IT8249727A1 - Composto peptidico ed attivita' ipotensiva e procedimento per la sua sintesi. - Google Patents

Description

SIB-83 675 Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: '<?>'Composto peptidico ed attivit? ipotensiva e pr-oce^ dimento per la sua sintesi"

della ditta italiana POLIFARMA S.p.A.

con sede in ROMA e

dell?Ente italiano CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE con sede in ROMA

RIASSUNTO

E<5 >descritto uri nuovo peptide, isolato dal veleno di serpente della specie "Crotalus Atrox", che presenta la seguente sequenza di aminoacidi-levogiri ;

PYR-LEU-THP-PRO-ARG-PRO-GLN-IL?-PRO-PRO

nonch? un procedimento per la sua sintesi ? il suo impiego per il trattamento di stati di ipertensione*

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un nuovo peptide la cui formula ? rappresentata dalla seguente sequenza di aminoacidi:

PYR-LEU-TRP-PRQ-ARG-PRO-GLN--ILE-PRO-PF.Q

<'>in cui indicano FYR acido piroglutamico,

LEU leucina,

TRP triptofano,

PRO prolina,

ARG arginina ,

GLN glutammina,

ILE isoleucina,

L'invenzione si riferisce inoltre ad un pr? cedimento per la produzione di tale composto e al suo impiego nel campo farmaceutico per il trattamento di stati di ipertensione,

Stato della tecnica precedente

E? da alcuni anni noto che i veleni d? diverse specie di serpenti contengono frazioni peptidiche in grado di abbassare la pressione sanguigna in mamm?f? ri.

Ad esempios nel 1970 Ferreira e collaboratori (Biochemistry 9? 2583-93) isolarono da veleno di "Bothrops Jararaea"'un peptide di struttura.: FYR-LYS-TRP-ALA-PRO capace di potenziare l'effetto della hradikinina.

Nel 1971 Rato e Suzuki (Biochemistry 10, 972-980) riportarono la presenza nel veleno di "Agkistrodon Haly3 Blomhoffii"di due peptidi potenziatori dello effetto della bradikinina, denominati potenziatone B e potenziatone C e di formula, rispettivamente, PYH-GLY-LEU-PRO-PRO-ARG-PRO-LYS-ILE-PRO-PRO e PYR-C-LY--LEU-PRO-FRQ-GLY-PRO-PRO-ILE-PRO-PRO .

Sempre nel 1971, Ondetti e collaboratori (Biochemistry 10, 4033-39) riferirono di aver indivi duato nel veleno di "Bothrops-Jararaca<11 >sei peptidi aventi la propriet? di inibire l?enzima che trasforma l'angiotensina I in angiotensina II. Di questi pepti_ di uno, denominato nel lavoro V-6--I e in successive pubblicazioni "teprotide<,i >mostra molta affinit? con il peptide oggetto della 'presente invenzione poich?, difetta soltanto della leucina in posizione 2 (forum la: PYR-TRP-PRO-ARG-PRO-GLN-ILE-PHO-PRO ). Gli altri hanno le seguenti formule: V2: PYR-TRP-PRO-ARG-PRO-THR-PRO-GLN-ILE-FRO-PR?; V*6-II: PYR-?SN-TRP?PRO-ARG-PRO-GLN-ILE-E?O-FRO; V-?: PYR-ASN-TRP-PR0-1IIS~PR0-PR0-PRO; V-9: PYR-GLY-GLY-TRP-PRO-ARG-PRO-GLY-PRO-GLU-ILE-PRO-PRO.

\

Nel 1973 il gruppo di Ondetti (Experientia 29, 1052-35) procedette alla sintesi di oltre 50 peptl di, modificando le struttur? originali del \teprotide e del pentapeptide identificato da Perreira.

Pi? recentemente, B?nilla (FEBS Le?t. 68, 297-302, 1976) ha descritto un peptide di 2G residui, isolato dal? .'veleno di ?Orotalus Atrox", in grado di abbassare la pressione degli animali da esperimento, ma non ne ha descritto la sequenza.

Sommario dell <8>invenzione

E<{ >stato ora trovato che nel velene di "Cr? talus Atrox" ? presente un peptide della seguente struttura:

PYE-LETJ-TRP-PRO -ARG-PRO -GLN-ILE-PR?- PR?

peptide che ? stato isolato per via cromat? grafica dal veleno liofilizzato e la cui-struttura ? determinata mediante analisi di aminoacidi, e, dopo nente con Rf = 0,9, negativo alla reazione con ninidrjL na (per i gruppi araminici liberi), ma positiva alla reazione di Ehrlich (per il triptofanp) ed.alia elo razione (per il legame peptidico).

L'analisi di amminoacidi/dopo idrolisi in HC1 6 N a 110?C , per 24 ore d? i seguenti risultati:

- acido glutammico (2,0);

- prolina (3*5);

- isoleucina (1,0);

- leucina (0,9);

- arginine (1,0);

(moli per mole di peptide, assumendo la presenza nel peptide di un residuo di arginina). La presenza di triptofano ? confermata dal caratteristico spettro UV della frazione

Il tentativo di determinare la presenza di un gruppo aminico terminale libero, mediante reazione con il cloruro di dansile, idrolisi acida e successiva identificazione dell'eventuale residuo dansilato su strato sottile di poliammide, d? risultato negativo.

Una aliquota d? P^ viene trattata con metano lo/acido cloridrico per 24 ore a temperatura ambiente (Anal. Biochem, 48, 5^6? 1972) e m?stra, dopo cromatogra fia su strato sottile di cellulosa, un unico comp? nente ninidrino-positivo, oltre che positivo alla rea zione di Ehr?ich ed alla clorazione e, dopo reazione con il cloruro di dansile, la presenza di acido g?uta? niico li-terminale*

50 mmcli di E? sono metanolizsate, e la s? quensa di amminoacidi viene determinata secondo la te_ cnica d? degradazione manuale Edman-dansi1e (Biochem. J* 119, 805, 1970).

La struttura del peptide risulta essere: PYB-LEU -TSP-FRO-ARG-PRO -GLN-ILE-FilQ- PRO La presenza di triptofano in posizione 3 vie ne assegnata solo sulla base di evidenze indirette ot tenute dalla degradazione Edman-dansilejina viene confer mata dai risultati della scissione a livello del tripto fano di una aliquota di F- dopo incubazione in una mi scela di dimetilsolfossido/HCl/HBr (Meth. Ensymol. 47, 459-463, 1977), e successiva purificazione ed analisi dei frammenti* Lo stato di amidazione della glutamina in posizione 7 viene assegnato in seguito alla determi nazione della mobilit? elettroforetica di a pH 6,5 secondo Offord (Nature 211, 591, 1966).

Il peptide oggetto dell'invenzione ? stato anche sintetizzato e nel seguito vengono descritti il procedimento di sintesi ed un esempio d? produzione.

Sintesi del peptide

La premessa fondamentale di questa meuodica ? che gli aminoacidi possano essere legati insieme in peptidi della lunghezza desiderata, ancorando uno di essi (quello -COOH terminale) ad un supporto insolubi le.

Dopo che ? stata legata insieme la sequenza desiderata di aminoacidi, si usa un reattivo che ?ibe ra la catena dal supporto, e lascia il peptide in solu zione.

Il supporto solido ? un polimero sintetico contenente gruppi reattivi. Questi gruppi sono scelti in modo da poter reagire con i gruppi carhossilici d_e gli aminoacidi, cos? che 1'aminoacido si trovi legato covalentemente al polimero.

Durante questa reazione , il gruppo aminicc dell<1>aminoacido deve essere protetto da opportuni gruppi sostituenti, in modo che 1*amina non reagisca con il polimero.

I gruppi proteggentidebbono inoltre essere tali da poter venire rimossi selettivamente, senza danneggiare il legame fra 1<?>aminoacido ed il supporto solido.

Dopo la rimozione del gruppo proteggente s? fa reagire 1*aminoacido legato al supporto solido con un secondo aminoacido protetto sul gruppo aminico, mediante l?aggiunta di opportuni agenti accoppienti.

Si procede quindi allo sblocco del secondo gruppi ami nico e cos? via, in.una alternanza di accoppiamento fra aminoacidi e sblocco dei gruppi aminici fino a che non sia raggiunta la desiderata sequenza^?i aminoacidi?

Alla fine della sintesi si usa u? diverso r?attivo per rompere specificamente il. legame fra il primo aminoacido ed il polirne^ ed il peptide viene li-berato in soluzione.

Forma pertanto oggetto dell'invenzione un prc; cedimento per la produzione del peptide secondo la presente invenzione comprendente le operazioni di:

far reagire prolina, protetta sulla amina da un gruppo protettore, con un reagente atto a legare covalentemente il gruppo carbossil?co della proli?a.

e supportato su una resina insolubile attivata, in soluzione anidra, ed in presenza d? un catalizzatore;

recuperare la resina portanto la prolina pr? tetta legata ad essa;

allontanare il detto gruppo protettore;

far reagire ulteriore prolina protetta sulla amina\ da un gruppo protettore, con il gruppo aminico della prolina legata a detta resina, in soluzione ani dra ed in presenza di un agente accoppiente, in modo da costituire il legame dei due primi aminoacidi della catena di aminoacidi del peptide;

recuperare la resina portante la catena di due gruppi di prolina, legati ad essa;

ripetere le operazioni di accoppiamento fra aminoacidi nella sequenza atta a costituire l?intera catena peptidica desiderata;

staccare detto peptide dalla detta resina;

e recuperare detto peptide.

Viene ora descritto un esempio dettagliato di sintesi del nuovo peptide.

Esempio di sintesi

2,5 g di resina attivata (chloromethy? Bio-Beade S-X 1 della ditta Bio-Rad) vengono messi a reagire in un pallone con 215 mg di li-terz.butossicarbonilprolina, 20 mi di etanolo assoluto e 0,15 mi di trietilammina.

Si sistema sul pallone un refrigerante ad acqua collegato ad un palloncino essiccante, contenente CaCl^. Si mette il pallone su bagno ad ?lio a 90?C e si lascia rifluire per 24-ore. La resina viene quindi fil^ trata su Buchner, lavata successivamente con etanolo, acqua, metanolo e diclorometano* e portata a secco sotto vuoto.

La resina con prolina viene posta in un reai piente cilindrico di vetro, fornito di apertura superi? re per 1'introduzione di reattivi, e munito,nella par te inferiore, di filtro accoppiato a rubinetto, entrari bi in teflon. Si aggiungono 20 mi di diossano, e si agita per 5 minuti con uno speciale apparecchio osci! lente in 105?*

Si filtra via il diossano e si aggiunge una soluzione di HC1 4 M in diossano (20 mi). Dopo 30' si filtra via l'acido e si lava con diossano, e poi con cloroformio- Si aggiunge trietilamina in cloroformio (1:9, 20 mi) poi si lava con cloroformio e quindi con diclorometano. Si aggiungono 430 mg di N-terz.butossicarbonilprolina in diclorometano e 1,2 mi di dicicloesilcarbodimmide (DCC). Si lascia reagire per 2 ore, quindi si lava con dielorometano. Si ripete quindi il ciclo partendo dal lavaggio con diossano.

Per evitare che la sequenza prolina-prolina dia origine a dichetopiperazina, l'aggiunta di DCC vij3 ne effettuata prima di N-terz.butossicarbonilisoleucina (460 mg).

Nel ciclo successivo si aggiungono 490 mg di N^-terz.butossicarboriilglutammina, e nel ciclo ulteri? re ancora 430 mg di N-terz.butossicarbonilprolina.

1/<1>arginine viene introdotta come Ha-terz.butos sicarbonile senza gruppi proteggenti il gruppo guani dinico. ma in largo eccesso (820 mg).

Dopo un altro ciclo di terz.butossicarbonilprolina, (430 mg) si aggiunge N-terz.butossicarboniltriptofano (620 mg) in diclorometano contenente indolo (1 mg/ml) e tracce di acido trifluoroacetic?, quindi:* nel ciclo successivo 460 mg di N-terz.butossicarbonilleucina, infine nell?ultimo ciclo, 260 mg di acido piroglut amico.

Per staccare il peptide dalla resina questa viene sospesa in 20 mi di acido trifluoroacetico. Si fa gorgogliareHBr anidroper. 90 minuti, quindi si fil tra la soluzione in pallone. Si porta a secco sotto vuoto senza riscaldare, quindi si lava con metanolo: acqua (1:1). Si riporta a secco e si pesa il residuo: 915 mg di peptide.

Vengono ora confrontati il peptid? sintetizza^ to e quello ottenuto per estrazione dal veleno di "Crotalus ?trox", con particolare riguardo alle loro propriet? chimiche.

1) Entrambi i peptidi, caricati su colonna di resina ? Bondapack fenile (ditta Waters)di dimensioni 0,44 x 50 cm ed eluiti con soluzione idroalcoolica, dan no un tempo di ritenzione di 9,1 minuti.

2) Entrambi i peptidi mostrano, all?analisi di aminoacidi, di possedere 4 proline, 2 glutamici, 1 arginina, 1 triptofano, 1 leucina , 1 isoleuuina.

5) Entrambi i peptidi, per cromatografia su strato sottile di gel di silise, ed usando come eluente a-butanolo/acetato di etile/acido acetico/acqua mostrano di avere Rf = 0*54..

4) Entrambi i peptidi, per elettroforesi a pH 1,9 su carta Whatman 5 ?1?, dopo 1 ora a 1000 volts, mostrano un?unica macchia con Rf=0,30.

5) Dopo apertura del piroglutamioo per metano lisi, entrambi i peptidi mostrano di avere la sequenza; FYR-LEU?TSP-PRO-ARG-PRO-- GLN-ILE~PR0~RR0 .

Studio dell?attivit? farmacologica

Sono state condotte prove per saggiare l*a;b tivit? enzimatica e farmacologica del peptide secondo 1 ?invenzione.

Proye^enziiaatiche^ ''in vitro?

Sia. il peptide estrattivo che quello sint?tico sono stati saggiati ?in vitro? sull?enzima che trasfoi? ma l'angiotensina I in angiotensina II.

Il metodo usato ? quello di Cushman e Cheung (Biochem. Pharmacol.. 20, 1637-48, 1971)?

L'IC^Q per il peptide sintetico ? risultata essere 3*5x10 ~6 M, mentre concentrazioni equimolari del peptide sintetico e di quello estrattivo (calcolate in base all'analisi degli aminoacidi) hanno mostrano inibi zione sull?enzima del 52 % e del 44-% rispettivamente. Saggiato nelle stesse condizioni* il teprotide ha aio strato avere IG.-Q = 5?XxlQ~^ H.

Prove farmacologiche "in vivo"

1) Effetto sulla pressione.

Sono stati usati ratti Vistar maschi, aneste tiaaati con uretano etilico, del peso di 200-500 g. Dopo incannulazione della trachea, la carotide destra veniva isolata e collegata mediante cannula ad Un trasduttore per pressione HP. Dalla carotide sinistra isolata veni va registrato il flusso mediante flussimetr? elettroma gnatico Biotronest. Altri parametri rilevati; dp/dtj ECO, ????.

Tutti i valori venivano registrati 3u poligra fo ad ?tto canali Hewlett-Packard.. Particolare attenzio ne ? stata posta alla pression? arteriosa carotidea. 11 peptide, sintetico oppure estrattivo, sciolto in solu sione fisiologica ed iniettato nella vena femorale, . provoca duraturo effetto ipotensivo dose-di pendente, evidente gi?.alla dose di 0,1 mg/kg.

2) Potenziamento della bradikinina.

Patti Vistar maschi, trattati come sopra, so no stati sottoposti a saggio con bradikinina. Questo pept?de fisiologico, iniettato nelle vena femorale pr? voca rapida e fugace ipotensione, in quanto viene de gradato rapidamente a livello del circolo polmonare dallo ACE (angiotensin-converting-enzyme).

Il peptide in oggetto, iniettato nella vena fe morale subito prima della bradikinina , ne potenzia e prolunga l 'effetto sulla pressione. Tale fenomeno ? evidente a partire dalla dose di 0,5 mg/kg.

li' effetto di potenziamento sulla bradikinina au

? stato constatato anche /ileo isolato di cavia, irnmer so in bagno per organi isolati contenente soluzione di thyrode a 30?C. Le contrazioni provocate dall 'aggiun ta al bagno di bradikinina risultano potenziate dal _Cs

peptide , gi? alla dose di 5 x 10 ' M.

5. Inibizione dell ' effetto de?l'angiotensina I, L'angiotensina I ? stata iniettata nella vena femorale destra di ratti Wistar maschi trattati come sopra. E* stato quindi iniettato il peptide in oggetto e dopo 90 secondi, ? stata di nu?vo iniettata ?a stessa dose di angiotensina I. Gi? alla dose di mgAg? il peptide ? in grado di attenuare sostanzialmente l?effet^ to pressorio provocato dalla seconda iniezione di an giotensina I.

L'effetto dell <s >angiotensina I resta inibito per oltre 2 ore.

4) DL50.

La tossicit? del peptide ? stata saggiata su topi swiss albino, somministrando per via ?ntraper?tonssi le la sostanza sciolta in soluzione fisiologica. La BL^Q appare essere di 5^-0 mg/kg.

Claims (1)

1. Pertanto il peptide secondo l'invenzione, in particolare quello ottenuto per via sintetica, si di mostra utile per il trattamento clinico di stati di ipertensione.

   Por-mano pertanto oggetto dell'invenzione an che composizioni farmaceutiche contenenti il peptide secondo 1*invenzione-Il peptide secondo l'invenzione pu? venire impiegato nell'uso clinico per somministrazione orale protetta sotto jforma di pastiglie, pillole, granulati, capsule, <? >e simili, per somministrazione retti* le, sotto forma di supposte e per somministrazione ??^ reiterale sotto forma di soluti iniettabili insieme a veicoli farmaceutici compatibili.

   Il dosaggio giornaliero di principio attivo, somministrabile nell'uso <1 >:clinico nei modi sopra ci-tati, ? preferibilmente t

   1) 2D0 fino a 1000 mg/die per via orale, 2) 50 fino a 500 mg/die per via intramuscolare 3) 20 fino a 250 mg/die per via endovenosa 4) 500 fino a 2000 mg/die per via rettale? Quantit? preferite di principio attivo per dose orale singola sono 200 mg e 50? mg^insieme ad usuali eccipienti farmaceutici*