IT8148565A1 - Metodo per la determinazione dell'attivita degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriali della glutammico ossalacetico transaminasi nel stero o plasma umano - Google Patents

Description

jDescr?zione dell ' invenzione avente per titolo:

'"METODO PER LA DETERMINAZIONE DELL'ATTIVIT?* DEGLI IS?ENZ1MI CITOPLASMATICO E MITOCONDK1ALE DELLA GLUTAMM3CO-OSSALACETICO ITRANSAMINASI NEL SIERO 0 PLASMA UMANO".

A nome: BIODATA S.p.A.

Con sede in Via Cilicia, 53 - ROMA _

j_ La presente invenzione riguarda un metodo per la determif ?

nazione_delle transaminasi utilizzabile nel campo della diagno-}

i

fctica clinica. , La glutammico-ossalacejtico transaminasi (L-aspartato:2-chetoglutarato, _aminotransferasi, EC 2.6.3.1.) siglata in letteratura con GOT, AST o AAT,_ esiste in due forme distinguibili blettroforeticamente con diversa localizzazione subcellulare: ?|L) un isoenzima cati.onico associato ai mitocondri (m-GOT) 2) un isoenzima anionico presente nel citoplasma (s-GOT).

; La misura dell<1>attivit? totale della GOT nel sangue ? am- ' i

piamente utilizzata per la diagnosi discriminante di infarto t

del miocardio, ed il suo livello di attivit? nei liquidi fisio-; l ?ogici ? stato utilizzato anche per la diagnosi di altre forme ;(

patologiche a carico del fegato o della muscolatura scheletrica

I metodi di determinazione attualmente in uso nella pra?

tica clinica consentono di misurare su campioni biologici 1'at?

tivit? totale dell'enzima, somma dei due isoenzimi.

! Ri sulta per? importante discrimi nare l ' attivit? relati va delle due forme isoenzimatiche della glutammicp-ossalacelico jtransaminasi al fine di possedere un, pi? sofisticato mezzo di indagine relativo allo stato di necrosi.tissutale.

i E' stato infatti notato per altri enzimi, quali la lattice delirogenasi e la creatina chinasi, che l'accurata determinai

fcione dell'attivit? relativa alle varie forme isoenzimatiche ponsente un maggior potere discriminatorio-nell'applicazione diagnostica.

1 metodi di dosaggio attualmente esistenti.per le due porme enzimatiche, citoplasmatica -e.mitocondriale, della-glu-T<? " ' ">

I _

tammico-ossalacetico.transaminasi sono basati su tecniche elettroforetiche, cromatografiche o.immunologiche che richiedono

Ii

?Ln genere la-preventiva separazione.di un isoenzima dall'altro.? <?>Pj

|. ,La presente invenzione ha per oggetto un nuovo metodo di 1 <_ . .. >determinazione-che consente di misurare singolarmente .1?at-? <^>

i!

tivit? dei due isoenzimi in campioni di siero o plasma, senza !

d.over ricorrere alla preventiva separazione degli stessi.

?

i : La,metodica ??essenzialmente basata sulla nota reazione

1 . . .

i

i

d?lia L-s?rina-O-solfato con la glutammico-ossalacetico trani

j

saminasi citoplasmatica porcina che, dopo periodi vari di ini

!

pubazione, viene inattivata mediante J.a formazionedi un .legame

^ovalente tra un derivato del substrato ed un gruppo reattivo

del sito attivo dell'enzima.(R.A. John, P. Fasella: "The reaction

of L-serine-O-sulfate with Aspartate Aminotransferase", Bio-

?hemistry, Voi. 8 n. 11, Novembre 1969J

corso,delle esperienze ?ffettuate si ? ri scontrato,

icontrariamente a.quanto, era da attendersij che 1 ?_condizi oni

_ idi . incubazi one per l ' inatti vazi one del ?' i so?nzima citopl asmati -

Jco umano in presenza di quello mitocondri?le non determinano i

alcuna perdi ta di attivit? di quest 'ultimo , <" >"

.. . . . . . . : . ! _ 1 _ftisul ta jp_ertant?_p?ssib<'>il e ,<! >medi ante nna determi n?zi one <j >_j_

<.>. <. " ? ' >f delT* attivit? GOT pres?nte nel plasma ? si ero prima -e dopo in- <1 >I <' >- - - ?.. <? >i <" >I !icubazione con L-seri.na-O-solfato. valutare nel_pri.mo ca.s.o.1*at-

tivit?-totale -somma -dei due isoenzimi e nel secondo caso (dopo.

incubazione con serina-O-solfato) l'attivit? del solo isoenzima

imitocondriale. Mediante semplice differenza si ottiene quindi <: >

?il'valore di attivit?-dell'isoenzima ci_toplasmatico.

-Si forniscono<'>qui di seguito, a scopo illustrativo, le

condizioni sperimentali di analisi per la determinazione del-

l'attivit? dei due-isoenzimi mi<'>tocondriale e citoplasmatico

ideila GOT:

; Per'l? determinazione nel siero -? plasma umano si procede;

<. >- .<.>_ - --- . - --j i ! jpreferibilmente utilizzando dueialiquote identiche di uno stesi-

iso campione, una delle quali serve per la determinazione del-

|1'attivit? totale (somma dei due isoenzimi) mentre dal1?altra,

|previa incubazione con serina-O-solfato, si ottiene il .valore

i

idei solo i soenzima mitocondri al e . i

i

!

j Da uno stesso campione di siero o plasma si prelevano e iI !si pongono in due provette diverse 0,5 mi. Nella prima provetta I

'(A) si aggiungono 25 microlitri di una soluzione 2 M di serinaL?O-sol fato in H 0 in modo da ottenere una concentrazione finale [approssimativa di serina- -solfato circa 50.mM, senza eccessiva diluizione del campione. Nella seconda provetta (B) si ag-[giungono invece 25 microlitri di H 0 per avere la stessa dilui zione che si ? ottenuta aggiungendo la serina-0-solfato alla provetta (A). Si lascia incubare, per trenta minuti a temperatura ambiente, oppure per..20 minuti a 30?C. Al termine di questo.periodo.la reazione ? completata, cio?.nella provetta. (A) ! un composto derivato dalla serina-O-solfato: (acido aminoacrilico) ha formato un legame covalente con un gruppo presente al sito.attivojdeli)isoenzima citopiasmatico, inattivandolo comp?etamente-ed;irreversibilmente, mentre tale periodo di incubazione non, consente: una analoga inibizione dell'isoenzima mito?. condriale

Si.determina quindi l'attivit? nelle due provette utilizzando la metodica derivata da Karmen, cio? seguendo il consumo. di.Nicotinamide.Adenin-Dinucleotide ridotto (NADH) nella,reazione accoppiata della glutammico-ossal?cetico transaminasi

conila malico?deidrogenasi

Si-ottengono, ricavandoli dal Delta di densit? ottica a

340 nm per minuto,<; >i valori di unit? enzimatiche per litro di

siero o plasma che sono rispettivamente:

Provetta (B) = Unit?/litro totali (isoenzima citoplasmatico

isoenzima mitocondriale).

Provetta (A) ='Unit?/litro del solo enzima mitocondriale.

Dalla differenza: Unit?/litro (B) - Unit?/litro (A)

j1 <* ? >:si ottiene il palore di uni t?/li tro de] 1 ' i soenzima ci toplasma-^ ?

itico che ? stato completamente inattivato ne]la provetta (A). <:>Esempio ; !Al fine di dimostrare la val idit? del metodo ? di esemplifi care t

!? !! la sua applicazione sono stati preparati cinque pools di_sierij_ i iumani contenenti diverse quantit? dei due isoenzimi. i _

:La matrice dei cinque pools era costituita da siero umano scelto con bassissima attivit? endogena (^5 U/l). A questo sieroJ <. >---- - . - ' | sono state aggiunte aliquote diverse dei due isoenzimi, puri- ?

<. _ >j l ? 1 ficati con la metodica descritta da E.J. Sampson ed altri (Cl?n.

i i Chem. 24, 1805, 1978). i Al termine i 5 pools risultano cos? costituiti:

pool n. 1 120 U/l di solo isoenzima citoplasmatico j - - ? j-<?>

) " n. 2 112,5 U/l di cui 90 U/l di isoenzima citoplasmaticoIe 22,5 U/l di mitocondriale ? n. 3 105 U/l di cui 60 U/l di isoenzima citoplasmatico;e I

45 U/l di mitocondriale [ " n. 4 97,5 U/l di cui 30 U/l di isoenzima citoplasmatico ? 67,5 U/l di ? mitocondriale

" n. 5_ 90 U/l di solo isoenzima mitocondriale. J i Procedendo alla determinazione delle attivit? isoenzima- ? 1j Itiche s'econdo la metodi ca descritta si sono ottenuti i ri sultati ! | iriportati nella tabella , media di sei di fferenti determinazi oni | i ](nella tabel la l ? i soenzima citoplasmatico ? si gl ato come ?-GOT ; <1 >! i

!

i

|e quello mi tocondri al e come m-GOT).

T A B E L L A

Valore teorico U/l Risultato sperimentale U/l pool n . 1 Attivit? totale 120 118,5

s-GOT 120 _ 118,5

t Js

m-GOT

_ .pool n . 2 Attiyi-t?_totale 112j 5 11 4 j 7

s-GOT 90 91.2

m-GOT 22,5 23,4

_ _ R?Q1 n .3 ^Attivit? _ _totale_ _ 105 103,1

s-GOT ?0 57.3

m-GOT 45 47,1

pool Attivit? total e 97,5 101,3

s-GOT 30 31.3

m-GOT 67 ,5 67,9

pool n. 5 Attivit? totale 90 88.4

s-GOT

m-GOT 90 88,4

Dal confronto dei dati sperimentali ottenuti, rispetto a quelli teorici_della_composi zione isoenzimatica, risulta evila validit? del metodo oltrech? la sua precisione.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI

   p i Metodo per la determi na zi one del l e si ngol e atti vi t? enzima- | piche degli i soenzimi ci topl asmati co e mi tocondri ale del l a jglutammi co-ossal aceti co transaminasi ( GOT) in campi oni di si eiro o pl asma , caratteri zzato dal fatto che si determina l ' attivit? GOT presente nel siero o plasma si a pri ma che dopo incu-

   , ? bazione con L-serma-O-solfato, per ottenere nel primo caso un jvalore di attivit? enzimatica corrispondente all'attivit? totale somma dei due isoenzimi, e nel secondo caso un valore di attivit? enzimatica corrispondente alllattivit? del solo iso?

   enzima mitocondriale, l'attivit? dell'isoenzima citoplasmatico {essendo ottenuta per differenza dai due valori suddetti.

   2) Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la determinazione viene effettuata su due identiche aliquote di uno stesso campione di siero o plasma.

   Metodo secondo le Riw . 1 e 2, caratterizzato dal fatto che!

   ^Le determinazioni delle attivit? enzimatiche vengono effettua-.:

   te seguendo il consumo di Nicotinamide Adenin Dinucleotide ri-^

   lotto (NADH) nella reazione accoppiata della GOT con la malicoj ieidrqgenasi. _ _ _ _ J I

   4) Metodo secondo la Riy. 1, caratterizzato dal fatto che l?inajt-

   tivazione dell'isoenzima citoplasmatico con L-serina-O-solfato [

   viene ottenuta mediante incubazione per trenta minuti a tempe- ^

   ratura ambiente.

   3) Metodo secondo la Riv. 1, caratterizzato dal fatto che l'inativazione dell<1>isoenzima citoplasmatico con L-serina-O-so]falo viene ottenuta mediante incubazione per 20 minuti a 30?C.

   5) Kit per diagnostica atto alla determinazione delle singole attivit? enzimatiche.degli isoenzimi citoplasmatico e mitoconoriale della GOT mediante l'attuazione del metodo delle Riveniicazioni 1-5, caratterizzato dal fatto di comprendere, come componente, la L-serina-O-solfato.