IT8048288A1

IT8048288A1 - Composto antibatterico antitumorale e procedimento per la sua preparazione.

Info

Publication number: IT8048288A1
Application number: IT1980A48288A
Authority: IT
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1979-04-02
Filing date: 1980-03-28
Publication date: 1981-09-28
Also published as: CA1165709A; IT8048288A0; IT1188917B; US4360458A

Description

DESCRIZIONE

a. corredo di una domanda di brevetto per invenzione avente per titolo:

"Composto antibatterico antitumorale e procedimento per la sua preparazione

RIASSUNTO

Nella presente invenzione viene descritto un composto antitumorale antibatterico indieato come-BBM-928 il quale viene prodotto mediante la fermentazione microbiologica in condizioni controllate usando una specie di actinomiceti. I componenti bioattivi del complesso hanno una pronunciata attivit? antitumorale e sono da moderatamente a debolmente attivi contro batteri gram-positivi e ad alimentazione ac da, ma praticamente inattivi contro batteri gramnegativi e funghi . Sulla base del tempo medio di soprav ivenza, il componente indicato con la sigla BBM-928A ? sostanzialmente pi? attivo della mitomicina C di un fattore da 10 a 300 volte contro i tumori dei topi impiantati in posizione intraperitoneale.

DESCRIZIONE DELLA INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un complesso nuovo antitumorale antibiotico e a proceterica relativamente debole in paragone con le actinoleucine che sono potenti antibiotici antibatterici.

Un complesso nuovo antitumorale antibiotico indicato con la sigla BBM-928 viene fornito dalla presente invenzione. Il complesso, che contiene almeno sei componenti, viene preparato ponendo in col tura un ceppo capace di produrre BBM-928 di actinomiceti (ATCC 31491) oppure un loro mutante in unmezzo nutritivo acquoso facendo impiego di o condizioni aerobiche sommerse. La presente invenzione inoltre si riferisce ad un procedimento per il recupero del complesso BBM-928 dal mezzo di coltura e alla separazione del complesso nei suoi componenti bioattivi mediante tecniche di distribuzione in controcorrente e tecniche cromatografiche.

L'ambito della presente invenzione compren de il complesso BBM-928 ed i componenti bioattivi BBM-928 A, B, C, D, E e F di questo. La presente invenzione inoltre in particolare fa riferimento ai componenti BBM-928 A, B, C e D in forme diluite, come concentrati veri ed in forma purificata.

La figura 1 ? lo spettro di assorbimento infraro sso di BBM-928A in bromuro di potassio,

La figura 2 ? lo spettro di assorbimento infrarosso di BBM-928B in bromuro potassico .

dimenti per la produzione, recupero e separazione nei componenti bioattivi.

Sulla base dei presenti dati spettrali e delle propriet? fisicochimiche disponibili attualmente, il complesso antibiotico antitumorale cui si riferisce la presente invenzione appare essere in relazione strutturale con il gruppo della chinossalina degli antibiotici come ad esempio la echinomicina, Dell, et al., J. Am. Chem. Soc.:, 97, 2497 (1975), lo chinomicine Shoji, et al., J. Antibiotics, 14A, 335 (i960 , e la triostina C, The Merck Index, nona edizione ,.9399? Tuttavia, il complesso antibiotico antitumorale ? differenziato da questi antibiotici per quanto riguarda i seguenti aspetti:

1. Il complesso della presente invenzione ed i suoi componenti contengono un nucleo della chinolina come cromoforo invece della chinossalina come nel gruppo delle actinoleucine degli antibiotici.

2. ?1 complesso della presente invenzione ed i suoi componenti non contengono zolfo in centrasto con la presenza di un ponte disolfurico ovvero tioacetalico nella struttura degli antibiotici di actinoleucina.

3. Il complesso della presente invenzione ed i suoi componenti mostrano una attivit? antibatla figura 3 ? Io spettro di assorbimento infrarosso di BBM-928C in bromuro potassico.

La fjgira 4 ?'l? spettro di assorbimento infrarosso di BBM-928D in bromuro potassico.

La figura 5 mostra lo spettro di risonanza magnetica protonica di BBM-928A disciolto in cloroformio deuterato usando TMS come standard interno determinato mediante spettrometro di risonanza magnetica nucleare ad una frequenza di 90MHz.

La figura 6 mostra lo spettro di risonanza magnetica protonica di BBM-928B disciolto in cloroformio deuterato usando TMS come standard interno determinato con uno spettrometro di risonanza magne tica nucleare a frequenza di 90 MHz.

La figura 7 mostra lo spettrco di risonanza magnetica protonica di BBM-928C disciolto in cloroformio deuterato usando TMS come standard interno determinato con uno spettrometro di risonanza magnetica nucleare a frequenza di 90 MHz.

La figura 8 mostra lo spettro di risonanza magnetica protonica di BBM-928D disciolto in cloroformio deuterato usando TMS come standard interno determinato con uno spettrometro di risonanza magnetica nucleare a frequenze di 90 MHz.

aL aresente invenzione pi? in particolare si riferisce ad un complesso nuovo antitumorale antibiotico il quale arbitrariamente ? indicato qui con la sigla BBM-928j. Il complesso secondo quanto si ritiene ? in relazione strutturale con il gruppo della actinoleucina degli antibiotici ed ? formato dall fermentazione di un ceppo di actinomiceti tuttora non identificato . Un ualunque ceppo di actinomiceti capace di formare BBM-928 nel mezzo di coltura pu? essere usato con il microrganismo di produzione preferito che ? indica come specie actinomiceti , ceppo Fo . G455- 101 nella collezione di colture Bristol-Banyu li microrganismo veniva isolato da un campione di terreno raccolto nelle isole Filippine , ed era stato depositato nella collezione di colture tipo americane dei microrganismi come ATCC 31491 .

Il complesso originale antibiotico antitumorale della presente invenzione che ? indicato qui possiede almeno sei componenti indicati come BBM-928 A? B, C, D, E e F. I componenti A? B, C e D del complesso BBM-928 sono stati isolati in forma cristallina con le strutture chimiche dei componenti A? B e C identificate . Il complesso (ed i componenti individuali) della presente invenzione hanno propriet? antitumorali antibatteriche . Per quanto riguarda l ? attivit? antibatterica, il complesso ed i suoi componenti individuali sono utili come supplementi nutritivi nei mangimi e come agenti terapeutici nella cura delle infezioni batteriche nei mammiferi. Inoltre , gli antibiotici sono utili nella pulitura e nella sterilizzazione delle vetrerie di laboratorio e negli strumenti chirurgici? e possono essere impiegati in combinazione con saponi, detersivi e soluzioni di lavaggio per propositi di igiene e sanit?. Per quanto riguarda gli effetti antitumorali, il complesso ed i suoi componenti individuali sono particolarmente utili contro una anrpa variet? di tumori dei topi impiantati in posizione intraperitoneale .

Specie actinomiceti, ceppo No . G455-101.

La seguente ? una descrizione generale del microrganismo preferito capace di produre il complesso antitumorale antibiotico BBM-928. Le osservazioni venivano fatte con riguardo alle caratteristiche della coltura, fisiologiche e morfologiche degli organismi daccordo con procedimenti standard tassonomici per esempio Shirling, et al., Int . J. Syst. Bacteriol.

16, 313 (i960) e Lechevalier, et al., Biol. Actinomycetes Related Org. rij 78 (1976).

Micromorfologia - Il ceppo Ho. G455-101 forma sia mieeli di substrato che miceli aerei, ed il micelio di substrato ? ben sviluppato , lungo e ranificato (larghezza da 0, 5 a 0,8 micron) . La frammentazione distinta del micelio di substrato non viene osservata. Ih maniera dissimile , la specie ordinaria di Streptomyces , ceppo 0455- 101 , reca soltanto miceli corti o rudimentali, aerei , oppure non forma miceli in mezzi di agar. Catene a spore brevi o lunghe vengono prodotte nel micelio aereo , che contengono di 2 a 50 spore ovali in una catena (per la massima p?rte da 5 a 20 spore ) . Le c?ene delle spore sono diritte , flessuose ovvero di sagoma a cappio . Le? spore sono sferiche (0, 3-0, 4 micron) , ovali o cilindriche (0, 3 x 1 , 5-3,0 micron) ed hanno superficie levigata. Le spore sono spesso separate da ife vuote . Uh vescicolo simile ad uno sporangio , amorfo, e racchiude catene a spore corte ed arrotolate , viene osservato occasionalmente sul micelio aereo .

Composizione della parete cellulare e componenti zuccherini della cellula intera - La parate cellulare del ceppo G455-101 contiene l ' acido mesco-diamminopimelico ma manca di glieina. L'idrolizzato cellulare integrale mostra la presenza di glucosio, mannosio e madurosio (3-0-metil-D-galattosio ) . La composizione sopra menzionata di parete cellulare ed i componenti zuccherini della cellula integrale indicaho che il ceppo G455-101 ? una specie di actinomiceti del tipo a parete cellulare IIIB.

Caratteristiche colturali e fisiologiche. Il ceppo G455-101 cresce abbondantemente, forma un micelio aereo da rosa a rosa grigiastro, e produce un pigmento rossastro insolubile nell'acqua, nei mezzi di agar'ricchi dal punto di vista nutritivo, come ad esempio agar di estratto di lievito-estratto di malto, e agar di farina di avena. Tuttavia, negli agar di sale inorganico-amido, agar di glicerolo-asparagina e agar di tirosina, esso da uno scarsa crescita, forma micelio aereo bianco o beige, rudimentale, e produce una piccola quantit? di un pigmento rossastro. Il pigm?nto melanoide non viene prodotto negli agar di peptone-lievito-ferro e agar di tirosina. Il nitrato viene ridotto a nitrito. Esso cresce ?bbondantemente a temperature di 28?C, 37?C e 45?C, ma non cresce a 10?C ovvero a temperatura di-50?C. Pentosi ?d esosi sono bene utilizzati dal ceppo. Le caratteristiche di coltura e fisiologiche del ceppo G455-101 sono mostrate nelle tabelle 1 2 rispettivamente. La utilizzazione delle sorgenti di carbonio ? mostrata in tabella 3

(segue tabella 1 )

TABELLA 1

? TABELLA ? (continuazione )

* : Osservato dopo incubazione a 37 ?C per 3 settimane

** : Abbreviazione: G - crescita

colore sul rovescio del micelio di substrato A - micelio aereo

pigmento diffusibile

(segue tabella 2)

TABELLA 2

I . ; i !

TABELLA 3

Mezzo basale PG: mezzo inorganico di Pridham-Gottlieb, supplementato con estratto di lievito allo 0,1% Lm: mezzo organico di Luedemann Tempo di incubazione: 2 Settimane a 37?C.

E? sottinteso che la produzione del complesso BBM-928 cui si riferisce la presente invenzione

non ? limitata alle particolari specie di actinomiceti corrispondenti al ceppo No. G455-101 descritte dalle caratteristiche di crescita e microscopiche

che sopra sono state riportate. Queste caratteristiche sono date soltanto per propositi di carattere illustrativo e la presente invenzione contempla l'impiego di ceppi o mutanti prodotti dagli organismi che sopra sono stati descritti con mezzi convenzionali

gi? noti nel ramo relativo come ad esempio la esposizione a raggi X, al raggi ultravioletti, alla iprite azotata, la esposizione ai saggi, e simili, che

sono capaci di produrre il complesso BBM-928 oppure i suoi componenti individuali.

Prep arazione del BBM-928 antitumorale antibiotic Il procedimento cui si riferisce la presente invenzione per la produzione del complesso natitumor ale antibiotico BBM-928 comprende la coltivazione mediante fermentazione degli actinomiceti,

ceppo No. G455-101 in soluzione acquosa contenente

una sorgente di carbonio assimilabile ed una sorgente di azoto assimilabile in condizioni aerobiche sommerse finch? viene impartita la detta soluzione

una attivit? sostanziale antitumorale antibiotica.

Procedimenti cavenzionali di fermentazione sono impiegati nel coltivare il ceppo di actinomiceti No. G455-101. I mezzi che sono utili per la produzione degli agenti antibiotico antitumorali della presente invenzione includono una sorgente assimilabile di. carbonio come ad esempio amido, glucosio, destrina, maltosio, lattosio , saccarosio, fruttosio, mannosio, melasse , glicerolo e simili. Il mezzo nutritivo dovrebbe an~

che contenere una sorgente di azoto assimilabile come ad esempio proteina, idrolizzato di proteina, polipeptidi, amminoacidi, liquidi di fermentazione del granturco, caseina, urea e simili come anche sali inorganici nutritivi i quali forniscono gli anioni inorganici ed i cationi inorganici come ad esempio potassio, sodio, ammonio, calcio, solfato, carbonato, fosfato, cloruro, nitrato e simili.

Nel produne il compiesso BBM-928, una qualunque temperatura che possa condurre ad una crescita soddisfacente dell'organismo pu? essere impiega-!ta. le temperature varianti a circa 20?C a 45?C sono impiegabili con una temperatura preferita per la crescita ottimale dell'organismo che varia da circa

28?C a 34?C, con un intervallo di temperature da 30

a 32?C assai preferito. La produzione massima del complesso BBM-9 28 viene in generale ottenuta in un

tempo da circa 4 a 6 giorni . Si impiegano procedimenti di carattere convenzionale nel periodo di fermentazione . Per esempio , la preparazione di piccole quantit? viene convenientemente condotta in palloni agitati ovvero mediante colture superficiali . La preparazione di grandi quantitativi viene di preferenza condotta in condizioni di coltura aerobica sommersa in recipienti sterili . Con la fermentazione in recipiente , un mezzo di inoculazione vegetativo viene per primo prodotto in un brodo nutritivo mediante inoculazione della coltura del brodo con una spora protendente dall ' organismo in modo da fornire una coltura di inoculazione attiva giovane che viene poi asetticamente trasferita al mezzo costituito dal recipiente di fermentazione . La gassatura in recipienti e bottiglie pu? essere fornita forzando aria sterilizzata attraverso il mezzo di fermentazione ovvero sul mezzo stesso di fermentazione con ulteriore agitazione nei recipienti stessi , che viene fornita da un agitatore meccanico . Agenti antischiuma come ad esempio oli. di silicone , oliodi semi di soia ed olio di lardo possono anche essere aggiunti a seconda di quanto ? Necessario .

I livelli di antibiotico nel brodo di fermentazione ovvero gli estratti del complesso BBM-928 possono essere determinati mediante il saggio di diffusione su agar e disco di carta usando Sarcina lutea come organismo diprova ed impiegando agar nutritivo come mezzo di assaggio. Il pH viene regolato alvalore di 9 ,0 per la sensibilit? ottimale del sistema di saggio che viene usato per determinare la potenza ottimale del brodo.

Il complesso BBM-928 viene isolato dal brodo di fermentazione con mezzi di carattere c?nvenzionale come ad esempio tecniche di estrazione con solvente. La purificazione viene convenientemente condotta mediante distribuzione in contro-corrente prep arativa e tecniche cromatografiche quali sono pi? completamente descritte negli esempi 2 e 3 pi? sotto riportati in modo da fornire i componente BBM-928 indicati con le sigle? A, B, C, D, E e F.

Propriet? chimico-fisiche dei componenti BBM-928A? B? C e D di cui all?esempio 3

I componenti individuali di BBM-928 mostrano solubilit? e reazioni colorate analoghe l'uno all'altro. Per esempio? essi sono facilmente solubili in cloroformio e cloruro di metilene, debolmente solubili in benzene, etanolo, metanolo e n-butanolo ed insolubili nell'acqua ed in n-esano. Le reazioni positive con cloruro fenico e reagenti di Ehrlich sono ottenute con reazioni negative per quanto riguarda le reazioni di Tollens? Sakaguchi e con la nimidrina.

Le propriet? chimico-fisiche caratteristiche dei componenti BBM-928 dell'esempio 3 sono mostrate in tabella 4-TABELLA 4 ? ;

Propriet? chimico-fisiche dei componenti BBM-928A, B, C e D

Gli spettri nell 'infrarosso ( IR) di risonanza magnetica nucleare (NMR) dei componenti A, B, C e D sono mostrati nelle figure ?a 1 a 4 e nelle fi- , gure da 5 ad 8 rispettivamente dei disegni allegati . Gli spettri di risonanza magnetica nucleare di BBM-928A (figura 5) ? BBM-928B (figura 6) , e BBM-928C (figura 7) sono molto analoghi l 'uno all 'altro con la sola differenza che ? costituita dalla presenza di gruppi acetilici nei componenti A ( ?: 2,03 ppm, 2 equivalenti molari) e B ( 6: 2,05 ppm, 1 equivalente molare) ma non in C . Per acetilazione con lo impiego, di anidride acetica in piridina, si introducevano 2, 3 e 4 equivalenti molari di gruppo acetilico nei componenti BBM-928A? B e C rispettivamente . I tre prodotti di acetilazione cos? ottenuti mostravano propriet? identiche per quanto riguardava la cromatografia su strato sottile , lo spettro ultravioletti , infrarossi e di risonanza magnetica nucleare , indicando ehe BBM-928A ? un derivato monoacetilico di BBM-928B ed un derivato diacetilico di BBM-928C.

L'idrolisi acida di BBM-928A produceva cinque frammenti solubili in n-butanolo, capaci di assorbire l ' ultravioletto ( I, II, III, IV e ?) e cinque sostanze solubili nell ' acqua, positive alla nimidrina (NPS-1 , 2, 3, 4 e 5 ) ? Queste ultime sostanze venivano separate mediante cromatografia su resine Dowex 50 x 4 ed identificate come costituite dai se guenti animino acidi

cromato grafia su strato sottile , con pH di gel di silice

S-123J soluzione al di acetato di ammonio-metano lo- 10% di ammoniaca. (9/1?/1 )

I cinque frammenti capaci di assorbire nel 1 ' ultravioletto sopra indicati sono mostrati dalle seguenti strutture

(seguono formule )

Per idrolisi acida (con HCl 6N) i frammenti ?,??, III e V davano i seguenti prodotti di degradazione :

(segue tabella)

Ser: aerina

HM-Val: beta-idrossi-N-metilvalina Sar: sarcasina

La idrolisi basica di BBM-928A ovvero BBM-928C con soluzione 0 , IN di idrossido sodico a 25?C per

3 ore fornisce il frammento VI (abbrevi azioni Ser, HM-Val , e Sar sono come gi? sopra stabilito , con Gly che rappresenta la glicina ed il simbolo "X" che rappresenta una parte non assegnata)

rammento VI

Trattand? il frammento VI con HC1 0, 1N a temperatura di 110?C per 1 ora, si ottiene il frammento VII pi? HM-Val .

Frammento VII

Trattando il frammento VI con NaOH Q, 1N a emperatura di 37?C per 40 ore , si ottiene il frammento Vili pi? frammento I.

Frammento Vili

Trattando il frammento VII con HaOH 0, 1N a temperatura di 37?C per 40 ore? si ottiene il frammento IX pi? frammento I.

Frammento IX

La parte non assegnata (x) possi?de formula molecolare di C_H,-N 0 (in forma peptidica) sulla base della microanalisi del' frammento IX ed altri frammenti peptidici contenenti (x) e l ? analisi spet trale pi? sotto esposta sommariamente:

Secondo i dati spettrali per i frammenti VIII_ e IX ed un protone a 360 MHz di risonanza magnetica nucleare di BBM-928 A dell 'esempio 4, la parte X di ammino acido non assegnato sembra e ssere meglio rappresentata dalla seguente st ruttura della tetraidropiridazina:

Sulla base dei risultati degli esperimenti di degradazione sopra descritti , dei dati spettrali, della microanalisi e delle det erminazi oni di peso mo~ lecolare, le seguenti strutture sono ritenute quelle che meglio rappresentano BBM-928A, B e C;

HM-Val : be ta- idrossi-N-metilv?lina Attivit? antimicrobica

L' attivit? antimicrobica dei componenti BBM-928 veniva determinata contro una ampia variet? di batteri e funghi mediante il metodo della diluizione in serie su agar in agar nutritivo pH 7 > usando un apparecchio di multi-inoculazione di Steer. Le dimensioni del mezzo di inoculazione venivano standardizzate cos? da applicare una aliquota del volume di 0,0025 mi degli organisi da sottoporre al saggio contenenti circa cellule/ml per tutti i batteri e funghi eccetto i batteri fissi con acido per cui una sospensione di 10 cellule/ml. veniva usata. Le concentrazioni inibitrici minime (MIC) determinate dopo incubazione per una notte a 37 ?C sono mostrate in tabella 5? Come si vede qui, i componenti BBM-928 sono da moderatamente a debolmente attivi contro i bat teri gram -positivi e fissi con acido ma praticamente inattivi contro batteri e funghi gram-negativi .

L'attivit? della induzione dei prof agi in un batterio lisogeno ( ILB) era determinata per i componenti BBM-928. Nessuna attivit? significativa ILB veniva dimostrata con i componenti BBM-928 A? B e C sino ad una concentrazione di 100 microgrammi/ml .

TABELLA 5

Attivit? antimicrobica in vitro dei componenti BBM-928 contro i batteri aerobici

Attivit? antitumorale

Prove di paragne dei componenti BBM-928 A, mitomicina C per attivit? antitumora le venivano condotte con i tumori impiantati in posi melanoma B16, carcinoma del polmone di Lewis (IL) ? e asciti di sarcoma 180 ( S180) . Le soluzioni di prova dei componenti BBM-928 in soluzione slina allo 0,9$ contenenti dimetilsolfossido 10 % e mitomicina C in soluzione salina allo 0,9% venivano somministrate una Volta al giorno in accordo con i programmi di dosaggio varianti da un trattamento singolo in un giorno solo a trattamenti giornalieri multipli . Variando il dosaggio , si determinava la dose minima effettiva (MED) che forniva un valore del tempo medio di soprav Vivenza per gli animali trattati almeno 1 , 25 volte maggiore di quello di un gruppo di controllo . Questo livello di attivit? ? considerato nella misura della attivit? antitumorale significativa. I risultati sono mostrati in tabella 6 insieme con i rapporti di attivit? calcolati che illustrano il fatto che BBM-928A ? notevolmente pi? attivo della mitomicina C di un fattore variabile da 10 a 300 in dipendenza dal ceppo tumorale e dal programma di dosaggio . I valori LD50 intraperitoneale dei componenti BBM-928 A, B, C e D della mitomicina C determinati mediante il metodo di Van der Waerden, Arch. Expt . Path. Pharmak, 195 , 389 ( 1940 ) , sono anche mostrati in tabella 6.

(segue tabella 6)

TABELLA 6

Attivit? antitumorale e tossicit? di BBM-928A, B, C e D e della mitomicina C

?

a. trattamento singolo il giorno 1 .

b. trattamenti giornalieri il giorno 1 e il giorno 9.

ESEMPIO 1 .

Produzione di complesso BBM-928

Fermentazione con agar - Una coltura inclinata di agar ben cresciuta di un ceppo di specie G455-101 di actinomiceti viene usata per inoculare un mezzo vegetativo contenente amido solubile al 2%, 1% di glucosio , 0, 5% di Pharmamedia, 0, 5% di estratto di lievito , 0, 5% di NZ-amina (tipo A) e 0, 1% di CaCO3 con il pH che viene regolato al valore di 7,2 prima della sterilizzazione . La coltura di inoculazione viene tenuta in incubatrice a 32?C per 72 ore su di un agitatore rotante (250 giri al minuto) e 5 ml del mezzo di crescita sono trasferiti sul pallone di Erlenmeyer del volume di 500 mi, contenente 100 ml

di mezzo di fermentazione composto da amido solubile al 2 %, 1% di Pharmamedia, 0,003# di ZnSO4.H2O e

3, 4% di CaCO3. La produzione del complesso di BBM-928 in generale raggiunge il valore massimo dopo circa cinque giorni di agitazione della coltura.

Fermentazione in recipiente - Una coltura di inoculazione viene agitata per 4 giorni in palloni Erlenmeyer e quindi inoculata fino al volume di

100 litri di mezzo di germinazione composto da 2,0% di farina di avena (Quaker Products, Australia), 0,5% di glucosio, 0,2% di lievito secco, 0,0008# di MnCl2.4H2O, 0,0007% di CuSO 4.7H 20, 0,0002% di ?nSO 4.7? 2O e 0, 0001% di FeS04.7H2O in un fermentatore costituito da un recipiente di inoculazione del volume di 200 litri che viene agitato alla velocit? di 200 giri al minuto a 30?C per 54 ore. Un volume di 15 litri della coltura di inoculazione viene poi inoculato in un volume di

170 litri di mezzo di fermentazione e contenente 2,0% di amido solubile , 1 ,0% di Pharmamedia, 0,003% di

Zn SO 4 7H20 e 0, 4% di CaCO un un fermentatore costituito da un recipiente del volume di 400 litri che viene fatto funzionare a temperatura di 30?C alla velocit? di 200 giri al minuto con una velocit? di gassatura di 150 litri ai minuto. Il pH del brodo gradualmente aumenta con il progredire della fermentazione raggiunge 8 > 4-8? 5 dopo 100-120 ore , nel quale momento si ottiene un picco della potenza antibi?tica di 300 mcg/m.

ESEMPIO 2

isolamento del complesso BBM-928 mediante estrazione con solv?nte

Il brodo raccolto ( 170 litri , ph 8, 5 ) dall 'esempio 1 viene filtrato con agente di illimpidimento . Si trova che l' attivit? ? presente sa nella massa agglomerata dei miceli che nel filtrato . La massa agglomerata dei miceli viene estratta due volte con una miscela solvente di acetone e metanolo ( l/l , 30 litri x 2) . Gli estratti sono combinati e quindi evaporati sotto pressione ridotta in modo da dare un concentrato acquoso il quale viene estratto con n-butanolo . Il filtrato costituito dal brodo viene estratto due volte con n-butanolo ( 40 litri x 2) . Concentrazione degli estratti combinati di n-butanolo sot to pressione ridotta e liofilizzazione del residuo forniscono un solido greggio in quantit? di 21 , 4 g.

Secondo la cromatografia su strato sottile effettuala come saggio? questo materiale ?. un complesso formato da tre maggiori componenti, A, E e C e tre minori componenti D, E e F aventi valori Rf come stabilito in tabella 7 qui sotto esposta.

TABELLA 7

Cromatografia su strato sottile di gel di silice sui componenti BBM-928

*: rivelazione mediante un dispositivo di scansione nell ' ultravioletto Shimadzu CS-910 a 345 nm **: miscela n-butanolo/metanolo/acqua (63/27/10) ***: miscela xilene/metiletilchetone/metanolo (5/5/1 ) .

ESEMPIO 3

Purificazione del complesso BBM-928

Il complesso greggio dell 'esempio 2 viene purificato mediante un apparecchio di distribuzione in controcorrente di preparazione (Mitamura? 100 mi per tubo) usando un sistema solvente formato da tetracloruro di carbonio/cloroformio/metanolo/acqua C 5/2/5/ 1 ) - Dopo 50 trasferimenti , i tiiL dal No . 5 al No * 20 sono combinati e concentrati in modo da dare 4, 4 g di una polvere di colore giallo pallido contenenti i componenti A, B, D, E, e F. Questa miscela viene disciolta in piccola quantit? di cloroformio e caricata, su di una colonna di gel di silice C-200 ( 500 ml) , che viene trattata preventivamente con acetato di etile . La colonna viene sviluppata con acetato di etile , con una quantit? crescente di metanolo ( 2-5% V/V ) e le frazioni vengono controllate mediante la densit? ottica a 345 nanometri . Il minore componente D viene eluito per primo con acetato di etile seguito dal componente A. I componenti E, B e F sono eluiti successivamente in questo ordine ad una concentrazione di metanolo pari al 3%. Ciascuna frazione contenente il componente appropriato viene evaporata sottopressione ridotta e quindi il residuo viene cristallizzato da una miscela di cloroformio/metanolo. Analogamente, il preparato greggio del componente C viene ottenuto dai tubi No . 21 fino al No. 35 della distribuzione in controcorrente sopra descritta. La purificazione del componente C viene condotta mediante la cromatografia su gel di silice e la cristallizzazione da cloroformio/metanolo. Le rese per i componenti A? B, C, D, E e F sono rispettivamente 988 mg, 421 mg, 848 mg, 130 mg, 119 mg e 114 mg ESEMPIO 4

Ulteriore purificazione del componente BBM-928A dell'esempio 3

Il saggio cromatografico su strato sottile del componente BBM-928A dell'esempio 3 (impiegando

un sistema costituito dal 10% di metanolo in toluene) indicava che il campione non era completamente omogeneo per il fatto di contenere un materiale aggiuntivo, che si muoveva appena alla testa del componente

BBM-928A* I seguenti stadi venivano condotti allo scopo di effettuare la purificazione.

(1) Il campione viene sottoposto a cromatografia su gel di silice usando un gradiente lineare di cloroformio, fino a 6% di metanolo-cloroformio.

le frazioni che venivano eluite tra 2,4 e 3,3% di metanolo/cloroformio (contenenti il componente BBM-928A

pi? una certa quantit? di contaminante) sono unite

in composizioni per lo stadio successivo.

(2) Si genera un gradiente concavo usando tre recipienti contenenti metanolo al 2%-toluene nei

primi due e metanolo al 6%-toluene nel terzo. La composizione proveniente dallo stadio 1 viene sottoposta a cromatografia (colonna di gel di silice) su

questo gradiente e fornisce cosi un minor componente il quale viene eluito per primo, subito seguito dal componente purificato BEM-928A (qui indicato come BEM-928Ap) .

Il peso molecolare BBM-928Ap come determinato mediante la spettrometria di massa con desorzione di campo, ? di 1427 corrispondente alla formula empirica C64H78H-140-24.-(peso molecolare 1427.417)

Analisi elementare (campioni essiccati a 100?C per 18 ore)

a.: per differenza.

b.: media di tre determinazioni

Claims

RIVENDICAZIONI

1 . Composto antitumorale antibiotico BBM-928A, che possiede le seguenti caratteristiche:

a) ? solubile in cloroformio e cloruro di metilene, leggermente solubile in benzene , etanolo , metanolo e n-butanolo , ed ? sostanzialmente insolubile in acqua e n-esano ;

b) d? una reazione positiva con cloruro ferrico e reagenti di Ehrlich ed una reazione negativa di Tollens, Sakaguchi e con la ninidrina;

c ) ? un agente antitumorale efficiente contro la leucemia P388, leucemia L1210, melanoma B16, ! cancro del polmone di Lewis, e tumori ascitici di sarcoma 18?, impiantati in posizione intraperitoneale nel topo ;

d) possiede un punto di fusione di 246-248?C;

e) possiede rotazione specifica

^

f ) possiede peso molecolare di 1427;

g) pos?ede una composizione approssimata elementare di 52,47% di carbonio, 5 ,48# di idrogeno , 13,819S di azoto, e 28, 24% di ossigeno;

h) mostra nella cromatografia su strato sottile di gel di silice un valore di Rf di 0,71 con

il sistema solvente n-butanolo-metanolo-acqua ( 63/27/10) , ed un valore Rf di 0,48 con il sistema solvente xilene-metiletilchetone-metanolo (5/5/ 1 ) ;

i ) per idrolisi acida, fornisce sostanze positive alla ninidrina, solubili in acqua, che includono beta-idrossi-N-metilvalina, glicina, serina e sarcosina;

( j ) produce per idrolisi con base il "frammento VI"

( segue formula)

Frammento VI

in cui Ser ? la serina? Gly ? la glicina, Sar ? la sarcosina, HM-Val ? la beta-idrossi-N-metlivalina ed il simbolo X rappresenta una parte di araminoacido;

(k) possiede un aspetto di assorbimento nell 'infrarosso in bromuro potassico sostanzialmente quale ? mostrato in figura 1 ; e

(l) quando viene disciolto in cloroformio deuterato , fornisce uno spettro di risonanza magnetica nucleare protonica sostanzialmente come ? mostrato in figura 5.
2. Antibiotico antitumorale della rivendicazione 1 in cui la parte di amminoacido X possiede formula empirica in forma di peptide .
3. Antibiotico antitumorale della rivendicazione 2 in cui la parte di amminoacido X nella forma peptidica radicale tetraidropiridasina della formula:
4. Composto antibiotico antitumorale della rivendicazione 1 avente la struttura:

in cui Ser ? la serina, Gly ? la glicina? Sar ? la sarcosina? HM-Val ? la beta-idrossi-N-metilvalina e

e sono radicali acetilici.
5. Composto antibiotico antitumorale BBM-928B avente un cromofoto di chinolina e produce , per idrolisi acida, componenti solubili in acqua che ind?dono la serina, glicina, sarcosina, e beta-idrossi-N-metilvalina che nella sua forma sostanzialmente pura possiede queste caratteristiche:

a) solubile in cloroformio e cloruro di metilene , lievemente solubile in benzene , etanolo. metanolo e n-butanolo, e sostanzialmente insolubile

in acqua e n-esano ;

b) fornisce una reazione positiva con cl?ruro ferrico e reattivi di Ehrlich ed una reazione negativa di Tollens, Sakaguchi e alla ninidrina;

c) ? un agente antitumorale efficiente contro la leucemia P388, impiantata in posizione intraperitoneale rei topo ;

d) possiede punto di fusione di 214-217?C; e) possiede rotazione specifica di

-74 0 (c 1 , CHCl3) ;

f) possiede una composizione elementare approssimata di 56, 14% di carbonio, 5, 29% di idrogeno, 12, 34 % di azoto , e 32, 23% di ossigeno ;

g) mostra nella cromatografia su strato sottile di gel di silice un valore Rf di 0,53 con il sistema solvente n-butanolo/metanolo/acqua ( 63/27/10) ed un valore Rf di 0, 26 come sistema solvente xilene/ metiletilchetone/metanolo ( 5/5/1 ) ;

h) possiede uno spettro di assorbimento nell ' infrarosso in bromuro potassico sostanzialmente come ? mostrato in figura 2; e

i) quando ? di sciolto in cloroformio deuterato fornisce uno spettro di risonanza magnetica nueare protonico sostanzialmente come ? mostrato in figura 6.
6. Composto della rivendicazione 5 avente la struttura:

(segue formula)

in cui Ser ? la serina, Gly ? la glicina, Sar ? la sarcosina, HM-Val ? la beta-idrossi-N-metilvalina e

R1 ? un radicale acetilico .
7. Composto antibiotico antitumorale BBM-928C avente un cromoforo chinolinico e che per idrolisi

acida produce componenti solubili nell?acqua che includono la serina? glicina, sarcosina, e beta-idrossi-N-metilvalina, che nella sua forma sostanzialmente pura possiede queste caratteristiche :

a) solubile in cloroformio e cloruro di metilene , lievemente solubile in benzene, etanolo , metanolo e n-butanolo , e sostanzialmente insolubile

in acqua e n-esano;

b) fornisce una reazione positiva con cloruro ferrico e reattivi di Ehrlich, ed una reazione', negativa ai reattivi di Tollens , Sakaguchi ? ed alla ninidrina;

c) ? un agente antitumorale efficiente con

tro la leucemia ?388, leucemia L1210, melanoma B16 , cancro del polmone Lewis , e tumori ascitici di sarcoma 180 impiantati in posizione intraperitonoale nel topo;

jl) possiede punto di fusione di 244- 248 ?C; e) possiede rotazione specifica di

-91? (c 1 , CHC13) ;

f) possiede peso molecolare approssimato di 1470;

g) possiede una composizione elementare approssimata di 51 ,77% di carbonio , 5 , 29% di idrogeno ? 13, 55% di azoto , e 23, 39% di ossido;

h) mostra nella cromatografia su strato sottile di gel di silice un valore Rf di 0, 27 con un sistema assorbente n-butanolo-metanolo-acqua (63/27/10) ed un valore Rf di 0,07 con il sistema solvente xilene-metiletilchetone-metanolo ( 5/5/1 ) ;

i) possiede spettro di assorbimento nell? infrarosso in bromuro potassico sostanzialmente quale ? mostrato in figura 3; e

3 ) quando viene disciolto in cloroformio deuterato fornisce uno spettro di risonanza magnetica nucleare protonico sostanzialmente quale ? mostrato nella figura 7.
8. Composto della rivendicazione 7 avente la struttura:

in cui Ser ? la serina, Gly ? la glicina, Sar ? la sarcosina , e HM-Val ? la beta-idrossi-N-metilvalina.
9. Antibiotico antitumorale BBM-928D avente le seguenti caratteristiche:

a) ? solubile in cloroformio e cloruro di metilene? lievemente solubile in benzene, etanolo, metanolo e n-butanolo, e sostanzialmente insolubile

in acqua e n-esano;

b) fornisce una reazione positiva con cloruro ferrico e reattivi di Ehrlich ed una reazione

negativa con reattivi di Tollens, Sakaguchi ed alla ninidrina;

c) ? un agente antitumorale efficiente contro la leucemia P388 impiantata in posizione intra-; peritoneale del topo;

d) possiede un punto di fusione di 224-227?C;

e) possiede rotazione specifica ?i

- 13? (c 1 , CHC13 ) ;

f) possiede una composizione elementare approssimata data da 50,75% di carbonio, 5 , 25% di idrogeno, 12,58% di azoto, 31 , 42% di oss?geno ;

g) mostra per cromatografia su strato sottile di gel di silice un valore Rf d? 0,73 con il sistema solvente n-butanolo/metanolo/acqua (63/27/10) ed un valore Rf di 0, 53 con il sistema solvente xilene/metiletilchetone/metanolo (5/5/ 1 )

h) possiede uno spettro nell infrarosso in bromuro potassico sostanzialmente quale mostrato in figura 4; e

i) quando viene disciolto in cloroformio deuterato fornisce uno spettro di risonanza magneticanucleare protonico sostanzialmente come ? mostrato in figura 8.
10. Procedimento di fermentazione per la produzione di antibiotico antitumorale complesso che comprende la operazione di porre in coltura un ceppo di actinomiceti, avente le caratteristiche del ceppo No .? G455-101 e in soluzione acquosa contenente la sorgente di carbonio assimilabile ed una sorgente di azoto assimilabile e condizioni aerobiche somme V'r? finch? il complesso BBM-928 prodotto impartisce attivit? sostanziale antitumorale antibiotica alla ta soluzione.
11. Procedimento della rivendicazione 10 che include lo stadio ulteriore di recuperare il complesso BBM-928 dal mezzo di coltura.
12. Procedimento della rivendicazione 10 che include lo stadio ulteriore di separare il complesso BBM-928 nei componenti A, B, C, D, E e F, in cui i detti componenti mostrano i seguenti valori Rf nella cromatografia su strato sottile di gel di silice: