollerabilit?. Detta associazione o combinazione essendo stata sviluppata per il mantenimento del benessere e della salute del sistema nervoso periferico, per la prevenzione e/o il trattamento di malattie correlate ai nervi periferici, per la protezione della funzione dei nervi periferici, per la prevenzione e/o il trattamento delle neuropatie periferiche, per la prevenzione e/o il trattamento del dolore neuropatico e per stimolare la produzione endogena di fattori neurotrofici.
[0013] Le nuove associazioni o combinazioni di principi attivi e le composizioni farmaceutiche e/o composizioni per dispositivi medici (Regolamento (UE) 2017/745) e/o composizioni nutraceutiche e/o composizioni alimentary (la/e composizione/i della presente invenzione) che le contengono, grazie alla presenza di ingredienti naturali, non presentano effetti avversi significativi, sono prive di effetti collaterali e hanno un'elevata tollerabilit? e possono essere somministrati a un'ampia categoria di soggetti.
[0014] Inoltre, le nuove associazioni o combinazioni di principi attivi e le composizioni farmaceutiche e/o composizioni per dispositivi medici (Regolamento (UE) 2017/745) e/o composizioni nutraceutiche e/o composizioni alimentari (la/e composizione/i della presente invenzione) che le contengono sono facili da preparare e poco costose e possono essere preparate con l'impiego di tecniche, metodi e attrezzature note agli esperti del settore.
[0015] Questi e altri scopi, che risulteranno chiari dalla descrizione dettagliata che segue, sono raggiunti dalle nuove associazioni o combinazioni di principi attivi e dalle composizioni farmaceutiche e/o composizioni per dispositivi medici (Regolamento (UE) 2017/745) e/o composizioni nutraceutiche e/o composizioni alimentari (la/e composizione/i della presente invenzione) che le contengono, grazie alle caratteristiche tecniche indicate nelle rivendicazioni allegate.
[0016] DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
[0017] Forma oggetto della presente invenzione un'associazione o combinazione di (i) un estratto di Gastrodia elata; preferibilmente, detto estratto comprende o ? costituito da gastrodina, e (ii) almeno un ingrediente scelto dal gruppo costituito da o, alternativamente, comprendente citicolina e L-acetilcarnitina, e/o loro miscele (in breve A1).
[0018] Forma oggetto della presente invenzione un'associazione o combinazione di (i) un estratto di Gastrodia elata; preferibilmente, detto estratto comprende o ? costituito da gastrodina, e (ii) almeno un ingrediente scelto dal gruppo costituito da o, alternativamente, comprendente citicolina, L-acetilcarnitina e/o loro miscele, detta associazione o combinazione avendo di un'interessante attivit? di prevenzione e riparazione dei danni al sistema nervoso. Preferibilmente, detta associazione o combinazione A1 ? per uso in terapia, in particolare in un metodo per la protezione della funzionalit? del sistema nervoso e/o in un metodo per la prevenzione e/o il trattamento delle neuropatie centrali e periferiche.
[0019] Forma oggetto della presente invenzione un'associazione o combinazione di (i) un estratto di Gastrodia elata; preferibilmente, detto estratto comprende o ? costituito da gastrodina, e (ii) almeno un ingrediente scelto dal gruppo costituito da o, alternativamente, comprendente citicolina, L-acetilcarnitina e almeno una vitamina del gruppo B, e/o loro miscele (in breve A2).
[0020] Forma oggetto della presente invenzione un'associazione o combinazione di (i) un estratto di Gastrodia elata; preferibilmente, detto estratto comprende o ? costituito da gastrodina, e (ii) almeno un ingrediente selezionato dal gruppo costituito da o, alternativamente, comprendente citicolina, L-acetilcarnitina e almeno una vitamina del gruppo B, e/o loro miscele; detta associazione o combinazione possedendo un'interessante attivit? di prevenzione e riparazione dei danni al sistema nervoso. Preferibilmente, detta associazione o combinazione A2 ? per uso in terapia, in particolare in un metodo per la protezione della funzionalit? del sistema nervoso e/o in un metodo per la prevenzione e/o il trattamento delle neuropatie centrali e periferiche.
[0021] Secondo una forma di realizzazione, l?associazione o combinazione comprende (i) un estratto di Gastrodia elata; preferibilmente, detto estratto comprende o ? costituito da gastrodina, e (ii) citicolina, L-acetilcarnitina e/o vitamine del gruppo B scelte dal gruppo costituito da o, alternativamente, costituite da vitamina B1, vitamina B2, vitamina B5, vitamina B6, vitamina B9 e vitamina B12, e loro miscele. Preferibilmente, detta combinazione ? per uso in terapia, in particolare in un metodo per la protezione della funzionalit? del sistema nervoso e/o in un metodo per la prevenzione e/o il trattamento delle neuropatie centrali e periferiche.
[0022] Preferibilmente, per associazione si intende l?atto di combinare elementi distinti che vengono somministrati contemporaneamente o a breve distanza (prima uno e poi l?altro). Ad esempio, gli ingredienti i) e ii) sono somministrati contemporaneamente, ma in maniera separata, o sono somministrati a breve distanza l?uno dall?altro, prima uno e poi l?altro, ma sempre in maniera separata.
[0023] Nel contesto della presente invenzione i termini associazione, combinazione e miscela si possono utilizzare in maniera interscambiabile tra loro.
[0024] La Gastrodia elata appartiene alla famiglia delle Orchidaceae. La parte attiva della pianta ? il suo rizoma (Rhizoma Gastrodiae) da cui si possono isolare, ad esempio, fenoli, polisaccaridi, acidi organici e steroli e la gastrodina, che ? uno dei glicosidi fenolici. Ciascuna di queste categorie di composti pu? contenere, al suo interno, diversi composti specifici o entit? chimiche specifiche come, ad esempio, la gastrodina.
[0025] Per estratto di gastrodia, preferibilmente di Gastrodia elata, si intende quindi comprendere un estratto che comprende o consiste di una o pi? di dette categorie di composti isolati, ciascuno dei quali pu? essere presente in detto estratto in una quantit? variabile dallo zero al 100% in peso, rispetto al peso dell'estratto. Ad esempio, detto estratto pu? comprendere o essere costituito da gastrodina, oppure pu? comprendere o essere costituito da una miscela di detti composti specifici o entit? chimiche specifiche appartenenti a una o pi? di dette categorie di composti.
[0026] Ricordiamo che sul mercato ? ormai consuetudine chiamare un "estratto" di Gastrodia, preferibilmente un estratto di Gastrodia elata, con il termine "estratto di gastrodina 10:1". In pratica, sebbene il termine gastrodina si riferisca a uno specifico composto isolato dal rizoma della pianta (Gastrodina, da Gastrodia alata ?98%; (2R,3S,4S,5R,6S)-2-Idrossimetil-6-(4-idrossimetilfenossi)-tetraidro-piran-3,4,5-triolo, 4-?-D-glucopiranosilossibenzil alcool, 4-idrossibenzil alcool 4-O-?-D-glucoside, CAS 62499-27-8) in commercio, il termine gastrodina ? usato anche per indicare un estratto, ad es. un estratto 10:1 o 5:1, che pu? contenere non solo la gastrodina in quanto tale (per s?), ma anche altri composti specifici. (Per chiarezza, facciamo riferimento a Gastrodina in italiano e Gastrodin in inglese per indicare lo stesso composto).
[0027] Nel contesto della presente invenzione, con il termine estratto di gastrodia si intende includere tutti i tipi di estratti, ad esempio 20:1 o 15:1 o 10:1 o 5:1 contenenti gastrodina, ma anche la gastrodina in quanto tale, senza alcuna limitazione. L'estratto di Gastrodia elata, preferibilmente l'estratto di Gastrodia elata 10:1, comprende o ? costituito da gastrodina.
[0028] Come menzionato sopra, gli estratti di Gastrodia, preferibilmente estratti di Gastrodia elata, pi? preferibilmente estratti di Gastrodia elata 10:1, comprendono o sono costituiti da gastrodina; detti estratti contengono principi attivi (composti specifici o entit? chimiche) che includono non solo piccoli composti molecolari come, ad esempio, gastrodina, cio? il 4-idrossibenzil alcool-4-O-?-D-glucopiranoside [(4-idrossibenzil alcool-4-O-?-D-glucopiranoside; CAS RN: 62499-27-8], di formula (I):
[0031]
[0033] che ? il principio attivo della Gastrodia elata che ? stato maggiormente studiato, Parishin, composti fenolici, alcol 4-idrossibenzilico e il ?-sitosterolo, ma anche macromolecole polisaccaridiche attive.
[0034] Nel contesto della presente invenzione con ?un estratto di Gastrodia elata? si intende riferirsi a, e includere, un qualsiasi estratto (e/o miscele di estratti) di Gastrodia elata, ottenuto, da qualsiasi fonte, con i metodi e apparecchiature ben noti all?esperto del settore.
[0035] Preferibilmente, l?estratto di Gastrodia elata pu?, ad esempio, essere un estratto di Gastrodia elata 10:1, ovvero standardizzato per contenere, ad esempio, una concentrazione 10 volte superiore rispetto alla concentrazione di sostanze attive presenti nel tubero di Gastrodia elata. Per esempio, l?estratto di Gastrodia elata pu?, ad esempio, essere un estratto di Gastrodia elata 5:1, oppure anche 3:1.
[0036] Nel contesto della presente invenzione, per estratto 10:1 si intende il rapporto [droga:estratto] (ad 1 grammo di estratto corrispondono i principi attivi contenuti in 10 grammi di vegetale).
[0037] Detto estratto di Gastrodia elata, preferibilmente un estratto secco di Gastrodia elata, si pu? ottenere mediante estrazione con un solvente estrattivo, ad esempio acqua o una soluzione acqua/alcol (ad esempio alcol etilico o etanolo), ad una temperatura, ad esempio, da 20?C a 70?C. Successivamente, si ottiene preferibilmente una polvere per essiccazione o per nebulizzazione con un sistema Spray-Drying a dare un estratto secco nebulizzato, in cui ad esempio l?estratto ? nebulizzato in corrente di vapore ad alta temperatura. Il breve tempo di contatto fra l?estratto e il vapore provoca l?essiccamento istantaneo senza danneggiare i principi attivi. In questo modo, si ottengono estratti molto concentrati.
[0038] Preferibilmente, un estratto secco di Gastrodia elata, ad esempio, con un rapporto droga/estratto di 10:1 pu? avere un profilo fitochimico del tipo:
[0039] - un contenuto di polisaccaridi totali compreso da 40% a 90%, preferibilmente compreso da 50% a 80%, pi? preferibilmente compreso da 60% a 70%; ad esempio, possono essere presenti alfaglucani e/o maltodestrine in una quantit? da maggiore di zero a minore di 10%, preferibilmente da maggiore di 0,1% a minore di 7,5%, pi? preferibilmente da maggiore di 2% a minore di 5%;
[0040] - un contenuto di triterpeni compreso da 0,5% a 5%, preferibilmente compreso da 1% a 4%, pi? preferibilmente compreso da 1,5% a 3%;
[0041] - un contenuto di polifenoli totali compreso da 0,05% a 3%, preferibilmente compreso da 0,1% a 2%, pi? preferibilmente compreso da 0,2% a 1%.
[0042] Inoltre, possono essere presenti in detto estratto, ad esempio, anche lignani in una quantit? compresa da maggiore di zero a minore di 0,01%, ad esempio, minore di 0,05% e anche triterpeni in una quantit? compresa da maggiore di zero a minore di 0,01%, ad esempio, minore di 0,05%. Preferibilmente, detti triterpeni e polifenoli possono essere a basso peso molecolare e riconducibili alla classe dei glicosidi fenolici.
[0043] Come ulteriore esempio, l?estratto di Gastrodia elata pu? essere un estratto di Gastrodia elata da rizoma o radice preparato, ad esempio, per estrazione con acqua ed etanolo avente un contenuto in polisaccaridi (misurato con metodo UV Phenol Sulfuric Acid, 490 nm) dal 50% al 90%, preferibilmente da 60% a 80%; una particle size di 80 mesh (Min.95% attraversa 80 mesh) e una bulk density CP <2020> compresa da 0,3 g/ml a 0,6 g/ml.
[0044] Come ulteriore esempio, l?estratto di Gastrodia elata pu? essere un estratto di Gastrodia elata rizoma P.E. 10:1 (estratto secco in presenza di destrina, come eccipiente) ed avente un contenuto in polisaccaridi (misurato con metodo UV Phenol Sulfuric Acid, 490 nm) da 10% a 40%, preferibilmente da 15% a 20%; una particle size di 100 mesh (100% attraversa 100 mesh), una solubilit? in acqua del 100% a temperatura di 25?C e una Tap density compresa da 0,35 a 0,55 g/cm3.
[0045] La citicolina, nome IUPAC 2-[{[5-(4-ammino-2-ossopirimidin-1-il)-3,4-diidrossiossolan-2-il]metossi-idrossifosforil}ossi-idrossifosforil]ossietil-trimetilazanio (CAS RN: 987-78-0), nota anche come citidina difosfato colina o CDP-colina ? un intermediario della biosintesi della fosfatidilcolina. ? uno psicostimolante/nootropico di uso ben noto nel supportare la salute del sistema nervoso.
[0046] Nel contesto della presente invenzione con ?citicolina? si intende riferirsi a, e includere, la citicolina in quanto tale e/o sottoforma di un suo sale farmaceuticamente accettabile e/o loro miscele.
[0047] La L-acetilcarnitina, nome IUPAC (R)-3-acetilossi-4-trimetilammonio-butanoato (CAS RN: 3040-38-8), nota anche come LAC, acetil-L-carnitina, levacecarnina o ALCAR, ? una forma acetilata della L-carnitina o carnitina.
[0048] Nel contesto della presente invenzione con ?L-acetilcarnitina? si intende riferirsi a, e includere, in generale la L-acetilcarnitina in quanto tale e/o sottoforma di un suo sale farmaceuticamente accettabile e/o loro miscele, e/o L-carnitina e/o carnitina.
[0049] Preferibilmente, detta almeno una vitamina del gruppo B, presente in combinazione con i) un estratto di Gastrodia elata e ii) almeno un ingrediente scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di citicolina, L-acetilcarnitina (per esempio associazione A2 e A4), ? scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina), vitamina B5 (acido pantotenico), vitamina B6 (piridossina), vitamina B7 (inositolo), vitamina B8 (biotina), vitamina B9 (acido folico), vitamina B12 (cobalamina) e loro miscele relative, preferibilmente vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B5 (acido pantotenico), vitamina B6 (piridossina), vitamina B12 e loro miscele relative.
[0050] Formano oggetto della presente invenzione composizioni farmaceutiche e/o composizioni per dispositivi medici (Regolamento (UE) 2017/745) e/o composizioni nutraceutiche e/o composizioni alimentari che comprendono un?associazione o combinazione della presente invenzione, preferibilmente l?associazione A1 o A2; opzionalmente, insieme a uno o pi? eccipienti e/o veicoli farmaceuticamente accettabili.
[0051] Preferibilmente, dette composizioni sono per uso in terapia, in particolare in un metodo per la protezione della funzionalit? del sistema nervoso e/o in un metodo di prevenzione e/o trattamento delle neuropatie centrali e periferiche.
[0052] Secondo una forma di realizzazione, la composizione farmaceutica e/o nutraceutica o composizione per integratore dell?invenzione comprende: un estratto di Gastrodia elata, citicolina, L-acetilcarnitina, vitamine del gruppo B, in particolare vitamina B1, vitamina B2, vitamina B5, vitamina B6 e vitamina B12; insieme ad almeno un eccipiente e/o un veicolo farmaceuticamente accettabili.
[0053] La composizione dell?invenzione ? una composizione per uso orale, preferibilmente una composizione allo stato solido, preferibilmente formulata in unit? di dosaggio. Per ?stato solido? si intende che la composizione pu? esistere sotto forma di granuli o polveri. Le composizioni granulari o in polvere vengono miscelate con additivi ed eccipienti farmacologicamente accettabili per fornire un prodotto finale come ad esempio un prodotto integratore, un dispositivo medico o una composizione farmaceutica. Il prodotto finale pu? essere in unit? di dosaggio farmaceutiche come ad esempio granulato in bustina, stick, stick orosolubile, compressa, gel o capsula.
[0054] Le compresse possono avere forme diverse tra quelle note nel campo delle forme farmaceutiche, come ad esempio una forma cilindrica o sferoidale. Le compresse possono essere rivestite o filmate con uno o pi? strati di rivestimento o film in grado di passare attraverso la barriera gastrica, secondo i metodi noti.
[0055] Le capsule in gel possono essere costituite da gelatina dura o gelatina morbida o gel morbido. Preferibilmente la composizione orale dell?invenzione ? una composizione solida o semi-solida (gel), come sopra descritto. Tuttavia, se desiderato o necessario, la composizione pu? essere formulata in forma liquida, ad esempio per dissoluzione o sospensione in acqua.
[0056] Le composizioni solide dell?invenzione possono contenere, come detto sopra, eccipienti e/o veicoli convenzionali fisiologicamente accettabili, come diluenti, agenti di carica, leganti, disaggreganti, sostanze atte a favorire lo scorrimento, lubrificanti, etc. Esempi non limitativi di veicoli ed eccipienti adatti sono descritti in ?Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21? Ed., Lippincott, Williams & Wilkins?. Le composizioni dell?invenzione possono, ad esempio, includere derivati della cellulosa, glucosio, lattosio, saccarosio, gelatina, malto, riso, farina, gesso, gel di silice, stearato di sodio, mono stearato di glicerolo, talco, cloruro di sodio, latte scremato in polvere, glicerolo, propilene, glicole, acqua, etanolo, e simili. La composizione pu? anche contenere reagenti tamponanti il pH e agenti bagnanti o emulsionanti.
[0057] Oltre ai componenti sopra descritti, se desiderato o necessario, la composizione dell?invenzione pu? comprendere ulteriori componenti attivi, ad esempio componenti in grado di coadiuvare i principi attivi nello svolgimento della loro azione nell?organismo del soggetto trattato, purch? detti ulteriori componenti siano fisicamente e chimicamente compatibili con i principi attivi della composizione. Esempi di ulteriori componenti sono dati, ad esempio, dalle vitamine del gruppo E, oppure dall?acido ialuronico e suoi sali relativi, come lo ialuronato di sodio.
[0058] Preferibilmente, le composizioni della presente invenzione comprendono o, alternativamente, consistono di i) un estratto di Gastrodia elata, e ii) citicolina, L-acetilcarnitina, almeno una vitamina del gruppo B, in particolare vitamina B1, vitamina B2, vitamina B5, vitamina B6, vitamina B12; insieme ad almeno un eccipiente e/o un veicolo farmaceuticamente accettabili. Preferibilmente, le composizioni della presente invenzione possono essere sotto forma di una capsula, una compressa, una bustina, uno stick, uno stick orosolubile (stick solubile a livello orale nella bocca), un gel per uso orale o un granulato.
[0059] La composizione dell?invenzione, preferibilmente formulata in unit? di dosaggio, pu? essere somministrata una o pi? volte al giorno, ad esempio una o due o tre volte al giorno.
[0060] La composizione farmaceutica e/o nutraceutica dell?invenzione preferibilmente comprende:
[0061] -da 10 a 1000 mg, preferibilmente da 50 a 500 mg, ancora pi? preferibilmente da 100 a 300 mg di estratto di Gastrodia elata; preferibilmente detto estratto comprende o ? costituito da gastrodina; e - da 50 a 500 mg, preferibilmente da 100 a 300 mg, ancora pi? preferibilmente da 150 a 250 mg di citicolina o un suo sale farmaceuticamente accettabile e/o loro miscele; e/o
[0062] -da 100 a 2.000 mg, preferibilmente da 200 a 600 mg, ancora pi? preferibilmente da 400 a 500 mg di L-acetilcarnitina (L-carnitina e/o carnitina) o un suo sale farmaceuticamente accettabile e/o loro miscele; e
[0063] - da 1 ?g a 100 mg di una miscela di vitamine del gruppo B (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B8, B9, B12) in particolare una miscela di vitamina B1, vitamina B2, vitamina B5, vitamina B6, vitamina B12; insieme a uno o pi? eccipienti e/o veicoli farmaceuticamente accettabili.
[0064] Le vitamine del gruppo B (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B8, B9, B12) in particolare una miscela di contenente la vitamina B1, vitamina B2, vitamina B5, vitamina B6 e vitamina B12, possono essere tutte assenti, oppure tutte presenti nelle composizioni della presente invenzione.
[0065] Le composizioni dell?invenzione possono essere preparate per miscelazione dei singoli componenti, e degli eventuali eccipienti e/o veicoli convenzionali.
[0066] Il dosaggio giornaliero dipende dallo stato di salute del paziente, dal peso, dal sesso e dall?et?. In generale, le composizioni dell?invenzione sono ben tollerate e possono essere somministrate una o pi? volte al giorno, anche per un periodo di tempo prolungato.
[0067] La Richiedente ha riscontrato che la combinazione dell?invenzione e le composizioni farmaceutiche e/o nutraceutiche che la contengono sono utili per mantenere il benessere e la salute del sistema nervoso e per prevenire e/o trattare le patologie ad esso collegate, come pure per prevenire e/o trattare il dolore neuropatico.
[0068] Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto l?associazione e/o la composizione dell?invenzione per l?uso in terapia, in particolare per mantenere il benessere e la salute del sistema nervoso periferico e per prevenire e/o trattare le patologie ad esso collegate, nella protezione della funzionalit? dei nervi periferici, nella prevenzione e/o trattamento delle neuropatie periferiche, e per prevenire e/o trattare il dolore neuropatico e per stimolare la produzione endogena di fattori neurotrofici.
[0069] Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto un metodo per la prevenzione e riparazione dei danni del sistema nervoso centrale e periferico e per prevenire e/o trattare le patologie ad essi collegate, per la protezione della funzionalit? del sistema nervoso e per prevenzione e/o trattamento delle neuropatie centrali e periferiche, come pure per prevenire e/o trattare il dolore neuropatico e per stimolare la produzione endogena di fattori neurotrofici, che comprende il somministrare, ad un soggetto che lo necessita, l?associazione e/o la composizione dell?invenzione, preferibilmente in una dose efficace allo scopo.
[0070] Preferibilmente, viene somministrata 1 compressa, ad esempio, di peso pari a 125 mg, preferibilmente 2 volte al giorno.
[0071] Preferibilmente, viene somministrata 1 bustina, ad esempio, di peso pari a 250 mg, preferibilmente 1 volta al giorno.
[0072] Preferibilmente, tramite la composizione della presente invenzione, viene somministrata una dose giornaliera di Gastrodia elata pari a 200 mg, ad esempio, mediante una somministrazione in bustina, oppure mediante due somministrazioni in compressa.
[0073] Preferibilmente, tramite la composizione della presente invenzione, viene somministrata una dose giornaliera di citicolina pari a 250 mg, ad esempio, mediante una somministrazione in bustina, oppure mediante due somministrazioni in compressa.
[0074] Preferibilmente, tramite la composizione della presente invenzione, viene somministrata una dose giornaliera di L-acetilcarnitina o L-carnitina o carnitina pari a 1.000 mg, ad esempio, mediante una somministrazione in bustina, oppure mediante due somministrazioni in compressa.
[0075] Inoltre, l?associazione o combinazione dell?invenzione e le composizioni farmaceutiche e/o nutraceutiche che la contengono, grazie alla presenza di ingredienti naturali non presentano effetti avversi significativi, sono prive di effetti collaterali e hanno elevata tollerabilit?, e possono essere somministrate ad un?ampia categoria di soggetti.
[0076] Infine, le associazioni e/o le composizioni dell'invenzione sono di facile preparazione ed economiche.
[0077] Delle forme rappresentative delle composizioni dell?invenzione sono riportate nella Sezione sperimentale che segue, a titolo puramente illustrativo ed in alcun modo limitativo.
[0078] Come sar? mostrato nella Sezione Sperimentale che segue e dalle figure che illustrano i risultati dei saggi sperimentali condotti, l?associazione/composizione dell?invenzione si ? dimostrata efficace nel trattamento dei disturbi del sistema nervoso, nel mantenimento del suo stato di salute e nella rigenerazione del sistema nervoso centrale e periferico.
[0079] Inoltre, l?associazione (o combinazione) della presente invenzione si ? mostrata pi? efficace e sicura di una composizione di un prodotto integratore presente sul mercato contenente acido alfalipoico, L-acetilcarnitina, citicolina e vitamine del gruppo B (in breve CF), con la quale ? stata confrontata negli studi sperimentali qui riportati.
[0080] Breve descrizione delle figure
[0081] Figura 1. Analisi di diverse sostanze in uno studio dose-risposta e tempo-dipendente per valutare la vitalit? cellulare mediante il test MTT. Effetti sulla vitalit? cellulare di: in (A) Gastrodina; in (B) Citicolina; in (C) Acetil-L-Carnitina; in (D) Vit. gruppo B. I dati sono espressi come media ? SD (%) di 5 esperimenti indipendenti normalizzati alla linea di controllo (0%).
[0082] Figura 2. Analisi della vitalit? cellulare (A) e della produzione di ROS (B) dei singoli componenti e delle loro combinazioni in uno studio tempo-dipendente. I dati sono espressi come media ? SD (%) di 5 esperimenti indipendenti normalizzati al controllo.
[0083] Figura 3. Studio della permeabilit? su cellule CaCo-2. In (A) Valore della TEER (resistenza elettrica transepiteliale) utilizzando EVOM3; da (B-D) analisi di TJ misurata con test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Occludina, Claudina1 e ZO-1 rispettivamente); da (B-D), le medie ? SD sono espresse confrontando i dati con il controllo (linea 0%), e tutte le molecole risultano in * p < 0,05 vs controllo; ? p <0,05 vs Citicolina, Acetil-L-Carnitina e Vit. gruppo B; ? vs Acido Lipoico; ? vs Gastrodina; le barre p<0,05 vs CF.
[0084] Figura 4. Analisi di EngNT 3D in condizioni fisiologiche. In (A) la vitalit? cellulare ? misurata con il test MTT; (B) quantificazione di TNF? con kit ELISA; il kit ELISA misura (C) l'attivit? di NGF; e (D) attivit? di ERK/MAPK misurata con kit ELISA. I dati sono la media ? SD di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato e normalizzati ai valori di controllo (linea 0%). * p < 0,05 vs. controllo; ? p < 0,05 vs. Citicolina, Acetil-L-Carnitina e Vit. gruppo B; ? vs. Acido Lipoico; ? vs. Gastrodina; le barre p<0,05 vs. CF.
[0085] Figura 5. Analisi degli effetti di singoli agenti e combinazioni in condizioni di PNI. In (A) vitalit? cellulare mediante MTT; in (B) analisi della produzione di ROS misurata mediante riduzione del citocromo C; in (C) quantificazione di TNF? mediante test ELISA; e in (D) analisi di IL-2 mediante test ELISA. I dati sono le medie ? SD (%) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato e normalizzati ai valori di controllo (linea 0%). GGF = glial growth factor 2; * p < 0,05 vs. controllo; ? p < 0,05 vs. Citicolina, Acetil-L-Carnitina e Vit. gruppo B; ? vs. Acido Lipoico; ? vs. Gastrodina; ? p<0,05 vs. GGF 200ng/mL; le barre p<0,05 vs. CF.
[0086] Figura 6. Analisi di singoli agenti e combinazioni sui canali NaV e sull'attivit? GABA in condizioni di PNI. In (A) attivit? proteica Nav 1.7; in (B) attivit? proteica Nav 1.8; in (C) attivit? GABA-A. Tutti questi test sono stati eseguiti con uno specifico kit ELISA. I dati sono le medie ? SD (%) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato e normalizzati ai valori di controllo (linea 0%). GGF = glial growth factor 2; * p < 0,05 vs. controllo; ? p < 0,05 vs. Citicolina, Acetil-L-Carnitina e Vit. gruppo B; ? vs. Acido Lipoico; ? vs. Gastrodina; ? p<0,05 vs. GGF 200ng/mL; le barre p<0,05 vs. CF.
[0087] Figura 7. Analisi di singoli agenti e combinazioni su marcatori molecolari SNP in condizioni di PNI. In (A) attivit? di p75 mediante test ELISA; in (B) myelin protein zero (MPZ) mediante test ELISA; in (C) neuregulina 1 (NRG1) mediante test ELISA; in (D) recettore estrogenico beta (ERb) mediante test ELISA; in (E) attivit? di NGF misurata mediante kit ELISA. I dati sono le medie ? SD (%) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato e normalizzati ai valori di controllo (linea 0%). GGF = glial growth factor 2; * p < 0,05 vs. controllo; ? p < 0,05 vs. Citicolina, Acetil-L-Carnitina e Vit. gruppo B; ? vs. Acido Lipoico; ? vs. Gastrodina; ? p<0,05 vs. GGF 200ng/mL; le barre p<0,05 vs. CF.
[0088] Esempio 1A
[0089] Composizione in forma di compressa (ad es.1 compressa due volte al giorno) contenente:
[0090] - 100 mg o 200 mg di estratto di Gastrodia elata 50% polisaccaridi
[0091] - 125 mg di citicolina
[0092] - 500 mg di L-acetilcarnitina e/o carnitina
[0093] - 12,5 mg di vitamina B1 12,5 mg di vitamina B2 9 mg di vitamina B5 5 mg di vitamina B6 16,5 ?g di vitamina B12 e, opzionalmente,
[0094] - eccipienti e/o additivi di grado alimentare o farmaceutico.
[0096] Esempio 1B
[0097] Composizione in forma di compressa (ad es.1 compressa due volte al giorno) contenente:
[0098] - 100 mg o 200 mg di estratto di Gastrodia elata 10:1
[0099] - 125 mg di citicolina
[0100] - 500 mg di L-acetilcarnitina e/o carnitina
[0101] - 12,5 mg di vitamina B1 12,5 mg di vitamina B2 9 mg di vitamina B5 5 mg di vitamina B6 16,5 ?g di vitamina B12 e, opzionalmente,
[0102] - eccipienti e/o additivi di grado alimentare o farmaceutico.
[0104] Esempio 2A
[0105] Composizione in forma di bustina (ad es.1 bustina una volta al giorno) contenente:
[0106] - 200 mg o 400 mg di estratto di Gastrodia elata 50% polisaccaridi
[0107] - 250 mg di citicolina
[0108] - 1.000 mg di L-acetilcarnitina e/o carnitina
[0109] - 25 mg di vitamina B1 25 mg di vitamina B2 18 mg di vitamina B5 10 mg di vitamina B6 33 ?g di vitamina B12 e, opzionalmente,
[0110] - eccipienti e/o additivi di grado alimentare o farmaceutico.
[0112] Esempio 2B
[0113] Composizione in forma di bustina (ad es.1 bustina una volta al giorno) contenente:
[0114] - 200 mg o 400 mg di estratto di Gastrodia elata 10:1
[0115] - 250 mg di citicolina
[0116] - 1.000 mg di L-acetilcarnitina e/o carnitina
[0117] - 25 mg di vitamina B1 25 mg di vitamina B2 18 mg di vitamina B5 10 mg di vitamina B6 33 ?g di vitamina B12 e, opzionalmente,
[0118] - eccipienti e/o additivi di grado alimentare o farmaceutico.
[0119] L'attivit? delle associazioni o combinazioni e delle composizioni che le contengono ? stata valutata sulla base di diversi saggi sperimentali.
[0121] 1. Introduzione
[0122] Il presente studio mira a sostituire l'acido lipoico con un estratto di Gastrodia, preferibilmente un estratto di Gastrodia elata 10:1 cosiddetto Gastrodina, combinato con citicolina, carnitina e vitamine del gruppo B per migliorarne le propriet? antiossidanti e antinfiammatorie per ridurre la segnalazione del dolore in un modello in vitro.
[0123] Le composizioni CI e CF si differenziano per la presenza di gastrodina in CI e di acido lipoico in CF.
[0124] 2. Risultati
[0125] 2.1 Studio dose-risposta dei singoli componenti su Caco-2
[0126] Prima di esplorare i potenziali effetti benefici contro il dolore neuropatico della nuova formulazione, sono stati valutati gli effetti dei singoli agenti sulla vitalit? della linea cellulare Caco-2 utilizzando uno studio dose-risposta per verificare l'analisi tossicologica, considerando un periodo compreso tra 2h e 6h come tempo di esposizione rilevante. Come riportato nella Figura 1A, tutte le sostanze hanno migliorato la vitalit? delle cellule CaCo-2, come riportato in letteratura, rispetto al controllo (p<0,05). Questi effetti sono pi? rilevanti se si considera la Gastrodina 25?M, in quanto ? stata in grado di migliorare il metabolismo mitocondriale di circa il 40% rispetto al controllo (p<0,05) e di indicare un profilo migliore in termini di vitalit? cellulare rispetto alla Gastrodina 50?M e alla Gastrodina 100?M (p<0,05). Inoltre, per quanto riguarda la Citicolina e l'Acetil-L-Carnitina, pur avendo un profilo temporale simile, la Citicolina 250mM e l'Acetil-L-Carnitina 7,5?M hanno dimostrato un andamento migliore rispetto alle altre due concentrazioni scelte (p<0,05). Infine, solo le Vitamina del gruppo B (Vit. B) 1mg/mL hanno esercitato gli effetti pi? benefici rispetto a 100?g/mL e 200?g/mL (p<0,05), il che potrebbe essere alla base della risposta autoprotettiva indotta dall'agente. Per questo motivo, per ogni agente da utilizzare nella formulazione finale ? stata scelta la concentrazione in grado di mantenere o produrre un aumento minimo della vitalit? cellulare (p<0,05 rispetto al controllo). In particolare, sono stati scelti Gastrodina 25?M, Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. gruppo B 1mg/mL.
[0127] In effetti, quando tutti gli agenti sono stati aggiunti insieme (Figura 2A), sono stati osservati cambiamenti significativi (p<0,05), indicando il mantenimento di una risposta di autoprotezione anche da parte della formulazione completa della presente invenzione (in breve, CI) senza acido lipoico, ma con Gastrodina o estratto di Gastrodia 10:1, indicando la possibilit? di un effetto sinergico utilizzando tutte le sostanze nella stessa formulazione. Inoltre, CI ha esercitato prestazioni migliori rispetto alle altre sostanze testate (p<0,05), in particolare rispetto a CF (contenente acido lipoico, citicolina, acetil-L-carnitina e vitamine del gruppo B) (p<0,05). Ci? potrebbe essere dovuto alla maggiore efficacia di Gastrodina rispetto all'Acido Lipoico (p<0,05), che potenzia il metabolismo mitocondriale e produce una risposta pi? favorevole. Gli stessi risultati sono stati riscontrati anche analizzando la produzione di ROS (Figura 2B), poich? CI ha esercitato un effetto significativo rispetto alle altre sostanze testate (p<0,05).
[0128] 2.2. Meccanismi di Permeabilit? e Assorbimento analizzati in un Modello di Barriera Intestinale in vitro
[0129] Sulla base dei risultati ottenuti nella prima fase dello studio, sono state eseguite ulteriori indagini per acquisire informazioni chiave sui meccanismi di assorbimento e trasporto dell'intestino, realizzando un modello di barriera intestinale in vitro. In questo contesto, sono stati valutati la resistenza elettrica transepiteliale (TEER), l'assorbimento intestinale e l'attivit? delle TJ, come Occludina, Claudina1 e ZO-1. Come riportato nella Figura 3A, l'analisi di TEER mostra che tutti gli agenti testati supportano attivamente l'assorbimento ottimale e mantengono la corretta omeostasi intestinale (p<0,05). In particolare, il passaggio attraverso l'epitelio intestinale dimostra che Gastrodina 25?M ha mantenuto l'integrit? epiteliale, aumentando il flusso ionico degli scambi paracellulari attraverso l'epitelio intestinale meglio degli altri singoli agenti (p <0,05). L'effetto potenziante di Gastrodina 25?M ? particolarmente apprezzato se combinato con Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. del gruppo B 1mg/mL, poich? CI ha mostrato maggiori effetti benefici rispetto alla CF (p<0,05). Questi dati sono stati confermati con l'analisi delle TJ; nella Figura 3B-D Gastrodina 25?M ha esercitato gli effetti pi? significativi rispetto agli altri agenti singoli per tutte le TJ testate (p<0,05). Inoltre, in questo caso, quando la Gastrodina ? combinata nella formulazione, CI ha esercitato l'effetto pi? significativo rispetto a CF per quanto riguarda la claudina-1 (circa del 51%, p < 0,05), l'occludina (circa del 47%, p < 0,05) e ZO-1 (circa del 57%, p < 0,05) e rispetto al valore di controllo (riportato come linea-0, p < 0,05). Inoltre, questi dati sono supportati dalla sola Gastrodina 25?M, che dimostra effetti migliorativi sulle TJ rispetto all'Acido Lipoico 50?M (p<0,05). Infine, i dati relativi all'analisi dell'assorbimento (Tabella 1) hanno supportato i risultati sopra riportati, in quanto la Gastrodina 25?M da sola possedeva una biodisponibilit? leggermente superiore a quella dell'Acido Lipoico 50?M (p <0,05), dimostrando la capacit? di attraversare la barriera intestinale in modo particolarmente efficiente e consentendo a CI di avere un profilo di assorbimento superiore rispetto alla CF (p<0,05). Tutti questi risultati hanno rivelato che la combinazione di Gastrodina 25?M, Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. del gruppo B 1mg/mL ha un profilo di assorbimento migliore rispetto a CF, confermando un miglioramento della biodisponibilit? e suggerendo un effetto sinergico della combinazione.
[0131] Tasso di assorbimento ottenuto dall'applicazione della seguente formula: J = Jmax [C]/(Kt [C]).
[0133]
[0134] Tabella 1
[0136] 2.3. Effetti dei Singoli Componenti e delle Combinazioni su co-colture 3D EngNT Considerando i dati ottenuti dall'analisi dell'assorbimento, sono stati condotti ulteriori esperimenti su tessuto neurale ingegnerizzato in 3D (3D EngNT) per studiare la capacit? di Gastrodina 25?M, Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. del gruppo B 1mg/mL, da soli e in combinazione, di raggiungere e agire sul nervo periferico dopo il passaggio intestinale in condizioni fisiologiche. Tutti i dati sono stati confrontati con CF e il suo ingrediente principale. Come mostrato nella Figura 4, tutti i singoli agenti testati sono riusciti a raggiungere il sito bersaglio dopo il passaggio intestinale senza influenzare negativamente il metabolismo mitocondriale o la risposta infiammatoria (p < 0,05). In particolare, Gastrodina 25?M ? stata in grado di amplificare la vitalit? cellulare rispetto agli altri agenti singoli (p < 0,05, Figura 4A), dimostrando una capacit? di mantenere il benessere mitocondriale e, allo stesso tempo, di ridurre la quantit? di marker infiammatori (p < 0,05). Ggastrodina 25?M ha anche esercitato un effetto significativo rispetto all'acido lipoico 50?M sulla vitalit? cellulare e sulla produzione di TNF? (rispettivamente circa del 44% e del 33%, p < 0,05). Inoltre, CI ha indotto un effetto significativo rispetto a CF in entrambi i parametri testati (circa del 15% per la vitalit? cellulare e del 24% per la produzione di TNF?, p < 0,05), dimostrando la maggiore efficacia di questa combinazione. L'attivit? del NGF ? stata analizzata per confermare i loro effetti in condizioni fisiologiche, poich? si tratta di un fattore pleiotropico coinvolto nella crescita, nella differenziazione e nella riparazione da danni neuronali. Come riportato nella Figura 4C, in questo caso, Gastrodina 25?M ha esercitato l'effetto pi? benefico rispetto ai singoli agenti (p <0,05), dimostrando l'efficacia di questa sostanza anche rispetto alle materie prime gi? disponibili sul mercato (p<0,05). Inoltre, questo vantaggio ? stato confermato dalla sua combinazione con le altre sostanze: CI ha indotto un impatto significativo rispetto a CF (circa del 42% p <0,05). Infine, ? stata analizzata anche l'attivit? di ERK/MAPK, considerando che, in seguito a lesioni nervose, la fosforilazione di ERK aumenta. Infatti, ? noto che la fosforilazione di ERK indotta da una lesione nervosa avviene precocemente ed ? duratura, per cui la regolazione di ERK/MAPK pu? essere considerata un promettente bersaglio terapeutico per il trattamento del dolore neuropatico. Come previsto, l'effetto di Gastrodina 25?M ? stato maggiore rispetto all'Acido Lipoico 50?M (circa del 16%, p<0,05); a conferma definitiva degli effetti osservati finora, anche in questo caso l'effetto maggiore ? stato ottenuto in seguito al trattamento con CI (p <0,05).
[0137] 2.4. Effetti dei Singoli Componenti e della Combinazione su un Modello in vitro di Lesione Nervosa Periferica (PNI, Peripheral Nervous Injury)
[0138] Per replicare una forte demielinizzazione prima della stimolazione con le due formulazioni e i singoli farmaci, l'EngNT 3D ? stato pretrattato con 200 ng/mL di fattore di crescita gliale 2 (GGF, glial growth factor 2) a partire dal 14? giorno di maturazione. Ci? si ? reso necessario in quanto lo studio doveva replicare il danno al tessuto nervoso periferico in vitro. Pertanto, sono stati condotti ulteriori studi per indagare gli effetti sulla vitalit? cellulare e sulla produzione di ROS (Figura 5A-B). Come previsto, il tessuto nervoso trattato con solo 200 ng/mL di GGF ha prodotto una notevole quantit? di ROS e un'attivit? biologica significativamente inferiore (p<0,05). Al contrario, sia i singoli componenti che le formulazioni sono stati in grado non solo di ristabilire le condizioni fisiologiche, ma anche di indurre un aumento significativo della vitalit? cellulare e una diminuzione della produzione di ROS (p<0,05). Infatti, CI ha aumentato la vitalit? cellulare di circa il 19% e ha diminuito la produzione di ROS di quasi 4 volte rispetto alla CF (p<0,05).
[0139] Inoltre, per quanto riguarda il pannello infiammatorio, anche se tutti gli agenti sono stati in grado di ridurre la produzione di TNF? e IL2 rispetto al solo GGF 200ng/mL (p<0,05), ancora una volta CI ha dimostrato effetti pi? significativi anche rispetto a CF, con una diminuzione della produzione di TNF? di 3 volte e dell'espressione di IL2 di 2,7 volte (p<0,05). Ci? ? dovuto alla presenza di Gastrodina 25?M nella formulazione, che, grazie al suo potente effetto antiossidante, pu? invertire gli effetti dannosi in modo sinergico con gli altri componenti della formulazione. Inoltre, considerando che Nav1.7 e Nav1.8 sono canali del sodio altamente espressi nella fisiopatologia del dolore, sono state effettuate ulteriori analisi sulla loro attivit? proteica. In particolare, i canali del sodio sono naturalmente coinvolti nella trasmissione di informazioni dai recettori del dolore nel PNS al sistema nervoso centrale (CNS). Come riportato nella Figura 6 (Pannelli A-B), tutti gli agenti testati sono stati in grado di indurre una diminuzione di entrambe le proteine Nav1.7 e Nav1.8 rispetto al GGF 200ng/mL (p<0,05). Non sorprende che anche in questo caso gli effetti principali siano stati ottenuti dalla nuova formulazione CI, che ha indotto una riduzione dell'attivit? della proteina NaV1.7 di quasi 2,5 volte rispetto a CF e una riduzione dell'attivit? della proteina NaV1.8 di quasi 10 volte rispetto a CF (p<0,05). In particolare, questi dati dimostrano come CI possa ridurre il dolore riducendo l'attivit? di entrambi i canali NaV 1.7 e NaV 1.8, deputati a modulare il dolore. Diversi studi esaminano la funzione dei recettori GABA vicino ai canali del sodio, che facilitano la propagazione degli spike negli assoni mielinizzati (Figura 6 C). In particolare, l'analisi dell'attivit? di GABA, la cui funzionalit? ? risultata statisticamente aumentata dal trattamento con tutti gli agenti da soli rispetto al GGF 200ng/mL (p<0,05), ha ulteriormente supportato gli effetti benefici della Gastrodina 25?M; infatti, favorita dalla sua presenza, la CI ha esercitato una diminuzione dell'attivit? GABA-A superiore a quella di CF (circa una volta in pi?, p<0,05).
[0140] Infine, ? stata studiata la modulazione in vitro di specifiche vie molecolari coinvolte nel dolore neuropatico. Come mostrato nella Figura 7A, i nostri risultati hanno illustrato come la Gastrodina sia efficace nel ripristinare la mielinizzazione in seguito al danno nervoso causato da 200 ng/mL di GGF (p<0,05), come dimostrato dall'analisi di p75 e, di conseguenza, dall'inibizione dell'attivit? di MPZ. In particolare, come si pu? vedere nella Figura 7A, CI ? stata in grado di invertire completamente il danno indotto da GGF 200ng/mL (circa del 77% in pi?, p<0,05), causando anche un aumento dell'attivit? di p75 rispetto a CF (circa del 59%, p<0,05). Inoltre, l'attivit? di MPZ, un altro marcatore coinvolto nel mantenimento della guaina mielinica, ? migliorata in seguito alla somministrazione di Gastrodina 25?M, Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. del gruppo B 1mg/mL da soli, in particolare se combinati in CI (p<0,05). In queste circostanze, la Figura 7B illustra l'attivit? benefica della Gastrodina 25?M su GGF 200ng/ml (p<0,05) e, successivamente, l'impatto di CI sia su di essa che sulla CF (circa 1,5 volte e del 70%, rispettivamente, p<00,5).
[0141] Un'altra prova del miglioramento della lesione nervosa e del ripristino del processo di mielinizzazione ? stata fornita dalle analisi delle attivit? di NRG1 ed ERb (Figura 7 C-D). In dettaglio, per quanto riguarda l'attivit? NRG1, l'Acido Lipoico 50?M non ? stato in grado di migliorarla rispetto al GGF 200ng/mL (p<00,5), mentre la sua combinazione nella formulazione CF ha ottenuto questo risultato; al contrario, sia la Gastrodina 25?M che, in particolare, CI hanno annullato i danni indotti dal GGF 200ng/mL migliorando l'attivit? NRG1 (rispettivamente circa del 18% e del 31%, p<0,05). Inoltre, CI ha ottenuto un'attivit? significativa rispetto a FC (circa del 58%, p<0,05), dimostrando la maggiore efficacia di questa nuova formulazione. Anche l'analisi dell'attivit? di ERb ha rivelato una tendenza simile: la condizione di PNI ha influito sulla sua attivit?, ma la somministrazione di tutti gli agenti testati ha rivelato un'inversione e un ripristino di questa condizione (p<0,05). In particolare, gli effetti pi? evidenti sono stati ottenuti con la Gastrodina 25?M e, soprattutto, con CI; quest'ultima ha esercitato un'influenza significativa rispetto a CF (circa del 33%, p<0,05). L'analisi dell'attivit? di NGF fornisce un'ultima prova del ripristino del meccanismo corretto. Anche in questo caso, la Gastrodina 25?M da sola ha esercitato un effetto superiore a quello dell'acido lipoico 50?M (p<0,05) e, quando inclusa nella nuova combinazione, ? incline a un effetto sinergico che migliora la risposta di auto-ripristino. In effetti, l'impatto pi? significativo ? esercitato da CI, con un aumento sostanziale dell'attivit? di NGF rispetto al FC (circa del 30%, p<0,05).
[0142] 3. Discussione
[0143] Per il trattamento del dolore neuropatico sono stati proposti numerosi trattamenti non farmacologici, tra cui metodi non invasivi come l'esercizio fisico, la terapia cognitivocomportamentale integrata e gli integratori alimentari. In effetti, negli ultimi anni si ? registrato un grande interesse per i cosiddetti "nutraceutici" e altri integratori non farmacologici, che potrebbero essere in grado di integrare l'attuale trattamento farmaceutico del dolore neuropatico cronico. In questo contesto, recentemente sono emersi numerosi nutraceutici per il trattamento del dolore neuropatico in diverse patologie, tra cui la neuropatia periferica, la neuropatia diabetica e il dolore neuropatico associato alla chemioterapia [33]. La presente indagine mirava a trovare un nuovo integratore alimentare efficace che potesse aiutare i pazienti con PNI a gestire il loro disagio. In particolare, sono stati studiati gli effetti dell'estratto secco di Gastrodiae Rhizoma 10:1 (chiamato OXADIA o Gastrodina o estratto di Gastrodia 10:1) rispetto all'Acido Lipoico e in combinazione con Acetil-L-Carnitina, Citicolina e vitamine del gruppo B (B1, B2, B5, B6 e B12) per valutare se la loro combinazione (chiamata CI) potesse essere pi? efficace di una CF contenente Acido Lipoico. La Gastrodina ha dimostrato risultati ottimali per quanto riguarda la vitalit? cellulare e un minore coinvolgimento dei meccanismi di induzione ossidativa rispetto al solo Acido Lipoico, componente della formulazione originale o CF. Ci? ha permesso di confermare la minore azione irritante a livello intestinale promossa dal componente nutraceutico in esame, rafforzando al contempo qualsiasi complicazione segnalata per l'uso orale dell'Acido Lipoico [10]. Ci? ? stato confermato anche dall'aumento dell'attivit? delle TJ intestinali, che sono parametri cruciali nella valutazione di un monostrato epiteliale allestito in vitro. Infatti, le analisi di Zo-1, che media l'adesione, di claudina-4, che mantiene la struttura, e di occludina, che contribuisce alla stabilizzazione, confermano il corretto funzionamento dell'intestino. Inoltre, l'analisi TEER conferma un migliore ruolo attivo della Gastrodina, ipotizzando un migliore assorbimento, rispetto all'acido lipoico. Tutte queste informazioni sono state confermate da un buon tasso di assorbimento ottenuto correlandolo con i risultati della sonda fluorescente utilizzata. Infatti, ha dimostrato una percentuale di assorbimento migliore rispetto al solo Acido Lipoico; i risultati si riscontrano anche nelle due composizioni, con CI che esercita un effetto migliore rispetto a CF. Dopo il passaggio intestinale, tutte le sostanze nutraceutiche in esame sono state caratterizzate sul target specifico dello studio, un sistema nervoso 3D. In particolare, sono state valutate le azioni antiossidanti e antinfiammatorie descritte in letteratura [35]. In effetti, la produzione di TNF?, un marker infiammatorio, ? stata soppressa dopo la stimolazione con Gastrodina, indicando un danno neuronale minore. Inoltre, sono stati analizzati i meccanismi fondamentali per il mantenimento della vitalit?, della funzionalit? e della sopravvivenza delle cellule; in particolare, ? stata analizzata l'attivit? di NGF. L'NGF ? stata la prima neurotrofina identificata con un ruolo chiave nella sopravvivenza e nella funzione dei neuroni sensoriali e simpatici del sistema nervoso periferico (PNS) e dei neuroni colinergici del proencefalo basale nel CNS [36]. Pertanto, la sua maggiore attivit? ? direttamente correlata a una migliore vitalit? cellulare. La valutazione di ERK/MAPK ? stata utilizzata fondamentalmente perch? la via ERK/MAPK, tradizionalmente associata a ruoli importanti nella proliferazione e differenziazione cellulare, ha trovato una forte rilevanza a livello periferico nel mantenimento della plasticit? neuronale. Inoltre, ? stato recentemente dimostrato che l'attivazione di ERK/MAPK contribuisce alle risposte nocicettive che seguono l'infiammazione e/o le lesioni nervose [30]. In effetti, anche il sistema biologico ERK/MAPK ? stato valutato e si ? riscontrato che Gastrodin ha esercitato l'effetto pi? benefico rispetto ad altri singoli campioni (p<0,05). Inoltre, in questo caso, ? stata valutata la superiorit? di CI rispetto a CF. A seguito di questi dati in condizioni nervose fisiologiche, la nostra ricerca ha proceduto con la caratterizzazione a livello di un modello nervoso 3D in condizioni di danno (indotto con 200 ng/ml di GGF), con conseguente demielinizzazione. In questa fase di studio, i risultati hanno ampiamente confermato gli effetti antiossidanti (riduzione dei livelli di ROS) e antinfiammatori (riduzione dei livelli di TNF? e di IL-2) promossi dalla Gastrodina, amplificati dopo il trattamento con CI grazie agli effetti antiossidanti e antinfiammatori degli altri componenti, rispetto a CF e all'acido lipoico (p<0,05). In particolare, CI ha soppiantato il meccanismo infiammatorio e lo stress ossidativo. Inoltre, la normale crescita del nervo periferico, la migrazione e la differenziazione delle cellule di Schwann sono regolate da NRG1 che attiva i recettori ERb; la condizione di PNI modifica la segnalazione NRG1/ERb disturbando l'equilibrio tra le isoforme di NRG1 e riducendo l'espressione di molteplici molecole coinvolte nella sopravvivenza cellulare [37]. Mentre l'interruzione della segnalazione NRG-1/ERb B2 e l'alterazione del supporto neurotrofico sono indubbiamente legati alla degenerazione dei neuroni sensoriali in PNI, molto probabilmente nell'attivit? biologica delle cellule di Schwann, il trattamento con CI ha ripristinato il neurotropismo alterato, prevenendo i danni alle fibre motorie e il rallentamento nella conduzione nervosa, dimostrando le sue propriet? neurotrofiche.
[0144] Inoltre, la nostra ricerca ci ha permesso di delineare il ruolo della nuova formulazione proposta non solo dal punto di vista antiossidante e antinfiammatorio, ma anche di caratterizzare l'effetto sui meccanismi direttamente coinvolti nell'avvio del dolore neuropatico. In letteratura, il ruolo dei canali del sodio Nav1.7 e Nav1.8, ampiamente espressi nella condizione fisiopatologica del dolore, ? stato definito cruciale [32]. Le analisi della loro attivit? hanno confermato gli effetti della sostanza analizzata, in quanto tutte sono state in grado di diminuire l'espressione e l'attivit? di Nav1.7 e Nav1.8, soprattutto dopo il trattamento con CI; gli stessi risultati sono stati osservati anche su GABA-A, un importante neurotrasmettitore inibitorio nel CNS dei mammiferi [38]. Inoltre, i dati hanno rivelato che CI sembra essere in grado di riparare i danni alla guaina mielinica che protegge l'assone e di agire contemporaneamente sul rilascio di NGF e di legare il recettore della neurotrofina p75, riproducendo il meccanismo di analgesia osservato nell'uomo e mimando in vitro la condizione di dolore neuropatico, in particolare l'infiammazione e lo stress ossidativo che portano a uno squilibrio del trasporto ionico. Infatti, come precedentemente dimostrato [39], un aumento dei livelli di NGF in varie situazioni infiammatorie pu? essere una caratteristica chiave della sindrome del dolore cronico umano. Di conseguenza, la riduzione della risposta infiammatoria ? fondamentale per mitigare gli effetti dannosi del dolore cronico. Al contrario, il dolore ? associato a uno squilibrio funzionale tra MPZ, ERb e NRG1, il cui equilibrio relativo ? fondamentale per mantenere l'omeostasi delle cellule di Schwann durante la PNI. NRG1 attiva normalmente i recettori ERB nei nervi periferici per regolare la crescita, la migrazione, la differenziazione e la de-differenziazione delle cellule di Schwann; tuttavia, la PNI altera la segnalazione NRG1/ERb alterando l'equilibrio tra le isoforme di NRG1, diminuendo l'espressione di diverse molecole coinvolte nella sopravvivenza cellulare e attivando cos? la via MAPK [40]. Mentre la neurodegenerazione sensoriale nella PNI ? associata a un ridotto supporto neurotrofico e a un'interruzione della segnalazione NRG-1/ERb, presumibilmente nell'attivit? biologica delle cellule di Schwann, il trattamento con CI ha ripristinato il neurotropismo alterato, prevenendo il rallentamento della conduzione nervosa e il danno ai motoneuroni. Tutti questi risultati indicano la potenziale utilizzabilit? di una nuova formulazione composta da Gastrodina (OXADIA) 25?M, Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. del Gruppo B 1mg/mL, in grado di attraversare le membrane biologiche, in particolare la barriera intestinale, e di raggiungere il sito bersaglio, mostrando effetti ottimali in un modello in vitro di PNI.
[0145] 4. Materiali e metodi
[0146] 4.1 Preparazione degli agenti
[0147] L'estratto secco di rizoma di Gastrodiae Elata 10:1 (chiamato OXADIA<TM >), la Citicolina, l'Acetil-L-Carnitina e le Vitamine del gruppo B (Vit. del Gruppo B, composte dal 22,5% di vitamina B1 e B2, dal 16,2% di vitamina B5, dal 9% di vitamina B6 e dal 29,7% di vitamina B12) sono stati testati da soli e combinati per verificare la loro efficacia nell'attraversare la barriera intestinale e raggiungere il sistema nervoso periferico (PNS). In particolare, la Gastrodina ? stata testata in un intervallo da 25?M a 100?M [41], la Citicolina in un intervallo da 100mM a 300mM [42], l'Acetil-L-Carnitina in un intervallo da 7,5?M a 30?M [43] e le Vitamine del gruppo B da 100?g/mL a 1mg/mL [44, 45]. Tutte le sostanze testate sono state preparate direttamente in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Merck Life Science, Roma, Italia) senza rosso fenolo e integrato con 0,5% di siero fetale bovino (FBS; Merck Life Science, Roma, Italia), 2 mM di L-glutammina (Merck Life Science, Roma, Italia) e 1% di penicillina-streptomicina (Merck Life Science, Roma, Italia) per tutte le analisi. In base ai loro effetti benefici, la migliore concentrazione di ciascuna sostanza ? stata scelta e combinata in una nuova formulazione composta da Gastrodina 25?M, Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. del gruppo B 1mg/mL (chiamata CI). Inoltre, CI ? stata analizzata nel corso del progetto confrontando i suoi effetti con i singoli attivi, l?Acido Lipoico da solo e CF (composta da Acido Lipoico, Citicolina, Acetil-L-Carnitina e Vit. del gruppo B). L'Acido Lipoico ? stato utilizzato a una concentrazione di 50?M, come riportato in letteratura [46], e CF ? stata testata allo stesso dosaggio di CI, contenente la stessa percentuale di Citicolina, Acetil-L-Carnitina e Vit. del gruppo B. Inoltre, tutte le sostanze testate sono state preparate come gi? detto e donate da AGAVE S.r.l., che le ha ottenute da
[0149] 4.2 Coltura cellulare
[0150] La linea cellulare epiteliale intestinale umana CaCo-2 ? stata utilizzata come modello per prevedere le caratteristiche dell'assorbimento intestinale umano in seguito all'assunzione orale [47, 48]. Le cellule sono state fornite dall'American Type Culture Collection (ATCC) e coltivate in Dulbecco's Modified Eagle's Medium Advance (DMEM-Adv,
[0151] ) integrato con il 5% di FBS, 2 mM di L-glutamina e l'1% di penicillina-streptomicina, mantenute in un incubatore a 37?C e 5% di CO2 e 95% di umidit?. Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando cellule CaCo-2 a numeri di passaggio compresi tra 26 e 32 per mantenere l'equilibrio fisiologico tra permeabilit? paracellulare e propriet? di trasporto [49]. Le cellule sono state piastrate in modo diverso: 1 x 10<4 >cellule su piastre da 96 pozzetti per studiare la vitalit? cellulare mediante MTT- In Vitro Toxicology Assay Kit e la produzione di ROS che sono state testate dopo aver sincronizzato le cellule per 8 ore con DMEM senza fenolo rosso e integrato con 0. 5% FBS, 2 mM L.5% FBS, 2 mM L-glutammina e 1% penicillina-streptomicina, mantenendo le cellule in un incubatore a 37 ?C con il 5% di CO2. Inoltre, 2 x 10<4 >cellule sono state piastrate su Transwell? da 6,5 mm
[0152] con un inserto di membrana in policarbonato con pori da 0,4 ?m in una piastra da 24 pozzetti per eseguire le analisi di assorbimento [50].
[0153] La linea cellulare di Schwann derivata dal ratto, RSC-96, acquistata da ATCC, ? stata coltivata in DMEM-Adv integrato con il 5% di FBS, 2 mM di L-glutammina e l'1% di penicillina-streptomicina [51] mantenuto in un incubatore a 37?C e 5% di CO2 e 95% di umidit?. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando cellule RSC96 tra i 10 e i 15 passaggi, subculturando 2-3 volte a settimana.
[0154] La linea cellulare neuronale di ratto PC12, fornita da ATCC, ? stata coltivata in Roswell Park Memorial Institute-1640 Advanced (RPMI-Adv, ) integrato con 2 mM di glutammina, 5% di siero di cavallo (HS; ) e 5% di FBS. Le colture sono state mantenute in subconfluenza in un incubatore a 37?C, 5% di CO2 e 95% di umidit?; le cellule utilizzate per gli esperimenti avevano un numero di passaggi compreso tra 3 e 13 [52]. Le cellule PC12 sono tra le linee cellulari neuronali pi? idonee e frequentemente utilizzate per lo screening in vitro di composti neuroprotettivi [53].4 x 10<6 >cellule RSC96 e 1 x 10<5 >cellule PC12 sono state inserite in un sistema di co-coltura per riprodurre in vitro l'EngNT 3D, creando un modello in vitro di ambiente nervoso periferico [51].
[0155] 4.3 Protocollo sperimentale
[0156] Questo studio ? stato condotto in tre fasi diverse; il punto di partenza del protocollo di studio era volto a studiare i processi di assorbimento e trasporto della nuova formulazione e dei singoli componenti attraverso la barriera intestinale utilizzando un modello 3D in vitro con cellule Caco-2 [49]. Le analisi effettuate hanno riguardato il metabolismo mitocondriale e il benessere cellulare, lo stress ossidativo, la permeabilit? e la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER), l'assorbimento e l'attivit? della tight junction (TJ). Nella seconda fase, il prodotto metabolizzato dalle cellule intestinali ? stato successivamente messo a contatto con un modello 3D per lo studio del nervo periferico (3D EngNT), valutando il metabolismo cellulare, l'infiammazione e alcune vie molecolari. Infine, nella terza fase, sono stati simulati in vitro il danno e la demielinizzazione del nervo periferico, trattando 3D EngNT con GGF 200ng/ml, per esplorare la sopravvivenza cellulare e l'attivit? mitocondriale, lo stress ossidativo e la quantificazione dei ROS, i processi infiammatori coinvolti nella neuropatia, le vie nocicettive per il controllo del dolore e le principali vie coinvolte nei processi di protezione della guaina mielinica e di formazione dei neuriti [51].
[0157] 4.4 Vitalit? delle cellule
[0158] Il kit per il test tossicologico in vitro MTT ? stato eseguito su una piastra a 96 pozzetti per determinare la vitalit? cellulare, seguendo un protocollo classico riportato in letteratura [49]. L'assorbanza di tutti i campioni solubilizzati (trattati e non trattati) ? stata misurata a 570 nm con correzione a 690 nm mediante uno spettrofotometro (Infinite 200 Pro MPlex, ) e i risultati sono stati espressi confrontando i dati con il campione di controllo (campioni non trattati definiti come linea 0%) e riportati come media di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0159] 4.5 Produzione di ROS
[0160] La produzione di ROS ? stata quantificata analizzando la riduzione del citocromo C secondo un protocollo standard [49]. L'assorbanza ? stata misurata a 550 nm mediante uno spettrofotometro (Infinite 200 Pro MPlex, Tecan, M?nnedorf, Svizzera). Il rapporto di O2 ? stato espresso come media ? SD (%) di nanomoli di citocromo C ridotto per microgrammo di proteina rispetto al controllo (campioni non trattati) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplo.
[0161] 4.6 Modello di barriera intestinale in vitro
[0162] ? stato creato un modello di barriera intestinale in vitro, seguendo un protocollo standard riportato in letteratura, utilizzando il sistema Transwell? per valutare se le sostanze utilizzate possono attraversare la barriera intestinale [49, 54] seguendo il protocollo approvato dall'Agenzia Europea dei Medicinali (EMA) e dalla Food and Drug Administration (FDA) [55, 56] che viene utilizzato per prevedere l'assorbimento, il metabolismo e la biodisponibilit? di diverse sostanze dopo l'assunzione orale nell'uomo. In breve, cellule CaCo-2, piastrate su inserti Transwell? , sono state mantenute in un terreno completo cambiato ogni due giorni, sia nella parte basolaterale che in quella apicale, per 21 giorni prima della stimolazione [49]. I valori di TEER sono stati valutati utilizzando elettrodi a bacchetta EVOM3 e STX2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) durante l'intero periodo di maturazione, per valutare la formazione di epitelio intestinale maturo e un corretto meccanismo paracellulare. L'analisi dell'assorbimento ? iniziata il 21? giorno quando i valori di TEER erano ? 400 ?cm<2 >[57]. Sul lato apicale, prima della stimolazione, il terreno di coltura ? stato verificato essere a pH 6,5, che assomiglia al pH del lume dell'intestino tenue. Al contrario, il pH 7,4 sul lato basolaterale rappresentava il sangue [49, 58]. Le cellule sono state stimolate con tutte le sostanze da 2 a 6 ore, prima delle successive analisi. In ogni momento, l'assorbimento ? stato rilevato utilizzando un tracciante fluorescente alla concentrazione di 0,04% (Santa-Cruz, CA, USA [59]). La quantit? di fluoresceina trasportata ? stata misurata a 37 ?C incubando le cellule CaCo-2 per 40 minuti alla concentrazione sopra indicata. La fluorescenza ? stata rilevata con uno spettrofotometro a fluorescenza (lettore di piastre multilabel, VICTOR X4, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) alle lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 490/514 nm. I risultati sono espressi come proporzione (%) della quantit? originale che permea le cellule. Il tasso di permeazione [nmol min (mg di proteina)], J, ? stato calcolato come segue:
[0163] J = Jmax [C]/(Kt [C])
[0164] dove:
[0165] - Jmax: massimo tasso di permeazione;
[0166] - [C]: concentrazione iniziale di fluoresceina;
[0167] - Kt: costante di Michaelis-Menten.
[0168] I risultati sono espressi come media ? SD (%) e sono stati analizzati controlli negativi senza cellule per escludere l'influenza della membrana Transwell?.
[0169] 4.7 Analisi delle TJs
[0170] I lisati di CaCo-2 sono stati utilizzati per analizzare l'attivit? di occludina mediante il kit ELISA Human Occludin (OCLN) , l'attivit? di claudina-1 mediante il kit ELISA e l'attivit? di Zona Occludens 1 (ZO-1) mediante il kit ELISA Human tight junction protein 1 (TJP1)
[0171] seguendo le istruzioni del produttore [49]. L'assorbanza ? stata misurata con uno spettrofotometro (Infinite 200 Pro MPlex, ) a 450 nm. I dati sono stati ottenuti confrontandoli con la curva standard (da 0 a 1500 pg/mL per occludina, da 0 a 1000 pg/mL per claudina-1 e ZO-1). Sono stati espressi come percentuale (%) rispetto al controllo (linea 0) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplo.
[0172] 4.8 Allestimento delle co-colture 3D EngNT
[0173] L'interazione tra le linee cellulari RSC96 e PC12 ? una caratteristica fondamentale per imitare in vitro l'ambiente del nervo periferico, rigenerare i neuriti e sostenere le cellule di Schwann [51, 60, 61]. In base alla letteratura, ? stato preparato il modello di tessuto nervoso 3D [51]. Brevemente, 1 mL di una soluzione contenente 80% (vol/vol) di collagene di coda di ratto di tipo I (2 mg/mL in acido acetico 0,6%, ), 10% (vol/vol) di Minimum Essential Medium (MEM, ), 5,8% (vol/vol) di soluzione neutralizzante e 4,2% di sospensione di cellule di Schwann (4 x 10<6 >cellule RSC96 per 1 mL di gel) ? stato aggiunto a uno scaffold rettangolare con dimensioni di 16,4 mm x 6,5 mm x 5 mm. Una volta indurito, il gel ? stato immerso in 10 mL di DMEM e incubato a 37 ?C con il 5% di CO2 per 24 ore per consentire l'autoallineamento cellulare; al termine, il gel ? stato stabilizzato mediante compressione plastica (120 g di peso per 1 minuto). Ogni gel cellulare allineato e stabilizzato ? stato tagliato in segmenti uguali in base ai campioni da trattare. Ogni segmento di gel ? stato trasferito in una piastra da 24 pozzetti e 1 x 10<5 >di PC12 sono state seminate sopra ogni segmento per stabilire le co-colture; questo passaggio ? fondamentale per consentire l'estensione dei neuriti attraverso il piano orizzontale che segue i gel di Schwann allineati. La piastra da 24 pozzetti contenente i gel ? stata mantenuta in un incubatore a 37?C con il 5% di CO2 e il 95% di umidit? per consentire l'attaccamento delle cellule neuronali al gel di collagene; successivamente, a ciascun pozzetto ? stato aggiunto 1 mL di terreno di coltura (DMEM, ) integrato con il 10% (vol/vol) di FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 ?g/mL di streptomicina.
[0174] 4.9 Test ELISA per TNF?
[0175] La quantificazione del TNF? ? stata ottenuta utilizzando il kit TNF? ELISA (Merck Life Science, Roma, Italia) secondo le istruzioni del produttore [62]. L'assorbanza dei campioni ? stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di piastre (Infinite 200 ProMPlex, ). I dati sono stati ottenuti e confrontati con la curva standard (da 0 a 6000 pg/mL) e i risultati sono stati espressi come media ? SD (%) rispetto al controllo (linea 0) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplo.
[0176] 4.10 Test di Beta-NGF umano
[0177] Il kit ELISA beta-NGF di ratto ? stato utilizzato in lisati cellulari seguendo le istruzioni del produttore [63]. In breve, 100 ?L di campioni diluiti sono stati incubati per una notte a 4 ?C, lavati quattro volte con tampone di lavaggio 1?, quindi 100 ?L di anticorpo di rilevazione sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Quindi, i pozzetti sono stati lavati quattro volte e 100 ?L di streptavidina-HRP e la piastra sono stati incubati per 45 minuti. Dopo l'incubazione, i pozzetti sono stati nuovamente lavati e sono stati aggiunti 100 ?L di substrato TMB. Infine, la piastra ? stata incubata per 30 minuti a temperatura ambiente e al buio, con una leggera agitazione, e la reazione ? stata fermata con 50 ?L di soluzione di stop. L'assorbanza ? stata misurata mediante spettrometro a 450 nm (Infinite 200 Pro MPlex, ) ed espressa come pg/mL rispetto a una curva standard (compresa tra 15 e 15.000 pg/mL). I risultati sono stati riportati come media ? SD (%) rispetto al controllo di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0178] 4.11 Attivit? di ERK/MAPK
[0179] I lisati di PNS sono stati utilizzati per valutare l'attivit? di ERK/MAPK utilizzando InstantOneTM ELISA seguendo le istruzioni del produttore [59]. A ciascun pozzetto di InstantOne ELISA microplate strips sono stati aggiunti 50 ?L di ciascun lisato. Il cocktail di anticorpi e le strisce per micropiastre sono state quindi incubate per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore per micropiastre. Dopo 20 minuti di applicazione del reagente di rilevazione, la reazione ? stata interrotta aggiungendo una soluzione di stop. Per misurare le strisce ? stato utilizzato lo spettrometro Infinite 200 Pro MPlex , che opera a una lunghezza d'onda di 450 nm. L'assorbanza media (%) rispetto al controllo ? stata utilizzata per rappresentare i risultati.
[0180] 4.12 Test ELISA per interleuchina-2
[0181] La quantificazione dell'interleuchina-2 ? stata determinata utilizzando Rat Interleukin-2 (IL-2) ELISA Kit secondo le istruzioni del produttore su lisati cellulari [64]. L'assorbanza ? stata letta a 450 nm con uno spettrofotometro (Infinite 200 ProMPlex,
[0182] ). ? stata tracciata una curva standard che mette in relazione l'intensit? del colore (OD) con la concentrazione degli standard (da 31,25 a 2000 pg/mL) e i risultati sono stati espressi come media ? SD (%) rispetto al controllo (0 linee) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0183] 4.13 Test ELISA per NAV1.7
[0184] La quantificazione di NAV1.7 ? stata determinata utilizzando SCN9A / Nav1.7 ELISA Kit su lisati di co-cultura secondo le istruzioni del produttore. In breve, 100?L di ciascun campione sono stati incubati per 2h a 37?C in una piastra pre-rivestita; successivamente, i campioni sono stati rimossi e sono stati aggiunti 100?L di Reagente di Rivelazione A per 1h a 37?C. Dopo aver lavato la piastra 3 volte, sono stati aggiunti 100?L di Reagente di rivelazione B per 1h a 37?C. La piastra ? stata nuovamente lavata 5 volte prima di aggiungere 90?L di substrato TMB. Dopo 20 minuti a 37?C, sono stati aggiunti 50 ?L di soluzione di stop a ciascun pozzetto e l'assorbanza ? stata letta a 450 nm con uno spettrofotometro (Infinite 200 ProMPlex, ). ? stata tracciata una curva standard che mette in relazione l'intensit? del colore (OD) con la concentrazione degli standard (da 0,312 a 20 ng/mL) e i risultati sono stati espressi come media ? SD (%) rispetto al controllo (0 linee) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0185] 4.14 Test ELISA per NAV1.8
[0186] La quantificazione di NAV1.8 ? stata determinata utilizzando il Mouse Sodium Channel Protein Type 10 Subunit Alpha (SCN10A) ELISA Kit (MyBiosource, ) su lisati di co-cultura secondo le istruzioni del produttore [65]. L'assorbanza ? stata letta a 450 nm con uno spettrofotometro (Infinite 200 ProMPlex, ). ? stata tracciata una curva standard che mette in relazione l'intensit? del colore (OD) con la concentrazione degli standard e i risultati sono stati espressi come media ? SD (%) rispetto al controllo (line 0) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0187] 4.15 Test ELISA per acido ?-aminobutirrico (GABA)
[0188] Il Rat GABA (?-aminobutyric acid) ELISA Kit
[0189] su lisati cellulari ? stato eseguito seguendo le istruzioni del produttore [66]. L'assorbanza ? stata misurata a 450 nm mediante un lettore di piastre (Infinite 200 ProMPlex,
[0190] ). I dati sono stati ottenuti e confrontati con la curva standard (da 6 a 400 pg/mL). I risultati sono stati espressi come media ? SD (%) rispetto al controllo (line 0) di cinque esperimenti indipendenti in triplicato.
[0191] 4.16 Attivit? di p75 mediante test ELISA per NGFR
[0192] Secondo le istruzioni del produttore, il Rat NGFR ELISA kit
[0193] ? stato utilizzato su lisati cellulari [67]. La piastra ? stata letta immediatamente a 450 nm con uno spettrofotometro (Infinite 200 ProMPlex,
[0194] ). I dati sono stati ottenuti e confrontati con la curva standard (da 0,312 a 20 ng/mL). I risultati sono stati espressi come media ? SD (%) rispetto al controllo (line 0) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0195] 4.17 Test ELISA per MPZ
[0196] Secondo le istruzioni del produttore, la produzione di MPZ ? stata determinata utilizzando un Rat ELISA kit in lisati cellulari [67]. La piastra ? stata letta a 450 nm con uno spettrofotometro (Infinite 200 ProMPlex, ). La concentrazione ? stata espressa come ng/mL rispetto a una curva standard (compresa tra 0,06 e 18 ng/mL) e i risultati sono stati riportati come media ? SD rispetto al controllo (line 0) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0197] 4.18 Test ELISA per NRG1
[0198] Secondo le istruzioni del produttore, il NRG1 Rat ELISA Kit ? stato utilizzato nei surnatanti delle colture cellulari [67]. La reazione enzimatica ? stata misurata con uno spettrofotometro (Infinite 200 Pro MPlex, ) a 450 nm. I risultati sono stati ottenuti confrontando i dati con la curva standard (da 0,156 a 10 ng/mL). Sono stati espressi come percentuale (%) rispetto al controllo (line 0) di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0199] 4.19 Test ELISA per Recettore degli Estrogeni ?
[0200] Il Rat Estrogen Receptor ? (ER?) ELISA Kit (Cloud-Clone, ) ? stato utilizzato su lisati cellulari, secondo le istruzioni del produttore [68]. L'assorbanza ? stata misurata con uno spettrofotometro a 450 nm (Infinite 200 ProMPlex, ) ed espressa come pg/mL rispetto a una curva standard (compresa tra 0,312 e 20 ng/mL). I risultati sono stati riportati come media ? SD (%) rispetto al controllo di cinque esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato.
[0201] 4.20 Analisi statistica
[0202] L'analisi della varianza a una via (ANOVA) e i test post hoc di Bonferroni sono stati utilizzati per elaborare i dati acquisiti utilizzando il software statistico Prism GraphPad 9.4.1. Per confrontare i due gruppi ? stato adottato il test t di Student con due code. Per valutare i confronti tra gruppi multipli ? stata condotta un'ANOVA a due vie, seguita da un test Dunnett post hoc a due facce. Per esprimere tutti i risultati ? stata utilizzata la media ? SD di almeno cinque variabili indipendenti eseguite in triplicato.
[0203] 5. Conclusioni
[0204] In conclusione, questo studio ha dimostrato come le propriet? antiossidanti e antinfiammatorie dell'acido lipoico possano essere sostituite dall'uso di Gastrodina come alternativa. In particolare, la CI contenente Gastrodina (OXADIA<TM >) 25?M, Citicolina 250mM, Acetil-L-Carnitina 7,5?M e Vit. del Gruppo B 1 mg/ml ha dimostrato di essere un'alternativa adeguata ai comuni farmaci analgesici per alleviare il meccanismo alla base del dolore causato da PNI. Di conseguenza, i nostri risultati supportano per la prima volta il concetto che questa nuova formulazione pu? ridurre efficacemente la neuropatia modificando il meccanismo fondamentale del dolore stimolando i meccanismi di recupero delle cellule del PNS. Inoltre, la CI ha prevenuto il danno alle fibre motorie e il rallentamento della conduzione nervosa, ripristinando il neurotropismo alterato. In conclusione, lo studio attuale fornisce nuove conoscenze sugli effetti dei nutraceutici sui disturbi del dolore neuropatico e pu? essere considerato un trattamento innovativo e sicuro della neuropatia.
[0205] Abbreviazioni
[0206] 3D EngNT: tessuto neurale ingegnerizzato in 3D
[0207] ADE: evento avverso da farmaco
[0208] ADR: risposta avversa al farmaco
[0209] ANOVA: analisi della varianza a una via
[0210] ATCC: American Type Culture Collection
[0211] BDNF: fattore neurotrofico derivato dal cervello, brain derived neurotrophic factor CNS: sistema nervoso central, central nervous system
[0212] DMEM-Adv: Dulbecco's Modified Eagle's Medium Advance
[0213] DMEM: Dulbecco?s Modified Eagle?s Medium
[0214] ELISA: test di immunoassorbimento legato a un enzima, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EMA: European Medicines Agency
[0215] FBS: siero fetale bovino, fetal bovine serum
[0216] FDA: Food and Drug Administration
[0217] GABA: acido ?-aminobutirrico
[0218] GGF: fattore di crescita gliale 2
[0219] GLT: trasportatori di glucosio
[0220] HBA: alcool p-idrossi-benzilico
[0221] MEM: Minimum Essential Medium
[0222] NGF: fattore di crescita nervosa
[0223] OS: stress ossidativo, oxidative stress
[0224] PN: neuropatia periferica, peripheral neuropathy
[0225] PNI: lesione nervosa periferica, Peripheral Nervous Injury
[0226] PNS: sistema nervoso periferico, peripheral nervous system
[0227] RNS: specie reattive dell'azoto, reactive nitrogen species
[0228] ROS: specie reattive dell'ossigeno, reactive oxygen species
[0229] RPMI-Adv: Roswell Park Memorial Institute-1640 Advanced
[0230] TEER: resistenza elettrica transepiteliale
[0231] TJ: giunzione stretta
[0232] Vit. del gruppo B: Vitamine del gruppo B
[0233] ZO-1: Zona Occludens 1

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI
1. Un?associazione o una combinazione comprendente o, alternativamente, consistente di i) un estratto di Gastrodia elata e ii) almeno un ingrediente scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di citicolina e L-acetilcarnitina, e/o loro miscele.
2. La combinazione secondo la rivendicazione 1, in cui detto i) un estratto di Gastrodia elata comprende o consiste di gastrodina.
3. L?associazione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta associazione comprende, inoltre, almeno una vitamina del gruppo B, e/o loro miscele.
4. L?associazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detta almeno una vitamina del gruppo B ? scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina), vitamina B5 (acido pantotenico), vitamina B6 (piridossina), vitamina B7 (inositolo), vitamina B8 (biotina), vitamina B9 (acido folico), vitamina B12 (cobalamina) e loro miscele relative; preferibilmente ? scelta tra vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B5 (acido pantotenico), vitamina B6 (piridossina), vitamina B12 (cobalamina) e loro miscele relative.
5. La combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detta combinazione ? per uso in terapia; preferibilmente detta combinazione ? per uso in un metodo per la protezione della funzionalit? del sistema nervoso e/o per uso in un metodo per la prevenzione e/o trattamento delle neuropatie centrali e periferiche.
6. Una composizione comprendente un?associazione o una combinazione, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, ed almeno un eccipiente e/o un veicolo farmaceuticamente accettabile.
7. La composizione secondo la rivendicazione 6, in cui detta composizione comprende o, alternativamente, consiste di:
- da 10 mg a 1000 mg, preferibilmente da 50 mg a 500 mg, ancora pi? preferibilmente da 100 mg a 300 mg di estratto di Gastrodia elata, e
- da 50 mg a 500 mg, preferibilmente da 100 mg a 300 mg, ancora pi? preferibilmente da 150 mg a 250 mg di citicolina o un suo sale farmaceuticamente accettabile e/o loro miscele; e
- da 100 mg a 2.000 mg, preferibilmente da 200 mg a 600 mg, ancora pi? preferibilmente da 400 mg a 500 mg di L-acetilcarnitina o un suo sale farmaceuticamente accettabile e/o loro miscele, e uno o pi? eccipienti e/o veicoli farmaceuticamente accettabili.
8. La composizione secondo la rivendicazione 7, in cui detto estratto di Gastrodia elata comprende o consiste di gastrodina.
9. La composizione secondo la rivendicazione 7 o 8, in cui detta composizione pu?, inoltre, comprendere almeno una vitamina del gruppo B scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina), vitamina B5 (acido pantotenico), vitamina B6 (piridossina), vitamina B7 (inositolo), vitamina B8 (biotina), vitamina B9 (acido folico), vitamina B12 (cobalamina) e loro miscele relative; preferibilmente ? scelta tra vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B5 (acido pantotenico), vitamina B6 (piridossina), vitamina B12 (cobalamina) e loro miscele relative.
10. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-9, in cui detta composizione ? per uso in terapia; preferibilmente, detta composizione ? per uso in un metodo per la protezione della funzionalit? del sistema nervoso e/o per uso in un metodo per la prevenzione e/o trattamento delle neuropatie centrali e periferiche.
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