IT8268049A1

IT8268049A1 - Procedimento per la produzione di portatori colloidali di radionuclidi dal siero-albumina umana e loro impiego

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Publication number: IT8268049A1
Application number: ITTO1982A068049A
Authority: IT
Original assignee: Solco Basel Ag
Priority date: 1981-08-28
Filing date: 1982-08-27
Publication date: 1984-02-27
Also published as: FI77374C; FI822941A0; FR2512031B1; FR2512031A1; NL8203360A; GB2108967A; JPS5846028A; CA1187789A; FI77374B; BE894233A; IT8268049A0; US4410507A; IT1156495B; JPH0375534B2; CH652599A5; GB2108967B; FI822941L

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: Procedimento per la produzione di portatori

di radionuclidi da siero-albumina umana e loro impiego"

Riassunto

Viene preparata una soluzione colloidale di siero-albumina umana, mediante miscelazione di una soluzione acquosa della stessa con un tensioattivo non ionogeno ed una soluzione acida di un sale di stagno (II), regolazione del pH a da 3,5 a 8,0 e riscaldamento ad una temperatura costante tra 45 e 100?C fino a completa idrolisi del sale di stagno (II) e denaturazione dell'albumina; la soluzione colloidale pu? anche essere liofilizzata. Mediante trattamento della soluzione, o del liofilizzato, con una soluzione di Tc-99mpertecnetato , si ottiene un preparato colloidale per la scintigrafia del sistema reticoloendoteliale o del sistema linfatico. Mediante il procedimento si possono ottenere a scelta, mediante sola regolazione del pH, colloidi di grossezza delle particelle, ad esempio, di 3,0-0,2 o 0,2-0,03, o inferiore a 0,03^um.

Particelle colloidali marcate radioattivamente sono gi? state impiegate nella medicina nucleare per esami scintigrafici, in particolare per la scintigrafia di perfusione dei polmoni, come pure per esami del sistema reticoloendoteliale. Come radionucli.de viene perlopi? impiegato tecnezio-99m, a causa delle sue propriet? radiologiche e fisiche particolarmente adatte (T , -decadimento = 6,05 ore, ener-1/2

gi? dei raggi gamma 140 keV).

Come portatore . o matrice ^ del radionuclide sono stati propostii o impiegati vari materiali in particelle, tra l'altro proteine, quali siero-albumina umana ed emoglobina Z.G.V. Taplin et al., J. Nucl. Med. 5 (1964), 2597. L'impiego di siero-albumina umana (HSA) come materiale colloidale ? vantaggioso sotto molti aspetti, perch? colloidi o particelle, di HSA sono ben compatibili per l'uomo, e la loro meta^olizzabilit? venne nettamente dimostrata sia mediante ricerche istologiche su tessuto polmonare sia anche mediante misure di radioattivit?.

Per ottenere prodotti di grossezza delle particelle riproducibile sono stati proposti diversi procedimenti di preparazione, ad esempio la coagulazione di HSA in presenza di sale di stagno (II) in soluzione di cloruro sodico fisiologica (CB-P5 1 389 809), la denaturazione di proteina umana mediante trattamento termico al punto isoelettrico di HSA (pH = 4,9) e successiva precipitazione mediante acido cloridrico dilui-' to (GB-PS 1 409 176), l'impiego di HSA dopo pre-purif icazione mediante dialisi (DE-AS 2 536 008), l'impiego specifico di tartrato di stagno (II) come agente riducente (DE-OS 2 654 298), la miscelazione di ioni metallici in soluzione di gelatina-HSA (US-PS Re 29 066), o l'impiego di soluzioni tampone (US-PS 4 024 233). Con tutti questi procedimenti vennero per? ^ottenute principalmente particelle di HSA grandi, con una distribuzione della grossezza delle particelle da 10 a lOO^um; esse vengono impiegate per la scintigrafia polmonare di perfusione.

Nella preparazione di particelle colloidali di HSA pi? piccole, invece, compaiono complicazioni a causa della formazione di aggregati difficile da controllare. A causa della loro importanza come mezzo radiodiagnostico per gli esami del sistema reticoloendoteliale e del sistema linfatico, si mira (pertanto( alla preparazione di particelle di HSA pi? piccole, con grossezze delle particelle definite.

Fra l'altro, venne riferito sull'impiego di siero-albumina umana sgrassata come materiale di partenza (DE-OS 2814 038). Da questa vennero ottenuti colloidi di HSA di due tipi: quelli della grossezza delle particelle di 15-50^um, come macroaggregati, si prestano per la scintigrafia polmonare, mentre microaggregati hanno presumibilmente la grossezza delle particelle di 0,l-5^um, e pertanto dovrebbero essere di utilit? limitata per la visualizzazione del sistema reticoloendoteliale. Mediante frantumazione di macroaggregati di HSA-Sn denaturati (10-100 um) mediante ultrasuoni, ? nota la preparazione di colloidi di HSA di grandezza delle particelle di 0,l-3,0^um, per la visualizzazione scintigrafica di sistemi reticoloendoteliali (US-PS 4 187 285). Tutti questi procedimenti richiedono (evidentemente (ulteriori dispendiosi procedimenti di separazione.

Nell1US-PS 4 226 846 vennero proposti microaggregati di HSA aventi grossezza delle particelle prevalentemente nell'intervallo di 0,2-5^um, per la visualizzazione radioattiva del sistema reticoloendoteliale . In esso, si effettua la microaggregazione di una miscela di siero-albumina umana e di sale di stagno (II) mediante denaturazione termica in presenza di un legante stabilizzante gli ioni stagno. Il legante aggiunto prima del trattamento termico!deve proteggere il sale di stagno (II) dall'idrolisi e dalla formazione di idrossidi insolubili fino ad avvenuta microaggregazione, e con ci? contribuire sostanzialmente ad una buona visualizzazione scintigrafica del sistema RE. Come leganti sono preferiti difosfonati, in particolare metilendifosfonato ed idrossietandifosfonato ; si prestano anche fosfati, quali pirofosfati, amminoacidi, acidi poiiidrossicarbossi1ici ed acidi policarbossilici.

Secondo questo procedimento, vennero ottenuti microaggregati di HSA con distribuzione di grossezza delle particelle relativamente larga: circa 40 a 70% nel campo di 0,2-3^um, e circa 10 a 30% nel campo al disotto di 0,2^um. La larga distribuzione delle grossezze delle particelle pregiudica l'assunzione organo-specifica desiderata del colloide. Invero, si pu? parzialmente rimediare all'inconveniente della piatta curva di distribuzione mediante filtrazione delle particelle pi? grosse (diametro superiore a 3^um); le particelle al disotto del diametro desiderato (tuttavia (non possono essere eliminate.

In conseguenza della distribuzione di grossezza delle particelle larga e variante da uno all'altro legante, i preparati colloidali ottenuti secondo il procedimento citato non si prestano per l'esame dello stato dinamico o dei processi dinamici del sistema reticoloendoteliale. Essi si prestano solo per la visualizzazione scintigrafica di malformazioni morfologiche del sistema RE, soprattutto del fegato e della milza (visualizzazione contemporanea di fegato-milza), ma sono impiegabili solo limitatamente per la visualizzazione scintigrafica del midollo osseo. Una migliore visualizzazione del midollo osseo viene ottenuta |come noto^ con preparati colloidali di grossezza delle particelle minore (prevalentemente al disotto di 0,2^,um).

Infine, essi non sono impiegabili per la visualizzazione scintigrafica del sistema linfatico, per cui sono notoriamente necessari preparati colloidali di grossezza delle particelle inferiore. All'uopo viene attualmente ,perlopi? Jimpiegato 99m ,?

1 colloide di Tc-antimonio-zolro che ha una grossezza delle particelle di 0 ,002-0,015^um, ma che biologicamente ? difficilmente metabolizzabile /G.N.Ege et al-, Brit.J. Radiol. 52 (1979), 1247-Per i motivi citati manca ora, come sempre, evidentemente, un preparato colloidale radioattivo che

1 - ? adatto non solo per la visualizzazione morfologica) ma soprattutto anche per esami scintigrafici funzionali, del sistema RE;

2 - permette una buona visualizzazione del midollo osseo, 3 - per la visualizzazione scintigrafica del sistema linfatico possiede propriet? migliori dei colloidi, attualmente 99m 99m disponibili, di Tc-solfuro di antimonio o Tc-zolfo. Per un esame funzionale quantitativo del sistema RE ? richiesto un prodotto colloidale con le seguenti propriet? (I. Zolle et al., Radioaktive Isotopen in Klinik und Forschung, Gasteiner Symposium 1972, Voi.10, pag.446):

1. particelle pi? piccole, omogenee, con distribuzione delle grossezze delle particelle esattamente definita, il pi? possibile stretta,

2. buona riproducibilit? dall'una all'altra preparazione,

3. buona stabilit? di marcatura e

4. buona compatibilit? e metabolizzabilit? nell'uomo.

Per la visualizzazione scintigrafica delle cellule RE del midollo osseo ? desiderato un prodotto colloidale che, oltre alle propriet? sopra citate, presenta inoltre una grossezza delle particelle nel campo inferiore a 0,2/Um. Come ? noto, esiste una relazione tra grossezza delle particelle e grado di arricchimento dei colloidi nel midollo osseo. Il migliore arricchimento nel midollo osseo viene meglio ottenuto con particelle pi? piccole /H.L. Atkins et al., J.of Reticuloendothelial Soc. 8 (1970), 176/ e la cui grossezza delle particelle ? assunta generalmente come ideale nel campo di 0,03-0,2/Um.

Per la visualizzazione scintigrafica del sistema linfatico, un preparato colloidale ideale deve distinguersi, oltre che per le propriet? sopra menzionate da 1 a 4, anche come segue:

5. come grossezza delle particelle ottimale viene assunto il campo di 0,002-0,03^um;

6. stabilit? del preparato - non deve avvenire un processo di agglomeraz ione;

7. il preparato deve avere un'attivit? residua la pi? piccola possibile nel punto di iniezione ^opo applicazione sottocutanea .

Si ? ora trovato un procedimento per la preparazione di preparati contenenti siero-albumina umana colloidale, marcabili con tecnezio-99m, che possiedono le propriet? sopra menzionate e che, pertanto, dopo marcatura con tecnezio-99m si prestano in modo eccellente per esami scintigrafie! morfologici come pure funzionali, in particolare del sistema RE (del fegato, della milza e del midollo osseo) e per la visualizzazione del sistema linfatico.

Il procedimento secondo l'invenzione si basa sulla scoperta che la grossezza delle particelle, come pure la distribuzione di grossezza delle particelle, del prodotto colloidale che si forma, a concentrazioni mantenute costanti dei componenti, dipende unicamente dal valore di pH della miscela prima della microaggregazione. I componenti sono siero-albumina umana, ioni stagno (II) (ed agenti tensioattivi non ionogeni ^in una soluzione tampone. Il campo di grossezza delle particelle del prodotto colloidale che si forma pu? essere controllato esattamente mediante sola regolazione del pH prima della microaggregazione. Sorprendentemente, la distribuzione di grossezza delle particelle del prodotto colloidale Iche con ci? si forma Irisulta strettamente definita e riproducibile. Per?, deve essere omesso il legante, che secondo l'US-PS 4 226 846 deve essere aggiunto prima della microaggregazione. Mentre ^ secondo questo metodo anteriore, il valore di pH deve essere regolato in ogni caso a seconda del legante particolare impiegato, i risultati sopra menzionati vengono ottenuti mediante la sola regolazione del valore di pH.

Il procedimento secondo l'invenzione consiste nel mescolare una soluzione acquosa di siero-albumina umana con un agente tensioattivo non ionogeno e con una soluzione acida acquosa di un sale di stagno (II), regolare il valore di pH della miscela di reazione(mediante aggiunta di una soluzione tampone, ad un valore di pH costante, pre-scelto, di 3,5 a 8,0, e riscaldare la miscela a temperatura costante, nell'intervallo da 45 a 100?C, mediante l'azione di microonde o sotto agitazione, fino alla completa idrolisi del sale di stagno (II) e contemporanea denaturazione della siero-albumina umana.

Il riscaldamento mediante forni a microonde presenta il vantaggio che la completa idrolisi avviene omogeneamente, con contemporanea denaturazione dell'albumina, a causa della regolare alimentazione di calore.

Il procedimento secondo l'invenzione permette di preparare preparati di HSA colloidali di grossezza delle particelle inferiore e di

- programmare il campo di grossezza delle particelle a seconda dello scopo di impiego,

- ottenere particelle di grossezza particolarmente omogenea, o di campo di grossezza stretto e definito, e

- ottenere dall'una all'altra preparazione colloidi di forma e di composizione praticamente uguali.

In particolare, si possono preparare colloidi di HSA con una grossezza delle particelle nel campo al disotto di 3,0/Um, ad esempio di 0,2-3,0^um, di 0,03-0,2^um e al disotto di 0,03^um. Questi preparati si prestano (rispettivamente per la visualizzazione scintigrafica di fegato-milza e per esami scintigrafici di funzionalit? del sistema RE,

per esami scintigrafici del midollo osseo, e per quelli

del sistema linfatico.

In appresso l'invenzione ? esaurientemente descritta.

Come siero-albumina umana si pu? impiegare qualsiasi prodotto commerciale, senza particolare purificazione o

pre-trattainento, e specialmente senza preliminare sgrassatura

o purificazione mediante dialisi, ultrafiltrazione o cromatografia su colonna. Si prepara da esso una soluzione acquosa

la cui concentrazione ammonta convenientemente a da 0,05

a 20 mg/ml, di preferenza da 0,2 a 2,5 mg/ml.

Per la liofilizzazione del materiale colloidale(seguente,

se desiderato, la preparazione, si ? dimostrato vantaggioso aggiungere alla soluzione ottenuta una carica farmacologicamente inerte, come pure una sostanza agente da stabilizzante.

A causa di queste aggiunte, la liofilizzazione porta ad

un liofilizzato qualitativamente migliore.

_ 99m

Con ci?, nella marcatura con Tc-pertecnetato sodico,

il prodotto si lascia sciogliere pi? facilmente in soluzione di cloruro sodico fisiologica, e si conserva come colloide stabile

a valore di pH fisiologico. Per queste aggiunte si presta

in particolarekuna soluzione acquosa di 0,05-40 mg di destrosio e 0,01 a 5 mg di sale sodico di inositolesafosfato (fitato sodico) per mi, di preferenza di 10 a 20 mg di destrosio

e 0,1 a 0,5 mg di fitato sodico per mi.

Evidentemente, oltre alle sostanze sopra citate, si possono impiegare altre sostanze agenti da carica o da stabilizzante, ad esempio derivati di idrati di carbonio (mannite, fruttosio, lattosio, inositolo, sorbite), glieina, sale da cucina, siero-albumina umana, fosfati?, solfati, carbonati inorganici, acidi monocarbossilici, fosfonati ecc. Trattazioni det tagliate di ci? sono ricavabili dalle seguenti monografie: H.Sucker, P.Fuchs, P.Speiser, Ed.: Pharmazeutische Technologie, pag. 321-332, 620-628, Georg Thieme Verlag, Stoccarda 1978; P.H. List, L. Horhammer, Ed.: Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, Voi.7, pag.297-302, 4.Ed., Springer-Verlag, Berlino 1971.

Eventualmente, il miglioramento della solubilit? del prodotto liofilizzato pu? essere ottenuto anche mantenendo il materiale, prima della liofilizzazione, a temperatura costante tra 35 e 75?C, per 1 a 3 ore. Con ci?, le particelle colloidali gi? formate, di efficacia ridotta, vengono parimenti stabilizzate, e la loro buona solubilit? o risospendibilit? ? conservata.

Come agente tensioattivo si impiegano sostanze idrosolubili, non ionogene, atossiche e ben compatibili per la somministrazione parenterale. Queste sostanze, a seconda dello scopo di impiego, vengono denominate, come noto, solubilizzanti, bagnanti , emulsionanti, tensioattivi, detergenti o solventi . Di conseguenza, si possono impiegare tra le altre le seguenti sostanze: Twe?n 80, Carbowax o polietilenglicoli tipo 600, 1500, 4000, poli-N-vinilpirrolidone tipo 20, 40, plasdone tipo C-15, derivati di poiisaccaridi,quale destrano, derivati di proteine, quali gelatine, copolimeri a blocchi di ossido di propilene-ossido di etilene (Pluriol-PE o Pluronics tipo F-38, F-88, F-98, F-108, Cremophore tipo EL, RH-40 e RH-60 ^come pure tergitoli). Esempi dettagliati di queste classi di sostanze sono ricavabili dalle seguenti monografie: H.P. Fiedler, H.v. Czetsch-Lindenwald: Lexikon der Hilfsstoffe fiir Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Ed. Cantor KG, Aulendorf i.Wiirttemberg 1971.

La concentrazione della soluzione acquosa di agente tensioattivo deve ammontare ,in generale ,a da 1 a 20 volte la concentrazione di HSA: di preferenza si impiegano da 0,2 a 40 mg/ml di Pluronic F-88.

L'impiego di soluzioni tampone per lo stretto mantenimento del valore di pH della miscela previsto, prima della microaggregazione, si dimostra vantaggioso. Tra l'altro sono impiegabili come tamponi: bicarbonato sodico/carbonato sodico, borace/soda caustica, diidrogenofosfato (ad esempio NaH^PO^)/monoidrogenofosfato (ad esempio Na^HPO^)/fosfato (ad esempio Na PO ), diftalato potassico/soda caustica,

3 4

acetato sodico, tris(idrossimeti1}-amminometano (tampone tris), acido 2-Z4-( 2-idrossieti1)piperazin-l-iL7-etansolfonico/soda caustica (tampone HEPES) ecc. Sistemi tampone in questione sono stati riassunti nelle seguenti monografie: H.M. Rauen, Ed.: Biochemisches Taschenbuch, 2.Ed., Voi.2, pag.90-104, Springer Verlag, Berlino 1964; N.E. Good, G.D. Winget, W. Winter, T.N. Conolly, S. I2awa e R.M.M. Singh, Biochemistry 5, 467 (1966); H. Eagle, Science 174, 500 (1971).

Per semplicit?, la soluzione acquosa, che consiste di siero-albumina umana, di un agente tensioattivo non ionogeno , e di un sale di stagno (II) in acido cloridrico, pu? essere dapprima mescolata con la soluzione tampone e successivamente essere portata esattamente al valore di pH previsto con soda caustica o con acido cloridrico.

Il sale di stagno (II) pu? essere (ad esempio,SnC1^.2H^0, un altro alogenuro di stagno (11)^0 tartrato di stagno (II).

Il valore di pH della miscela, prima della microaggregazione, viene regolato, a seconda della grossezza delle particelle desiderata, tra 3,0 e 8,0. Se la soluzione tampone non viene subito mescolata con la soluzione acquosa di sieroalbumina umana, di agente tensioattivo non ionogeno e di ioni di stagno (II) in acido cloridrico, allora la regolazione di pH prevista pu? essere effettuata mediante una soluzione acquosa di reagente tampone e reagente alcalino, ad esempio soda caustica, potassa caustica, ammoniaca acquosa (o una base organica. Si forma qui ^in ogni caso^una miscela tampone ,che mantiene il valore di pH costante desiderato prima della microaggregazione. Della soluzione tampone se ne prepara, o aggiunge, vantaggiosamente, tanta che la sua concentrazione nella soluzione ammonti a da 0,05 a 50 mg/ml.

Per la preparazione di preparati colloidali aventi grossezza delle particelle di 0,2-3,0^um, si preferisce la regolazione di pH nel campo di 5,8-6,8, e per la grossezza delle particelle di 0,03-0,2^um, invece, quella negli intervalli di pH di 3,0-5,0 o 6,8-8,0. Questi valori di pH valgono soprattutto se la concentrazione di siero-albumina umana ammonta a 1,0-3,0 mg/ml, quella di agente tensioattivo ammonta a 1,0-40 mg/ml r e quella di sale di stagno (II) ammonta a 0,1-0,8 mg di SnCl^.2H^0/ml . Nel campo di pH di 6,0-6,8, ? preparatile un preparato colloidale avente grossezza delle particelle di 0,03-0,2^um, rispettivamente nel campo di 6,8-7,5 ? preparatile un preparato colloidale avente grossezza delle particelle inferiore a 0,03^um, se la concentrazione di siero-albumina umana ammonta a 0,2-1, 2 mg/ml, quella di sale di stagno (II) ammonta a 0,05-0,4 mg di SnC1^.2H^0/ml, e quella di agente tensioattivo ammonta a 1,0-40 mg/ml.

L'idrolisi degli ioni ZniII^che si trovano nella miscela di reazione inizia gi? durante la regolazione del valore di pH previsto mediante la soluzione tampone, l'idrolisi completa avvenendo contemporaneamente al processo di microaggregazione completa mediante riscaldamento della soluzione.

Come noto, l'idrolisi degli ioni Sn(Il) avviene a stadi.

Molto probabilmente, il trattamento termico della soluzione provoca non solo la completa microaggregazione della siero-albumina ma anche la deidratazione di ?drossidi di stagno a prodotti poco solubili, che uniti a siero-albumina coagulata sono presenti come particelle colloidali.

Il trattamento termico avviene ,vantaggiosamente (mediante un forno a microonde^oppure mediante riscaldamento a temperatura costante sotto agitazione. E1 importante, che il valore di pii scelto sia strettamente mantenuto, per rapporti di concentrazione dei componenti di reazione mantenuti costanti. In generale, la soluzione viene mantenuta ad una temperatura determinata di 45-100?C. La durata del processo di microaggregazione dipende (come noto ,dalla temperatura scelta ^come pure dal volume; essa pu? variare tra 2 minuti e 2 ore, in generale si mantiene in un intervallo di 5-45 minuti. Una durata di microaggregazione pi? breve viene ottenuta mediante trattamento termico per mezzo di forni a microonde a 100-250?C (da 50 secondi a 30 minuti). E1 risultatofinoltre, che la microaggregazione dei prodotti da preparare pu? essere attuata anche mediante circolazione della soluzione in un tubo a serpentino, continuo, come recipiente di reazione, nel bagno di riscaldamento. Il mantenimento del flusso viene assicurato mediante una pompa di alimentazione collegata al circuito di reazione, la temperatura del bagno di riscaldamento essendo mantenuta vantaggiosamente tra 70 e 90?C.

Successivamente, il materiale colloidale formato pu? essere impiegato direttamente per la marcatura con Tc , oppure essere liofilizzato ed essere conservato in questa 99m

forma fino al momento della marcatura con Tc-pertecnetato sodico.

Per facilitare la ridissoluzione del prodotto liofilizzato prima della marcatura, si dimostra vantaggiosa l'aggiunta al materiale, prima della liofilizzazione, di sostanze agenti da carica e da stabilizzante. All'uopo viene preferita una miscela di destrosio e di fitato sodico (sale sodico di inositolesafosfato)t poich? sono note le eccellenti propriet? del destrosio farmacologicamente accettabile ed anche i vantaggi dell'elevata carica specifica del fitato sodico (6 cariche negative per molecola). Con ci?, le particelle colloidali gi? formate, di effetto ridotto, vengono meglio stabilizzate, ed ? conservata la loro buona solubilit? o risospendibil ita.

Una forma di attuazione particolarmente preferita del procedimento consiste nell'impiegare (come agente tensioattivo non ionogeno ( Pluronic F-88 o Cremophor-EL, come tampone fosfato bisodico o tris(idrossimetil)-amminometano (tampone tris) ( o acido (4-(2-idrossieti1)-piperazin-l-il^-etansolfonico/soda caustica (tampone HEPES), e come carica (o stabilizzante ,destrosio e fitato sodico, la microaggregazione essendo effettuata mediante forni a microonde.

Dal materiale preparato secondo l'invenzione (come soluzione colloidale,o in forma liofilizzata) si pu? facilmente preparare una corrispondente soluzione radioattiva colloidale per esami scintigrafici, mescolando il materiale con una 99m

soluzione di Tc-pertecnetato, di preferenza una soluzione 99m

di Na TcO .

4

Che nel caso del presente prodotto colloidale, non si tratti solo di una miscela di siero-albumina umana che si trova separata, di sale di stagno (II) e di altri componenti, che sono marcabili come tali, separatamente, con tecnezio-99m, risulta chiaramente dai presenti dati di analisi (tabelle 1 e 2).

Una miscela preparata senza microaggregazione (prodotto No. 4) si comporta, sia nella distribuzione di grossezza delle particelle sia anche nella distribuzione biologica 99m

dopo la marcatura con Tc, diversamente dai preparati secondo l'invenzione (prodotti No. 1, No. 2 e No. 3). La miscela (prodotto No. 4) si comporta come un.set reagente di HSA idrosolubile per la visualizzazione del volume del sangue (prodotto No. 5, preparato commerciale). Secondo il procedimento secondo l'invenzione, invece, si ottiene effettivamente un preparato colloidale (prodotti da No. 1 a 3). La differenza tra i preparati secondo l'invenzione No. 1, No. 2 e No. 3 consiste nel fatto che il prodotto No. 1 venne preparato programmatamente con una grossezza delle particelle di 0,2-3,0^urTlj u prodotto No. 2 con una grossezza delle particelle di 0,03-0,2^um ,ed il prodotto No. 3 con la grossezza delle particelle inferiore a 0,03^um. La determinazione della distribuzione di grossezza delle particelle avviene mediante microfiltrazione attraverso filtri Nucleopore, le cui minime grossezze dei pori reperibili sono di fino a 0,03^um. Il fatto che il prodotto No. 3 secondo l'invenzione (grossezza delle particelle inferiore a 0,03/Um) sia veramente in forma colloidale ? evidente dalla sua distribuzione biologica (tabella 2). Dopo iniezione endovenosa, un colloide viene immagazzinato nel sistema RE mediante fagocitosi. Per chiarezza, sono riportati 1 dati dei set di reagenti commerciali (colloidi di HSA o Sb-S} come pure, per confronto, quelli della soluzione , 99m

di Tc-pertecnetato.

Per la determinazione della grossezza delle particelle,

99m

il prodotto marcato con Tc viene alimentato attraverso microfiltri di grossezza dei pori definita (filtri Nucleopore). L'attivit? della soluzione ^prima e dopo la filtrazione j viene misurata nel contatore di radiazioni gamma, e la distribuzione di grossezza delle particelle viene determinata sulla base della distribuzione di attivit? misurata.

99m Per la biodistribuzione, il prodotto marcato con

viene somministrato per via endovenosa nella vena caudale. 30 minuti dopo somministrazione, gli animali vengono uccisi sotto narcosi da etere, dissezionati e l'attivit? nei singoli organi viene misurata nei contatori di radiazioni gamma.

Nella tabella 3 sono riportati i bio-dati su ratti, 2 ore dopo iniezione sottocutanea nel tallone destro della zampa posteriore. I prodotti secondo l'invenzione da No.

8 a 11 si prestano evidentemente^tra 1'altro(per la visualizzazione del sistema linfatico.

La resa di marcatura dei prodotti, secondo esame radiocromatografico, ? sempre superiore a 95%. Per la determinazio-99m ne della resa di marcatura, i preparati marcati con Tc vengono radiocromatografati, ed il radiocromatogramma viene analizzato con uno scansore a strato sottile. L'assenza 99m

di Tc-pertecnetato non legato ? determinabile tra l'altro con i sistemi tampone riportati nella tabella 4.

Per la preparazione di prodotti colloidali per la somministrazione parenterale, ? necessario che i reagenti, soluzioni, come pure oggetti d'uso tda impiegare siano sterili ed esenti da sostanze pirogene, e che tutte le preparazioni e accorgimenti di procedimento siano effettuati in atmosfera di azoto e in condizioni asettiche. La prova di asetticit? viene effettuata secondo la farmacopea US XIX, quella per l'assenza di sostanze pirogene secondo la farmacopea europea.

Esempio 1

Soluzione tampone: 1,0 mg di NaHCO^ 0,5 mg di NaOH/ml d'acqua.

In un recipiente di reazione ca 100 mi,chiuso ,si predispongono 250 mg di siero-albumina umana (corrisponde a Lp25 mi di soluzione di HSA ai 20%) e 250 mg di destrosio in 70-75 mi d'acqua. Dopo aggiunta di 2,5 mi di soluzione di SnCl^ al 0,8% in HC1 0,1 N, la miscela viene portata^ on la soluzione tampone^a pH 6,37 (consumo 14,0 mi). La miscela( debolmente opalescente viene diluita con acqua ad un volume di 90 mi e riscaldata per 3 minuti a 80?C. La sospensione lattea viene raffreddata a temperatura ambiente (e nuovamente riscaldata a 60?C durante 60 minuti. Prima della liofilizzazione, si aggiungono 10 mi di soluzione di HSA solubile e Na^HPO^ (corrispondenti a 100 ng di ISA o Na^HPO^ per 1 mi), e la soluzione ottenuta viene liofilizzata in ampolle del contenuto di 1 mi.

1 ampolla contiene: 2,5 mg di HSA in forma colloidale

0,2 mg di SnCl^.2H^0

2,5 mg di destrosio

10,0 tng di HSA solubile come carica

10,0 mg di Na ??0 come stabilizzante NaHC0^/Na0H come tampone prima della microaggregazione .

99m

I bio-dati dei prodotto marcato con Tc sono riportati nella tabella 5.

Esempio 2

Soluzione tampone: 1,0 mg di NaHCO^ ?0,5 mg di NaOH/ml d'acqua Si procede come nell'esempio 1; regolazione di pH a 6,98.

1 ampolla contiene: 0,5 mg di HSA in forma colloidale

0,2 mg di SnCl .2H 0

2 2

2,0 mg di Cremophor RH-40

10,0 mg di HSA solubile come carica

10,0 mg di Na ??0 come stabilizzante

& 2 4

NaHC0^/Na0H come tampone prima della

microaggregazione.

Bio-dati, vedi tabella 5.

Esempio 3

Soluzione tampone: 1,0 mg di tetraborato bisodico

0,5 mg di NaOH/ml d'acqua.

250 mg ciascuno di siero-albumina umana e di polivinilpir-

rolidone {KW 29-32) vengono predisposti in 50 mi d'acqua.

Si aggiungono 2,5 mi di soluzione al 0,8% di SnC1^.2H^0

in acido cloridrico 0,1 N. Il valore di pH della soluzione

debolmente opalescente viene regolatoicon la soluzione tampone

a 6,5 (consumo 15 mi). Dopo aggiunta d'acqua fino ad un

volume di 95 mi, la soluzione viene riscaldata per 3 minuti

a 80?C. L'ulteriore trattamento avviene come nell'esempio 1.

1 ampolla contiene: 2,5 mg di HSA in forma colloidale

0,2 mg di SnCl .2H 0

2 2

2,0 mg di polivinilpirrolidone

10,0 mg di HSA solubile come carica

10,0 ma di Na HPO come stabilizzante

2 4

Borace/NaOH come tampone prima della microaggregazione.

Bio-dati, vedi tabella 5.

Esempio 4

Soluzione tampone: 11,92 mg di acido 2-[A-{2-idrossietil )-piperazin-l-il_7-etansolfonico (HEPES) 2,0 mg di idrossido di sodio/ml di H^O.

In un recipiente da 100 mi chiuso ,si sciolgono 250 mg ciascuno di HSA e Cremophor EL in 50-60 mi d'acqua. Si aggiungono 2,5 mi di soluzione al 0,8% d? SnC1^.2H^0 in HC1 0,1 N. Mediante aggiunta della soluzione tampone il valore di pH viene regolato a 6,4. La soluzione debolmente opalescente viene riscaldata per 60 secondi in un forno a microonde {potenza di uscita 1500 Watt). Alla soluzione lattea si aggiungono 1,5 g di destrosio e 250 mg di fitato sodico anidro. La soluzione colloidale viene liofilizzata in ampolle del contenuto di 1 mi.

Bio-dati, vedi tabella 5.

Esempio 5

Soluzione tampone: Na HP0^/Na0H

In un recipiente di reazione da 100 mi, chiuso, si sciolgono l'uno dopo l'altro: 250 mg ciascuno di HSA e di Pluronic F-38, 2,5 mi di SnCl .2H 0 al 1,6% in HC1 0,1 N, e 50 mg di Na2HPO4 1in 50-60 irti d'acqua. Mediante aggiunta di NaOH 0,025 N, il pH viene regolato a 6,4. La miscela debolmente opalescente viene ulteriormente elaborata come nell'esempio 4, e liofilizzata.

Bio-dati, vedi tabella 5.

Esempio 6

Soluzione tampone: 1,0 mg d.i tetraborato bisodico 0,5 mg di NaOH/ml d'acqua.

In un recipiente di reazione da 100 mi, chiuso, si mescolano 50 mg di HSA, 200 mg di Pluronic F-68 e 20,0 mg di SnCl^ .2H^0 in HC1 0,1 N, in 50-60 mi d'acqua. Il pH della miscela viene regolato(con la soluzione tamponer? 6,9, successivamente si diluisce con acqua a 100 mi. La miscela debolmente opalescente viene riscaldata come nell'esempio 4 mediante un forno a microonde. La soluzione colloidale viene marca-99m

ta con Tc-pertecnetato .

Bio-dati, vedi tabella 5.

Esempio 7

Soluzione tampone: 5,0 mg di Na^HPO^ e 1,0 mg di NaOH/ml

d 'acqua.

Si procede come nell'esempio 6; regolazione del pH a 6,8.

1 ampolla contiene: 0,5 mg di [ISA in forma colloidale

0,2 mg di SnCl .2H 0

2 2

2,0 mg di Cremophor EL

15,0 mg di destrosio

0,25 mg di fitato sodico anidro Na^HPO^/NaOH come tampone prima della microaggregazione .

Bio-dati, vedi tabella 5.

Tabella 1

Microfiltrazione dei prodotti marcati con Tc attraverso filtri Nucleopore

% distribuzione della grossezza delle particelle

Prodotto N. 1 per confronto Colloide secon Colloide secon Colloide secon Miscela secon Colloide di Colloide di

do il procedi do il procedi do il procedi do il procedi reagente di HSA commer Sb-S commer

generatore mento mento mento mento, ma pri_ HSA solubile ciale ciale

ma della mi- commerciale

croaggregazio

ne

>5 ,um :

5 a 3 ,um:

21,0%

100% 100%

Tahella 2 Bio-distribuzione dei preparati marcati con_ Tc (30 minuti dopo somministrazione i.v.)

% dose applicata, valore medio di 3 animali

Prodotto Nr. 1 2 3 4 5 6 7 per confronto 99m Preparazione Colloide se Colloide se Colloide se Miscela se Set Colloide di Colloide di TcO di 4 condo il pro condo il procondo il procondo il reagen BSA commerSb-S

generatore cedimento cedimento cedimento procedimento te di HSA ciale commerciale

ma prima del solubile

la microag commerciagregazione le

Grossezza del 0,2-3,0^um 0,03-0,02/Um inferiore a inferiore a inferiore a larga di- inferiore inferiore a le particelle 0,03/Um 0,2^um 0,2/Um stribuzio a 0,2^um (principalmen ne (v.tab. 0,2/Um

te nel campo) 1)

0,2-3,0 um

Bio-dati Ratti Ratti Topi Ratti Topi Topi Topi Topi

Sangue 0,37 0,59 2.63 14.86 28,5 1,06 13,3 8,0 Polmoni 0,19 0,18 0,27 0,78 2,1 6,15 1.9 1,2 Fegato 81,48 78,78 80,04 29.87 15,7 78,78 66,5 6,8 Milza 2,20 1,45 1,76 0,55 0,5 1,58 1,2 0,3 Reni 0,69 5,33 1.63 10,52 4,9 0,98 1,3 1,2 Stomaco

0,20 1,74 1,30 3,39 7,7 2,12 2,7 39,5

intestino

Ossa e rnidol

6,07 8,89 10,10 14,64 27,9 2,66 9,1 5,0

lo osseo

Muscolo 0,62 2,59 1,54 8,24 0,1 1,32 0,1 0,0 Urina 0,49 3,00 2,26 13,09 12,4 2,23 4.9 11,4 Tabella 3 Bio-distribuzione in ratti. 2 ore dopo somministrazione sottocutanea

% dose applicata, valore medio di 2 animali

Prodotto No. 8 10 11 12 per confronto

Provenienza secondo il secondo il 99m secondo il secondo il commerciale commerciale commerciale TcO del procedimento procedimento 4

procedimento procedimento

generatore

Osservazione HSA colloida USA colloida HSA colloida HSA colloida Set Sb-S colloi Zolfo col 99m

Tc-pertecne le, agente le, agente le, agente le, agente reagente. dale per il loidale per

tato libero riducente a riducente a riducente a riducente a di HSA sistema lin il sistema

base di Sn , base di Sn ? base di Sn , base di Sn, solubile-Sn fatico linfatico

Cremophor , Pluronic Cremophor , Pluronic, per volumi

tampone tampone bo tampone tampone del sangue

NaHCO^/NaOH race/NaOH Na ??0 /NaOI-I Na ??0 /NaOH

2 4 2 4

Luogo di

iniezione 47,7 56,46 56,58 51,20 63,91 52,66 71,95 3,40

( tallone

destro)

Ln .popliteus.

-a destra 12,0 13,39 14,46 17,15 1,57 7,88 6,12 0,03

-a sinistra 0,006 0,007 0,005 0,002 0,001 0,002 0,0 0,01

Ln-inguinalis

-a destra 0,02 0,02 0,006 0,003 0,026 0,005 0,0 0,01

-a sinistra 0,01 0,003 0,006 0,003 0,026 0,005 0,0 0,01

Ln-i 1iacus

ex?

-a destra 2,12 1,00 6,51 6,22 1,11 5,86 2,31 0,01

-a sinistra 0,10 0,002 0,003 0,02 0,04 0,002 0,0 0,00

Ln .renalis

a destra+

a sinistra 0,006 0,001 0,004 0,002 0,14 0,002 0,0 0,01 Sangue 7,41 1,09 2,82 1,20 5,98 '3,45 1,35 8,65 Fegato 2,74 0,35 2,28 1,22 1.78 2,93 2,26 3,48 Milza 0,08 0,01 0,09 0,04 0,23 0,38 0,03 0,10 Reni 4,20 1,88 3,42 1,71 3.79 0,99 0,92 1,52 Tabella 4

99m

Sistema di prova radiocromatografico per_ Tc-colloidi

Valori Rf Piastra pronta Merck SG Whatman ET 31 soluzione di sale da Acetone cucina al 0,9%

Pertecnetato

libero 1.0 1.0

Radionud ide

-legato 0,0 0,0 Tabella 5: Raggruppamento degli esempi delbrevetto - Bio-dati 30 minuti dopo somministrazione v. Valore - medio di 3 animali

Esempio No. 8

Colloide HSA HSA HSA HSA HSA HSA HSA HSA Agente ridu

cente SnCl .2H 0 SnCl .2H 0 SnCl .2H 0 SnCl .2H 0 SnCl .2H 0 SnCl .2H 0 SnCl .2H 0 SnCl .2H 0

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Agente bagnante Destrosio Cremophor Polivinil- Cremophor Pluronic Pluronic Cremophor Pluronic F-68 RH-40 pirrolidone EL F?88 F-68 EL

NaHCO NaoHP0 Na-tetrabo HEPES Acido citrico Tampone 3 2 4 Na2HPQ4 Na-tetrabo Na2HP04

NaOH NaOH rato+NaOH NaOH NaOH rato+NaOH NaOH NaOH

pii prima del 6,4 6,1 6,5 6,4 6,4 6,9 6,8 5,9 riscaldamento

Carica HSA solub. HSA solub. HSA solub. Destrosio Destrosio Destrosio HSA solub.

Stabiliz Na HPO Na HPO Na HPO Na-fitato Na-fitato Na-fitato Na-HPO

zante 2 4 2 4 2 4 ? 4

Dose appi. {topo) {topo) {topo) (topo) (topo) (topo) (topo) (topo) Sangue 2,78 3,10 3,41 1,61 1,18 1,10 1,82 4,36 Polmoni 0,36 0,54 0,32 0,37 0,94 0,17 0,73 0,52 Fegato 67,35 76,45 74,84 80,81 80,81 77,72 82,21 72,17 Milza 0,78 0,67 0,63 1,32 1,36 1,27 1,19 1,19 Reni 6,04 1,83 3,00 0,96 0,62 0,61 1,56 1,91 Stomaco

3.62 2,27 3,65 1,07 1,12 1,29 0,85 2,34 intestino

Ossa e midol

5,65 4,80 6,02 4,81 3,18 7,90 5.00 lo osseo

Muscoli 1.63 1,15 1,72 1,24 0,96 0,78 1,98 0,90 Urina 4,44 2,38 2,16 0,33 1,50 ? n 2.00

Esempio 8

Soluzione tampone: 5,0 mg di acido citrico monoidrato 1,0 mg di idrossido di sodio/ml d 'acqua

Si procede come nell'esempio 6; regolazione di pH a 5,9.

1 ampolla contiene: 0,5 mg di HSA in forma colloidale 0,2 mg di SnC1^.2H^0

2,0 mg di Pluronic F-68

10,0 mg di HSA come carica

10,0 mg di Na ??0 come stabilizzante

2 4

Acido citrico NaOH come tampone prima della microaggregazione.

Bio-dati: vedi tabella 5.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. - Procedimento per la preparazione di un materiale colloidale contenente siero-albumina umana, fisiologicamente degradabile, marcabile con tecnezio-99m, di grossezza delle particelle minore e di distribuzione di grossezza delle particelle pi? stretta e definita, caratterizzato dal fatto che si mescola una soluzione acquosa di siero-albumina umana con un agente tensioattivo non ionogeno ed una soluzione acida acquosa di un sale di stagno (II), si regola il valore di pH della miscela di reazione, mediante aggiunta di una soluzione tampone, ad un valore di pH prescelto, costante, di 3,5 a 8,0, e si riscalda la miscela a temperatura costante nel campo da 45 a 100?C ,mediante l'azione di microonde o sotto agitazione, fino alla completa idrolisi del sale di stagno (II) e contemporanea denaturazione della sieroalbumina umana.

2. - Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che come soluzione acida acquosa di un sale di stagno (II) si impiega una soluzione acquosa di cloruro di stagno (II) in acido cloridrico.

3. - Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che si liofilizza la soluzione colloidale ottenuta.

4. - Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che si aggiunge alla soluzione colloidale, prima della liofilizzazione, destrosio e sale sodico dell'acido inositolesafosforico (fitato sodico ).

5. - Materiale colloidale pronto per la marcatura con tecnezio-99m, preparato con il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2.

6. - Materiale liofilizzato pronto per la marcatura con tecnezio-99m , preparato con il procedimento secondo la rivendicazione 3 o 4.

7. - Impiego del materiale colloidale preparato con il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 per la produzione di un preparato radioattivo colloidale per esami scintigraf ici del sistema reticoloendoteliale o del sistema linfatico, caratterizzato dal fatto che 99m si tratta detto materiale con una soluzione di Tc-pertecnetato.

8. - Impiego secondo la rivendicazione 7 del materiale liofilizzato preparato con il procedimento secondo la rivendicazione 3 o 4, caratterizzato dal fatto che 99m si tratta detto materiale con una soluzione di Tc-pertecnetato.