IT8249114A1 - Procedimento per la preparazione di insulina umana e suoi esteri. - Google Patents

Description

DOCUMENTAZIONE

RILEGATA

49114*82 315-4? 7/AC

DESCRIZIONE

^ ? !

_ -3 _ c o r r e d o_ d i _un a _d o m a nd a . . d i_.br e ve tto per .in ve n z i o n e [avente per titolo :

- - -jlProaedimento _per_.la-_prepar azione .di. insulina .umana

r

-je? su o i- e s t e r i -' ?

Ja-nome : K0RDI5K .IKSULINLABORATORIUM.

Descrizione modificata

(ort. 43 D.P.R. n. 338/1979)

istanza dep. il <9.6.1^85<^ >RIASSUNTO

o~ t/i ? ?_'""??????-<|>--. In sulina umana^ovvero suoi. B-30... est eri. ..vendono _ preparati, facendo ..reagire un_derivato_.dell ' insulina ^

o

.-del la_ formula _

(1 ? r? A? 21 ) ?

oc i

<?>?<' >(_1-J? B- J-29) -R XIX -C -in cui- R -?. un os sidri le. _o _un_r a di c a 1 e_.d i . amm ino a ci?o _ 2eL_..

co -che -sia-diverso dalla, treonina, ed.?-A-_e.._r-B-.. rappre-_ sentano le -A-_ e_B-catene con? la.. medesima. _seauensa

_ t :di- amminoacidi, che si. trov.a.-nell <1 >insulina umana , .

i <r >con _ - ?un ...derivato della L-rtreonina_c on__un._ carbossile pr?- _ _ _ J l tetto. e. ..facoltativamente... c.on_ un ossidrile_protetto _ _ j

_ iad-una. c.onc en trazione. da__2.v5_a ...circa .6 m o li_.per . li- _ _ Ltr.o_in- presenza _di.-?ripsina_o. di. un_.enziraa_simile.- _ .... _ la 1 1 a._t r ip ? i n a ...i n_.un__m e s z_o_di. . r eazione c on t enent e a c - _ - iqua e- facoltativamente anche .un .co solvente organico . _ _ ! ad .un .valore, del.. pH . di 5^fino_ a..?9. _e. .ad una tempera- _ _ iiura._ inferi ore a.. 50_?C, operazione seguita , se si de- _ .iIsidera, dalia-rimozione -dei gruppi-protettivi -presen.--

Llinsulina^umana-vlen e.-prenara ta-in_un_modo. ai-

cile___e_s.emplice con_una_r.esa..elevatq. ed.una,elevata,.

<?>Durezza,

__ DESCRIZIONE.-!DELLiU IM EHZIOME .

_la__presente...invenz_ione_si riferisce ad un pr?-:

-? e?--cedimento originale per~la preparazione di .insulina.-. iSX-! <' ? >!

lumana o dei suoi B-jQ esteri. ?-

.Per.molti__anni._sono state usate svariate insuli- O Cc-

ne-nella-.cura._dei.diabeti..insulina-d?Dendenti.._Sarebr-. ci !be_naturale ..curare gli_e.sseri...umani_.c.on_!|J insulina

1

-umana la qual .cosa_non_?._possibile-,.-tuttavia, in_vi? I I - ! co -sta -della domanda, esistente...Perci?.v..per_ragioni

x? i I <~>

!

-pratiche -<? >sono -impiegate_.llinsulina_b ovina_e_JL_!_in_sjij I

J.1ina_porcin a.__Tuttavia,_in . un._grado_maggiore_o mino-

ire.,?queste.JLnsuline...provocano la formazione di anti-

!corpi. nel.corpo-umano, -la..qual_c.osa tra.l'altro com-

prende -un .effe11o ridotto de11?'ulteriore...trattamento

- :con-insulina .- -- T ._ j_ j_

_ _ !_ ^_Si suppone che ouesto svantaggio sia causato_in_ _

<? " ' " ">I . <'>

- .parte dalle -"impurezze<1>',nell 'insulina bovina/porcin.a _

i ' i

<1>

_ _ in-parte. dalla natura estranea.. Quest,?ultima si manii

_ festa per il fatto che la molecola dell'insulina u- . .

mana .differisce dalie molecole dell!insulina .des?i

altri-animali per alcune~differenze-nella? c.omposizio--

ine-dei componenti degli amminoa cidi,- -- l_

?.....?Grandi miglioramenti_spno__stati. ottenuti__per_

'quanto riguarda le -preparazionf-.delU _insulina_.dopo

?Li '-introduzione<; >dei -nuovissimi-procedimenti- di purifi-I

? [cazione, ma -la-formazione degli-anticorpi -nel-corpo _

? Lumano pu? ancora avvenire.-Si-Densa. -che.-ouesto.-nos-? - ~

<*? -sa-essere -rimediato-usando insulina-umana_al_DOsto..-^L.

-dell'insulina di altri animali.?

cx-O

-EL-noto-come_ pr.eparare_llinsulina_chimicamen.te;_c?

_ isi-veda. il brevetto statunitense No. 590^068 e il rat-eai _ LIavoro . di_.Hoppe-Seyler Z,_Physip1, Chem . 357, 759-$ - b ?67_.( ......_ V _ __ _

co .Questi-procediment i__comprendono_.. i.l.cpndensare

un-desoctapeptide~(B2 3-30)_d i_ insulina_.poreina.COIL

-un_octapeptide sintetico _cerrispendente alle posi-

-Lzioni B2.3-3?.ne11..'_insu1ina_umari.a_._Tuttatria. nel .pr.i-. I

?mo- procedimento ..si_effettua._un!ldr_o.lisi.._alcalina,_

?che ? accomp_agnata da sfavorevoli reazioni collate-

- f-rali.-Il-secondo_procedimentoH comprende ..una.reazione?

Lnon _.spec1fic_a __c.he_da.-.origine a numerose .reazioni ._ i? <1>

i-.collaterali. .e .richiede complicate tecniche di puri-

j_freazione..Di?conseguenza, _questi_.procedimenti non !?

Lsono -adatti _per__l_*impiego. su _scala_industriale ._

Anche- il-brevetto -statunitense No.?3276961-descri-.

ve-un- procedimento -per-la-prepara zione- dell?insulin a.umana._dalLe__.insul.in.e__di_a11ri animali., mediante

.1-!-azione_di.-un.enzima, per_esemp io_1a__c.arbossipepbi

i

dasi-A-o-la-tripsina,? in?presenza_di_treonina..? Tut-..-.,

-tavia,-n on-??stato-pr ovato-che sia_pos sibile^ prepare l?insulina umana in quantit? apprezzabili.con auesto procedimento-.noto. Questo ^probabilraente_?_d.ovut_o_

al ..fatto che la.tripsina e.la. carbossipeptidasi _Aj _

?

idrolizzano non solamente il legame peptidico lisil? ?r

._a1anina.XB2_9-B3.QX,._ma.. anche, altre posizioni dell.<1 >in- <?>T--sulina-n e11e-c ondizioni _di_re a1izzazi one.._3ja?.tripsina_ c>

!di._preferenza idrolizza il legame peptidico arpjnil--^licina -(B22-B23)? piuttosta_che_il__leRame_.lisil-ala-^

-nina .(B29-B30). Tuttavia,.^la.carbossipeptidasi. A.

<?>iSL _ inon .pu?-.esclusivamente scindere 1.'alanina. nel carbo-_

! i nio~.terminale_della...catena_ B_senza_scindere_anche_l_!_ _

t

-asparagina nel carbonio _.terminale_della_catena.. A_.._

J?i?_bardi _?._s.tat.o_jnostrato...ehe ? necessaria una coni1

--dizione- specifi ca, -per_esempio._1a..reazione,?in_una ....

! i

isoluzione -tampone di bicarbonato ..di._ainmoni.o.v._per._ ,_ ~impedire._il._r.ilascio delliaBparagina.,_..si_veda_di

Hoppe-Seyler Z.Phvsiol .-Chem. ,.359, ..799-602_.Xl9781

-Comunque,, una. considerevole formazione del^ peptide

Law iene scarsamente, poich? la velocit? della rea

Azione di -idrolisi ? pi? elevata di ouella della sin- - --tesi<. >-del-peptide-alle condizione- di_realizzazione. _ ..

* I _ Pi?_tardirsi..,?_..saputo.che .1..'aggiunta_di un_sol-_

-jvente organico -al mezzo -di -reazione-in -un-procediraen-! ..j_t_o__c.atalizzato.-_enzimaticamente-aumenta in_modo -rimar-_ ?

i

-jchevole -la velocita-della sintesi? di?legame-pentidi -- Sco e-diminuisce la velocit?-dell '-idrolisi-V-si-veda--?

<? >1 <1 ? >- ?fogalls-ed .altri, (1975),?Biotechn.-_Bioeng._17, -1627, _ Le-Homandberg-ed .altri, Biochemistry._17, -5220L-(1978.)... i.La concentra_zion_e_del solvente nei mezzo di reazio-^

ne dovrebbe e.ssere .elevata,__e .nell.'ult.imo_.rif.erimen^. ito-della-let-teratur.a ,?_aflermato_.che_quando.si impie.-^l :ga_.111,4?butanediolo come, solvente.__si_ottengono i_

-risultati migliori- ad una concentrazione.-de.lH 80-^^--del -detto solvente.- -,_ ,_ __ :J_

Tenendo .questo presente, .il_desoctapeptide-;.(.?23=?30_)-.delllinsalina .. (DOI) veniva copulato con .suoress o?medi.ante_cata lisi con tripsina con un octa-

pept-ide-sintetico -corrispondente alle posizioni? B23--B3_0__de.lll?nsulina. .umana .usando un eccesso (10:1) de!U liultimo_reagente_ ed _usando.._un . solvente.. organico_

I(-DMP.)-ad .una?concentrazione .maggiore di ..5-0-?;._si.^vei?

da-J-.? Ani . Chem.-Soc.-lOl,-751-752? (.1979)?? -La copula? -jzion e-proced e_con.-.una..resa_ragionevo1e,...ma,._consi j . <: >derate -tutte-le -cose ,. q.uesto._proc_edimento_ ?_ancpra> _ : C ost oso. ed....indaginoso , ._poich?_esso . richiede una _ dige-

st ion e_c.a t a li z z a t a_d<'>al 1 a_t r ip sina_de.HLin sulina_p.or-_

f

cina-per-f ormare -la-DOI?e ,? inoltre ,?l?octapeptide

-r ie hi e s t o -de V e_ e s s er e-pr e p ar a t o-a-m e zz o_di- una~ s in-f

tesi-complicata.. _ ; _ _ _ _ _

?Inoltre , _anche_ITa.ture_-280.,.JH2=^H3__(-1.9.?-9.)._! e._Blo-

chem .-Bionhys . Res . -Com . _92_No .-2,_596-??.02__( 1980) . _

I

descrivono un procedlmento_.per_la.._pr.eparazi.one_semir 4 e/> ? sintetica .dell <1 >insulina umana , mediante il quale 1 <1>

- Lala-B.30_nel U-in su 1 in a._n ore in a_vi e n e_. scambiai a con la o oc ! <' >! Q _ tr.eonina_.usando_ tripsina o _ ac r om oh atte ri opro te a si in oc ^ I -2 Oc3:L _ pre senz a _.di._HH^HCO^...per-f ormare la desalanina-B30- i _

O

_ : _ Li n su lina (DAI) . La copulazion e di DAI catalizzata <? >_

oc _ Lda tripsina o. acromobatteriooroteasi viene condotta

i -a :Saj ' co - impiegando un grande eccesso, di . un jderivato__prptei-- _

_ Lt o_ della -tre onina, _ cio? l ' estere butilico della _ ! _

|

I t

j tre onina ..(Ihr-OBu t )_..ne 1_ rannorto di 30/1 fino a 100/1

i ;

_ j e ad una elevata concentrazione di solvente organico.

i <* " '">?

vir c a ~60 $. -di -un a -miscela _di__dime .tilf.ormamm id.e.._e _di .

\

f

-et an o lo ? In ... tali- condiszoni . 1 a., sci s sione_.de l_lega-_

!

. _rae.. Arg(B22 ) -Gly(B23) ? 1 arsamente ridotta ._ _ j_

_ E?__. evidente dalla descrizione di cui sopra che

gli svantao;p;i del procedimento gi? noto. del. Jbrevet-

to statunitense Ho . 3276961 sono ..stati . rimediati ;

dal fatto che la. rea zionei viene condotta ad elevate concentrazioni.di-solventi organici,.ed.??stato tro-| vaio..che .1,'aumento, della_r_esa.??-in.relazione con il

grande...contenuto,di...so.1'venta..organico

Tut.tavia,...?..anc.ora una.caratteristica._importan-..

<1 >i te quella seconda la quale uno-dei reagenti ^ presen-

te-in-grande -ecdesso.-Tuttavia,-molti-dei-solventi--

pi? adatti proposti sono sospettati-di essere muta? ..

geni.,? e.-pOiche...essi,potrebbero_essere_di:fficili da___

rimuovere._coinpletemente.jdall.!.insulina_.ottenuta...come.

X

4> .prodotto,.1.'impiego.di detti,solventi?dovrebbe.-esse-

ire_evitato il..pi?-possibile ...

! E.!?1Q_scopo..de11a__pr_e.se.nt;e___.invenzi.one_que110

!di_fornire_un procedimento oer la_ conversione... d_i una ?

. .

!insu1ina___animale.,__preferibilmente _insu1ina suina on-

-pure il?suo-desalanin-BoO-derivato.,?.acLuna?insulina- ^

-umana .con?aIta resa e.senza-.usar.e_s.olventi__organici_

dannosi...

.E<1 >staio_.s_orprondeniemente trovato_ehe 1<1 >intro-

!duzione-della -treonina nella poslzione__B50.in.-una?

-insu-l-ina-usando?tripsina ow ero-.un-enzima_simile_al-_

-la-tripsina come catalizzatore.,pr.oc.ede_senza._incon-__

|venienti i.n un mez'ro_ac.quos_o.,__.qua.ndo.__la. concentrazio-

line molare-(?l .derivato,di?treonina.nel .mezz.o di rea-r_ j ;

?zione?viene mantenuta .al .d?..sopra di un certo eleva-! j ito_valore ._ <?>_ :_ :_ __ [_.

Pertanto., -la -presente_invenzione-si-riferisce ?

-ad-un-procedimento-per-la? prepara zione.-di?insulina-?

? <? >|

.umana, ow ero-di_ un.,suo-B-estare.,?nel-quale?procedi-i

jnento-un?deriv.ato_di_L-treonina...protetto._s.ul_ c.arbbs-

sdle?e?facoltativamente? sulliossidrile? viene? fatto-Lj

reagire_.con_un_derivat.o_delll insulinq della formula!.

_ (lrr? A---21)_ __ !

(IX

in.cui R ? un.gruppo ossidrilico o.un radicale?di [

i - i a.

c? lammin oacido_ehe...?...diff..erente dal grup<p>o della treo-

-;nina,? e? A? e? B? rappresentano?le?catene-A?e-B-Con.-o Ck -?la-medesima..sequenza. di-amminoacidi dell'insulina !

20 _ [umana.,? in presenza -.di ..tripsina .o.di,_un, enzima, simile MI ! ? oS _ (alla,.tripsina in.,un ,.mezzo_di.reazi.one_contenent?_ac- -O -<c j ! ML _ __ 'm a...e_facottativamente un. co-solvente _organico^_ad _ ! OC oa ! ?

- -un-valore del pH da 5.a _9_e_ad-una-temperat.ur_a__.al_ o -35-di-sotto _di 5Q?G, operazione seguita se si desidera

T

_ |dalla rimozione di un qualunque gruppo protettivo ;

eventualmente .pr.esente ed il procedimento della pre?

sente-invenzione? ?..caratterizzato?dal_.faitO?.che_il

derivato della _L-treonina_? .presente nella,miscela _

. i

di. reazione in un rapporto, molare j?a 2,5 a circa 6,\

i . '

1 . i

III limite superiore dipende. dal derivato individuale

di?treonina .-? ? ? -? ?- - - -- ? _

II. significato della_ooncentrazipne del derivato

treonina nel mezzo di.reazione. non .?.stato ancora

- !chiarito. -Si..riteneva che_.l'idrolisi-catalizzata dal- ?

? ! _ :_ la..tripsina .e quindi..la formazione..di_.sot_t.oprodotto. _

_ _ in_mezzi.--acq.uosi.-fosse .inevitabile,.e__che .1.'idrolisi

-j? - <:>- potesse essere soppressa- soltanto -impiegando un mez-

- !zo-_contenente da-5Q .a .90.

\ % di.un solvente organico-.,_

__ -_ _ Imiscibile_con_acqua ._

_ :_ Et.stato_ in.precedenza-proposto.. l_limpiego.-di

un?elevato- rapporto molare tra -il?derivato -di L-treo-_

nina ed il- composto insulinico, per-esempio da -5/1?A -<! >\A a_3.Q0/l , come forza motrice del procedimento. _ ^

J3!?stato .trovato,.__in particolare_in reazioni ,s<: >CaJ .acquose v.-.ch.e.-.una_elevata...concentrazione,di un derivaj ? _;t.o_ di_L-treorina neIla .miscela di reazione ? di de- ^

_ ?cisiva.importanza, _mentre_uii_elevato rapporto. molare _3?_ _<? >?<? >set* _ _.tra derivato di L-treonina ed_insulina-_?-.meno_.impor- _

C2. _t.ante,__quasi .indipendente dalla concentrazione dell* ^

^Insulina..

. _Una_c_oncentrazion e__molare__di, .derivato di L-treo-

m ina_.di.2.,_5? e_.pi?__d?_come risultato una reazione

-specifica-deli-<1 >amminoacido con. insulina ..nella,.posi-

!zione.B29-B30,_mentre?ll.idrolisi_della posi zione_ ;

_ 1B22-B23 _.?_.soppressa... Inoltre,_essa d?._come_risultato

!

lanche una solubilit?..molto. elevata dell.<1 >insulina._

..Quando, il. derivato .di .L-treonina_? presente

- inel. mezzo di . reazione nella concentrazione molare

-|elevata._s opra-menzionata, -nessun., particolare, vantaggio _

{-Viene . ottenut ordalia. ulteriore._aggiunta_di_quan.tit? _

piu piccole di- un-solvente -organico- miscibile-con

acqua alla_miscela_-di_xeazione.?Se-sl-aggiunge-. un:

.solvente, orgabico , _ liaggiun.ta...dovre.b.be....essere_..minore

- - - di circa 50 $-in -volume/volume- allo, scono .di evita- _

! , <' >|

_ i i.re-.una. diminuzione_de_ll_a. . velocit? di reazione . Nel l ? procedimento della presente invenzione-si -preferisce..

ff are -impiego del -.derivai o -di-.L~.tre onin a. x e.l_ me z z.o _di. A_

?

-re a z ione ad _ una _conc entra z i.on e.__m.o lare__del valore

_ _ ? da_3 .a_ 5. Una_._c oncentra zione .molare maggiore di 5 d? ? o _i come-risultato., un -drastico? aumento .della_viscosit?_.L_ e c: ....della . miscela . di._reazipne . Una concentrazione mola- _ r^?

?-! ' j -c --re -del- derivato di .L-treonina essenzialmente _al_dlL_

r--J. sot.to -di 2, 5 molare d? come risultato la formazione

<1 >' i o -L. a umani at a_ di_ s ottoprodotto, una diminuita solubili- <?>a,'

?-t? dell ' insulina_e.__rese corrispondenti inferiori. <1>

-- ? - Il-reagente -in sulinico? pu? -essere-costituito ? j ?

: i

? ? !-dal-la-insulina--suina-opnure-_un_suo? qual?nque_der?vat.o.

- r i della - formula I sopra -indicata. Per esempio, la .d?sa j-_.

. i |

_ ! lanina_-B( 30) insulina, derivata dall ? insulina suina ; _

! i

_ <' >pu?. essere impiegata.. _ _ _ _ _ _ _ _ _

Ll_reagente . c ostituit o_da . L-.t.reoni.na .? di preferen-! z a -un deriva to_di-L-treonina protetto della formula

i

J ?

I

I

ThrCR?-H R<2>) (II)

_in_<j>3.ui_Tlir_.A _il_gruppo_di.L-treoninar_R:L_?_idrogeno

-bppure?un_gruppo?dj_ protezione? del?radicale?ossidr.i.^-_ ? p

lico.,?ed-R .?._un._.grupp-0-.di-.proi.e.zione._del._c.arb.o.3sile.._

jln__derivat.o__di_L-rtreonina.pref.erit.o_A.un_.estere_aLabi-.

_?ico-,_per-esempio_un -estere metilico,-.etilico -ow ero-

-t!erz-butilico. - - :- -- L1

.Per...una_neutralizzazione possibile_del_derivat.o_

di L-treonina per regolare il.valore del pELsi posso-..__ i ; -no?impiegare -acidi?inorgan icj? ovvero_acidi?carbossi-_

-1ici?inferiori-,-per-e sempio?1Lacid o acetico?o?liac?pLo-

-p!ropionico.-LLen zima-pr oteoliti co-dovrebb e_ave re.u?na ..

C? -Specifici t.?. p_e.r_la .soiasiorie_dei-legami..carbonilic^.__

Q

-della-lisina -nei peptidi_e .pu?.-.essere_per .esempio..^

-tf -tripsina proveniente -da svariate- sorgenti, -differenti O <' >.-derivati. della_tripsina...ovvero _a<5romobatterioprote?||__ tvi S 1 _ _ _ _ _ 1_ st

_ _ La-temperatura di reaziqne__pu?_essere_.c omprespv

-tra-0?C e-50?C, per-esempio -tra._5e-20<?>C_.-_i_ Se<''>una L-.tr eonina_pr?te.tt.a__s.iimpiega corae._reagente_

il-prodotto- insulinico conterr? .uno o pi?-gruppi pro-! <' >?

tettivi e detto gruppo.o-detti-.gruppi.possono essere!

rimossi in maniera nota. _ _ _ _ [.. ? ?i -_ __ Esempio 1. __ _ _ i. ! <* >! - 200 mg di insulina suina venivano .disciolti in .

. _ 1. mi di una soluzione acquosa 3, 7 M di . estere etilico . -

- d I i-L-treonina come propionato. A questa-raiscela venj !j- -

va? aggiunt a _un a_ s o luz i on e . di-A_.rag-di-t r ip s in a_ suin a

in-AOL microlitri _di_ acetato, di. .calcio. Q..02-M.. ed_il_

_ V al or e di- pH_ .er a_ di_ nuovo _r e g o la t o _ a..6 , 3? c.on. ?a c i do _

I

- propionico .-Poi -la soluzione -Era-lasciata. a-2Qf.CL.per _

_ ore, e quindi_la reazione era. interrotta mediant?l _

_ ? l-'aggiunta di-9-ml-di . acqua .e la.. regolazio <'>ne_del. _v.a^ i _

<r >!

_ dor? , di pH . a. 3--con_.l-' impiego .di acido clqridricoJpMi. _

? I

_ L <? >I _ <1 >anali si_cr?matograf ica su liquido adulta _pres-_

?

- i sionec. .mostrava-una-conversione-del-75- %-? -

_ | _ La..iJiiscela_di ..reazione er.a...f il.tr ata_su._gel_su _ _

.. _ d i un a __c o 1 onn a__di_ Sephadex {m archi p di fabbri c a depo- _

_ sitato)? G-50 Superf ine__C2,6_ x._9_0?cm) _in_a.c_ido_ jacet ?C_Q__.

_ I N* La ?r a.z ione __c ont enent e_e_s tere__di insulina iman a _

i oZ _ ed .insulina, suina. non_r.eagita . veniva.. liofiliz.zata,_._.j _ _

_ La-resa _ era-di_130._mg_.di.. miscela di prodotto. _ _

i |

I In seguito l ?a miscela ottenuta c?me prodotto

? 1

- .veniva sottoposta a-scambio -ionico._a~ A?.C_ si-di -una? ? _

! - I

- ?colonna- di-DEAS-cellulosa?(V/hatmann-DS~52-)?C-5 x 2 cm) ?

? \

- messa in equilibrio con -un flusso- di_75--nil/ora-di_un -

_ .t Iamp ?one....costituito .da__Tris.. 0, 02 <? >.M ed urea 7 M, rego i-

! ?

- lato -al valore di pH- di-8,1 c on_ acido cloridrico. _Do- _ ..

?

- po -avere -caricato . del_.prodot_to _ la_._colonna ...questa ve^

I

- niva- eluita-per-2, 5-ore_.con... la? soluzione Jt.ampone._di^ _

?ui_sopra ,_.pol_per..2-.ore..con-i3_.tampone-di_cui sopra-_ !

miscelato-con_0,<.>QO-4-5-_moli-di-cloruro-sodico-per-litro-

ed alla._fine_.per_.-12..ore.con.la soluzione .tampone?nri-^_

iia_menzionata._in_nL?scela__c_on_Q,011_m.o.li di_cloruro

sodico?per_litro. _

Il _ma.t_eriale. eluito..conteneva .due frazioni pro-

teiche principali ,.. La frazione eluita per prima era_ j. : identificata- mediante -cromatografia_-.su .liquido-ad_

-alta pressione come estere.-di .insulina umana._e~.la _

i -frazione- eluita-dopo -come?insulina -suina non?reagita-.-^*? !\ <? >? _|_ La_frazione _principale._eluita._per...prima_jv_e.ni.Ya._ ^

-j?dissalata._su-di._una_colonna_di_Sephad.ex.-G-2.5_in-ac.i-_ ^

?ce tico-0 ,1_M ?ed_in._seguito.._1iofi1izzata_c_os? da. L

_render e._12.0. mg_d.i__estere?-.e.tilico ..di.insulina .umana,.

_Ll.estere...etilico..di._.in?u1ina._umana era__d_iseio1-_

r -to in.-50..mi di_aco.ua, il .valore del...pH essendo.reso- -?. i

lato a 9,5 con idrossido sodico 0,1 M. La soluzione

j

,.era_lasciata a 25?C per 72 ore sotto., cpntroIlo del_ i

v.alore di pH,_.e_p.o.i__l1insulina, era_cristaIlizzata in

?an ie ra-gi?_n ota-di -per?s? Cosi-.si_ottenevano _110 mg-

Jdi_insulina, umana id?ntif lcata...per_l_'ana.lisi._d.egli_ _

|

.amminoacidi.. e_.dalla_.cromatografia_su?liquido ad alta_ !<' ? >? <? >i ^pressione. _ _ __ _ _ _

j- .Esempio 2_ __ __ L... .? ! :

j_ 1 g_di. estere metilico di L-treonina era discioli

i

- lto..in -l_ini di.acqua, e auindi-si aggiungevano 100 mg

!|

di -insulina -suina,? e^-la*miscela-veniva .agitata, -fin?

ch? 1<1 >insulina- si- era-disciolta-.?10 -rag-di-tripsina-

venivano- poi-disciol-ti-nella -miscela,?e?la?miscela-

_e.r_a_.lasciata._a._._teiiLp.eratura._.ambient.e per 30.minuti.

Poi la reazione, era ..interrotta regolando,il valore

;.di pH a .3 con acido -cloridrico I N?._ __ i.

i |

_!_ :_ L'.analisi -mediante..cromatografia. su liquido ad..

t <" >:

? ' i

:alta pressione mostrala, una.,resa del .24-.#..di .estere.

?jmetilico-de Ila-insulina ..umana..

ex lA _ Esempio 3_

g . di._estero _meti1ico_.di_L^treopina yeniva di- S O

o sciolto in 1 mi di .acqua. 100.mg..di.insulina. suina_. f-4 i ?

Mi .venivano aggiuntile portati, in.soluzione_.con_breve.L

o? i -O agitazione. -In.-questa.miscela .10..mg..di _tripsina_ye.-_

-4 M

! - . <1 >CiC 1-nivano-disciolti, e-dopo?-5-minuti -il. valore-djLpII? -<

O

jdella soluzione era regolato a 6,3 mediante aggiunta

? i

.j.di.. 450 mic.rolitriJLi_acido_acetico glaciale. Poi la

miscela, era?lasciata--a_temperatura_ambiente,..e_.dopo..

2?ore.la..reazione_.era__in.t.erro11a_.me.diante_r_egolazio-

ne.-del valore .di .pH.aJ5 con acido cloridrico I N ;

-L*analisi-.mediante ..cromatografia su .liquido,ad.

?alta,pressione mostrava una resa.di. estere-metilico

<: >di-insulina..umana-pari -al?31-%.-

EsempiO-j4-.

?500 me:-di insulina -suina--venivano-di seiolti in-?

I Lml _di_estere-metilico- di- L-treonina- -4?M,-come

-d -oridrato-,? <?>valore-di?pH-6,-5?~-Dopo regolazione-de-lvalor e_di_pH-a 6,3-c.on _30CLmicrolitri-di acido._cloridrico -5-M-si?aggi-ungeva-una-soluzi one-di- 10-mg? di

J-tripsina-in-100-raicrolitri di-,.aceta.to-.di-.calcio_0,-.02-?? , e la miscela di reazione era lasciata a _8?_C per i?.6-5?ore#..-.Quindi;...la_-r.e.azione ven <">iva_.arrestata_me?diant;e.

!aggiunta di 25 mi di acqua e regolazione del .Calore

pH~a ?3?con_acido_cl oridric0?5-M

.L<1>.analisi?cromatograi<,>icai su liquido ad alta ^Lpressione-della. miscela?di_.re,gzione__mostrava_una_con-^5? o JJversi one?deU t3-% ,? cz .Esempio ? l,5.nil_d so1u zi.one_..5 JM-di _estere_meti1ico_.del-.Lia L-treonina come, acetato,, contenente 200._mg.._di_in- ?. !i <' >?.sulina_ suina_..venivan.o...preparati..mediante__dissqlu.zio-_

C3 -1-ne-di-200-mg -di-insulina .suina.in_ 750_inicrDlitri__.di_ acido -acetico+-10-M-e aggiungendo poi_a quest a_misce-.

T--Jl.a?1?g -di?estere -metilico di*L-treonina...Si aggiun-.

i

Lgevano 2 mg di tripsina.suina, e la miscela di rea- _

1 _zione_ limpida, avente un valore di pH di 6,3_. veniva _ JLasciata. a. riposo a..20?C. La reazione.era arrestata

|-dopo 90 ore mediante aggiunta,di 15 mi di acqua e :_

[-regolando il_,valore__di pH a_.3 con acido cloridrico

? - Li analisi- cromatografica- su -liquido-ad- alta-,?

I

pressione della_mis_cela_di_reaz?one mostrava _una_con--^versione -dell '-85-/5.- -- -- ?

Esempi o-6

-2_g di__insulina_suina_esente-_da_ zin.co-_veniv.ano_

? disciolti in 200 mi di bicarbonato- di ammonio 0,2 M,._

! I

_ ;con_.regolazione_ad_un valore- del pELdi-8, 4 impieganti?

_ -'do..acqua ammoniacale. 20 .mg-di.carbossipeptilasi A i_

<? >I !

- jvenivano disciolti -in 4-_ml_di acqua-per.mezzo-di al-?.

- icuni grani di-Tris .solido -ed-aggiunti -alla~?.soluzione_

j <?>?

_ Ldl-insulina, .la...Quale.era J.n seguito-,lasciata-a_.20.?LCL_

-per?2,5 ore._La_,soluzione -veniva c.entr.ifuga.ta.-.con.?.

I

'raffreddamento. ,e_llofiliz zata._ :_ __ r ? <! >_ La,polvere Jliof ilizzata. er.a _disciolta_in_80_ml_

I

idi-acido .acetico 1.i-I..e._f.iltrata su-gel-su__di-juna_cOr-- -? Lionna riempita -di-Sephadex.G-50 ..Superiine_(-5_x_9-Q ti t e - lem).nell e...ste.sso...me.zso.._?a.frazione contenente ins?

4-1ina-er a 1iofilizza.ta..i-In..ta1_modo-_si_ott_e.nevano.

.118.00. mg di des-(E3Q-alanina)insulina. suina.

-<? >- - -? ? Esempio 7 -i

...Una. , soluzione...di_180 mg...di des-(B30,~a1anina)in-. -sulina suina-in <z>i-75 microlitri .d?.estere.metilico, di

-. _ :.L--treonina 3.,2 .M..come.. acetato,__veniva_preparata_di-_ ]sciogliendo. ...100.mg di des-(B30-alanina) in sulina

?

.suina, -.preparata-secondo -.l.'.esempio.-S,-in _?na?mispela.

!djL2Q0-.microli.tri?di-acqua__e._75?micr-01itri_di__acldo_ i "iacetico-glaciale,? ed_in-seguito.~ag iungendoJ100_mg_i:_ ? :

!

jdi._estere_.metilioo_?di_Lr-tr.e.onina.._D_opP-_regolazione

Idei valore di pH a 6,5 con acido acetico glaciale si

aggiungeva-un-mg -di-.tripsina_suina .?La -miscela__veni-

va. lasciata a temperatura ambiente per 2 ore, e poi

u-reazione?er?- arrestata mediante . aggiunta di 5 mi

-Idi acqua,e-regolando ..il valore.di..pH..a.3.con.acido.j

?eloridrlc o

.Liapalisi cromatograf ica su liquido ad alta pres_ tS? ?gf -sione mostrava una.conversione de178 % . Q -eto -Il-trattamento -dell-'.es.tere_-meti<'>lico_di_insulina 71

tumanappura. ~e_1a.,susu conversione...ad?insu1ina_umana_ ^

j-poteva .essere realizzato,seguendo le indicazioni del- o ;

llesempio .!.. Cai ea Esempio 8 O - zr

_ l_.g _di_estere metilico._de1la._L-1reonina veniva

Idiaci olto in 1 mi di acqua, e a questa soluzione ve-

4jiivano._aggiunti..200 mg?di_depalanina_03_--3_0_)_.insulina_

.suina -preparata.secondo 1 'esempio 6 .11 valore del

_.pH-della-soluzione- era regolato a 6,3L c.on__<z>I-5P. micrqlitri

- di- acido...acetico..glaciale..Si.aggiungevano . 10 .mg. di

_ Ltripsina,. la soluzione era._lasciata a temperatura

?

- -ambiente ..Dopo 20.minuti la reazione . era arrestata _ mediante .regolazione del valore .di pH.a ,3 con l'.im-

piego-di acido cloridrico -1--N? ? - ? L?anali?i_cromatografica-su-liquido;- ad-alta--pressione -mostrava-una resa di-estere-metilico dell!

[

-insulina- uraana-del-7-3--&.- _

Esempio..9.

.2. g dell'estere metilico, di L-treonina yenivar.

po-disciolti-in -2-.ml-di_acaua,- .e_a..questa .soluzione

.isi.aggiungevano -4-00 mg-.di_desalanina. (B-3.CD? insulina,

i !

-suina_.prenarata -secondo-JLLesempio^e-., 11_va1ore di pH

! i

_d.ell.a_so.luzione era regolato a 6,2 con 900 microli-

-tri-di-acido-acetico-glaciale 20_mg~ di_tripsina_for- c?o<* >i ;

-.milata venivano-aggiunti, _e_.!a soluzione era lascia- o o -_t.a <? >a..temperatura ambiente per 2 ore. Quindi la rea-, C

zione era -interrotta ,mediante -regolazione del_v.alor?? ?<

di pH a..3 -Con_l^impiego_di_acidp. cloridrico. 1 N..

.LAanali.s.i__cromatografica su liquido ad alta pres^_ f*~

Cp sione -mostrava _una..resa_di_ ester.e_meti1ico._di_i

-na-uraana.del-6-9_$/-Esempio-.Si .preparava..una_miscela._di_reazi_Qne_conten.en-_

_ te-200.mg-di_de.s-(B-.30?alanina) insulina. suina in

-14-00 microlitri di_.estere raetilico._di_L-treonina ?2,5?

M_com e.acet ato,_med iante..disso1uzi one_di_2 00_n]g_di_ ?__

ii !

des-CB-50 alanina) insulina suina preparata secondo

1le sempio..6.in una miscela -di-400.microlitri- di-ac-

|qua -e?180 microlitri-di?acido acetico -glaciale?e?la-

-aonsecutiva-afegiunta-di--? 0-<.>mg-di estere-metilico

_Ldi_.L-treQnina. ?1la.s.oluz.ione...ihimpida?si aggiunge.v.a.

una -soluzione -di?2- mg-di-tripsina-suina -in JOO -micro--

|litri-di-acqua.- La-miscela -avente-un-va lore-di-pH ? i

^_di 6,3_yeniva lasciata a. 25?C per .2 .ore, e _dopo_la !_

i I' '<? >? sreazione-veniva -arrestata mediante- aggiunta- di?10 -mi

di. acqua .e regolazione del valore .di-.pH a 3-con 1 *

1| <' >Ij 'impiego?di_acido?c.loridr.ico?;5?M?_ :_ -?

j_ Lianalisi ..cromatograficu-du ..liquido..ad__al.t.a_

! ] [pressione--mostrava -una -conversione- de1-64--$ .- tn

!? ,- Esempio 11- _ .- C- _

! <: c >J_ 100 .mg-di-des.-B30-.alanina_insulina .suina_prepa-_ _ | r. ---rata-secondo 1?esempio 6 -venivano-disciolti -in una - ? -miscela. di_160 .??????1????^?-????3?-40-??????? ??? t

,di etanolo assoluto e 75 microlitri di acido acetico____? ' a> g laciale e poi si-aggiungevano-200-mg- di estere,me-? cr>_ *

jtilico-di-L-treonina. ...?lla_soluzione_liquida_c..on._va.- _

!1-ore-di-pH-di--6,-5 si aggiungeva -1-mg-di -tripsina ? !-

? -porcina.-La miscela era lasciata a temperatura .aiibien- .

? te per 2_ore, e -poi -la reazione era.arrestata median- . ! i _!te aggiunta. di 5 wl di acqua .e regolazione del vaio- . i

!r_e. di _pH._a .3 _con?l'impiego di:acido_cloridrico 5_N..._

<? >_ Lianalisi, cromatografica su .liquido ad alta pressione.-indicava- una -resa-deli 'SO.J?

I

RiyENM CAZIOHX.

JL*_Pr..o.cediment_o__pe.r_l.a_produzi_one.__di .insu 1ina

umana-.ow er.o?un-.suo-B-5-0-estere.,?nel?quare_pr.o.c.edit

_i_mento..un_.derivat.o..di_L-_treonina_nro_teti_o.sul._radic.a-

le carbossilico- e facoltativamente sul radicale osi ?

?

Lsidrilico viene_ fatto .reagire ..con un derivato dell <1>

linsulina corrispondente alla formula

i_ (_l--r-A--T-21)_ _

(1 -_-.B-4_~2 _ (I)

in _cui_ E-?..un_grupno..ossidr.ilic.o__o_un__radicale_di__L <?-IS> I / !

f amminoacido- che??-differente dalla?tre onina_e _-A^=?

e-? B? rar>nresentano_le-catene _A-_e__B? .on-lamedesii.ma__seguenza. di _amminqacidi dell 'insulina umana, ini

r-<j >presenza di un enzima proteolitico.. simile^alla trii- ?? rC> -Lpsina_in ^un. mez.zo-.di...r.eaz.io.ne_c_Qnienente__acg.ua,__e -p*

% .facol.tativam ent_e_anche_un_c q-solvente organico ad L et ? un valore del pH variabile da 3 a 9? ed una tempera-_tura-.minore...di_50?C, cuesta.operazione essendo se- ,

?guita,_se cos?, si desidera_dalla rimozione_..di_uno

.guai siasi dei gruppi di protezione che sono presenti,

il quale procedimento ? caratterizzato_ dal fatto _J_

i

che . il_?erivato_di. .L-tr.eonina .?.presente nella mi- _____

scela -di reazione ad una concentrazione molare yariah_

bile da.-2, 5 a . circa ?6

- ?2 . -Procedimento: secondo??a_rivendica2?one_.l, il..

*

-quale-? caratterizzato - daltf atto che -il- derivato _ ? ? ideila.. L-treonina ? -presente? nella, miscela di...reazione-ad-una-concent razione. -raolare_di -valore compreso-? \

i

tra -3? e- -5? - - - ? ? .- - -f i .

J _ 3. Procedimento second_o.._le_ rivendicazioni^ l_o

2 ,__il_.quale_?_c ara tteriz z a tO?dal-fatt o_.che i l._deri_- . iato_insulinico -usato. _?_la.-desalanina-B-30_ insulina LODAI de r iva t a .dalla insul in a_ suina ..

4 . _.Pro redime n.t_Q_s.e con do _l.e. r ive nd ica zi oni 1 o

-2 , ? i 1 . qual e_procedimehto ?.. .caratteri zzai o_ da 1 fatto.

-?3 ?-jfthe viene impiegata una insulina suina , il_ radicale g/> j ?*? <' >4JR- rappresenta.. Il alanina. - _ : _ _ _ o G

_ 5 ,_Pr.oc.edimento _s,e.cond_o_.1 e rivendic a z i oni_da __ O - L -l_a- 4 , c ar at t e r i z z at o_.d a 1 f atto_._ch.e_JL 1 ?de rivato_del-I

.?la -L-_t re orina ? ,.un_..e_stere mettile o , . etilico o buti-[

_li CO? te rz i.a rio della L-treonina. _ - fC-??

C-_6_._Procedimento secondo le rivendicazioni da 1

<?>SL J_a_5_i 1. quale procedimento ? caratterizzato dal fat--to- che l<1 >enzima proteo litico? ? . la ?tripsina . _ :

I _7. .-Procedimento? secondo_le rivendica z i oni da 1 -j_a-6v- il-.quale procedimento_?_c_aratterizzato dal fati to che la reazione viene condotta in un mezzo acquo-L-so contenente 1una-auantit?_d.s_Q_ a_.20..j? ,in_ peso di - uru co-solvente organico . ? , - - - - - - -j _ 8.. _Pr oc ed im en t o. -i s e c ondo_l a_r iven d i c a z i on e? 7,? il i ? - guale -?-caratterlzzato--da-l? fatto? che? il? co??- solvente.<; >?

_ l?_ un_alcanolo_avente-da_l_a_4?? atomi_di_car-b-onto-. _ j _ i _ 9, Procedimento secondo le rivendicazioni da 1? ? <1 >_ k 7, il., qua 1 e _:pr o c e d imeni. o_?__c a ratte r i z zato .dal., f at-! i _ -fco che non si. fa - impiego -di ...un. co-solvente -or^anicol-? -f ' ?<a >?t-H-Sffrss - ? - l? p NORDISK - INSULINLABORATORIUM

ING . B ARZ Alidi _ &_ Z AN ARDO_ROI'LA._S_. p ..A

ALLEGATO A

Elenco delle rettifiche da apportare al testo della domanda di

brevetto No. 49 114- A/82 contenute in No. 3 Postille chieste con

istanza di rettifiche dej 6 GIU 1985

POSTILLA J -pag. 3 riga_14 correggere "1967" in <11>1976"

POSTILLA 2 -pag. 16 riga 22 correggere ?180" in <M >100?

POSTILLA 3 -pag. Jj) riga 19 rettificare "liquida" in "limpida".

Roma, ? GIU 1985

p.: NORDISK INSULINLABORATORIUM

ING. BARZANO' & ZANARDO ROMA S.p.A.

UN MANDATARIO

?. l

(Enrico Toschi)

CJ/gt.-8333-

!

I I '

- ._ _Lmana differisce dalle _mol.eeole delllinsulina degli _ - - ;altri -animali -per alcune-dif f.erenze . nella .composizio- _ - <<>.ne. dei componenti -degli amminoacidi-. . . . : _

_ _ j. _ grandi miglioramenti _ sonp_stati_ ottenuti per _ _ - - - .Lquanto_riguarda-le_preparazloni_dell.Linsulina dopo _ _ _ - - ? 1 -introduzione' dei -nuovissimi ? procedimenti- di purif i? -- - cazione, ma la formazione degli anticorpi nel- corpo -- - -umano -pu? ancora avvenire . -Si -pensa. che ouesto .pos-- - . sa. essere rimediato usando-insulina_umana al posto . _ - ? -dell ' insulina-di altri, .animali,. _ _ . _

- - - E!__noio .come-pr.eparare_l_!j.nsulina chimicamente;.. _ _ . _ si- veda il brevetto statunitense Ho. 5905068 e il___ _ _ _ lavoro ..di. .Hoppe-SevlerJS. JPhvsiol. Chem._357, 759-VEDI POSTULI J _ 76? i 1962U _ 1__ - Que st i-pr.o.cediment 1-C ompre.ndono__ll- .condensare _

? - un- des octapeptide-CB2 3-30)? di insulina porcina con _

- - L-un-_o.C-tapep?ide._sintetico_corr.isp_0nd.ente _alle_pp.sl?^ _

- .zioni- B23^30-jnell-<, >insulina _umana_._Tuttatla, nel pri-- - mo-procedimento si eff ettua un '.idrolisi , alcalina,

_ _ che ? accompagnata_ da ^favorevoli reazioni coliate-

- .. - -rali. Il -secondo orocedimento .. comprende .una_re azione _ _ _ non .specifica -Che da. origine, a numerose reazioni _

_ : _ .collaterali _e .richiede, complicate ^tecniche di puri-_ _ f inazione., . Di_.conseguenza , . questi procedimenti non _ - - - sono? adatti per-Himpiego. su scala industriale .

- -4- .I/'-anelisi?cromatografica su -liquido-ad-alta -. ? _ _-?REOSsione_ della._miscela_di__reazione mostrava ..una_con-_ - Lv-ersione-.-de.ll'85-% ?_ _ _ _ ?_

- - - Esempio 6- ? - - -_ L_ 2 ..g di insulina suina.e_sente__da_zinctov enivano _

? - disciolti -in-200 mi -di...bicarbonato-di -ammonio 0,2 .M, . .

- con regolazione ad un..valore,del pH di._8,A _impiegan-- _d.o acqua .ammoniacale..20 _mg_di _carbossipep.tilasi A ..

- venivano -disciolti -in.4-?mi-di acqua per.mezzo -di_al-...

- -cuni-grani _di-Tris-solido ed aggiunti -alla-.soluzione _ - di Insulina, _1a _aual.e.-era _in seguito..lasciata .a _2D.<?>C _ - per?2,5-ore. -la .soluzionev eniva centrifugata-con _ _ - -raffreddamento e liofilizzata. _ u_

_ La_p.olv.er_e_liofilizzata^era .disciolta .in. 80_.ml _

-- di-acido_ac.e_tico_.l .M e filtrata.su._g.al_.su__di_una co-_ - ILonna-riempita -di-Sephadex G-50 Superiin e_(_5?X 90_

_ cm).nello stesso...mezzo. ?a. fraz.ion_e._oontenente. insur _ - -lina era -liofilizzata.-In?tal. modo si .ottenevano _

_ _ 18.0.0 mg di ..de.s-(B50-alanina.)insulina suina._ _ _

- - - Esempio. 7- -? - -- -VODI

_ Una .soluzione_di 180 mg .di _des-(B3P-alanina)in

- sulina suina,in 4-7_5_..microlitri _di estere metilico di

_ L-^treonina. 3,2 .11 come acetato,.veniva preparata di-_ sciogliendo. 100 mg. di des-(B50-alanina) insulina _

1iesemp io 6?in?una?miseala di..4OQ-microlitri?di?ac-

nua e 180_microlitri-di^acido-acetico glaciale ? -la onsecutiva?a&giunta di?? 0-mg?di?estere?met-iL4Go di.L-_t.reoninSL._A1l.a_soluzione limpida si aggiungeva.

un i-soluzione-di?2? mg-di?tripsina-suina-in 30G-miero* ri_di_acqua.^La? miscela-avente-un -valore di-pH? -? di 6_,3_yeniva. lasciata a 25?G per .2 ore, e_dopo.._la_

- reazione veniva .arrestata -mediante- aggiunta di -IO -ml-? di-acqua e regolazione dei-valore, di -.pH a -3 con .li-_ _impiegO-di .acido cloridricoJj-I^L_

Lanalisi. _c.r_omatografica_?u liquido,ad alta pres sion e-mostravasine? conversione del 64- ..

;- Esempio? 11- -10.0_mg.-di--des=B30=alanina-insulina suina_pr_epa-

-rata-secondo? 1?esempio 6 venivano disciolti-in una? -miscela_di?160-._microli-tri?di_acq.ua,.-4-0-microli-tri-_di_etanolo assolut o e 75 microlitri di _acido acetico

- glaciale,- e-poi -si -aggiungevano 200 mg -di.estere..me- .. vnm

- ._-_tilico-di _L-treonina. .Alla-soluzione -liquida,con v_a-__ - -1-ore-di-pH-di -6,5-si aggiungeva 1 mg di ...tripsina -- porcina. La miscela era-lasciata-a -temperatura .ambien-- te per -2-ore, e poi la reazione,era arrestata median-_ .te .aggiunta.di 3 ral di acqua e.regolazione del .valore di pH a 3 con l'impiego di .acido cloridrico 5 N. _ L'.analisi cromatografica su liquido ad alta presSt emina

REGNO DI DANIMARCA

Il direttore dell Officio Brevetti p. Mar?-.

chi con il presente certifica che il. 7 Gi ugn? igft?

la Nordisk Insulinlahoratorium, di Gentoft e ha depo-

?.?gitai-Q? in._qu.esto__u??i_c.io_jJina? domanda-dj _ brevetto in

Danimarca per _ , _

_H<,>VPrgcsdini.ent.<Q>_p.e.r_la_p.ro-du<j>sio.ne_dl_insulina^vimana-0-v-.vero di suoi est eri ?-??<11 >.<1 >_ , _ _ _ _

;( Domanda_Nd .!25i-5-jdel_13-82 Ini.l-Cl.i-G? 12-?)-.

La^cop.i a_f.0t.05t ati.ca-qui_alle gat-a-?? con-

f-onn e<^>c on 1 a^domanda-e-l a? d e s e-ri-z-i-o-ne-d-ep o s-it-at-a-eo n -la-domanda-di- -hrevet-t oV

-( Sigillo.)

-C o-pahhagen-j ? 8 ? Satt-embr e ? 1"9'8-2-

F-.to-:

<?>??-Fol-kmar-

Tassa-pagat a-??,M-8

-Som and a? d-i? brevetto?

No stro r? f e r im e nt o : 314 - 84 / AC/JJ <1 >. .

-Riservato- ali-- Ufficio del Direttore

-07-.?6.-82 3807-7-5 - 8272545 *43 **800700 Richiedente: Nordisk Insulinlaboratorium

Citt?: 2820 Gentoft e, Danimarca

j Strada: Niels Steensens Vej 1

; Agent e di brevetto : DANSK PATENT KONTOR ApS

H.O J gfest eds Ve.j 70 , 1879 Copenhagen V . Inventori : Finn Hede Andresen

ia: 3400 Hilleroed, Danimarca, Sommersve.i 21

Per Balschmidt

la: 30 60 Espergaerde, Danimarca, Tibberup Alle 20 Titolo :

Procedimento per la produzione di insulina umana ov:-

<?>Per domande depositat e come domande divisionali

No .<1 >della domanda relativa: 2221 /81 Data effettiva

di deposito 15 Sett embre 1981

Allegati copia del modulo di domanda

Descrizione in triplo

Riassunto in triplo

Tassa do domanda 800 Kr.?

Copenhagen, 7 Giugno 1982

DANSK PATENT KONTQR ApS

F.to: Inge lise Persson

2545/82 - 7 Giugno 1982

Inventori: Kim R Ry Hejnaes

2800 Lyngby, Danimarca ! V

Bredebrovej 29

Hans Kofod

2800,Lyngby, Danimarca

Soebakken 3

2545/82 - 7 Giugno 1982

Nostro Caso No .<' >314-83/AC/JJ

Descrizione con rivendicazioni e riassunto Domanda divisionale

Domanda relativa No.' 2221/81

Data di deposito : 20 Maeeio 1981

7/6/82

Nordisk Insulinlaboratorium

2820 Geni otte

i

."Procedimento per. la produzione di insulina umana ovvero di suoi esteri B-30" .*

La presente invenzione si riferisce eri un srocedimento originale per la produzione di derivati iella insulina.'

Da molti anni il diabete viene trattato cor 1 L ? insulina.<1 >Sarebbe nat_ur_ale_c.urare eli esseri -umani. con 1* insulina. .umana, cosa _ che non ? possibil e tutta-Via in vista della ri cintesi a e sist ent e J Perni ?, ner <1 >I notivi di_c.arat.tere pratico si? impiagano l' insulina _ | _

! ! 1 i 1 | , bovina e 1 * insulina porcina.* Tuttavia, in grado mngi? giore o minore, queste insuline danno luogo alla f ors mazione di anticorpi nel corno umano . cosa che tra , l?altro comprende un effetto ridotto dell'ulteriore trattamento insulinico_.

Questo inconveniente secondo quanto si suppone, ? provocato in parte dalle "impurezze<11 >presene I

t i nella insulina bovina o porcina impiegata^ in pani n 11 e_dalla_natur_a_ali_ena..l_Qu^si-l_ultima_s.i_manif-<e>-S?-a_p-er t

' il fatto che la molecola insulinica umana differ? s c e d ol l e altre mo lecole i animali per poche differenze nella sequenza di amminoacidi Grandi_ml??.io_ram.enti_so_no_ stati? ottenuti p.e.r_ q.uanto_ ri.guar_da_i_ pr_epar.ati_i nsulini.c.i? do_po_ Ili nt ro_duz.iojae_ del_p.i?._r_e.c?e.nt e. procedimento. di_.pur_if.lc a-| izione, ma la formazione di anticorpi nel corpo umano I

pu? ancora verificarsi.' .S.i .riti.ene..ch.e__questp? ] ! . essere, .un inconvenie nte. e liminato us and? insulina u-?

i -mana-invac e _ di alt r.a . insulina-animale.. _ , _ j_ _ LEl_gi?_not-a_la_t.e.ani.ca_di_pno-duz?OJie_clini|=. ca della insulina umana? e per questo si pu?,-Co^sul-. . tare_il_bne?ie-t-t-o_si.at.uni.t.ense_No-j_3-.9D3 .-0-68_e_il_la= _

V:QJCO_ di_ Hopp.e-Seyler_Z-.? Phy-siol^i-Chem-.-jj-T-,? 7-?=7-67-^ ?

- . - - |?

I

- Questi? pro-cedimenti? comprendono? la-eond^nsa?

i zione di una insulina desoctapeptide-(B23-B30) por-- - 1 -cina con una octapeptide sintetico corrispondente alle posizioni B23-30 nella insulina umana.' Tuttavia t 1

!nel primo procedimento si realizza una idrolisi alca lina . che ? accompagnata da sfavorevoli reazioni co 11-laterali . Il secondo procedimento comprende una reazione non specifica la quale d? luogo a molt? reazio I

I

ni collaterali e richiede tecniche di -purificazione c omplicat e.' Di conseguenza, questi pr? cedimenti non isono adatti per l 'uso su scala industriale.<4>

Inoltre, il <">brevetto statunitense No .

3 .<'>276.261 descrive un procedimento per la produzione di insulina umana da altre insuline animali per azioi., per esempio car?ossipeptida,si A o di treonina.

I

_ Tuttavia mediante questo procedimento gi? . noto, non ? possibile preparare insulina umana ad al cun grado apprezzabile. Questo probabilmente ? dovu <? >tO_ .dal_f-at_t_o-__se.c.o.ndo_il_quale_la_trip.sina_e_la_c.arb.o-s s ipept-i das.i_A-_idro.liz z ano__no.n--.s.o.Lt-ant-o_il_Le.gam-e_di 1 i si l=al anina-P-ep.ti.dic.o__-tB.29--^.B3_0_)_ma_ancb.e_alt.r_e_p.o -Fri zioni nel 1. ' insulina nelle condizioni operative.? Di p ref_e renz.a-1 a_ trip.sina-idro.llz z.a_i l_l.e.gam.e_ar gin il.eglicina-p ep-tid.ico_(-B22=B23-)? piuttnst-O?clie-J-? JLe g?m e Ins ilerai ani na_(-B.29.=B30-)-._T.ut-t.avia_la-c arb.o.ss ip.ept i-

i i i <1 ? >? ; dasi A non pu? esclusivamente separare l a ai anina aulJ_e.nn i naie C del la_ c at_ena-B? s enza-anc he? s ep ar ar e C_d el la-c at-ena-A s-ta? inoltre mostrato che una condizione cio? l a rHqy.j mie in una, soluzione tampone di bicarbonato i di ammonio r ? necessaria allo scono di impedire la .c.e.s.sio.ne_di_asp ara gina, s i veda ad esempio Hoppe Seyler Z . Physiol.' Chem. , 359 , 799-802 ( 1978) Inoltre.j gi verifica difficilmente una considerevole formazione di papti da poich? la velocit? delia reazione di idrolisi _ ?.._. pi?? elevata? di. quella della sintesi del [paptide alle -condizioni operative. Questo prqbabilmenj t_e_?.-.la ragione_p.er_c.ui_il^ro_do_t_t..Q? preparai o s e c ondo _^gl i? e s empi. del b.r e v e 11. o-_st.at.unii_ens.e_No_._3- . ' 27.6.9-61 _ a? come

iconie -inaulina-umana.l

ii? 1 roto dalla rivista J. Am.? Chem.<' >Soc .<1 >7-5-W7-5-2_(j-9-79) il pno_cedimenlLO_p-e:r_cnnduiT-e_-Una .copulazione

p ept i de---(-B 23^30.)? i nsulina_(-B.01.)_c.o_n_un_o_c_t_ap_e_p_t ide i sintetico corrispondente alla sequenza-di_ainmino_aci-j ! di? (B 23-B3 0-)? nel 1 a-i nsul inannnana n_qu.es-t.o_pro.c_e.di -[mento? gi?-noto? la-insulina? sintetica? v_iene_uaat.a_in.

(J-G :4_)-,? ed-iL-mez zo? di_r e azione? cont i 4U? so 1 ve nt-e-cr-ganio o (- DMff-)? ad- una-c oncent-r azione? di_i_ _ , pi? del 50$, per cui la concentrazione di nonn a ? considerevolmente ridotta.* La copulazione ? di sue-J

cesso ma, tutti i fattori considerati, auesto proce? dimento ? costoso ed ingombrante, poich? tra l' altri <?>

esso implica una sintesi costosa dell'octapeptide ri chiesto.<1>

<?>Inoltre, la rivista Nature Voi. 280, 2 A-sosto 1979 alle pagine 412-413 e la descrizione di 1

! domanda di brevetto danese No .' 15 56/80. descrivono un procedimento per lo scambio dell? amminoacido B30 nella insulina porcina.' In primo luogo, lamini noacid 0 B30 nell' insulina porcina ? separato per mezzo del trattamento dell'insulina porcina con carbossipeptidasi A a 25 ?C per 8 ore in presenza di tampone di bi carbonato di ammonio in modo da formare una insul i ne desalanina (DAI) che ? isolata.' Poi, la DAI formata e l'estere butilico di treonina (Thr-OBu ? sono nopu lati in presenza di tripsina in una soluzione contenente grandi quantit? di un solvente organi no , circa 60$, a 37?C per 20 ore in modo da formare (B30-Thr-DBu^ ) insulina porcina, che viene isolai a,<1 >Tnfi np i l gruppo dell' estere butilico viene separato con 1 ' imaie.go di acido trifluoroac etico operando in presenza di anisolo .'

Cos? i difetti essenzi al i t nevati nel pr??

! <1 >l_c_e.dime.nt_o_di _.cui al brevetto, statunitense No-, i

4-3-?-27J5.?.9-61 _ possono . essere? sorpass ati? ef-fet-tuando-la '_co.nt_enent_e_ elevate? c.oncentra^-zioni? di_ so Lci, cosa-che .pe rmet-te? una diminuzione? della? co.nc.ent raz ione? di? acqua fino a-circa ,f -10 . e-la .r-esa-dipende-dalla-quantit?-di? solvente? or^

I

_gani.co-.pr.es ent e nel. mezzo? di? reazione., ?poich? una ;a-Concentrazxane? di_ solvente-organico? di I f risultato una -elevata-resa?? Gli? svantaggi? di? questo ,-pro.c.e.diment.o sono tut-?via^-c h e elevate? concent.razio^ |ni?di? salv-f?n?_e_o-r-ganico-ilanno? diminuire-la? v_elo-ci-t?_-t de Ila-re az io ne_e? c he-molti? de i_ s olvent i_ proposti-p r o -. -b?bilm ent-e-sono-mutageni-^JP-oicii?? essi? po-ssono? e sse- ? ?^-?????????????-?????-???????-?????????? compiei a i dal pro-? i 4-do-tio? costituito - dall-<1>- insulina,? il? loro? impiego? ? - 1? l

Idannoso? ovvero? alme no? ^ indesiderato-.- -^ - Lo scop o della? pr e s ente -invenzione? ?? qu-el-r ! j jlo? d-t-iornire? uiHProGed-i-mentn? in^-cu-i? una? insulina- a-i nimaler? di? -prefe-r-enza-i-nsuli-na? porcina-^? in-uno? sta-- -dio? e? s o-t t o? l^influenza? en-z-imat-i-G a-,? v-iene-?onv-ert-it-a-|a? de-riv-at-o-di? B30? t-reonina? insulinarl-n-^Lta? resa-e ? I

js enza? impiegare? s Q-l-v-enti?o-rgani-e-i? dannosi-. <J >? i -| - E* -st ato trovato-i-n -manier-a-so-rp-rendent-e ? - ole ? la ? sostituzione ? enzimatic a ? della ? B3 Q ? alanina ? dei * ila? insulina-por e-ina?pe-r-m ezzo? del? derivato? di? tre o ? <

i

i

nina nella posizione B30 della molecola insulinica pu? essere effettuata selettivament e senza infhiengiare altre posizioni della molecola, se il derivato di treonina viene usato nel mezzo di reazione ad. una certa concentrazione di valore elevato ,<1>

II significato della elevata concentrazione del derivato di treonina nel mezzo di reazione non ? stato realizzato finora.<1 >E<1 >stato in generale rit er-, nuto che l? idrolisi tript ica e la formazione di sott j pr? dotto nel mezzo acquoso erano inevit abili e che 1 <1 >idrolisi poteva essere ridotta soltanto se la miscela di reazione cont eneva quantit? considerevoli di solventi organici Di conseguenza fino ad ora le miscele di reazione contenenti da 60 a 90 $ di un sol-.

e organico miscibile __qpn_a.C-qua._s.onCL. stati. . i gati,

E <1 >b en_notja_ch.e_l_!_i.drQllai_c.atalizzata-da _e.nzima_di_l.e.gaini__p_ep_t_i.di.c.i_?__r_e:ve.r_sib.il.e_e_che_lie.qni librio pu? essere spostato verso la copulazione guarii do__un .r_e.at_t.iv_o. _v_i.en.e_agglunt.o__in_e.c_c_e.sso-. .un jelevato rapporto molare tra-.il. derivat.o_di--t.r.eonina ?e.d.._il_c.omp.onent.e_-insulini.co->_p.er_es.emp.lo_t.ra-5-/-1 _ e ;50.0/_1 _f_.?_st ato?impie gat.oV

Tuttavia, ora ?. stato- trovato che una elev-a^--cono e nt raz io ne molar e d e] _ derivato di-treonina-ne >__da_c.i.r.aa_2.,_5_a_c.irca? 6_moli/litro_?? di _impQ.rtanz.a_de.c.ini?:a? p.er la funzionalit?? di? successo d.e.l_p-r-o-c-e-dim.eiit-af_m.eiit.re_il_rappo-r?-0-molar-e-ij?a^-i-l ; derivato di treonina e il componente insulinico ? largarmi aura di . ne asuna. importanza.

_P_ert.aiit_o_,__ll_prQ_cjijiiiiLentj5_della^r&s^nt_e_ invenziane_e_c.ar_at_t_e.rizzat.o? dall'impiego, d.eiliammi n? -.aci.do-_c.o.n_gi^.p.Q_c.arb-o-ssjQicp-^pxoie1ijLo_a.?_una:_c_oji=i. cent nazione. .di _ circa. 2, 5 fino. ...a ..circa . 6 moli/lit ro_

?_il_deri.v_at-0_di_t-r.e.o.nina_?_] e ad una -concent razione? camp-resa-ira c i r_c.a_2,,_5_46_c.irj^_

I

cu? 6_jno.li/litro, questo d? .come : una reazi??e specif.i ca-con-il-component-e-insulinico?nella-sua. posizione B 29.^B30-,-ment.r.e_lli.drol lai- in. tutte le al-;_e circo st acz e,. -1'- aggi unta di. solvente organico. non ?.._.richieRta

quoso, ? sostanzialmente? senza-formazione? di? so-t-t.o? pr? do-t-toi - 1 - 1 -La-GO-ncentr azione preferita -dei? derivato di? treonina-?? da? circa? 3? a-cirea-5-moli/lit-ro-.? Se? la concent-pa-zi-o-na? supera? ei-rca?6-moli/li-tro? la? yiiaco-si t A-de-lla^mi-scel-a? di? reazione? sar?? aum entat-a-in-mani e ^a_non? do-vu-t-a.? La? v-isc o-si-t?? pu?? tuttavia? es s er e? ri-dotta alquanto mediante aggiunta di piccol a quanti -t? di un solvente organico miscibile non acqua.* ?? alcanolo . come ad esempio etanolo, ? parti co lamento adatto, e la quantit? del solvente dovrebbe essere ^mantenuta al disotto del 40$ in vo lume/ volume.<1>

In qualit? di insulina reagente, di preferenza si usa la insulina porcina, per? si pub anche impiegare insulina proveniente da altre specie.<1 >Quan-,do si usa reagente costituito da treonina, si fa impiego di una l-treonina protetta, ed il gruppo protettivo ? di preferenza un estere alchilico come ad e-jsempio estere metilico . _ _

In qualit? di enzima proteolit ico, ai pu? impiegare un qualunque enzima adatto come ad esempio I un

. tripsina o/enzima in relazione a questo.' _

La temperatura della reazione pu? essere scelta ad un valore compreso tra Q?G e 50?C ed il var lo re di pH ? nell 'intervallo da 5 a 9,<*>

Jl_?pro.c.e.diment o . della pr.e s ente__invenzio ne viene ult_eriO-ment_e_illushrato_4ier_i]iezzo_de.glj _ es.emp:i che seguono,.'

Esemplo 1

1 grammo di estere mati T i no rii ?,-t ran ni n? yeniva-disciolto In un volume . di--1 . mi di acqua, e quindi si a ggiun gevano 100 mg - di insuli na p oraina, e? la

t

miscela veniva agitata finche l <f >insulina si era di-.

<? >sciolta?<1 >10 mg di tripsina venivano poi disciolti , j e la miscela era lasciata a temperatura ambiente per ^ 30 minuti .' Poi la reazione era int errotta mediante regolazione del valore di pH a 3 con l ' impiego di acido cloridrico 1 N.'

. _ L <1 >analisi mediante cromatografia su liqui? 1

t

do ad alta pressione most rava una resa del 24 # di estere metilico di insulina umana.<1>

La miscela di reazione veniva filtrata su gel, su colonna di Sephadex (marchio di fabbrica de? positato) 0-50 Superfine ( 2, 6 x 90 cm) in acido ace? tico 1 M.' La frazione principale contenente estere insulinico era raccolta e liofilizzata.<1 >La resa era | di 89 mg di miscela di prodotto .'

Po.i.j?Ia-mi s c_ela_Qtionuta_cora.e__projdot_t o e ra -f

' sottoposta a scambio ionico a 4?0 su colonna . di DEA _c_e.llulo.sa.- .(_What man .. DE- 5.2.) _ (_5.x 2_cm.)_,_m.e.ssa_irLi_e.q.ui 1 i=. b r i o_c.o.n_7_5_ml/o.r.a_di_un_tampnne-f ormato_da_TRI 5 0 , 02 M__.e.d_ur_e.a _7_M_f_c.o.n_re.go.lazio.ne__al_pH_di_8.,_1_cnn llimpi_e.g0? di_aci.do_._clo.ridrico .. Dopo aver .. ricaricai n i 1 pro.do_t_t_o_,__JLa_c.o.lo.nna_veni?a_eluit a. p er ...2,5? ore ; conila -soluzione -tampone di. cui _ sopra, _p.o.i_p.er_2_o-! ne_c.onL_i l_.tamp.o ne di _cui_sop.ra_in-mis cela_co.n_0-,_Q.04-5 - I moli di c lo-rtiro_di? so-dio_pe r_litro? ed-inf-ine.

o re . con il t ampone. jpr ima_m.enz.ionat_o_. in_misc ela-.c on 0,011 moli di cloruro di sodio per litro.<1? >_

_ La frazione principale proteica eluita per prima era rac colta ed identificata medi ant_e_ cromato -graf ia su li_qu i do ad alta pres s_i p ne. come contenent e.. est ere metilico di insulina umana.' _ , _

La frazione raccolta era in seguitai-, li. ssalata su colonna di Sephadex (marchio di fabbri ca depo sitato) G-25.. in soluz.ion_a._di_Jii c arti o nato _di_ .ammo nio 0,05 M .' La frazione proteica veniva raccolta, dopo di che 1* estere metilico . insulini.co_cont?nuta in essa veniva sottoposto ad idrolisi mediante rogolaz ione d_el_ valQre__di_p.H_della_soluzione_a-9-,5 llimpi.ego . .libammo niac.a. acquosa,- 0-p.erazione?seg dal__ripo.so_a . t emp.erat ura ambi?nt. e_p.er_4-8_o-r-e-.L-Dopo li Q fi 1 i z.z.az ione. , _ _si _o_t_t enevano 1..8 mg-di- -insulina-u-mana pura, i dent if ic at.a_m ediant-e-Hanali si-degl-i-am? mino acidi e la cromato graf-ia_su-liquido_ad-al-t a?pre) sione.'

._Es.empio_2 _

_1 -grammo _di _.est ere m et ilico? di?L-t-reoni-na ara di sc io lt o. _in 1 mi? di acqua.-- 100? mg - di? i-nsu-l-ina-; p_o.ro ina ..venivano, -aggiunt-i-e-port at i in-so-l-u-zi-eme-con <' 3j>rev<.>e_<.>agit azio<Ji>e-.'?In_que st-a-m-i-scela-si di sc-?e-gl-i ev-ano. ..10 _mg. di_ t ripsina- e_dopo? 5-mi-nut i il vaio re-d-i- -pH: della soluzione era regolato a 6,3 mediante aggiunta di 450 mi ero litri di acido acetico glaciale j Poi] la miscela veniva lasciata a temperatura ambiente e . dopo 2 ore la reazione era interrotta regolando il I

! vaio re di pH a 3 con acido cloridrico lN.<j>

. Mediante cromatografia su liquido ad alta p ressione, si trovava una resa di estere metilico di j insulina umana del 3J.2?? !

Il prodotto di reazione veniva isolato , ,f razionato ed idrolizzato impiegando il procedimento de scritt o nell 'esempio 1 f per cui si ottenevano 24 m g di insulina umana pura.<1>

Es.empi.o_3

2QQ-_mg_di_insulina_p.ox-cina_erano? diaciolt.i [in J_ml_di_una_soluzione? acquo.sa 3 ,7 M .di est.ere? e^ <,>t il lcO?di?L^treoni na c ome_prop ionat-O.L_A-quest-a-so lu| J3.io.ne_s.3 ? s.ggiungeva? una? soluzione ? dj _ 4? mg? di ? tripsd=4 I ' na-parcl na in un volume? di- 4-0-. m i c rol itri? di? acetato | .di_ calcio- 0,-0-2-M,!? ed? il -pH della-soluzione era? rego-Lat.o_a? 6,3? con_llimpie go_di? aoido-p-ropioniGO .4-Po-i? 1-a soluzione? era-lasciata a 20<0>.C.. per 5 ore,--per-cui? 1-a I re azione? er a-i nt.e r r otta-m e di ante- 1 'aggiunt a di - 9 m 1 di_aequa-e_ regolaz ione-dei? v-alor e-d-:U-pH-a-3? c on-l---inipiego?di_acido? cloridrico? 5-Nv ? <1>

Li anali s i cromatografica su liquido? ad? alta pressione mostrava una conversione del 7?.? La miscela di reazione era filtrata su gel su colonna di Sephadex (marchio di fabbrica depositato) G-50 Superfine (2, 6x90 cm) in acido acetico 1 M La frazione contenente l?estere insulinic? u-mano ed insulina porcina non reagita veniva liofiliz-zata.<1 >La resa era di 180 mg di miscela di prodot to.?_

Poi la miscela di prodotto era sottoposta a scambio ionico a 4?C su colonna di DEAE- cellulosa ( Whatman DE-52) (5 x 2 cm) in equilibrio con 75 mi/ ora di un tampone formato da TRIS 0,02 M ed urea 7 M. con regolazione al pH di 8 , 1 con 1* impie go di acido cloridric oL_Dopo_ avere caricato il prodotto f ,la _co_-lo nna veniva e lui t a per 2 ore e mezza con la sdazio:? ne tampone di cui sopra, poi per 2 ore con il t amp_o ne in miscela con 0,0045 moli di cloruro di sodio p ir X itro ed inf ine per 12 ore con il tampone pep primo nenzionat o in miscela con 0f 0l 1 moli di cloruro di ..

I

sodio per litro _ _ _ _ _

_ Il materiale eluito conteneva jdu_e__.f razio ni proteiche principali.<1 >La frazione che venivate ?uitaper prima era identificata mediante cromatografia su li ido _ad^ alta pre s s i o ne. come costituit a. da_e.st. e.re_ insulinic? umano , e la frazio ne _eluit a_dop-o_coj]ie_insu- _ ina po rcina non reagita.

La frazione e e lui t a per prima e~ , ra dissalata su colonna di Sephadex G-25 (marchio j di fabbrica depositato) in acido acetico 0? 1 M e quindi liofilizzata cos? da rendere 1 20 mg di estere etilico di insulina umana.'

L? estere etilico dell?i umana isolato era djgciolto in un volume di 50 mi di acqua, il I

, pH essendo regolato a 9^ con, idrossido sodico 0, 1 N.' , La soluzione era lasciata a 25?C per 72 ore sotto con-| t rollo del valore di PH, dopo di che l'insulina, era ; c ln_maniera_gl?_no_t.a-di p.er_.s?_,

In seguito, si ott ene_vano_1-1_0__mg di insu-^ i li na? umana , _ ident ?ficata? mediant-e_anal x s i de gl i_amm i-. no ac idi_e_c r_omatngraf la- su - liquido? ad-alt-a-pre salone Esempi o-4

-50-0-mg-di-insulina-pnr-cina-veni-v-ano? di s c io 1-: t i in_un_volume?di_2,-50-mLdi? soluzione? acquosa 4$M _di_ est.e re_m et-iliao? di -L-=t.r eonina, ? clo-ri-d-rat ?,? o OH

O-r.e?di?pH-di? 6-,-5-J-DOPO-_;_??_6^3- ??<?>- un- volume di- 300-micro-li-t-rd--4-i? ae-i-do? e-le-:idrlao? 5M.,? si-aggiungeva-^ina-so-lu-zio-ne-d-i? tO-mg-d-i

11 rip s ina -in-un?volume-d-i? l-OO-m-i-erol-i-tri? di? soluzione ,di. acet at o -di? cal c io? 0, 02? M-,? e? 1-a? misc ela? dt-reaz-?o-<,>ne -era las ciata-ad-8^-C? per- 65-o-Fe-.? Po-i? l-a?reaz-ione-e i r a-int e rrotta mediante- aggiunta -d-i -2-5-ml? di? ae qua e I regolando il valore di pH a 3_ con_ acido, cloridrici) _ 5 N.<<>_ _ _ _ , _

_ _ Lagnali si. .cromatografica su liquido... ad... alta prensione, della miscela di reazione mostrava una conversione del 33^ ?- _

_ _ RIVENDICAZIONI _ _ _

J .1 _ Procedim ento per la .produzione di.__de.-^_ rivati deH* insulina mediante scambio delllamminoaci^ do C-terminale della . .c.at_ena_B , sott orazione enz imati= _ ca in <? >cui nel mezzo _.di_.r.e.aziane_acquoso-iac o Itati--*. v ameni e contenente una mino r_ . quantit?. _di? solvente-or ..ganico., _.un_a_ ina.uli.na._vi-ene__tj;ati-at^_co.n_un_enzima _p.ro t_e olii i.co ..in ..presenza di un eccesso- di-un-ammi-noa-

0 id o_ c Q n _ grup.p o_ c arb o. s silio o^ r ot et t o-,? e? quindi? i-1-grup_po__carb o_s s il i co _ di? p rota zinna? viene-facoltativam.ent e ..sep.arat o _il...qu aleiprace dimeni o -?? carat-te rizza- ? t o_ dall.? impi e go? d e 11.' ammino acido? con sgruppo? caibo s si- -_ dico, protetto ad una concentrazione--da-circa-2-,-5? a-_ Circa. 6_.mali/lit.ro.i _

.. ? 2._ Pro-cedimento~ della? rivendicazione 1 , ? ea- ? .] ?at t e r i z z at o -dall limp iego della tripsina ovvero di un ? enzima _in_relazione a-quest o? come- enzima? protao litico .

. - - _3-.LPro cedimento? del-la-rivendieazion??1? carati eri zzato dalla eff et tuazione -de-lla? reazione? ad-un _ . calore di-rN nelHint ervallo- da-c-irca-5- a- circa 9 .4V Procedimento della rivendi c azi one 1 oq-<1 >! ratterizzato dall ' impiego di etanolo in qualit? di I solvente organico .

5 ? Procedimento delle rivendi OH zio ni da 1

cina in qualit? di insulina.<1>

amminoacido con gruppo carbossi l i no protetto

. Er_o_c_e_diiiient_o_de 1 le_r iven di.c azi oni da

jtui?o_da__eskere-J;-eT-z=but.ilico<,>r-^t<j>rd^gruppi^di? estere? &l.chili.co?inf-er?o.Fe?o? gruppi? amm-i-di-e-i? come? gru-p-popr.o?-et-t-iv-o_del_carbossi-le,

Ee r. traduzione c onf orme

per se e per gli altri

Domenico de Simone

? Stemma

) DI DANIMARCA ?31 1 4 A / 82

Il direttore dell?Ufficio Brevetti?e_Mar- ! Ohi? cnn_jL^pre.s_ent_e_c_e-rt?f??a^c]ie_il_XJIiugno_L9i?2_ -N.o.r_di.sk_Insulinlab_o.ratjari_im,_di^ento_fte_Jia.

^itat-Q_in_q-ue.3_t_o_ufi?-i_c_?Q_una^_dQmancla^_diJb_r_exett.o_.in.j Da-? .nimar_c.a_p.er

"Procedimento per la produzione di insulina umana ovi_e.s_t_er_i_B-3-0_l.

.(.Domanda No . .254 6 del. 19.82._Int-._Cl.:_C._1.2 P)

copia, fot.o.st.at i c a - qui .allegata, ?

forme? con-la-domanda-e 1 a-des.c r-izione?dep.osit.at a coi L la-domanda-di? brev-ettO.'

(-Si-gillo-)-Copenhagen,? 8-S.et-t-embre.. . 1-9-82 Fvt-O? ! EV--Eolkmar-

-Domanda? di? brev-et-to-Nastro? r-if-er-imento :^-1-4-8^/AC/4J-J -Riservat-o-all?Uff icio del Lirettore-??6.182? 38077-6 - ^82-12-54-6 **800, 00

Richiedente : Nordisk Insulinlabcnatorium _ \ 1

Citt?: 2820 Gentofte, Danimarca

i

l Strada: Niels St eensens Vej 1

Agent e di brevetto : MNSK_PAT.ENT_KQN.T.O.R_ApS_

HLC LsjLeds_Jfe. j-TO-j?te-T?? C.openhage n-4? Inventori: Finn Hede Andresen

a: 3400 Hillero ed|___D_anim.ar_aa,_S.onim.ersv.ej 21 1

Per Balschmidt

!a: 3060 Espergaerde,.- Danimarc.a,_!ntbherup_All?_20

?Titolo :

"Procedimento ..per la produzione di -insulina-uiaana-o-Vr jv e ro suo i esteri B-40 " j

Per S? di-V-isio-naJ-i ? _ LNo.*.'_._d.e.ila_d<Q>!nanda relativa: -354-5/8-1? Dat-a--e??et-t-i-v-adi deposito 15 Settembre? 1-9-84-AXlLe.galLl_C-OLp.ta-d e 1 mo-dulo_di? d om andab.es crizio ne_in_t.r_iplo-Ri as.s_unt_o_in_t riplo _ , _ ?

1 las_sa._di_domanda_8-0.0_Kr-.! _

- Copenhagen,? 7? Giugno l 982

_ DANSK-PATENT _K0 N-TOR -Ap S ?

- - E-.-t-o-. ? Inge ? Riso ? E er s so n

-2546/8 2 -- -7 -Gi-u-gno? 1-9-82-i.:_Kim.-Ry_ He-jnaes

I

; 2800 Lyngby, Danimarca *

<?* >I V

! Bredebrovej 29

? - ' '

- - j ! - Hans Kof od <1>

<1 >2800 lyngby, Danimarca

. Soebakken 3

- 1 - ___________

1

! 254 6/82 - 7 Giueno 1982

I Nostro caso No .' ^14-85/AC/jJ

Descrizione con rivendicazioni e riassunto

Domanda divisionale

Domanda relativa No.' ^545/81

Data di deposito: 10 Agosto 1981

7/6/82_ : _ _

Nordiak: Insulinl ahorayorium

2820 Gentofte

"Procedimento per la produzione di insulina umana nv

vero suoi esteri B-W . , _ ? _

,

I Ln presente<? >i nvenzi one si ri -Feri s? e ad, un

.prnoedimento ori nai e per produzi one di ins? <">l i,-1

i

ina umana adatto ner la nrenerazione di onTnnnsi zi nni

? t erapeutiche di_insulinay nel_qual.e procedimento un

predetto insulinlco porcino^-vien e-trattato? co.n_c arbo s^

- 1 S-ipepiidasi A_o_wero. un corrispondente? enzima in mo~ 1

do da fe rmare un . pro dotto di_des alanina^insuli-na? 0 , .che ? in se guito condens ato con un estere al chi li co di L-treonina in presenza di tripsina ovvero uri enzima in relazione a questo ed un solvente organico, dopo di che l' estere insulinico fonnato viene idrolizzato ad insulina umana.<1>

li ' insulina ? un medicamento indispensabile per la cura del diabete.' Sarebbe naturale curare gli esseri umani con preparati ici ottenuti da insulina di origine umana!" Tuttavia il numero dei i <1 >jdiabetici e la necessit? individuale dell'insulina sono sproporzionati, rispetto alla quantit? disponibile di materia prima (pancreas umano) .'

Perci? per motivi di carattere pratico i preparai i t erap eutici ottenuti da insulina, bovi nq F> porcina sono ouellLimp_i_e_^ati..lJEu_t_t_a?l.a^_iinmisurB_ maggiore o minore, queste insuline danno lungo al l a formazione di anticorpo nel corpo umano, _ c.o.sa_ch e_c oinvolge un effetto ridotto dell'ulterio re t.r.att amento. nsulinico

Questo svantaggio secondo quanto? si_supp oneprovocato in parte dalle impurezze^ r_esentl_jnella insulina bovina e porcina^ _ i n_p.art_e_dall a-natur a-al ie? na, poich? la sequenza _dl_ammino_ac?di_dellHns1jli na diff erisce da .qu.ella^-dell * insulina--umana nel-l? J osi zio ni A8, A10 e _B3_0_y_ment r e 1<1 >i nsul i na- p onci nadif ferisce dalla... insuli na umana^solt-anto nella- posizione B30.*

1

j II problema della formazione di anticcapi |? stato sostanzialmente ridotto dal momento dell'in-|

itroduzione di preparati terapeutici ottenuti da ins? i .

ilina bovina e porcina purificata cromatograficamente ? !

Tutt avi a la formazione di anticorpi pu? ancora veri-' ?i carsi Si ritiene che quest,o possa essere un inconveni ent e elimi nato dall?<1 >impiego di preparati ter^pau- -tici ottenuti da insulina della medesima sequenza rii amminoacidi della insulina umana.' _

E ' no t a 1 a tecnica di preparazione dell* i n-<: >mulina per via chimica , ad esempio nel brevetto sta-<?;>unitense No.? 3.903.068 e si veda inoltre Hoppe-Sey- ; yer 2 Physioi.<1 >Ghem.?. 357, 759-767 (1976) .<1>

Questi procedimenti comprendono la nnnrj e n? sazione di una insulina porcina rieenntapppti de-(P23-30) con un o et apeptijle_s.int.etico corrispo ndent-e-alle po sizioni B- 23-3 0_nella_insnl lna_um ana.'. Tutt av-ia? nelp_ro c e dim ent o_si_r_eali zz a^una-?drolisi? al c ali na . che ? <;>-a_da_r_eazio-nLcollaterali? sfavorevoli II secondo_pro.c.edinient o . comprende? una reazione non_sp_e_c_if.i?c a la quale_d?_luo-gO?a-molte? reazioni collai e r al i_e_r?chi.ede?. t e c ni c he-di_puri?i cazio-ne-e omp 1 i c.at e_.!_.In_c_onseguenza_q-ues.t i procediment-i-^io-n-sonQ?adat ti .p_er_ l_Lu 30_su_. scala --ind? stri ale. i

inoltre, il brevetto statunitense No .<! >3.<1>276.? 61 descrive un procedimento per la produz i.o^ : ne di insulina umana da altre insuline animali per a-! zio ne di un enzima? per esempio carbossipeptidasi A ovvero tripsina* in presenza di treonina.

Tuttavia mediante questo procedimento noto non ? possibile preparare insulina umana ad alcun grado apprezzabile ?<i >Questo h probabilmente dovuto al fatto secondo il quale la tripsina e la Garbo ssipeptidasi A non soltanto il di lisilalanina peptidico (B-29-B^0) ma anche altre posiz io- <? >ni insulina nelle condizioni di

Di preferenza la tripsina idrolizza il legame peptidi co__ar. ginina- ? co che il legame lisile-alanina (B29-B1Q) Tuttavia la carbos sipeptidasi A non pu? esclusivamente separare la alani na sul terminale C della catena B senza anche p ro -vocare la separazione della asparagi nR_S-Ul_t_erminala-C della catena A.<1 >E* stato : inolt re_mo.s_t_rat.Q_c3ie_una co.ndi.zi.one_sp_e_cif ina, _ ci.o_?_l.a_r_e.azione _ in., una-soluzio. iie_t ampolle^ di_b.i.c.arl).ojiat_o_di_arnmrmio-,_?_ne.c.essariascopo di impedire la__cesaione

e per questo si veda H0ppe-Seyler_Z_^iPiiys?Ql.i_Cliem.l ! 159-,? 79-9? 8_Q2_.(_1.978 ) _Ino.lt.r_e.,_ si_verif ica-scarsamen-'t_e_una_cons_lder_evol e. f o rmaz io.ne_d i_p_e.pt j..de_p.o.i.c h.?_l a velocit? della reazione di idrolisi _ ? pi? elevata di quella della sintesi peptidica nelle condizioni di ilavoro.'

E* noto dalla rivista J.? Am.<! >Chem.' Soc.<1 >10,1 , 7 51 -752 (1979) il procedimento per rei 3. un ac coppi amento catalizzato dalla tripsina di dasnctapepptide-(B23-B30) insulina (POI) con un octapeptide ai ni tetico corri e alla successione di amminoacidi (B23-B30) nella insulina umana. In questo procedimento gi? noto la insulina sintetica viene usata in an eccesso ( 10/1 ) , ed il mezzo di' reazione contiene il solvente organico (DMF) _ in una concentrazione* di pi? del 50$. per cui la concentrazione dell'acqua ? considerevolmente ridotta. La ione h di succes-__ 30, ma tutti i fattori essendo considerata questo arocedimento ? costoso e ingombrante, poich? tra l<f >attiro esso implica una sintesi costosa dell'octapeptide richiesto

_Imlt_r_a*_la_r i visi_a_Hat_ur_e_y_o 1. L.28.0 , . del. 2 AgQ.st.o_ 1979 alle-_p.agipe_4-1-2=4l3_e la descrizione brevetto Pane se No . ! .15.5-6/8.0_des.crl_v_e__un_pra_codimentO-i R r. amb io_delllamminaacido_B3-0_nella-_insulina po rr?. i -_iia.i_In_p.r_imo__luago_ll.ammi no_ac.ldo_B3.0_ ne lllinsulinap? re ina_?_s_ep_ar_atPLjm.e_di.ant_e_jb_ra? t.ament o d?llinsulina _ por c ina con .c arb.o.ssipeptidasi_JL_a_2.5_?-C_p.e r_ .8 _ o r e in.

i _ ; <, >presenza di tampone di bocarbonato di ammonio in mo-l-1 do da formare una insulina con desalanina (DAI) la quale viene isolata.? Poi il DAI formato e l' estere <s >, t .

butilico di treonina (Thr-OBu ) sono copulati m pre senza di tripsina in una soluzione contenente grandi quantit? di un solvente organico , circa 60$, alla . temperatura di 37 ?C<' >per 20 ore in modo da formare ii 1-; sulina porcina (B30-Thr-0Bu ) che viene isolata.<1 >Infine il gruppo dell' estere butilico viene separato con acido t rifluoro ac etico operando in presenza di anisolo

Cosi, i difetti essenziali che si trovano 1 : :

'nel procedimento di cui al brevetto statunitense No .

possono essere sorpassati effettuando la |

(reazione in un mezzo contenente elevate concentrazic jm di solventi organici, cosa che permette una dimi-/

jnuzione della concentrazione di acqua verso valori c i i

(circa 10$, e la resa dipende dalla quantit? di sol-!

jvente organico presente nel mezzo di reazione, poi-(che una elevata concentrazione di solvente organico !d? come risultato una elevata resa.' Gli svantaggi di ^questo procedimento sono tuttavia che elevate concejtrazioni di solvente organico fanno diminuire la velocit? di reazione e che molti dei solventi proposti' probabilmente sono mutageni.' Poich? essi pcffiono difficilinente essere^ _rlmoj3m-iiLJ?Lani_ar_a_conipleta--dal. prodotto insulinico y il loro impiego ? dannoso ovvero almeno indesiderato.* _ ; _

Lo scopo della presente invenzione ? quello di fornire un procedimento in cui una des-B30 insulina di origine animale, preferibilmente des-B30 insulina porcina, pu? essere copulata con insulina BJO-trennina in elevata-neaa? e_ sjenza_impiegare solventi organici? dannosi-*!

J21? stato... trovato? in-nLanl&ra^c_rpr_end.ente_ che la ..copulazione? enzimatica del. .derivato? diljtreoni^ na-nella_po-sizio.ne_B.3-0. .dalla mo.le.c.ola._insulinic.a? pu? essere? efiettuata-S-elettivpmente?S-enza-influenzare.. altre posizioni della, molecola stessa, se il derivato di? t reo nina_ viene usato? ne-l_mezzo ..di-reazione? ad una certa? co.nc.ent razione? d i vai o re_eLev_at.o .<1>

-H_signiiie.at.o_ della-co.nc.ent.razione elevata-dei? derivato? di?treo-nina-nel-mezzo?di-reaz i o ne non i . |?_ stato-f-inora-compreso-.:? In gener-ale_ai_riteneva-che!_ ?L ^idrolisi triptica^e-la-formazione-di? sotto? pro-dot?^ !to?nel-raezzo? acquo so -f o ssero? inevitabili. e che_Hi= ? ?dro-li-s i? p o te va essere? ridotia-soltanto se-1 a-miscela jdi? reazione-conteneva-quantit?? considerevoli? di? sol^fi vente-o r gani G o V? In-co ns e gu enz a-fino? ad-or a-le-m i scale -di -re azione, contenenti? da? 60ra 90$ di? solvente? organi i <' >1

I

j i .. ^ nico miscibile con acqua sono state impiegate ?'<?>

E' ben noto che l' idrolisi catalizzata da

enzima di legami peptidici ? reversibile e che l' equilibrio pu? essere spostato verso la copulazione,

quando un reagente viene aggiunto in eccesso .' Perci? ?

? stato impiegato un elevato rapporto molare tra il

1

1 derivato di treonina ed il componente di insulina, p er

1

[esempio tra 5/1 e 500/1 .?

Tuttavia, ora ? stato trovato che una eie-l

( |vata concentrazione molare del derivato di t , reonina nell' intervallo di circa 2, 5 fino a circa 6 moli/litro ? di importanza decisiva per la funzionalit? di

1

successo della reazione di conulazione. mentre il

rapporto molare tra il derivato di treonina. pd il

componente di des-fB-30) insulina ? in larga mi su?

di nessuna imoortanza.<1>

i .

[ Pertanto, il procedimento della predente i r 1-i

venzione ? caratterizzato dal l' impiego di estere al -chilico di L-treonina in una concentrazione ,di ci rca

2, 5 fino a circa 6 moli/litro !<?>

Quando il derivato di treonina R presente

ad una concentrazione tra circa 2.5 e circa 6 mol i / _ _ _

1

litro. Questo d? come risultato una r_eazione_Rn.eci f_ica con il componente ins?! ini co nel l a sua posi zione

_ B 29-B30 ?m.ent r_e_ lli.dro_li.si_in_tu.tt.e_l.e_alt.re? po-siz io r l?

? soppressa/ In queste circostanze _.l*_aggiunt a.. di. solvent e q rganic o no n ? ri chi est a per. sopp.rim ere ?la _f o ^inazione di sotto .prodotto Co s? . lajreazi one . pu?-e.s.-^. ._ 4sere condotta in un mezzo .acquo so . .sost anz i. alm.ent e._ s.eni za_f ormazione di _sot to prodotto.^ _ _ _ _ _ _ _ La concentrazione preferita del derivato _c _ treonina ? da circa 3 a cicrca 5 _moli/lit ro .Se.. la supera circa 6 moli/lit ro la_v:i.s_co_s.i-X t? della_jnisce_la_d_:L_ r_eaz_i_o_na__aar?_aum.ent.at a_in_.mani.ep _ ra non dovuta.* La viscosit? pu? tuttavia essere ridotta alquanto mediante . aggi?nt a_ _di?p ic_c_o.le_quant i_t_? di_un solvente organico che . sia .misc.ibile_co.n._l_<,>.ac-_-u? .i _Un ?al.c anoJ.o_._c o me. ad _ esempi o_et amlo , _?_ parti co^ 1 f armento adat.to.__ e_la.?quant it? . del solvente dovrebbe .

I es.s.ere_ raani.enut a _ al._dis.ot t.o _-del_4-C$__(_vo lul.e/vo lume.) J _ Come reagente insulinico,. di. -p.ref.erenza- si _impiega.._un_deri-v-at.9._di.-des-alanina-(B=30)? insulina _ _ dalla JLns.ulina _po.rc.ina,? ma. anch.e _.un_ derivat o? di- des^ _ ?lanina_CB-30_)_.insulina_dalla -insulina-pravenian?.e._d?.-_ -alt-re__spe.ci.e,_ p.u?_e.ss ere _ impiegata. <1 >-Come?reagerrt e -dii

treonina, una L-tr.eno.nina p ro t et t a _v.ien e - - imp-i e gat a , __.?l_-gruppo__di__prot ezione di_pref erenza-essendo? un- est ?--_ jj*e._alchilico ,_ _p.er.-e s empi o_est.ere_ metili co- J ? -.In qualit? di enzima proteolitico -un... qu-alun-_que_. enzima. adat.t.o come ad . esempio -tripsina ovvero- un i enz ima__ln?relazi.o_ne_a_q.u.e.s.t_o_,__pu?_es sere irap ie gat o ;

L ajt emp er at_ur a__d.i^._c_e_azi one_pu?__e s s_e.r.e_.sc e 1-. t a_ad un valore compreso tra 0?C e 50 ?C e il valore ,di pH nell intervallo da 5 a Q .<1 >i IX_projD e_dim.ent_o__d.e.ll a_p.nes.e.nt-e_i nY.enzi.one .viene ulteriormente illustrato per mezzo degli esempi che seguono,.*

^Es.empio 1

2_gr-ammi_di_ins-ulina_p-o.r.c.ina_e.sent_e da pirico venivano disciolti in 200 mi di aolu z ione_0^2_M di_bi.c.arb-onat-o_di_aimno.nio-,_r-e.go.lat.a_ad_un_pR_di_8.,4 co n_ammo.ni.ac.a_ac.q.uo.s.a .^_2.0_in g_d j _ c arb.o.s s lp.epti das i A venivano-<.>dis<.>ciorti? in-un_ volume? di-4- ml-di? acqna? per mezzo_di_po-clii? grani-di TRIS solido e aggiunti- -alla soluzione? di? insulina,? che? era? in-segu-i-to?las ci at a ?a 20? C? per- 2? ore? e-mezz a.<1 >La soluzione veniva? conge-l-at a sotto centrifugazione e li of ilizz ata.' La-p o-l-v-e-r e li c -f-iliz zata era di s c i o lt a i n un volum e - d-i? 80-ml? d-i? ae i -do? ac et ico? 1-M? e? f-i-lt rat a? su? gel? i-n-co-l-onna-ri empii a con-S ephadex? (-mareM-o? di? f ab?ri-G a? dapo-sit-ato-)-^Gr-50 Superfane? (-2-,-?? x? 80 cm) nel medesimo mezzo i La-fraz-i-o ne? contenent e insulina era -liofilizzata.<1>- In tal? modo si-o-ttenevano 1 800 mg- di insulina de s-(B-3 0 - alani na) porcina.<1>. - i - i -Esempio

I

1 grammo di estere metilico della L-t reonina veniva^ discio lt o_ in un volume di 1 mi _ di^acqua _ _ e 200 jn g di insulina d e s alani na ( B-3Q) porcina pre-parata secondo 1* esempio 1 venivano aggiunti a questa soluzione II valore di pH della soluzione era r ego Iato a 6, 3 con 450 microlitri di acido acetico glaciale.' 10 mg di tripsina venivano aggiunti e la soluzione era lasciata a temperatura arobient e|j Dopo 20 minuti la reazione era interrotta per regolarlo ne del valore -di pH a tre con 1* impiego di acido ci T? ridrico 1 NJ L' analisi cromatografica su liquido ad alt a pressione mostrava una resa di est_e_re._m.et i 1 ic.o di . insuli.na_um.ana_di__7_3^_.l

.La -m?P_c_ela._di_r_eazione__era .. filtrat a . su gel,.. . su colonna di .Sephadex G-50 ( marcili o . di ..fabbrica- -de^ 'posit at o_) .. G-5Q.. . Superi ?ne _(_2., 6_x__9_0 _cm.)__in_aci.do_-ace I

it i co <? ? >:

1 _M*_!a_ _f.razione_cont_en.ent_e_este.re_insulini.co _ mano_e_iinsul ina_de s_al ani na-( B-30) non reagii a,-era lip I ' ^ fili zzai a* _ _ _ ; _ L _ _ - _In .seguito , _la_fr azi o.ne_sop ra-m enzio nata _ invaniva. s_o_t_t_ o_po_s_t_a _a_sc ambia_ io.nico.-a-4B.C-.su-c.olo nna-]

. di DEAE-c.ellulo_s.a.( Whatmann DE=5 -2.) _ (_5x? 2_ cm-)? in equi-_ 1 ib.ri o_ _c o n _7.5_ .ml/or a_di_ un_ tamp one-c ostituito da TRIS _ Q ?., 02_ M . e.d._ur_ea_7? M j _r-e.golat.o_ al ?valore -di? pH-< \ -tl-i? 8 , -1 I-con. acido cloridrico .:. Dopo - aver? cari cato? il -prodotto- , ! la colonna veniva eluita per 2 ore e mezza con la soluzione tampone di cui sopra? quindi per 2 ore con la soluzione tampone di cui sopra in miscela con 0,0045 moli di cloruro di sodio per litro ed infine pei* 12 ore con il tampone per primo menzionato in miscela con 0,011 moli di clo <?>ruro di sodi <'>o pei* litro ;.r<1 >i _

Il materiale eluito conteneva due frazioni principali proteiche** La frazione eluita per prima era identificata mediante cromatografia su liquido ad alta pressione, come formata da estere di insulina umana e la frazione eluita in se o come insulina desalanina '(B-30) ? non reagita.<1>

ia f razione. principale, eluita. per prima_v_e= :niva_disj3_alata_su_cAlQnna_di_S.e.phade:x:_(marciiio_di_fabbrica_dep_o_s.it_at.oJ _ G-25 in acido acetico Q, 1 M. e lio-[fili z z ata_c.o_s ?J.da-_r_ende re_9-5? mg_di_e ste r.e_e t.i.lico_ di i

'insulina_uniana.v <' >'

LJLest-ere? etilico? di-iilsulina-umana-iso lato.

C

- Ler a_di s.clolt_o_in _50L_ml_wdi_acqu a il_p H? v_en iv-a-r e golar-- - 't-0_a_9-,_5? con_so.luzione_acq-uo-sa-0.,-1rM_di? idro^sidoLso?-dico-.i-La-Soluzione? er-a--lasciata_?-2-5-??? pep-7-2-one-sot? ^n?controllo?del? vaio r-e_del_pH_e? poi? insulina? era c rist ai lizzat.a-in_m ani era_gi?-.not i-di? per? s?i .

-Quindi^_si_o-t-t-enav-ano_85-mg-d-i? in3ulina-u--| mana, identificata mediant e- anali si de&Li amminoacidi cromatografia su liquido ad. alta. pressione.<1>

Esempio 3

_ _ 2 grammi di estere met ilico di L-treonina venivano disciolti in un _ volume di 2 mi di acqua e _ 11 (?? ?-

_ _ !a questa soluzione si aggiungevano 400 mg di ins?- _ i I

lina desalanina (B-30) porcina preparata secondo l ' e? I - - << " " ?>

sempio 1 ,<1 >II valore di pH della soluzione era regolato a 6, 2 co n 900 micro litri di acido acetico giaci a-] le.<1 >20 mg di tripsina foiroilata venivano aggiunti e la soluzione era lasciata a t emperatura ambiente -per 2 ore.' Poi la reazione era int errotta per regolaz.ic jie del valore di pH a 3 con aci do cloridrico 1 N.<! >l?<1 >nalisi cromat o grafica su liquido ad alta pressione mostrava, una resa di estere m?tilico di insulina _u=-.__. j

mana del 69#.? _ _

Il f razionament o._e l ? isolamento del prodo.t.-r t_o._di ..reazione e la._sua_ idrolisi come des.critte_.nelesempio 2 . rendevano 1 60 .mg .di _.insulina_umanav_

Esempio_^L__

_ Una soluzione di . 100. mg di ..insulina _de.s- _ 1

_ _. _(.B30-alanina). __p.o.r_cina in_4Z5-micro.lit.ri di estere ace .... _ _t_ato_met ilico. di L-treonina.3 ? 2_.M, v.eniva -pr ep.arata- .

r

. . . _p.e.r_ disso.luzione_dl__100_mg_ di_insulina-des-T.(B10-ala-r _ lina) ^porcina preparata-secondo-.l ? esempio . 1, in una _ miscela -di_20.0 micro lit ri_.di_ac.qua- e. 7 5 - mie r.olit ri_di I acido? acetico? glaciale? ed_in_s.egu.it_o? aggiungendo? 200 ^g di estere metilico . di_L-t.reo.nina.Uopo? regoiazio-

n e_del_ vaio-re? di_ pH_ a_6.,_5? uo n_ac ido? ac eti co gLac i al e,, -usi_aggiungeva- .1 mg di-.trip.sina-po.rcina.iLa-iniseela-vn=.

I

-iiiva JLasciata^a^temperat-ura-ambienta_per? 2_ore,? e? poi? -ila^rnaz ione? era-interrotta per aggiunta-di? 5-ml-di _ [acqua-e? regolando? il-valore? del- pH_a-^? con-acido? ci?,-; r idrico? 5? H.?-Li-analis i er ornato grafie a? su? liqu-i do? ad alta-prassione-mostrava-una-conversione-del -7-8$.? -II? trattamento? delliastare-metilica^di?in-! sull na VAmana? pur a? e? la? sua? conversione? nell? insulina I

po t evano? esse re? c ondotti -seguendo . -le? direttive dell ' esempio -2-.?

i

RiV-END-I-GAZ-ION-I

1 .?Prece dimeni o p er i-a -produzione? dir-i-nsuli-na-umana-ovve-ro--d-i? un? suo? est ere-13--30- -, i-n^oui? un predo tt-o? co s-t-i-tu-i-t-o? da? i-nsuii-na? porc ina? viene<?>t rat -I

tato? con? earbossipeptidas-i? A? ovvero? un? corrispondent?

<? >enzima? i-n -modo -da? formare-ur? prodotto? di? desa?anina--?3?? insuli-na? che-?? i-n? se-guito? condensato<- >cor-rtn<- >e-<~ >-st-ere? aichi-l-i-co? di--Ir-treenina<_>in presenza<- >di<- >un-mez^ -zo? di? reazione acquo so j -f-acoltat ivamente<- >contenent e" -una-minor-quantit?? di? solvente? organi-co-i-ad-una- tempe?^" -rratura-ai?di-sotto?di-^e-oG-e-poi?ii?gruppo?di-prot-ezii^ -ne?viene-f ac oitativamente-rimossoy<_>i?<?>qura?e-pTO cedici ? mento ? caratterizzato dall * impiego dell <?>estere alchilico di L-treonina in una concentrazione da cir-: caj ,5 a circa 6 moli/litro

2, Pro oedimento dell a rivendicazione 1 ca?

ffi a come prodotto insulinico -porcino /

3_v_ Procedimento della rivendicazione 1 ca-

L-treonina ad una concentrazione da ? a__5___ moli/l it ro_.i

ratterizzato dal fatto di condurre la reazione in un mezzo acquoso contenente da 0 a 10$ in volume/volume __di jun_ solvente__Q rganlao_ad?un_valojre_di_.pH da

_ 5_._ Pro-C.e.diment.O?della-Jiven di e azio ne -1-f_c ? _ rat tjeri zzat o , _dall <1 >imp ie-go_di^e.st-e.re -metilico -di L-? .t.re_o_nina_come_es_t ere _alciiilico_ di_L=treonina

ratlarizz.ato_dalllimp.ie.go. _di_ei-anolo_come_so.l venta _

Per. traduz pieron see e c poernf goirrmuuat.t,

Anione

(

AL MINISTERO DELL' INDUSTRIA DEL COMMERCIO E DE V 77

LL 'ART <v>IGIANA ^TO

Ufficio Centrale Brevetti - R O M A -Oggetto: Domanda di brevetto No. 49114-A/82 depositata il

14 settembre 1982 a nome: Presentata add?- _ G ?Uli__iQR?v- . NORDISK I NSULI NLABORATORI UM <ore >.. - come da verbale

1. Con riferimento alla domanda di brevetto in oqqetto,

la Richiedente desidera apportare alcune rettifiche nei docume nti oriqinariamente depositati allo SCOPO di eliminare deoli er

rori di scrittura.

2. Le rettifiche che si intendono apportare sono le sequenti:

- rettificare il cognome del quarto inventore da "HOFOD" a

"HOFOK"

f - pag. 3 riga 14 correggere "1967" in "1976" j /3' ? - oao. 16 riaa 22 correoaere "180" in "100"

t - oaq. 19 riga 19 rettificare "liau?da" in "limpida".

L il <y>

3. Secondo la orassi usuale si allenano i seguenti documenti :

- duplice copia dell 'elenco delle rettifiche da apportare mediante postille (Allegato A) datato e f innato;

- duplice copia delle pagine 3. 16. 19 del testo italiano come! originariamente depositate e recanti i richiami alle summenzionate postille.

4. Gli emendamenti proposti dalla Richiedente hanno il

solo scopo di porre rimedio ad errori involontari incorsi nel

Claims (1)

1. la stesura del testo originario.

   La Richiedente dichiara di volersi avvalere'dell'Art.

   49 del D.P.R. No.338 del 22.6.79 per apportare le summenzionate rettifiche.

   Con osservanza

   ING. BARZANO* & ZANARDO ROMA S.p.A.

   UN MANDATARIO

   (Enrico Toschi)

   CJ/gt.-8333