IT8224689A1

IT8224689A1 - Immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza

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Publication number: IT8224689A1
Application number: IT1982A24689A
Authority: IT
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1981-12-11
Filing date: 1982-12-10
Publication date: 1984-06-10
Also published as: AU558800B2; DE3245854C2; NZ202613A; AU9088082A; GB2111491B; DE3245854A1; CA1248086A; GB2111491A; JPS58113189A; IT8224689A0; FR2518096B1; BE895300A; IT1155424B; FR2518096A1

Description

IMMUNOSAGGIO DI POLARIZZAZIONE DI FLUORESCENZA.

RIASSUNTO

La presente descrizione riguarda un metodo e ri guarda reagenti per determinare ligandi in fiilidi biologici come siero, plasma, fluido spinale, fluido amniotico e orina. In particolare, la presente descrizione riguarda un procedi mento di immunos?ggio di polarizzazione di fluorescenza e riguardano una nuova classe di composti traccianti impiegati come reagenti in tali procedimenti. Il procedimento descritto riunisce la specificit? di un immunosaggio con la velocit? e il vantaggio di tecniche di polarizzazione di fluorescen za per realizzare un metodo per determinare la quantit? del lo specifico ligando presente in un campione.

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un metodo e riguarda reagenti per determinare ligandi in fluidi biologici come siero, plasma, fluido spinale, fluido amniotico e orina. In particolare, la presente invenzione riguarda un procedimen to di imraunosaggio di polarizzazione di fluorescenza e riguarda traccianti impiegati come reagenti in tali procedimenti. Il procedimento di imraunosaggio di polarizzazione di fluorescenza della presente invenzione riunisce la specificit? di un immunosaggio con la velocit? e il vantaggio di tecniche di polarizzazione di fluorescenza per realizzare un mezzo per determinare la quantit? di uno specifico ligando presente in un campione.

Immunosaggi di legame competitivi per misurare ligandi sono basati sulla competizione tra un ligando in un campione di prova ? un reagente marcato, denominato tracciante, per un limitato numero di siti di legame di ricettori su anticorpi spec?fici nei confronti del ligando e del tracciar, te. La concentrazione del ligando nel campione determina la quantit? di tracciante che si legher? specificamente ad un anticorpo. La quantit? di coniugato tracciante-anticorpo pro dotto pu? venire misurata quantitativamente ed ? inversamente proporzionale alla quantit? di ligando presente nel campio ne di prova.

In generale, le tecniche di polarizzazione di fluorescenza sono basate sul principio che un composto marca to fluorescente, quando viene eccitato da luce polarizzata linearmente emetter? fluorescenza avente un grado di polarizzazione che ? in relazione inversa rispetto alla sua velocit? di rotazione. Pertanto, quando una molecola per esempio un coniugato tracciante-anticorpo avente una traccia fluo rescente viene eccitata cnn luce polarizzata linearmente, la luce emessa rimane altamente polarizzata poich? il fluo? roforo ? costretto dalla rotazione entro il tempo durante il quale la luce viene assorbita-ed emessa. Quando un compo sto tracciante "libero" (ossia non legato ad un anticorpo) viene eccitato da luce polarizzata linearmente, la sua rota zione ? molto pi? rapida rispetto al corrispondente coniugato tracciante-anticorpo e le molecole sono maggiormente o rientate con disposizione casuale, pertanto, laluce emessa ? depolarizzata. Cosi, una polarizzazione difluorescenza realizza un mezzo quantitativo per misurare la quantit? di coniugato tracciante-anticorpo prodotta in un immunosaggio con legame competitivo La presente invenzione comprende un metodo per determinare ligandi in un campione che consiste nel mescola re con detto campione un sale biologicamente accettabile di un tracciante avente la formula:

in cui X ? un gruppo scelto dalla classe costituito da un gruppo ossalile avente la formula:

un gruppo solfonile avente la formula:

e un gruppo' carboammidosolfonile avente la formula

e

R ? un ligando-analogo in cui detto ligando-ana? logo ha almeno un epitopo comune con detto ligando in modo da essere specificamente riconoscibile da un anticorpo comime;

e un anticorpo capace di riconoscere specificamente detto ligando e detto tracciante; e, quindi, determinare la quantit? di coniugato tracciante-anticorpo mediante tecniche di polarizzazione di fluorescenza, come misura della concentrazione di detto ligando nel cauzione.

la presente invenzione riguarda inoltre una nuova classe di traccianti di formula (i) e loro sali biologicamen te accettabili, che sono utili come reagenti nel metodo de? scritto sopra. I metodi e i tracciatiti della presente invenzione sono particolarmente utili nel controllo quantit? tivo di concentrazioni di farmaci terapeutici nel siero e nel plasma.

Il termine "ligando" cosi come viene qui usato si riferisce ad una molecola, in particolare un aptene di basso peso molecolare, con il quale si pu? ottenere o si pu? formare un ricettore, normalmente un anticorpo. Gli apteni sono corpi privi di proteine, generalmente di basso peso molecolare, che non provocano formazione di anticorpi quando vengono iniettati in un animale, ma sono reattivi nei confronti di anticorpi. Anticorpi nei confronti di apte ni in generale vengono fatti aumentare coniugando dapprima gli apteni con una proteina e iniettando il prodotto coniugato in un animale. Gli anticorpi cosi ottenuti vengono isolati adottando tecniche di isolamento di anticorpi tradizio nali

I ligandi determinabili mediante il metodo della presente invenzione variano in un ampio intervallo di peo molecolare. Sebbene si possano determinare ligandi di pe so molecolare elevato, per ottenere i migliori risultati, in generale ? preferibile adottare i metodi della presente invenzione per determinare ligandi di basso peso molecolare, in generale in un intervallo di peso molecolare compreso tra 50 e 4000. Si preferisce maggiormente determinare ligandi aventi un peso molecolare compreso tra 100 e 2000.

Il nuovo tracciante della presente invenzione comprende composti di f?rmula (i) in cui il ligando-analogo rappresentato da R comprende radicali aventi un peso mo lecolare compreso tra 50 e 4000 Tra i nuovi traccianti pre feriti sono compresi composti di formula (i) in cui tra i ligando-analoghi rappresentati da R sono compresi radicali aventi un peso molecolare compreso tra 100 e 2000.

Tra gli esempi rappresentativi di ligandi determinabili mediante i metodi della presente invenzione sono compresi steroidi come esterone, estradiolo, cortisolo, testosterone, progesterone, acido chenodeossicolico, digoss:L na, acido colico, digitossina, acido deossicolico, acidi li_ tocolici e i loro derivati esteri e ammidi; vitamine come vitamina B-12, acido folico;tiroxina, triiodotironina, istamina, serotonina, prostaglandine come PGE, PGF, PGA; far maci antiasmatici come teof?llina; farmaci antineoplastici come doxorubicina e metotrexato; farmaci antiaritmia comediso pirammide, lidocaina, procainammide, propanololo, chinidina, N?acetil?pr?cainammide; farmaci antionvulsivanti come feno? barbitale. fenitoina, primidone, acido valproico, carbammazepina e etosuximide; antibiotici come penicilline, cefalosporine, eritromicina, vancomicina, gentamicina, amicacina, ci?ramfenicolo, streptomicina e tobramicina; farmaci antiartritici come salicilato; farmaci antidepressivi ivi compresi composti triciclici come nortriptilina, amitriptilina, imiprammina e desiprammina;e simili e anche i loro melaboliti. Inoltre, secondo i metodi della presente invenzione si posso no determinare farmaci che provocano farmaco dipendenza per esempio morfina, eroina, idromorfone, ossimorfone, metapone, codeina, idrocodone, diidrocodeina, diidroidrossicodeinone, folcodina, destrometorfano , fenazocina e deonina e loro metaboliti .

I traccianti della presente invenzione esistono in generale in un equilibrio tra la loro forma acida e la lo ro forma ionizzata, e nello stato ionizzato essi sono efficaci nel metodo della presente invenzione. Pertanto, la presente invenzione comprende i traccianti nello stato acido o nello stato ionizzato e, per praticit?, i traccianti della presente invenzione sono qui rappresentati strutturalmente nella loro forma acida. Quando i traccianti della presente invenzione sono presenti nel loro stato ionizzato, i traccianti esistono nella forma di sali biologicamente accettabili-. Cosi come viene qui usata, l?espressione " sali biologicamente accettabili " si riferisce a sali come sali di sodio, potassio, ammonio e simili che consentono ai traccianti della presente invenzione di esistere nel loro stato ionizzato, quando vengono impiegati nel metodo della presente invenzione. In generale, i traccianti della presente invenzione e sistono in soluzione sotto forma di sali , il sale specifico viene ottenuto dalla sostanza-tampone impiegata, per esempio in presenza di un tampone di fosfato di sodio, i traccianti della presente invenzione in generale esisteranno nel loro stato ionizzato sotto forma di un sale di sodio.

Il termine "ligando-analogo" cosi come viene qui usato si riferisce a un radicale monovalente oppure polivalen te, una sostanziale proporzione del quale ha la medesima strut tura spaziale e polare del ligando per definire uno o pi? siti determinanti o epitopici capaci di competere con il ligando per i siti leganti di un ricettore. Una caratteristica di un tale ligando-analogo e che esso possiede una somiglianza strut turale sufficiente con legando che interessa,in modo da venire riconosciuto dall'anticorpo per il ligando. Per la massima parte, il ligando-analogo avr? la medesima oppure sostan zialmente medesima strattura e distribuzione di carica (organizzazione spaziale e polare) del ligando che interessa per una notevole porzione della superficie molecolare. Poich? spesso, il sito legante per un aptene sar? il medesimo nel preparare l'antigene per la produzione di anticorpi usato per il legame con il ligando, la medesima porzione del ligandoanalogo che realizza la struttura per l?anticorpo sar? esposta dal ligando-analogo nel tracciante?

Quando X ? un gruppo solforile,

la classe di ligando-analoghi rappresentata da R ? derivata dal corrispondente ligando mediante allontanamento di un i? drogeno aromatico, ossia un idrogeno legato a un carbonio a romatico, preferibilmente un carbonio del fenile, oppure dalla formazione di un fenile o di un derivato del fenile sostituito del ligando. Inoltre, un ligando pu? venire modificato strutturalmente dall?aggiunta o dalla sottrazione di uno o pi? gruppi funzionali per formare un ligando-analogo conservando i necessari siti epitopi per il legame con un anticor po. Tuttavia, si preferisce che tali ligando-analoghi modificati siano legati alla porzione di solfonilammino-fluorescenza tramite un atomo di carbonio.

Quando X ? un gruppo ossalile,

la classe di ligando-analoghi rappresentata da R ? derivata dal corrispondente ligando mediante allontanamento di un atomo di idrogeno legato ad una ammina reattiva, ossia, un ato mo di idrogeno legato ad una ammina primaria oppure ad una am mina secondaria oppure mediante la formazione di un ammino-de rivato del ligando in cui un gruppo imminico

sostituisce uno o pi? atomi originariamente presenti nel ligando, in corrispondenza del sito di legame con una porzione di ossalilamminofluoresceina. Tra gli esempi illustrativi di ligandi che, all'atto dell'allontanamento di un idrogeno, si legano con una ammina reattiva da un ligando-analogo rappresentato da R sono compresi, per esempio, procainammi de, tiroxina, chinidina e gli antibiotici amminoglicosidici. Tra gli esempi illustrativi di ligandi i cui ammino-derivati sono utili come ligando-analoghi cono compresi teofillina cido valproico- fenobarbitale, feniteina, primidone, disopirammide, digossina cloramfenicolo, salicilato, acetamminofene, carbammazepina, desimprammina e nortrifilina. Inoltre, un ligando pu? essere strutturalmente modificato mediante l'aggiunta o l'asportazione di uno o pi? gruppi funzionali per formare un ligando-analogo, conservando i necessari siti epitopi per il legame con un anticorpo. Tuttavia, si preferisce che tali ligando-analoghi modificati siano legati alla porzione di ossalilamminofluoresceina tramite un gruppo imminico.

Quando X ? un gruppo carboammidosolfonilamminico

la classe di ligando-analoghi rappresentata da R ? derivata . dal corrispondente ligando mediante allontanamento di un ato mo di idrogeno reattivo, ossia, un atomo di idrogeno legato a un ossigeno ossidrilico o ad una ammina reattiva (primaria o secondaria) oppure mediante la formazione di un ammino-derivato del ligando in cui un gruppo imminico

sostituisce uno o pi? atomi originariamente presenti nel li gando, in corrispondenza del sito di legame con una porzione di carboammidosolfonil-ammino-fluoresceina. Tra gli esempi illustrativi di ligandi che, all?atto dellallontanamento di un idrogeno reatiivo, possono formare un ligando analogo rappresentato da R sono compresi, per esempio, procainammide, tiroxina, chinidina e gli antibiotici amminoglicosidici . Tra gli esempi illustrativi di ligandi i cui ammino-derivati sono utili come ligando-analoghi sono compresi teofillina, acido valproico, fenobarbitale, fenitoina, primidone, disopirammide, digossina,doramfenicolo, salicilato, acetamminofene, carbammazepina, desimprammina,enortriptilina. Inoltre, un ligando pu? venire strutturalmente modificatome diante l?aggiunta o l?asportazione di uno o pi? gruppi funzio nali per formare un ligando-analogo, conservando i necessari siti epitopi per legare con un anticorpo. Tuttavia, si preferisce che tali ligando-analoghi modificati siano legati ad lina porzione di carboamm?dosolfonil-amminofluoresceina tramite un gruppo imminico oppure tramite un ossi-gruppo.

Si preparano i traccianti della presente invenzione secondo tecniche note. Quando X e un gruppo solforile,

i traccianti della presente invenzione vengono preparati facendo reagire un composto avente la formula:

in cui R ha il significato definito sopra e Y ? un idrogeno aromatico, preferibilmente legato a un anello fenile, con acido clorosolfonico per produrre un clorosolfonil ligandoanalogo avente la formula:

Si fa reagire il clorosolfonilligando-analogo con una amminofluoresceina avente la formula:

in cui il gruppo amminico ? legato alla posizione 4 o alla po sizione 5 dell'anello dell'acido benzoico; in presenza di un solvente inerte per ottenere un tracciante della presente in venzione avente la formula:

Quando X ? un gruppo ossalile,

i traccianti della presente invenzione vengono preparati facendo reagire un composto di formula

in cui R ha il significato definito sopra e Z ? un idrogeno legato a un azoto reattivo (ammina primaria oppure ammina se condaria), con metilossalilcloruro per ottenere un metossi. ossalil ligando-analogo che viene idrolizzato in presenza di una base ottenendo cos? un idrossiossal il ligando-analogo avente la formula

Si fa reagire l'idrossiossalil ligando-analogo con una ammino-fluoresceina di formula (IV) in presenza di un a? gente copulante, per esempio, cloridrato della 1-etil-3 (3 dimetilamininopropil)-carbodiimmide e in presenza di un solvente inerte per dare un tracciante della presente invenzione avente la f?rmula:

Quando X ? un carboammidosolfonile,

I

i traccianti della presente invenzione vengono preparati facendo reagire un composto avente la formula

in cui R ha il significato definito sopra e W ? un idrogeno legato a un azoto reattivo (ammina primaria oppure ammina secondaria )oppure aun osaigeno-ossidrilico; con clorosolfonilisocianato per dare un derivato clorosolfonilammidocarbonil-ligan do-analogo avente la formula

Si fa reagire il derivato clorosolfonilammidocar bonil-li gando-analogo con una amminofluoresceina di formula (IV) per ottenere i traccianti della presente invenzione aventi la formula:

La temperatura in corrispondenza della quale la reazione per preparare i traccianti della presente invenzione decorre non ? critica. La temperatura potr? essere una temperatura sufficiente, tale da fare iniziare e mantenere la reazione. In generale, per praticit? e per ragioni economiche, ? sufficiente la temperatura ambiente. Nel preperare i traccianti della presente invenzione, il rapporto tra i reagenti e non strettamente critico. Per esempio, per ciascuna mole di un composto di formula (II), si potranno impiegare due moli di acido clorosolfonico per ottenere una resa ragionevole. Si preferisce impiegare un eccesso di acido clorosolfonico per facilitare la reazione e per ricuperare i prod?tti della reazione. I composti di formula (IV) impiegati come sostanze di partenza nella produzione dei traccianti della presente invenzione sono reperibili in commercio oppure vengono preparati secondo tecniche note.

Per facilit? di manipolazione e di isolamento del prodotto, il procedimento per prepararei traccianti del la presente invenzione viene effettuata in presenza di un solvente inerte. Tra i solventi,inerti adatti sono compresi quei solventi che non reagiscono sostanzialmente con le sostanze di partenza e che sono sufficienti a sciogliere le sostanze di partenza e tra.essi sono compresi per esempio acetone, cloroformio, piridina e simili. Allo scopo di realiz zare rese di prodotto massime, la reazione preferibilmente decorre in condizioni neutre oppure alcaline. Tra le basi a? datte sono comprese per esempio trietilammina, piridina e simi li. I prodotti di reazione vengono generalmente purificati effettuando una cromatografia su strato sottile oppure una cromatografia su colonna prima della applicazione nei metodi della presente invenzione.

Secondo il metodo della presente invenzione, si mescola un campione contenente il ligando da determinare con un sale biologicamente accettabile di un tracciante di formula (I) e con un anticorpo specifico per il ligando e per il tracciante. Il ligando presente nel campione e il tracciante competono per limitare i siti dell'anticorpo e si ottiene come risultato la formazione di complessi ligando-anticorpo e tracciante-anticorpo . Mantenendo costante la concentrazione di tracciante e di anticorpo, il rapporto tra complesso ligando-anticorpo e complesso tracciante-anticorpo che viene for mato ? direttamente proporzionale alla quantit? da ligando presente nel campione. Pertanto, all?atto della eccitazione della miscela con luce fluorescente e all?atto della misurazione della polarizzazione della fluorescenza emessa da un tracciante e da un complesse tracciante-anticorpo, si ? in grado di determinare quantitativamente la quantit? di ligando nel campione.

In teoria, la polarizzazione di fluorescenza di un tracciante non complessato con un anticorpo ? bassa, ed ? pros sima allo zero. All?atto della formazione del complesso con un anticorpo specifico, il complesso tracciante-anticorpo co si formato assume la rotazione della molecola dell?anticor? po che ? pi? lenta rispetto alla rotazione della molecola del tracciante relativamente piccola, e cos? si osserva un aurnen to della polarizzazione. Pertanto, quando un ligando compete con il tracciante per siti di anticorpo, la polarizzazione di fluorescenza osservata del complesso tracciante-anticorpo di venta un valore in certo qual modo compreso tra quello del tracciante e quello del complesso tracciante-anticorpo. Se un campione contiene ima elevata,concentrazione di un ligan do, il valore di polarizzazione osservato ? pi? prossimo a quello del ligando libero, ossia, ? basso. Se il campione in esame contiene una bassa concentrazione del ligando, il valore di polarizzazione ? pi? prossimo a quello del ligando legato, ossia ? elevato. Eccitando sequenzialmente la miscela di rea zione di un immunosaggio con luce polarizzata verticalmente e, successivamente, con luce polarizzata orizzontalmente e analizzando soltanto la componente verticale della luce emessa, si pu? determinare con precisione la polarizzazione di fluorescenza della miscela di reazione. La precisa relazione esistente tra polarizzazione e concentrazione del ligando da determinare viene stabilita misurando i valori della polarizzazione di sostanze di taratura aventi concentrazioni note. La concentrazione del ligando pu? venire estrapolata da una curva standard preparata in questo modo.

Il pH in corrispondenza del quale si realizza il metodo della presente invenzione deve essere sufficiente a consentire che i traccianti di formula (i) esistano nel loro stato ionizzato. Il pH pu? essere compreso circa tra 3 e 12, pi? usualmente nellintervallo di valori compreso tra 5 e 10, nel modo pi? preferibile nell'intervallo di valori di circa 6-9. Si possono usare diverse sostanze-tampone per ot tenere e mantenere il pK durante il procedimento di prova.

Ira le sostanze-tampone rappresentative sono comprese borato, fosfato, cartonato , tris , barbitale e simili. La particolare sostanza-tampone impiegata non ? critica ai fini della presente invenzione, ma in un singolo saggio, si pu? preferire una sostanza-tampone specifica in vista dell'anticorpo impiegato e in vista del ligando da determinare. La porzione di catione della sostanza-tampone in generale determiner? la porzione di catione del sale tracciante in soluzione.

I metodi della presente invenzione vengono realizzati in corrispondenza di temperature modeste e prefer?bil ment? ad una temperatura costante. La temperatura, normalmen te, sar? compresa circa tra 0?C e 50?C pi? usualmente sar? compresa tra circa 15?C e 40?C.

La concentrazione di ligando che pu? venire esaminata in generale varier? da circa pi? usual mente varier? circa da Si possono rilevare concentrazioni di ligando pi? elevate Per diluizione del campione originale.

Oltre all?intervallo di concentrazione del ligando che interessa, considerazioni come per esempio se il saggio ? qualitativo, semiquantitativo oppure quantitativo, considerazioni riguardanti l'apparecchiatura impiegata e le caratteristiche del tracciante e dell'anticorpo normalmente determineranno la concentrazione del tracciante e dell'anticorpo da impiegare. Mentre la concentrazione di ligando nel campione determiner? l'intervallo di concentrazione degli al tri reagenti, ossia tracciante e anticorpo, normalmente per rendere ottimale la sensibilit? del saggio, si determineranno in modo empirico le singole concentrazioni dei reagenti. Coloro che sono usualmente esperti nel settore stabiliranno facilmente le concentrazioni del tracciante e dell'anticorpo.

Come precedentemente indicato, i traccianti preferiti della presente invenzione vengono preparati da 5-ammino-fluoresceina oppure da 4-amminofluoresceina e esistono pref eribilmente sotto forma di isomeri aventi la formula:

in cui R e X hanno il significato definito sopra. P

Gli esempi non limitativi, illustrativi che seguono serviranno a dimostrare ulteriormente a coloro che sono esterti nel settore il modo secondo il quale si possono preparare specifici traccianti nell'ambito della presente invenzione. Il simbolo / A.F / che compare nelle formula di struttura che illustrano i composti preparati negli esempi che seguono, rappresenta una porzione avente la formula:

in cui l'azoto imminico ? legato alla posizione 4 oppure alla posizione 5 nella formula di cui sopra, a seconda dello specifico isomero di amminofluoresceina impiegato come sostanza di partenza

ESEMPIO I

A 0,71 g di lidocaina si sono aggiunti 2,8 g di acido clorosolfonico e si ? riscaldata la miscela cos? ottenuta a 60?C per 1 ora. Si ? raffreddata la miscela di reazione e si sono aggiunti alla miscela acqua e ghiaccio triturato per distruggere l ? eventuale acido clorosolfonico non reagito . Si ? neu tralizzata la soluzione acquosa cos? ottenuta fino a pH 7 usando idrossido di sodio. Si ? estratto il prodotto cos? ; ot tenuto due volte con porzioni da 10 ml di cloruro di metilene . Si sono riuniti gli estratti in cloruro di metilene, si sono anidrificati su solfato di sodio , filtrati e evaporati a secco ottenendo cos? 100 mg di una miscela di meta- e para? clorosolfonil lidocaina sotto forma di un prodotto oleoso gom moso . Ad una soluzione contenente 5 mg di 4-amminofluorescenina in 0, 5 ml di piridina si sono aggiunti 5 mg della miscela di clorosolfonillidocaina di cui sopra. Uopo 10 minuti , si ? formato un prodotto grezzo . Si ? purificato il prodotto grezzo mediante cromatografia su strato sottile usando gel di sili ce e cloroformio , quindi usando una mi scela di cloroformio: acetone ( 1 : 1 ) e alla fine usando un miscela di clorofor mio:metanolo ( 1 : 1.) come solventi sviluppatori e si ? ottenuta cos? una miscela di un coniugato di solfonillidocaina amminofluoresceina avente la formula generale:

ESEMPIO II

A 1 , 2 g di fenobarbitale si sono aggiunti lenta -mente 4,5 g- di acido clorosolfonico e si ? riscaldata la mi scela cos? ottenuta a 60?C per 1 ora? Si ? quindi raffredda ta la miscela di reazione e si sono aggiunti alla miscela di reazione ghiaccio tritato e acqua per distruggere l 'acido clorosolfonico eventualmente non reagito. Si ? quindi fil tr?ta la miscela di reazione ottenendo un precipitato bianco che ? stato lavato con acqua e ? stato essiccato in un essicicatore sotto vuoto ottenendo cos? 0, 8 g di una miscela di meta- e para-clorosolfonilfenobarbitale avente un punto di fusiOne di 190-195?C.Ad una soluzione contenente 5 mg di 5-amminofluoresceina in 0, 5 mi di piridina si sono aggiunti 5 mg della miscela di cui sopra di clorosolfonilfenobarbi -tale? Dopo 10 minuti , si ? formato un prodotto grezzo che ? stato purificato due volte adottando tecniche di cromatografia su strato sottile impiegando gel di silice e una miscela di cloroformio metanolo ( 2: 1 ) come solvente sviluppatore e si' ? ottenuto cos? un coniugato solfonilfenobarbitale-amminofluoresceina avente la formula:

ESEMPIO III

A 2 g di ?-fenetil- -me tilsuccinnimMide si sono aggiunti goccia a goccia 2,5 g di acido clorosolfonico e si e sottoposta ad agitazione la miscela cos? ottenuta a 26?C per 1 ora. Alla miscela si sono aggiunti ghiaccio tritato e acqua per distruggere l?acido clorosolfonico eventualmente non reagito. Un prodotto di reazione che si era formato ? stato estratto due volte con porzioni da 10 ml di clorofor mio. Si sono riuniti gli estratti cloroformici, si sono anidrificati su solfato di sodio e si sono evaporati ottenendo cos? un prodotto oleoso pesante . Il prodotto oleoso ? stato cristallizzato da una mi scela di toluene e etere di petrolio ottenendo cos? 0, 29 g di una miscela di ? -(meta- e para-cloro solfonilfenetil) -? -metilsuccinimmide avente un punto di fusione di 145-1 50 ?C. Ad una soluzione contenente 5 mg di 4-amminofluoresceina in 0, 5 ml di piridina si sono aggiunti 5 mg della miscela d? cui sopra ottenendo cos? la ? -( clorosolfonilfenetil )? -metilsuccinimmide . Dopo 10 minuti , si ? formato un prodotto grezzo che ? stato purificato due volte adottando tecniche di cromatografia su strato sottile impiegando gel di silice e una miscela di cloroformio : metanolo ( 2: 1 ) come solvente sviluppatore e si ? ottenuta cos? una miscela di coniugato ?-(solfonilfenetil ) - ? -metilsuccinimmide-amminofluoresceina avente la formula:

ESEMPIO I V

Ad una soluzione contenente 2 g di imminostilbene e 2 ml di trietilammina in 50 ml di cloroformio si sono aggiunti 1,5 g di metilossalilcloruro. Si ? posta sotto riflus so la miscela cos? ottenuta per 1 ora e quindi la si ? evapo rata a secco. Si ? ripreso il residuo in 50 ml di cloroformio e, quindi, lo si ? estratto con 50 ml di acqua. Si ? evapora to lo strato cloroformico fino a secco.Al residuo si sono aggiunti 100 ml di idrossido di sodio 2N e s? ? posto sotto riflusso la miscela cos? ottenuta per 30 minuti. Si ? raffred data la miscela a temperatura ambiente e, quindi, la si ? estratta con 50 ml di cloroformio. Si ? acidificato lo strato acquoso a pH 1 usando acido cloridrico concentrato e, quindi, lo si ? estratto con 100 ml di etere. Si ? anidrificato l'estratto organico su solfato di sodio e lo si ? evaporato a secco. Si ? ripreso il residuo in 50 ml di metanolo e lo si ? triturato con acqua ottenendo cos? un getto di cristalli. Si ? filtrata la miscela e si sono raffreddati i cristalli per 16 ore ottenendo cos? 2J4 g di N-idrossiossalil-imminostilbene (punto di fusione 162-163?C).

A 5 mg del N-idrossiossalil-imminostilbene si ? aggiunta una soluzione contenente 5 mg di 4-amminofluoresceina in 0,5 ml di piridina. Si ? lasciata decorrere la reazione per 2 ore a 26 ?C ottenendo cos? un prodotto grezzo. Si ? purificato il prodotto grezzo effettuando una cromatografia su strato sottile impiegando gel di silice e una soluzione di sviluppo costituita da una miscela di cloroformio : acetone (1:1) e si ? ottenuto cos? il coniugato N-ossalil-imminostilbene/amminofluoresceina avente la, formula :

Si sono preparati inoltre i traccianti che seguo no secondo i procedimenti indicati sopra:

ESEMPIO V - Coniugati solfonilprimidone - amminofluoresceina

ESEMPIO VI -

ESEMPIO VII

ESEMPIO VIII

ESEMPIO IX -

ESEMPIO X -

ESEMPIO XI -

ESEMPIO XII

ESEMPIO XIII

ESEMPIO XIV

ESEMPIO XV

ESEMPIO XVI -

ESEMPIO XVII

ESEMPIO XVIII

ESEMPIO XIX -

ESEMPIO XX -

Come precedentemente indicato, i traccianti della presente invenzione sono reagenti efficaci per venire usati in immunosaggi di polarizzazione difluorescenza. Gli esempi che seguono illustrano la idoneit? dei traccianti della presente invenzione in immunosaggi nei quali si adottano tecniche di polarizzazione di fluorescenza. Si effettuano tali saggi secondo il seguente procedimento generale:

1) Si introduce un volume misurato di standard oppure di siero in esame in una provetta e s? diluisce con una sostanza-tampone;

2; Si aggiunge quindi a ciascuna provetta

una concentrazione nota di un tracciante della presente inven zione contenente eventualmente un tensioattivo;

3) Alle provette si aggiunge una concentrazio. ne nota di antisiero;

4) Si sottopone a incubazione la'miscela di reazione a temperatura ambiente; e

5) Si misura la quantit? di tracciante legato all ?anticorpo adottando tecniche di polarizzazione di fluorescenza, come una misura della quantit? di ligando presente nel campione

ESEMPIO XXI - Saggio della, lidocaina

Sostanze

1 ) Tampone: fosfato 0, 1M, pH 7,5, contenente 0, 01 % (peso/volume ) di sodio azide e 0,01 % (peso/volume) di gammaglobulina di bue (qui di seguito denominata "tampone BGG"

2) Tracciante: coniugato solfonillidocaina-amminofluoresceina (preparato nell?Esempio i) ad una concentra zione di molare tampone tris cloroidrato0,1M pH 7,8, contenente 0,1$ (peso/volume) di dodecilsolfato di sodio, 0,01% (peso/volume) di gammaglobulina di bue e 0,01% (peso/volume) di sodio azide

3) Anticorpo: antisiero di coniglio nei confron ti della lidocaina diluito 1 a 80 in tampone BGG.

4) Standard oppure prodotti non noti: siero umano (oppure altro fluido biologico) contenente lidocaina in un intervallo di concentrazione compreso tra 0 e 10 microgrammi/ml?

5) Polarimetro a fluorescenza : strumento capace di misurare la polarizzazione di fluorescenza di una soluzione di fluoresceina unit? di polarizzazione?

Protocollo

1) A 20 ?l di standard e sostanze non note aggiungere 200 ?l di tampone BGG?

2) A 20 ?l di ciascun standard diluito e ciascun prodotto non noto diluito in una provetta da coltura,aggiungere 200 ?l di tampone BGG.

3) A ciascuna provetta da coltura contenente standard diluito e prodotto non notodiluito aggiungere 40 ?l di

tracciante e 100 ?l di tampone BGG.

4) Quindi aggiungere 40 ?l di anticorpo e 1000 ul di tampone BGG a ciascuna provetta da coltura.

5) Mescolare i reagenti e sottoporre a incubazione le prov?tte da coltura contenenti standard e prodotti non noti per circa 15 minuti a 23?C.

6) Misurare la polarizzazione di fluorescenza di tutte leprovette . Risultati tipici per campioni standard sono presentati nella Tabella I.

TABELLA I

I valori di polarizzazione decrescono all 'aumentare della concentrazione di lidocaina, consentendo di costru? re una curva standard. Le sostanze non note trattate in modo identi co possono venire rilevate quantitativamente riferendosi alla curva standard

ESEMPIO XXII - Saggio con fenobarbi tale

Sostanze

1 ) Tampone BGG

2) Traccianti: coniugato (para-metil-meta-solfonil fenobarbitale-amminofluoresceina (preparato nell?Esempio VII) ad una concentrazione di 5,75 x in colato di sodio al 5,75%?

3) Anticorpo: antisiero di coniglio nei confronti del fenobarbitale diluito 1 a 78,3 in tampone BGG.

4) Standard oppure prodotti non noti: sirero umano-(oppure altri fluido biologico) contenente fenobarbitale in un intervallo di concentrazione compreso tra 0 e 80 ug/ml.

5) Polarimetro a fluorescenza: strumento capace di misurare la polarizzazione di fluorescenza di una soluzione di fluoresceina 1 x 10 M fino a 0,001 unita di polarizzazione.

Protocollo

1) A 20 ul di standard e di prodotti non noti ag giungere 200 ul di tampone BGG.

2) A 20 ul di ciascun standard diluito e ciascun prodotto non noto diluito in una provetta da coltura aggiungere 200 ul di tampone GBB.

3) A ciascuna provettada coltura contenente standard diluito e prodotto non noto diluito aggiungere 40 ul di tracciante e 1000 ul tampone BGG.

4) Quindi, aggiungere 40 ul di anticorpo e 1000 ul di tampone BGG a ciascuna provetta da coltura,

5) Mescolare i reagenti e sottoporre a incubazio ne le provette da coltura contenenti standard e prodottinon noti per circa 15 minuti a 23?C.

6) Misurare la polarizzazione di fluorescenza di tutte le provette. Risultati tipici per campioni standard sono rappresentati nella lamella II.?

TABELLA II

I valori di polarizzazione diminuiscono all 'aumentare della concentrazione di fenobarbitale consentendo di costruire una curva standard? Le sostanze non note trattate in modo identi co possono venire rilevate quantitativamente riferendosi alla curva standard?

ESEMPIO XXIII - Saggio con carbammazepina

Sostanze :

1 ) Tampone BGG.

2) Tracciante: coniugato N-ossalilimminostilbene? amminofluoresceina (preparato come descritto nell 'Esempio IV) ad una concentrazione di 2nM in tampone BGG contenente 0, 2% (peso/volume ) di colato di sodio .

3) Anticorpo : antisiero di coniglio nei confronti della carbammazepina diluito 1 a 3040 in tampone BGG.

4) Standard oppure prodotti non noti si ero usano (oppure altro fluido biologico) contenente carbammazepina in una concentrazione compresa tra 0 e 20 ug/ml.

5) Polarimetro a fluorescenza: strumento capace di misurare la polarizzazione di fluorescenza di 1 x 10 -9 M di soluzione fluorescente fino a 0 ,001 unit? di polarizzazione. Protocollo :

1 ) A 10 ul di standard e di sostanze non note aggiungere 300 ul di tampone BGG.

2) A 10 ul di ciascun standard diluito e sostanza non nota diluito in una provetta da coltura aggiungere 300 ul di tampone BGG.

3 ) Aggiungere 1 mi di tracciante a ciascuni provetta da coltura.

4) Quindi aggiungere 1 ,0 ml di anticorpo a ciascuna provetta di coltura

5) Mescolare i reagenti e sottoporre a incubazione le provette da coltura contenenti standard e sostanze non note per circa 1 5 minuti a 23?G.

6 ) Misurare la polarizzazione di fluorescenza di tutte le provette da coltura. Risultati tipici per campioni standard sono riportati nella Tabella 3.

TABELLA III

e

I valori di polarizzazione diminuiscono all 'aumentare della concentrazione di carbammazepina , consentendo di co struire una curva standard. Le sostanze non note trattate in modo identico possono venire rilevate quantitativamente riferendosi alla curva standard.

Nella Tabella che segue vengono riassunti i diversi immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza che sono sta ti effettuati secondo i procedimenti precedentemente descritti impiegando i traccianti preparati negli esempi precedenti I traccianti impiegati sono identi ficati col numero dell 'esempio e sono indicati gii specifici ligandi determinati .

Come ? evidente dai risultati indicati sopra, i traccianti della presente invenzione sono reagenti efficaci in immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza. Oltre alle propriet? indicate sopra, i traccianti della presente inven

Claims

RIVENDICAZIONI

1 ? Composto avente la formula:

in cui R ? un ligando-analogo avente un peso molecolare conpreso tra 100 e 2000 in cui dettoligando-analogo ha almeno un epitopo comune con detto ligando in modo da essere specificamente riconoscibile a un mune anticorpo, e detto ligando-analogo ha un ato mo di carbonio aromatico mediante il quale il ligando-analogo ? legato alla porzione di solfonammido fluoresceina;

e suoi sali biologicamente accettabili

2. Composto secondola rivendicazion? 1 avente la formula:

oppure

e suoi sali biologicamente accettabili 3? Composto secondo la rivendicazione 2 in cui R ? derivato da un ligando scelto dal gruppo costituito da steroidi, ormoni, prod?tti antiasma, antineoplastici, antiaritmici, anticonvulsivanti, antibiotici, antiartritici, an tidepressivi e glicosidi cardiaci.

4. Composto secondo la rivendicazione 3 in cui R ? derivato da un antiaritinico?

5. Composto secondo la rivendicazione 4 in cui R ? derivato da lidocaina.

6* Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R e

7 Composto secondo la rivendicazione 3 in cui R e derivato da un anticonvulsivante?

8. Composto secondo la rivendicazione 7 in cui R e derivato da fenitoina.

9 Composto secondo la rivendicazione 8 in cui R e

10. Composto secondo la rivendicazione 7 in cui R ? derivato dal primidone

11. Composto secondo la rivendicazione 7 in cui R

in cui R' ? alchile avente da 1 a 4. atomi di carbonio.

12. Composto secondo la rivendicazione 7 in cui R ? derivato da etosuccimmide .

13 Composto secondo la rivendicazione 12 in cui R

in cui n ? un numero intero compreso tra 0 e 3.

14. Composto di formul

in cui R ? un ligando-analogo avente un peso molecolare compreso tra 100 e 2000 in cui detto ligando-analogo ha almeno un epitopo comune con detto ligando in modo da essere speci ficamente riconoscibile da un comune anti corpo e detto li gandoanalogo ? legato alla porzione di carboammidosolionilamminofluoresceina tramite un atomo di ossigeno ossidrilico oppure tramite una ammina reattiva;

e suoi sali biologicamente accettabili .

15 Composto secondo la rivendicazione 14 avente la formula

oppure

o suoi sali biologicamente accettabili.

16. Composto secondo la rivendicazione 15 in cui R ? derivato da un ligjando scelto dal gruppo costituito da steroidi, ormoni, prodotti antiasmatici, antineoplastici, antiaritmici, anticonvulsivanti, antibiotici- antiartritici, antidepressivi e glicosidi cardiaci.

17. Composto secondo la rivendicazione 16 in cui R ? derivato da un anticonvulsivante.

18. Composto secondo la rivendicazione 17 in cui R ? derivato da carbammazepina.

19. Composto avente la formula indicata nella rivendicazione 18 in cui R?

20. Composto secondo la rivendicazione 16 in cui R ? derivato da un antiaritmico.

21. Composto secondo la rivendicazione 20 in cui R ? derivato da procainam mide.

22 , Composto secondo la rivendicazione 20 in cui n ? derivato da propanololo, 23. Composto avente la formula

0 O H

R-C-C-N

// \

o OH

in cui R ? un ligando-analogo avente un peso molecolare compreso tra 100 e 2000 in cui detto ligando-analogo ha almeno un comune epitopo con detto ligando in modo da essere specificamente riconoscibile da un comune anticorpo e detto ligando -analogo ha un azoto reattivo mediante il quale il legando? analogo ? legato alla porzione di ossalilamminofluoresceina;

e suoi sali biologicamente accettabili.

24. Composto avente la formula:

oppure

e suoi sali biologicamente accettabili

25 Composto secondo la riv. 24 in cui R ? derivato da un ligando scel to dal gruppo costituito da steroidi, ormoni, antiasmatici, antineoplasti ci, antiaritmici, anticonvulsivanti, antibiotici, antiartritici, antidepressivi e glicosidi cardiaci.

26. Composto secondo la riv. 25 in cui R ? derivato da un antidepressivo 27? Composto secondo la riv. 26 in cui R ? derivato da un farmaco triciclico.

28. Composto secondo la riv. 27 in cui R ? derivato da nortriptilina, amitriptilina, imiprammina oppure desiprammina.

29 Composto secondo la riv. 28 in cui R ? derivato da un anticonvulsi vante.

30. Composto secondo la riv.29 in cui R?derivato da carbammazepina. 31. Composto secondo la riv. 30 in cui R ?

32. Metodo per determinare ligandi in un campione che consiste nel mescolare con detto campione un sale "biologicamente accettabile di un tracciarte avente la formila:

in cui R ? un ligando-analogo avente un peso molecolare compreso tra 100 e 2000 in cui detto ligando-analogo ha almeno un epitopo comune con detto ligando in modo da essere specificamente riconoscibile da un anticorpo comune e detto ligando-analogo ha un atomo di carbonio aromatico mediante il quale il ligando-analogo ? legato alla porzione di solfonammidofluoresceina e un anticorpo capace di riconoscere specificamente detto ligando e detto tracciante e, quindi, determinare la quantit? di tracciante legata all?anticorpo mediante tecniche di polarizzazione di fluorescenza come una misura della quantit? di ligando presente nel campione.

33. Metodo secondo la riv, 32 in cui il gruppo solfonammidico legato al grup po R ? legato anche alla posizione-4 oppure alla posizione-5 della porzione di fluoresceina.

34 Metodo secondo la riv. 33 in cui detto ligando ? uno steroide, ormone, antiasmatico, antineoplastico, anti aritmico, anticonvulsivante, antibiotico, antiartritico, antidepressivo, glicoside . cardiaco oppure un loro metabolita.

35. Metodo secondo la riv. 34 in cui R ha un peso molecolare compreso tra 50 e 4000.

36. Metodo secondo la riv. 35 in cui R ha un peso molecolare compreso tra 100 e 2000.

37 Metodo secondo la riv. 36 in cui detto ligando ? un antiaritmico.

38. Metodo secondo la riv. 37 in cui detto antiaritmico ? lidocaina.

39 Metodo secondo la riv. 38 in cui detto ligando ? un anticonvulsivante.

40. Metodo secondo la riv . 39 in cui detto anticonvulsivante ? fenitoina.

41. Metodo secondo la ziv. 39 in cui detto anticonvulsivante ? primidone. 42. Metodo secondo la riv. 39 in cui detto anticonvulsivante ? etosuximmide.

43 Metodo per determinare ligandi in un campione che consiste nel mescolare con detto campione un sale biologicamente accettabile di un tracciante avente la formula:

in tra 100 e 2000 in. cui detto ligando-analogo ha almeno un epitopo comune con detto ligando in modo da essere specificamente riconoscibile da un anticorpo comune e detto ligando-analogo ? legato alla porzione del gruppo carboammido? solfonilamminico tramite un ossigeno ossidrilico oppure tramite una amm?na reattiva; e suoi sali biologicamente accettabili.

44 Metodo secondo la riv.43 in cui il gruppo carboammidisolfonilamminico legato al gruppo R ? legato anche alla posizione-4 oppure alla posizione-5 della porzione di fluoresceina.

45. Metodo secondo la riv. 44 in cui detto ligando ? imo steroide, ormone, antiasmat?co, antineoplastico, antiaritmico , anticonvulsivante, antibiotico, antiartritico, antidepressivo, glicoside cardiaco oppure un loro metabolita 46. Metodo secondo la riv.45 in cui R ha un peso molecolare compreso tra 50 e 4000.

47 Metodo secondo la riv.46 in cui R ha un peso molecolare compreso tra 100 e 2000.

48. Metodo secondo la riv.47 in cui detto ligando ? un anticonvulsivante.

49 Metodo secondo la riv.48 in cui detto anticonvulsivante ? carbammazepina.

50. Metodo per determinare ligandi in un campione che consiste nel mescolare con detto campione un sale biologicamente accettabile di un traccinate avente la formula

in cui R ? un ligando-analogo avente un peso molecolare compreso tra 100 e 2000, in cui detto ligando-analogo ha almeno un epitopo comune con detto ligando in modo da essere specificamente riconoscibile da un anticorpo comune e detto ligando-analogo ha un azoto reattivo mediante il quale il ligando-analogo ? legato alla porzione di ossalilamm?nofluoresceina; e suoi sali biologicamente accettabili.

51. Metodo secondo la riv. 50 in cui il gruppo ossalilamminico legato al gruppo R ? legato anche alla posizione-4 oppure alla posizione-5 della porzione di fluoresceina.

52. Metodo secondo la riv. 51 in cui detto ligando ? uno steroide, ormone, antiasmatico, antineoplastico, antiaritraico, anticonvulsivante, antibiotico, antiar-tritico, antidepressivo, glicoside cardiaco oppure un loro metabolita.

53. Metodo secondo la riv.52 in cui R ha un peso molecolare compreso tra 50 e 40OO.

54. Metodo secondo la riv. 53 in cui R ha un peso molecolare compreso tra 100 e 2000.

55. Metodo secondo la riv. 54 in cui detto ligando ? un anticonvulsivante.

56. Metodo secondo la riv. 55 in cui detto anticonvulsivante ? carbammazopina.