JPS58113189A - 螢光偏光免疫分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は面清、血漿、背１液、羊膜液、尿などの生物学
的流体中のりガントを測定するだめの方法および試剤に
関する。

特に本発明は螢光偏光免疫分析法およびこのような方法
に使用する試剤としてのトレーサーに関する。本発明の
螢光偏光免疫分析法は免疫分析の特性を螢光偏光技術の
迅速および簡便性と組合せて試料中に存在する特定リガ
ンドの釦を測定する手段を提供するものである。

リガンドを測定するための競合拘束性の免疫分析は試験
試料中のりガントとトレーサーと呼ぶ標識試剤との曲の
、該リガンドおよびトレーサーに特許の抗体上の限られ
た数の受容体結合の場合についての、競合にもとづいて
いる。試料中のりガントの濃度は抗体に特定的に結合す
るトレーサーの量を２１− 決定する。生成するトレーサー−抗体の共役体は定ｈｔ
的に測定することかでき、試験試料中のりガントのけに
反比例する。

一般に、螢光偏光波’ｔ４ｕＬ腺状に偏光された光によ
って励起さねたときの螢光標旅化合物がその回転迷度に
反比例する偏光度をもつ螢光を放出するという原理にも
とづいている。そわ故、トレーサー−抗体の共役体のよ
うな分子が線状に偏光された光で励起されると、放出光
は高１徒に偏光された状態を保つ。それは螢光体が吸収
光と放出光とのＩｆＪＪで回転するのを拘束されるから
である。“遊駈°のトレーサー化合物（すなわち抗体に
結合していないトレーサー化合物）か線状に開光された
光によって励起されると、その回転は対応するトレーサ
ー−抗体の共役体よりもずっと速く、分子はよりランダ
ムに配位され、それ故に放出光は脱偏光される。従って
螢光偏光は競合結合性免疫分析中に生成するトレーサー
−抗体の共役体の量を測定するだめの定量的手段を与え
る。

２２− 本発明は次の式（１） １１ らえらばれた基であり；Ｒはリガンド類似体であり、該
リガンド類似体は共通の抗体によって特定的に認識しう
るように、少なくとも１つの、該リガンドと共通するエ
ピトープをもつ〕をもつトレーサーの生理学的に薊容し
うる塩および該リガンドと該トレーサーを特定的に認識
しうる抗体を試料にまぜ、次いで試料中のりガントの尺
度として螢光偏光技術によりトレーサー−抗体の共役体
のｋＬを測定することを特徴とする試料中のりガントの
測定法、を包含する。

ここに使用する“リガンド°なる用語は受容体ふつうに
は抗体がこねに抗してえられるまたは生成される分子特
に低分子量ハプテンをいう。ハプテンは動物に注射した
とき抗体の生成をあ起しないが抗体に対して反応性のあ
る。一般には低分子量の、蛋白質を含まないものである
。ハプテンに対する抗体は一般にまずハプテンを蛋白質
に結合させてこの結合生成ｑａ　（共役体）を動物に注
射することによって生ぜしめられる。えられた抗体は〃
７ｊ常の抗体単離技術によって単離される。

。、。１１１１（ｉ’）／ｉｌ”ｌ！２Ｇ、Ｔ、Ｉ）ｒ
ｆｆｌｉｌ＆Ｌう６　！Ｊ　ｊｆ＞　）−ｉｊＥｕ’＊
”ｆｌｊ：ｅ　　　ｊ回にわたって変化する。高分子は
のりガントも測定しうるけれども、最良の結果のために
は一般に５０〜４０００の範囲の低分子はのりガントを
測定するために本発明の方法を使用するのが好ましい。

１００〜２０００の範しｌの分子量をもつりガントを測
定するのか最も好ましい。

本発明の新規なトレーサーはＲによって衣わされるリガ
ンド類似体が５０〜４０００の範囲内の分子量をもつ茅
を含む式（１）の化合物を包含する。好ましい新規なト
レーサーはＲによって表わされるリガンド類似体か１０
０〜２０００の範ｄＢ内の分子量をもつ基を含む式（１
）の化合物を包含する。

本発明の方法によって測定しうるリガントの例として、
ステロイドたとえばエステロン、エストラジオール、コ
ルチゾル、テストステロン、フロゲステロン、ケノデオ
キシコリン酸、ジゴキシン、コリＺ酸、ジギトギシン、
デオキシコリン酸、リドコリン酸、ならびにそのエステ
ルおよびアミドア導体；ビタミン類たとえばＢ−１２、
葉区；テ四キシン、トリー２５＝ ヨードチロニン、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグ
ランジンたとえばＰＧＥ、ＰＧＦ、Ｐ（）Ａ；抗ぜん車
側たとえばテオフィリン；抗１］車７４Ｍ　０＋またと
えばドキソルビシンおよびメトトレキ七−ト；抗不整脈
剤／ことえは”シソビラミド、リドカイン、ブロカイン
アミド、ブロフ′ラノロール、ギニジン、Ｎ−アセチル
ープロ力インアミド；抗けいれん剤たとえばフエノバル
ビタール、フェニトイン、プリミドン、パルプロ１ｖ１
カルバマゼピンおよびエトサクシイミド′：扮、生物質
たとえばペニシリン、セファロスポリン、エリスロマイ
シン、バンコマイシン、ジエンタマイシン、アミカシン
、クロラムフェニコール、ストレストマイシンおよびト
ブラマイシン；抗関節炎剤たとえばサリチル酸頃類；ト
リサイクリック糸を含む抗うつ剤たとえばノルトリブチ
リン、アミトリブチリン、イミプラミン↓３よびデスイ
ブラミン；なとならびにこれらの代謝物Ｎかあげられる
。更に、乱用薬品類だとえ汀モルヒネ、ヘロ２６− イン、ハイドロコドン、オキシモル７オン、メタボン、
コディン、ハイドロコドン、ジヒドロコシエン、ジヒド
ロヒドロキシコデイノン、ホルコジン、デキストロメト
ルファン、フエナゾシン、およびデオ；ンおよびそれら
の代噛物質も本発明の方法により測定しうる。

本発明のトレーサーは一般にその酸の状態とイオン化状
態との［ｌ）１の平衡において存在し、本発明の方法は
イオン化状態において有効である。それ故、本発明は酸
またはイオン化の状態のトレーサーを包含するか、便宜
上本発明のトレーサーは明細書中では構造的に酸型で示
しである。本発明のトレーサーがイオン化状態で存在す
るとき、それは生理学的に許容しうる塩の形体で実存す
る。ここに使用する“生物学的に許容しうる塩°とは、
本発明の方法で使用したとき本発明のトレーサーをイオ
ン化状態で実在させるナトリウム、カリウム、アンモニ
ウムなどの」ムをいう。一般に本発明のトレーサーｄ塩
として溶液中に存在し、この特定の塩６使用する緩働液
から、すなわちリン酸ナトリウム緩衝液の存在において
、生ずる。本発明のトレーサーはナトリウム地としてそ
のイオン化状態において一般に存在する。

ここに使用する“リガンド類似体°なる用ｍｊは、−価
もしくは多価の基であってその実質的部分かりガントと
同じ空間的および極性上の機能をもち受容体の結合の場
についてリガンドと競合しうる１つまたはそれ以上の決
定の場所またｔ、Ｊ、エピトープの場を規定するものを
いう。このようなりガント類似体の特性りそれが関心の
あるリガンドに対して十分な４１４Ｍ上の類ＩＩｉ性を
もっていてリガンドのための抗体によってＭ＆＆ｌ。

されるということである。はとんどの部分について、リ
ガンド類似体し１分子表面のかなりな部分にとって該リ
ガンドと同一のまたは実質的に同一の構造と電佃分布（
空間的なおよび極性上の偽ｆｉ目）をもつ。多くの場合
ハゲテンの結合の場ｄリガンドへの結合のために使用す
る抗体の生成のための抗原の製造において同じであるの
で、抗体の型を与えるリガン）ＩＵ似体の同じ部分はト
レーサー中のりガント類似体によって露出される。

１ り されるリガンド類似体の種類は芳香核の水素すなわち芳
香核炭素好ましくはフェニル炭素の除去によって、また
はりガントのフェニルもしくは置換フェニル誘導体の形
成によって、対応するりガントからｈｍされる。また、
リガンドは抗体に結合するに必要なエピトープの場を保
持しなから１つまたはそれ以上の官能基の添加または選
択によりリガンド類似体を形成させることによって構造
的に変性することかできる。然しながら、このような変
性リガンド類似体は芳香核炭素を介してスルホニルアミ
ノフルオレセイン部分に結合するのか好−２９−、− ましい。

わされるリガンド類似体の種類り、反１心性アミンに結
合する水系原子すなわち＠１級もしくは第２級アミンに
結合する水素ルアミノフルオレセイン部分に結合する場
において、リガンド中にもとから存在する１つまたはそ
れ以上の原子を１行模しているリガンドのアミノア橋体
の形成によって、対応するリガンドから鹸榎される。反
応性アミンに結合している水素の除去の際にｌ（によっ
て表わされるリガンド類似体を形成するりガントの例と
しては、たとえばプロ力インアミド、チロキシン、ギニ
ジンおよびアミノグリコシド糸抗生物質かあけられる。

そのアミノ６専体かリガンド類似体として有用であるリ
ガンドの汐りとして、たとえばテオフィリン、ハルプロ
酸。

３０− フエノバルビタールｆ１（、フェニトイン、ピリミドン
、ジンビラミド、ジゴキシン、クロラムフェニコール、
サリチル酸塩一、アセトアミノ７エン、カルバマゼピン
、デスイムブラミンおよびノルトリブチリンがあげられ
る。またりガントは、抗体に結合するに必要なエピトー
プの場を保持しなから、１つまたはそれ以上の官能基の
添加まだｄ削除によりリガンド類似体を形成させること
によって、構造的に変性しうる。然しなから、このよう
な変性リガンド類似体はイミノ基を介してオキザリルア
ミノフルオレセイン部分に結合するのか好ましい。

Ｘかカルボアミドスルホニルアミノ基 １ るリガンド類似体の柚傾ば、反７ｊｆ＞性水索原子すな
わちヒドロキシ酸紫もしぐは反応性アミン（第１級また
は第２級）に結ト１ カルボアミドスルホニルアミノフルオレセイン部分に結
合する場において、リガンド中にもとから存在する１つ
またはそれ以上の原子をｉ＆Ｎしているリガンドのアミ
ノ誘導体の形成によって、対応するリガンドからｋｍさ
れる。反１ノＴｈ＝性水素の除去の際にＲによって表わ
さねるリガンド類似体を形成しうるリガンドの例として
、たとえばプロ力インアミド、チロキシン、キニジンお
よびアミノグリコシド抗生４Ｍ（かあげられる。そのア
ミノ誘導体かりガント類似体として有用なりガントの例
としてはテオフィリン、バルグロ１′へ！、フェノバル
ビタール、フェニトイン、ピリミドン、ジンビラミド、
ジゴキシン、クロラムフェニコール、サリチル酸塩、ア
セトアミノフェン、カルバマゼピン、デスイムツブラミ
ンおよびノルトリフ。

チリンかあげられる。また、リガンドは、抗体に結合す
るにへ 必要なエピトープの場を保持しなから、１つまたはそれ
以上　　　　　　ｊ：の官ｆ７ヒ基の添加または削除に
よりリガンド類似体を形成させることによって、構造的
に変性しうる。然しなから、このような変性リガンド類
似体はイミノ基またはオキシ基を介゛してカルボアミド
スルホニルアミノフルオレセイン柑）分に結合するのか
好ましい。

本発明のトレーサーは周知技術により製造することかで
き１ 〇 一ザーは式（ＩＩ）Ｒ−ｙの化合物（式中のＲは上記定
６のとおりであり、Ｙは分合核水素、好ましくはフェニ
ル環に結合している水素である）をクロロスルホニルン
と反応させて式（１）Ｒ−８−ＣＩ　　　のクロロスル
ホニル−リガンド類似体を形１ 成させることによって製造される。このクロロスルホニ
ル−リガンド ６　６− Ｈ （ただし式中のアミ７基は安息香６り壇の４位または５
位に結合している） をもつアミノフルオレセインと不活性浴媒の存在下で反
ｔｉｔ．、させると、次式（Ｖ） をもつ本発明のトレーサーかえられる。

−サーは式（Ｖｌ　）　Ｒ−Ｚ　［式中のＲ１１−１上
記定義のとおりであり、Ｚは反応性窒素（第１級または
第２級アミン）に結合する水素である］をメチルオキザ
リルクロライドと反応させてメトキシオキザリル−リガ
ンド類似体を製造し、次いでこれを塩基の存在下で加水
分解して式（Ｖｌｌ）にすることによって製造される。

このヒドロキシオキザリル−リガンド類似体はカプリン
グ剤たとえは１−エチル−３−（３′　−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩と不活性溶媒との存
在下で上記式（ＩＶ）のアミノフルオレセインと反応さ
せると次式（Ｖ門） をもつ本発明のトレーサーかえられる。

１ であるとき、本発明のトレーサーは式（■）Ｒ−Ｗ（Ｒ
ｉｉ上記定＾のとおりであり、Ｗは反Ｔｌｔ；性窒素（
第１級または第２級アミン）またはヒドロキシ画業に結
合している水素である〕をクロロスルホニルイソシアネ
ートと反Ｊｉ？にさせて式（Ｘ）１ ガント類似体Ｍｊ導体を生成させることによって製造さ
れる。

このクロロスルホンアミドカルボニル−リガンド類似体
誘導体を式（ＩＶ）のアミノフルオレセインと反応させ
ると次式　゛（刀） Ｈ をもつ本発明のトレーサーかえられる。

本発明のトレーサーの製造のだめの反応が進行する温度
は臨界的ではない。湿度は反応を開始させ維持するのに
十分なものであるべきである。一般に、簡便性および経
済的地山がら、室温で十分である。本発明のトレーサー
の製造において、反応試剤の比率は狭い臨界的なもので
はない。たとえば式（■）の化合物の１モル当り２モル
のクロロスルホン酸を使３７− 用して合理的な収率を得るべきである。反応の谷易さ及
び反応生成物の回収のために過剰のクロロスルホン酸を
使用するのが好ましい。

本発明のトレーサーの製造における出発物質として使用
する式（ＩＶ）の化合物は商業的に入手しうる、または
周知技術により製造しうるものである。

生成物の取扱いおよび回収を容易にするために、本発明
のトレーサーを製造する方法は溶媒の存在下で行なわれ
る。好適な溶媒は出発物質と実質的に反応せず且つ出発
物質を溶解するのに十分な溶媒類であって、たとえばア
セトン、クロロホルム、ピリジンなどがあけられる。最
大収率を得るために、反応は好ましくは中性もしくは塩
基性の条件下で進行させる。

好適な塩基にはたとえばトリエチルアミン、ピリジンな
どが包含される。反応生成物は薄層クロマトグラフまた
はカラムクロマトグラフを使用して一般的に＃に製して
から本発明の万６８− 法に使用する。

本発明の方法によれば、測定すべきリガンドを９む試料
に式（１）のトレーサーの生物学的に許容しうる塩およ
びりヵオドとトレーサーに対して特定的な抗体をまぜる
。試料中に存在するりガントおよび該トレーサーは競合
して抗体の場を限定し、それによってリガンド−抗体の
錯体およびトレーサー−抗体の錯体が生成する。トレー
サーおよび抗体の濃度を一定に保つことによって、生成
したりガント−抗体の錯体とトレーサー−抗体の錯体と
の比率はサンプル中に存在するりガントの鼠に直接的に
比例する。それ故、この混合物を螢光で励起させ、トレ
ーサーおよびトレーサー−抗体錯体によって放出ぢれる
螢光の偏光全測定すると、試料中のりガントの鼠を定量
的に測定することができる。

理論的に、抗体に錯結合しないトレーサーの螢光偏光は
低く、ゼロに近い。特定の抗体と錯結合すると、このよ
うにして生成されたトレーサー−抗体の鉛体は、比較的
小さいトレーサー分子の回転よりもおそい抗体の回転を
呈し、それによって観察される偏光が増大する。それ故
、リガンドか抗体の場についてトレーサーと競合すると
、トレーサー−抗体錯体の螢光の観察された偏光はトレ
ーサーの螢光偏光とトレーサー−抗体錯体の螢光偏光と
の間のどこかにある値になる。試料が高濃度のりガント
を含んでいると、１１１６先の観察値は遊ン１ｔリガン
ドのそれに近い、すなわち低い。試験試料か低濃度のり
ガントを含んでいると、偏光の値は結合リガンドのそれ
に近い、すなわち高い。免疫分析の反応混合物を垂直偏
光とそれにつづく水平偏光によりひきつづいて励起させ
、放出光の垂直成分のみを分析することにより、反応混
合物の螢光の偏光と濃１りとの「１）１の関係は既知濃
度についてのキャリブレーションの偏光値をｉｉｌ！Ｉ
定することによって確立される。リガンドの濃度はこの
方法で作成した標準曲線から外挿することができる。

本発明の方法を実施する際のＩ）Ｈは式（１）のトレー
サー奄そのイオン化状態で存在させるに十分なものでな
ければならない。このｐ）（は約３〜１２の範囲、より
普通には５〜１０の範囲、最も好ましくは約６〜９の範
囲でありうる。種々の緩衝液を使用して分析操作中のｐ
Ｈを保持することができる。

代表的なａ術部にはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリ
ス、バルビタールなどがある。使用する個々の緩衝液は
本発明にとって臨界的ではないが、使用する抗体および
測定すべきりガントを考慮して特定の緩衝液を使用する
のが好ましい。緩衝液のカチオン部分は溶液中のトレー
サー塩のカチオン部分を一般に決定する。

本発明の方法は温和な１Ｍ度で且つ好ましくは一定の温
度で実施される。この温度はふつうには約０〜５０℃、
よりぶつ４１− うには約１５〜４０℃の範囲にある。

分析しつるりガントの濃度は一般には約１０−２〜１０
−１３Ｍ、よりふつうには約１０−６〜１０”Ｍの範囲
にある。より高濃度のりガントはもとの試料を希釈して
分析することができる。

関心のあるリガンドの濃度範囲の他に、分析が定性的で
あるか、半定に的であるか、定量的であるかというよう
な考慮、使用する装置、ならびにトレーサーと抗体の特
性が使用すべきトレーサーと抗体の濃度をふつうには決
定する。試料中のりガントの濃度により他の試剤すなわ
ちトレーサーおよび抗体の濃度を決定して分析感度を最
適化するのがふつうであるけれども、個々の試剤の濃度
は実験的に決定される。トレーサーおよび抗体の濃度は
当業者か容易に確かめることかできる。

＋ｉｉＪ述のＶ目＜、本発明の好ましいトレーサーは５
−アミノフ４２− ルオレセインまたは４−アミノフルオレセインから製造
すれ、好ましくけ下記式（Ｘｌｌ　）および式（Ｘｊｌ
ｌ）の異性内傾として存在する。なお、これらの式中の
ＲおよびＸけ前記足腺のとおりである。

ＬＪ 明の範囲の特定トレーサーを製造する方法を当業番に史
にカ示するだめのものである。これらの夾ノ池例中でφ
！ｉ造さｔする化合物を示す禍造式中に記載の符号（Ａ
Ｐ）は次式の部分を衣わす。

１−１ なお上記式中のイミノ室光は、出発物資として使用する
特油のアミノフルオレセイン異性体に依存して、上記式
中の４位またり５位に結合する。

実施例１゜ ０７１ｇのリドカインに２．８ｙのクロロスルポン酸を
加え、えられた混合物を６０℃において１時間加熱した
。反ルレ、混合物を冷却し、砕氷および水をこの混合物
に加えて未反応クロロスルホン酸を消滅させた。えらｔ
′した水溶ｊｙを水酸化ナトリウムを使用してｐＨ７に
中和した。えられた生成物を１０−づつのメチレンクロ
ライドで２回Ｊｔｈ出したつメチレンクロライド抽出物
を集めて＆ｆ　酸ナトリウム上で乾燥し、濾過して蒸発
乾固し７、ゴム質油状物としてｉｏｏ〜のメタ−および
パラ−クロロスルホニルリドカイン混合物をえた。ピリ
ジン０５ｍ１　中に５９の４−アミノフルオレセインを
含む溶液に上記のクロロスルホニルリドカイン混合物５
ダを加えた。１０分後に粗生成物が生成した。シリカゲ
ルおよび展開用ｆ７Ｉ媒としてクロロホルム、次いでク
ロロホルム：アセトン（ｉ：１）？＋を合物そして最後
にクロロホルム：メタノール（１：１）混合物を使用し
て薄ノ饅クロマトグラフにより粗生成物を＃＃製して次
の一般式のスルホニル−リドカイン−アミノフルオレ七
イ＝４５− ン共役体の混合’４５＋をえた。

実施例２ １２ｇのフェノバルビタールに４．５Ｉのクロロスルポ
ン酸を徐々に加え、えられた混合物を６０℃において１
時１ム１加熱１〜ｋ。反１１１″、？混合物を冷却し、
砕氷および水をこの混合物に加えて未反応クロロスルホ
ン酸を消滅させた。この反応混合物を次いで濾過して白
色沈殿物を得た。これを水で洗い、真空デシケータ中で
乾燥して０．８ｇのメタ−およびバラークロロスルホニ
ルフエノバルビタール混合物をえた。融点１９０〜１９
５℃。ピリジン０．５　ｗｔ中に５９の５−アミノフル
オレセインを含む溶液に上記のクロロスルボニルフエノ
バルビタール混合物５ＴＩｖを加えた。１０分後に粗生
成物か生成した。シ４６一 リカゲルおよび展開用溶媒としてクロロホルム：メタノ
ール（２：１）７Ｍ合物を使用して薄層クロマトグラフ
技伶により粗生成物を２回精製して次の一般式のスルホ
ニルフェノパルビタールーアミノフルオレセイン共役体
をえた。

実施例３゜ ２ｇのα−７エネチル−α−メチルサクシニミドに２．
５１７のクロロスルホン酸を滴下状に加え、えられた混
合物を２６℃において１時１１）ｊかくはんした。砕氷
および水をこの混合物に加えて未反応クロロスルホン酸
を消滅させた。生成した反応生成物を１０−づつのクロ
ロホルムで２１１！Ｉ抽出した。クロロホルム抽出物を
集めて硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発さルとの混合物
から再結晶させて０．２９１１のα−（メタ−およびパ
ラ−クロロスルホニルフェネチル）−ａ−メチルサクシ
ニミド混合物をえた。融点１４５〜１５０’Ｃ。ピリジ
ン０５ｍ１中に５９の４−アミノフルオレセインを含む
溶液に上記のα−（クロロスルホニルフェネチル ミドの５９を加えた。１０分債に、生成した粗生成物を
集め、シリカケルおよび展開用溶媒としてのクロロホル
ム：メタ／−ル（２：１）７ｉｆ．金物を使用して薄層
クロマトグラフにより２回梢装Ｌ　次式のａ−（スルホ
ニルフェネチル）−αーメチルサクシニミドーアミノフ
ルオレセイン共役体の混合物をえた。

実施例４。

クロロホルム５〇−中に２Ｉのイミノスチルベンと２ｒ
ｎｅのトリエチルアミンとを含む溶液に、ｉ．５Ｉｉの
メチルオキザリルクロライドを加えた。えられた混合物
を１時間還流させ、次いで蒸発乾固した。残渣を５０艷
のクロロホルム中にとりあげ、次いで５０ｍｌの水で抽
出した。クロロホルム層を蒸発乾固した。この残渣に２
Ｎ−水酸化ナトリウムの１００ｍＡを加え、えられた混
合物を６０分曲還流させた。この混合物を室温に冷却し
、次いで５０−のクロロホルムで抽出した。濃塩酸を使
用して水性層をｐＨ１に酸性化し、次いでエーテル１０
０ｍｅで抽出した。有機抽出物を硫酸す）　ＩＪウム上
で乾燥し、蒸発乾固した。この残渣を５０−のメタノー
ル中にとりあげ、水ですりつぶして結晶物をえた。この
混合物を沖過し、結晶を１６時間冷却して２４ｆ１のＮ
−ヒドロキシオキザリル−イミノスチルベン（融点１６
２〜１６３℃）をえた。

４　９− このＮ−ヒドロキシオキザリル−イミノスチルベンの５
＃Ｉ／／に、ピリジン０５−中５〜の４−アミノフルオ
レセインを含ｔｒｆｒ：！液を加えた。反応を２６℃に
おいて２１１ηｌｉＹｌ進行させてＵｔ生成！吻をえｌ
ｃＯこの粗生成４ｈを、シリカゲルおよびクロロホルム
：アセトン（１：１）混合物から成る展開用溶液を使用
してＮｊｌｄクロマトグラフにより精製して、次式のＮ
−オギザリルーイミノスチルベンーアミノフルオレセイ
ン共役体をえ１；記のｈ法によりＦ記のトレーサー９μ
を装造した。

実施例５ ５　０− 実施例６゜ ＣＨ３ 実施例Ｚ １１３ 実施例８ 実施例９ アミノフルオレセイン共役体 実施例１０ ＣＨ３ 実施例１１８ ５３一 実施例１２ 実施例１３ ５４− １ ０ 実ｈＩＩ例１４ 実施例１５ レセイン共役体 ４ 実加ｉ４シリ１６ ン共役体 実施例１Ｚ ン共役体 実施例１８ 実施例１９ ン共役体 ５７− 実施例２０ ン共役体 前述のように、本発明のトレーサーは螢光偏光免疫分析
に使用するだめの有効な試剤である。以下の実施例は螢
光偏光技術を使用する免疫分析における本）ｈ明のトレ
ーサーの好適性を説明するものである。このような分析
は次の一般操作に５８− 従って行なわれる。

１）測定した容量の標準または試験ｍ１涜を試９吃管に
入れて緩倫液で希釈する。

２）任意に表面活性剤を含む、既知濃度の本発明のトレ
ーサーをそれぞれの試験管に加える。

３）既知濃度の抗血清を試験管に加える。

４）反応混合物を室温で培養する。そして５）試料中の
りガントの１ｄの尺度として、抗体に結合したトレーサ
ーのｌｉｔを螢光偏光技術により測定する。

実施例２１　　リドカイン分析 材料： １）緩街液：００１％（重量／容置）のアジ化ナトリウ
ムおよび００１％（止址／容は）の牛のγ−グロブリン
を含むｐ　Ｈ７５の０．１Ｍリン酸塩溶液（以下“ＢＧ
Ｇ緩衝液術部１１デぶ）。

−ｌ−）　ＩＪ　ラム、０．０１％（車量／容量）の牛
のγ−グロブリンおよび００１％（重［ｄ／容１迂）の
アジ化ナトリ１ンムを含む１）　Ｈ７，８の０．１　Ｍ
　トリス塩酸魅を緩１釘液中の２．３４　Ｘ　１０−７
Ｍの濫用のスルホニルリドカイン−アミノフルオレセイ
ン共役体（実施例１で製造したもの）。

３）抗体：　　ｎｏｏ５衝液中にに８０に希釈したリド
カインに対するウサギの抗血清。

４）標準試料または未知試料二〇〜１０μ９／−の濃度
範囲のリドカインを含むヒトの血清（または他の生物学
的流体）。

５）Ｗ光ｎ光計：　　ｌＸ１０−９Ｍのフルロレセイン
浴液ノ螢ツＣの偏光を±０００１偏光単位偏光側定しう
る憔器。

分析法： １）２０μｌの標準および未知試料に２００μｌのＢｏ
Ｏ稜衝液術部える。

２）培養・１・中の希釈した標準および未知試料の各２
０μｌに２００μｊのＢＧＧ緩備液を加える。

６）希釈した標準および未知試料の入れであるそれぞれ
の培養管に４０μｊのトレーサーおよび１０００μｌの
１３８　Ｇ鞍術部を加える。

４）次いで４０μｌの抗体および１０００μｌのＢＢＧ
＠衝液を術部ぞれの培養管に加える。

５）試剤を混合し、標準および未知試料を入れである培
養管を２３℃において約１５分間培養する。

６）　　ｔべての培養管の螢光偏光を測定する。標準試
料の代表的な結果を第１表に示す。

第１表 １０．０　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
７１偏元値はリドカイン濃度の増大につれて減少し、標
準曲線の作成を可ＴＪ目にする。同様に処理した未知試
料杖この標準曲線を参照して定量できる。

実施例２２．　　フェノバルビタール分析材料： １）ＢＧＧ緩価液 ２）トレーサー：　５７５％のナトリウムコレート中の
５．７５ｘ１０’Ｍの濃度の（バラ−メチル−メタ−ス
ルホニル）フェノパルビタールーアミノフルオレセイン
共役体（実施例２で＃造したもの）。

３）抗体：　　ＢＧＧ緩＆液中で１ニア８．３に希釈し
た、フエノバルビタールに対するウサギの抗血清。

４）標準試料または未知試料二　０〜８０μＩｌ／−の
濃度範囲のフェノバルビタールな含むヒトの血清（また
は他の生物学的流体）〇 ６２− ５）、螢光偏光計：　　１）１０−’Ｍのフルオレセイ
ン溶液の螢光の偏光を±０００１偏光単位偏光側定しう
る機器。

分析法： １）２０μｌの標準および未知試料に２００μｌのＢＧ
Ｇ緩衝液を加える。

２）培養管中の希釈した標準および未知試料の各２０μ
ノに２００μｌのＢ　Ｇ　Ｇ紗術部を加える。

６）希釈した標準および未知試料の入れであるそれぞれ
の培養管に４０μｌのトレーサーおよび１０００μｌの
ＢＢＧ緩衝液を加える。

４）次いで４０μｌの抗体および１０００μｌのＢＢＧ
緩＠液をそわそれの培養管に入れる。

５）試剤を混合し、標準および未知試料を入れである培
養管を２６℃において約１５分曲培養する。

６）すべての培養管の螢光偏光を測定する。標準試料の
代表的な結果を第２衣に示す。

第２表 ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５５
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０
８２０　　　　　　　　　　　　　０．０９２４０　　
　　　　　　　　　　　０．０７４ａｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｏ、ｏ６゜偏光値はフエ
ノバルビタール濃度の増大につれて減少し、標準曲線の
作成ＱｉＪ’１ヒにする。同様に処理した未知試料はこ
の標準曲線を＃Ｊｌ＜ｆして定量できる。

林料： １）ＢＢＧ緩衝液 （ ２）トレーサー二　０２％（車量／容量）のナトリウム
コ　　　　　　　：ｉレートを含むＢＧＧ緩ｍ液中の２
ｎＭの濃度のＮ−オキザリルイミノスチルベン−アミノ
フルオレセイン共役体（実施１刈４で製造したもの）。

３）抗体：　　ＢＧＧ緩衝故中で１：３０４０に希釈し
た、カルバマゼピンに対するウサギの抗血清。

４）標準試料または未知試料：　０〜２０μＩ／−のｍ
度範囲のカルバマゼピンを含むヒトの血清（または他の
４・勧学的流体）。

５）螢光偏光計：ｌＸ１０’ＭのフルオレセインＭ’ｆ
＆の螢光の偏光を±０００１偏光単位偏光側定しうる機
器。

分析法： １）１０μｌの！！：４準および未知試料に６００μｌ
のＢＧＧ綾倫液を加える。

２）培養管中の希釈し大椋準および未知試料の谷１０μ
ｌに６００μｌのＢＧＧ緩衝液を加える。

３）それぞれの培養管に１−のトレーサーを加える。

６５− ４）ｅＫいで１．　Ｏｔｔｒｔの抗体をそれぞれのＬｆ
Ｓｌ管に加える。

５）ｊａ：剤を混合し、＠Ａ卓および未知試料を人ねで
ある摘頁管を２６℃において約１５分曲培養する。

６）すべての培養管の螢光偏光をγ１１！Ｉ定する。標
準試料の代表的な結果を第３衣に示す。

第３表 Ｌｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
２２４２０，１０８ ４０，１３５ ８０，１０５ １２０，０８８ ２００，０７７ 偏Ｊｔ、値ｄカルバマゼピン濃度の増大につれて減少し
、標準面９１＋のｆ′「成をｐｆｊ４？、にする。同様
に処理した未知試料はこの標？−曲脚を参１ｔ（４して
定重できる。

６６− 下記の第４衣は前述の実施例で製造したトレーサー類を
使用し、上述の方法により行なった細々の螢光偏光免疫
・分析をまとめたものである。使用したトレーサーは実
施、例査号で表示してあり、測定した特定のリガンドは
表中に示しである。

トレーサー ２　　　　　　　　　　　　フエノバルビターソレ３　
　　　　　　　　エトサキシミド ４　　　　　　　　　　カルバマゼピン５　　　　　　
　　　　ブリミドン ６　　　　　　　　　　プリミドン ７　　　　　　　　　　フエノバルビタール８　　　　
　　　　　フェニトイン ９　　　　　　　　　エトサキシミド １０　　　　　　　　　　　フ“ロパノロール１１　　
　　　　　　　　　カルノくマゼピン１２　　　　　　
　　　　ブロカインアミド１３　　　　　　　　　　ク
ロラムフェニコール１４　　　　　　　　　　シソピラ
ミド１５　　　　　　　　　　キニジン １６　　　　　　　　　　　　フ“ロパノロール１７　
　　　　　　　　プロ力インアミド１８　　　　　　　
　　　Ｎ−アセチルプロ力インアミド１９　　　　　　
　　　　デスイブラミン；イミプラミン２０　　　　　
　　　　　　ノルトリブチリン；アミトリブチリン上記
の結果から明らかなように、本発明のトレーサーｔｉｔ
螢光偏光免抄分釘の有効な試剤である。上記の件油に加
えて、本発明のトレーサーは尚ルの熱安定件、篩ルの結
合偏光、尚度の］ｌ↓子収率をもち、且つ比較的容易に
製造および精製しうるものである。

本発明を特定の具体例について述べたか、そのｔ）ミ細
は本発明を限定するものと解釈すべきではない。それは
、種々の均等物、変化および変性か本発明の精神および
４ＬＪＩｌから逸脱することなしに実施しうろことは当
業者にとって明らかであり、このような均等な具体例か
本’ｉｔ＝明に包含されることか理解されるからである
。

％ｌｆ１・出願人　アボット　ラボラトリーズ化　　理
　　人　　弁理士　　川　　瀬　　良　　治〃　　　　
　　　〃　　　角　　藤　　武　　邸第１頁の続き （［株］発　明　者　マイケル・アーネスト・ジョレイ アメリカ合衆国イリノイ州うウ ンド・レーク・ボックス１３３ル ート・ナンバー１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次式（１） のカルホ゛アミドスルホニル基から成る計からえらばれ
   た基であり；Ｒｄ−リガンドｍｆＩＪ体であり、Ｂ’ｉ
   　’Ｊ力゛ンド頒似体は共通の抗体によって特定的に認
   識しつるように、少なくとも１つの、該リガンドと共通
   するエピトープをもつ〕をもつ化合物および生物学的に
   計容しうるそのｊν。 〔式中のＲは１００〜２０００の乾回の分子−をもつり
   ガント類似体であって、該リカンド類似体幻共辿の１４
   １体によって勉足的にｍｂしうるように、少なくとも１
   つの、該リカンドと共通するエビドーグをもち、また該
   リガンド類似体をスルホンアミドフルオレセイン部分に
   結合させる芳香族炭宋を寛つ〕 をもつ特許請求の範囲第１項記載の化合物および生物学
   的に許容しうるその塩。 ３　次式をもつ特許請求の範囲第２項記載の化合物およ
   び生物学的に許容しうるその塩。 または ４　Ｒがステロイド、ホルモン、抗せん幻剤、抗肺掲剤
   、抗不整脈剤、抗けいれん剤、抗生物質、抗関節灸剤、
   抗うつ剤および強心剤グリコシドから成るｔＩＦからえ
   らばれたリガンドから島尋されたものである特許４７．
   ｌ求のｍｌ！ｉｌ第３項記載の化合物。 ５　Ｒか抗不整脈剤からあ坤されｌ（ものである特許請
   求の範１１１」第４項記載の化合物。 ６　Ｒかりドカインから誘導されたものである時計η＾
   求の範囲第５項記載の化合物。 ７　　Ｒかα式の基である特許請求の範囲第６項記載の
   化合物。 ＣＨ。 ８　Ｒか抗けいれん剤から誘導されたものである特許請
   求の範囲第４ｍ記載の化合物。 ９　Ｒがフェニトインから誘導されたものである特許請
   求の範囲第８項記載の化合物。 １０　ｌ？か次式の基である特許ＭｉＶ求の範囲第９項
   記載の化合物。 １１　ｌ？かプリミドンから誘導されたものである特許
   請求の範囲第８項記載の化合物。 ５− １２、　Ｒか次式の基である特許請求の範回第８項記載
   の化合物。 Ｒ′ 〔式中のＲ′は１〜４個の炭素原子をもつアルキルであ
   る。〕１３、Ｒがエトサクシイミドから＝１ｎされたも
   のである特許請求の範囲第８項記載の化合物。 １４、Ｒが次式の基である特許請求の範囲第１３項記載
   の化１５　次式 ＯＨ 〔式中のＲは１００〜２０００の範囲の分子量をもつり
   ガント類似体であって、該リガンド類似体は共通の抗体
   によって特定的に認識しうるように、少なくとも１つの
   、該リガンドと共通するエピトープをもち、そしてヒド
   ロキシ酸累または反応性アミンを介してカルボアミドス
   ルホニルアミノフルオレセイン部分に結合している〕 をもつ特許請求の範囲第１項記載の化合物および生物学
   的に許容しうるその塩。 １６、次式をもつ特許請求の範囲第１５項記載の化合物
   および生物学的にｉｆｆ’容しうるその塩。 または １７、Ｒかステロイド、ホルモン、抗ぜん息剤、抗―剤
   、　　　　　　　〜抗不整脈剤、抗けいれん剤、抗生物
   穎、抗関節炎剤、抗う　　　　　　　　１つ剤および強
   心剤グリコシドから成る群からえらばれたりガントから
   ｔｊ導されたものである特Ｗｆ晶求の＠囲第１６項記載
   の化合物。 １８、Ｒが抗けいれん剤から籾尋されたものである特許
   請求の範囲第１７項記載の化合物。 １９　Ｒがカルバマゼピンから誘導されたものである特
   ＃！Ｆ紬求の範囲第１８項記載の化合物 ２０、　Ｒが次式の基である特許ｔｌｉ’ｆ求の範囲第
   １９項記載の化合物。 ２１、　Ｒか抗不整脈剤からあ導されたものである特ｔ
   ｔ紬求の＠すｒ１第１７項記載の化合物。 ２２、Ｒかプロ力インアミドから誘導されたものである
   特許請求の範囲第２１項記載の化合物。 ９− ２５、Ｒかプロア′ラノロールから♂ｆｊＭされたもの
   である特Ｗ１・請求の範囲第２１項記載の化合物。 ２４、次式 〔式中のＲ＆ｊ：１００〜２０００の範囲の分子量をも
   つりガント類似体であって、該リカ′ンド石似体０共而
   の抗体によって特走的にルｇ緑しうるように、少なくと
   も１つの該リガンドと共通するエピトープをもち、また
   該リガンド類似体をオギザリルアミノフルオレセイン部
   分に結合させる反応性窒素をもつ〕 をもつ特許請求のｉｍｖｓ第１項記載の化合物および生
   物学的に１０− 許容しつるその塩。 ２５３次式をもつ特許請求の軛１ｉｈ第２４項記載の化
   合物および生理学的に許容しうるその塩。 または ２６、Ｒがステルイド、ホルモン、抗ぜん息剤、抗１１
   ！ｔｔＪＭ剤、抗不整脈剤、抗ゆいれん剤、抗生物質、
   抗関節炎剤、抗うつドから訪辱されたものである＋γ許
   ｍｌ求の範囲第２４項記載の化合物。 ２７、Ｒか抗うつ剤からｂ導されたものである特許請求
   の範囲第２６項記載の化合物。 ２Ｂ、Ｒがトリサイクリック系薬剤から誘導されたもの
   である特許請求の範囲第２７項記載の化合物。 ２９、Ｒかノルトリブチリン、アミトリブチリン、イミ
   プラミンまだはデスイブラミンから誘導されたものであ
   る特ｉｆｆ　ＢＦ３求の範囲第２６項記載の化合物。 ５０、Ｒか抗けいれん剤から訴等されたものである％許
   請求の範囲第２９項記載の化合物。 ６１、　Ｒかカルバマゼピンから誘導されたものである
   特許請求の範囲第３０項記載の化合物。 ３２、Ｒか次式の基である特許請求の範囲第３１項Ｊ［
   １蔽の化合物。 ６３　次式（１） らえらばれた基であり；Ｒはリガンド類似体であり、該
   リガンド類似体は共通の抗体によって特足的にＷ４ｂＬ
   うるように、少なくとも１つの、該リガンドと共通する
   エビトーフをもつ〕をもつトレーサーの生理学的に許容
   しうる塩および該リガンドと該トレーサーを特定的にｍ
   ＝しうる抗体を試料にまぜ、次いで試料中のりガントの
   尺度として螢光偏光技術によりトレーサー−抗体の共役
   体の量を測定することを特徴とする試料中のりガントの
   測庁法。 ３４、次式 〔式中のＲは１００〜２０００のｌｉｑ′ｉ囲の分子量
   をもつりガント類似併であって、該リガンド類似体は共
   ｉｉＩノの抗体によつ′て特定的に詔諌しうるように、
   少なくとも１つの、該りガントと共通するエピトープを
   もち、また該リガンド類似体をスルホンアミドフルオレ
   セイン部分に結合させる芳香族炭素をもつ〕 をもつトレーサーの生理学的にＷト容しうる塩および該
   リガンドと該トレーサーを特定的に認ｉ＾しうる抗体を
   試料にまぜ、次いで試料中のりガントの清の尺度として
   螢光偏光技術により抗体に結合したトレーサーのｈｌを
   測定することから成る特許請求の範ＩＩｆｌ第６６項記
   載の方法。 ｓ５．　　Ｒ４６に結合しているスルホンアミド基か該
   フルオレセイン部分の４位または５位にも結合している
   特許請求の範囲第３４項記載の方法。 ３６　該リカンドかステロイド、ホルモン、抗せん、ｅ
   剤、抗抗うつ剤、強心剤グリコシド、まｆＣｉＬその代
   願物質である特ｉｉ１’ｌ’ｉｌ！ｌ求のｌｌ１１！聞
   第３５項記載の方法。 ３７　■（か５０〜４０００の範囲の分子ｈ１をもつ特
   許請求の範囲第３６項記載の方法。 ３８、Ｒか１００〜２０００の範囲の分子１貸全もつ特
   許請求の範囲第３４項記載の方法。 ３９　該リカンドか抗不整脈剤である特許＃＋′ｉ求の
   Ｎ７ｔｂｉ第３８項記載の方法。 ４０　抗不整脈側方リドカインである符軒８６求の範囲
   第３９項記載１の方法。 ４１、　　該リガンドが抗けいれん剤である特許請求の
   範囲第°°項記載０方法・　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　ｊ４２　抗けいれん剤がフー
   ＝トインである符ＷＦＨ＊求の範囲第　　　　　　　□
   ゛４１項記載の方法。 ４３　抗けいれん剤かプリミドンである特許請求の範囲
   第４１項記載の方法。 ４４、抗けいれん剤がエトサクシイミドである特許請求
   の範囲第４１項記載の方法。 ４５、次式 〔式中のＲは１００〜２０００の範囲の分子量をもつり
   ガント類似体であって、該リガンド類似体は共通の抗体
   によって特定的に詔誠しうるように、少なくとも１つの
   、該リガンドと共通するエピトープをもち、そしてヒド
   ロキシ酸素また１反元、性アミンを介してカルボアミド
   スルホニルアミノ基の部１７− 分に結合している〕 をもつトレーサーの生理的に計容しうる埴を試料にまぜ
   ることから成る特Ｆｊ＋請求の範１Ｉ１１第３３項記載
   の方法。 ４６、Ｒ基に結合しているカルボアミドスルホニルアミ
   ノ基が該フルオレセイン部分の４位または５位にも結合
   している特許請求の範囲第４５項記載の方法。 ４Ｚ　該リガンドがステロイド、ホルモン、抗ぜん息剤
   、抗腫瘍剤、抗不整脈剤、抗けいれん剤、抗生物質、抗
   関節炎剤、抗うつ剤、強心剤グリコシド、またはその代
   誦物質である特許請求の範ｌ１１１第４６項記載の方法
   。 ４８、　Ｒが５０〜４０００の範囲の分子量をもつ特許
   請求の範囲第４７項記載の方法。 ４９　　Ｒがｉｏｏ〜２０００の範囲の分子量を吃つ特
   許請求の範囲第４８項記載の方法。　　□ ５０　該リガンドか抗けいれん剤である特許請求の範１
   １ｆｌ第４９項記載の方法。 ５１　抗けいれん剤かカルバマゼピンである特許請求の
   １１４２回第５０項記載の方法。 ５２、次式 〔式中のＲは１００〜２０００の範囲の分子量をもつり
   ガント類似体であって、該リガンド類似体は共通の抗体
   によって特定的に認識しうるように、少なくとも１つの
   、該リガンドと共通するエピトープをもち、また該リガ
   ンド類似体をオギザリルアミノフルオレセイン部分に結
   合させいる反ＪｉＱ＋件窒素をもつ〕 をもつトレーサーの生理学的に許容しうる塩を試料にま
   ぜることから成る特許請求の範囲第３６項記載の方法。 ５３、　Ｒ基に結合しているオキザリルアミノ基か該フ
   ルオレセイン部分の４位または５位にも結合している特
   許請求の範し１１第５２項記験の方法。 ５４　該リガンドがステロイド、ホルモン、抗ぜん車側
   、抗ｌｌ１１！瘍剤、抗不整ＨＪｒｅ剤、抗けいれん剤
   、抗生物質、抗関節炎剤、抗うつ剤、強心剤グリフシト
   、またはその代謝物質である特ｉｆ！ｌ−請求の範囲第
   ５３項記載の方法。 ５５、Ｒが５０〜４０００の範し月の分子量をもつ特、
   ｆ′ｌＩ梢求の範し１１第５４項記載の方法。 ５６、Ｒか１００〜２０００の範ｕＢの分子量をもつ特
   許請求の範囲第５５項記載の方法。 ５７　該リガンドが抗けいれん剤である特許１ｉ′Ｉ求
   の軛め１第５６項記載の方法。 ５８、抗けいれん剤かカルバマゼピンである特許請求の
   範囲第５７項記載の方法。