IT8322785A1 - Metodo e composizione per il trattamento di tumori - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:

"METODO E COMPOSIZIONE PER IL TRATTAMENTO DI TUMORI"

R I A S S U N T O

Si descrive un metodo per il trattamento di tumori consistente nel somministrare composizioni farmaceutiche a base di L-carnitina eventualmente in associazione con cisteina e/o acidi grassi a lunga catena.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce a un metodo e a composizioni per il trattamento di crescite tumorali.

Pi? specificamente la presente invenzione si riferisce a un metodo e a composizioni che promuovono una riduzione nella dimensione di crescite tumorali conclamate.

Pi? di 50 anni fa Otto Warburg scopr? che cellule tumorali maligne fermentano il glucosio ad acido lattico molto

pi? rapidamente della maggior parte delle cellule normali, cio? esse dipendono dalla glicolisi per la loro fonte primaria di energia per la crescita (1' "effetto Warburg").

(0. Warburg, The Prime Cause and Prevention of Cancer, Triltsch, Wurzburg, Germania, 1967 pp. 6-16, Biochem. Z.

142 , 317 (1923)).

Recentemente, Racker e coll, hanno dimostrato una elevata attivit? ATPasica (ATP- *ADP Pi) nel tessuto tumorale ed hanno proposto che l'elevata attivit? ATPasica sia richiesta per l'alta attivit? glicolitica delle cellule tumorali poich? l'idrolisi di ATP a ADP Pi ? nota costituire lo stadio determinante della velocit? di reazione per l'utilizzazione del glucosio. (Racker, E. e Spector, M. Science 213, 303 (1981)). Pertanto, sebbene la scoperta di Racker e coll, supporti l'"effetto Warburg", non ? ancora stata spiegata la ragione dell'elevata velocit? di glicolisi aerobica nelle cellule tumurali.

Si ? ora trovato che la crescita dei tumori pu? essere e.f ficacemente combattuta somministrando ad un animale portatore di tumore quantit? relativamente grandi di L-carnitina.

Si ? inoltre trovato che la crescita di tumori maligni in vitro pu? anche essere inibita dalla presenza di L-carnitina.

Inoltre, si ? trovato che se la L-carnitina ? somministrata all'animale o impiegata in situazioni in vitro in combina zione con cisteina l'inibizione e l'effettiva inversione della crescita e formazione tumorale ? aumentata.

E' ben noto che la L-carnitina ? normalmente sintetizzata nel fegato e nel rene umano da lisina e metionina; che essa ? fornita al cuore, alla muscolatura scheletrica e ad altri tessuti attraverso la circolazione sanguigna; che la sua funzione principale ? di facilitare l'ossidazione mitocondriale degli acidi grassi (Fritz , I.B. Physiol. Revs. 41^, 52 (1961)). E' anche noto che la stimolazione dell'ossidazione degli acidi grassi da parte della carnitina ? effettuata tramite l?azione congiunta degli enzimi c?rnitina transferasi I, il translocatore della carnitina, e carnitina transferasi II,poich? l'acil GoA non pu? superare la membrana interna mitocondr iale (Bremer, J., Trends in Biochemical Science, 2 , 207 (1977)).

Sebbene la seguente spiegazione teorica non sia da considerare limitativa, si ? postulato che poich? le cellule tumorali richiedono una elevata velocit? di glicolisi per la loro crescita, e che poich? la carnitina stimola la ossidazione degli acidi grassi, la somministrazione di elevati livelli di carnitina potrebbe costringere le cellule tumorali a utilizzare acidi grassi come una fonte di energia che potrebbe impedire la glicolisi e avere effetti dannosi su tali cellule. E' sembrato che il metabolismo degli acidi grassi stimolato da carnitina potrebbe essere deleterio in tre modi possibili.

1. Se vi ? una diminuita stabilit? a ossidare acidi grassi a CO e H O, ma ? presente una normale attivit? carnitina transf erasica , un 'aumentata attivazione degli acidi grassi porterebbe all'accumulo di acil carnitina a lunga catena e a CoA esteri di acidi grassi (come dimostrato avvenire nella ischemia - vedi Shug, A.L. e coll., Arch. Biochem . Biophys . 187, 25, 1978). E' stato dimostrato che tali prodotti inibiscono un numero di sistemi mitocondriali e potrebbero U sare le membrane mitocondriali e cellulari a causa della loro potente azio ne detergente. (Shug, A.L., Texas Reports on Bio. and Med. 39, 409 (1979); Powel1, G. e coll., J.

Biol. Chetn. 256, 12740 (1981)).

2. Poich? l'attivazione di acidi grassi utilizza ATP e produce AMP PPi Acil CoA, l'attivazione degli acidi grassi stimolata da carnitina nelle cellule tumorali, dove l'ossidazione era rallentata, porterebbe a livelli diminuiti di ATP, diminuita formazione di ADP Pi da ATPasi, e meno glicolisi.

3. L'ossidazione di acidi grassi stimolata da carnitina pu? essere benefica per cellule normali (Shug, A.L. e coll. , Academic Press, NY , NY, Carnitine Biosynthe sis, Metabolism and functions , pp. 321-340 (1980.)) stimolando il loro metabolismo produttore di energia e la produzione di pi? ATP, rendendo perci? disponibile pi? energia per la sintesi di sostanze antitumorali, per esempio interferon. Pertanto, anche grazie al noto aumento del flusso sanguigno verso i tessuti tumorali e all'aumentata captazione di substrati caratteristica delle cellule tumorali, la carnitina quando somministrata in elevato dosaggio, tenderebbe, in effetti, a colpire e distruggere le cellule tumorali .

Negli esempi seguenti la L-carnitina era amministrata come base libera (sale interno). Anche la D-carnitina era amministrata come base libera.

ESEMPIO 1

Si utilizzarono ratti femmina Sprague-Dawley che sviluppano spontaneamente un tumore mammario benigno, ben incapsulato (i tumori furono considerati essere classici fibroadenomi costituiti di spire e fasci di collagene denso). Si scelsero sei animali con tumori di varie dimensioni per ogni gruppo per essere sottoposti a trattamento. Tutti gli animali furono mantenuti a una dieta ad elevato tenore di grassi.

Ad un gruppo di sei animali si iniettarono 3 g/chilo di L-carnitina i.p. due volte al giorno. Un secondo gruppo di sei animali ricevette una simile dose di D-carnitina. Il terzo gruppo di sei animali ricevette 3 g/chilo di L-carnitina e 1 g/chilo di cisteina due volte al giorno. Le iniezioni in ogni caso furono continuate per 25 giorni valutando la dimensione del tumore ai giorni 8, 15, 19, 22 e 25. Gli animali furono tenuti in osservazione per ulteriori 17 giorni e la dimensione dei tumori fu valutata al 36? e al 43? giorno. I risultati sono presentati nella seguente tabella.

E* evidente dai dati sopra riportati che la carnitina quando somministrata da sola o in associazione con cisteina era efficace nel ridurre la dimensione del tumore.

Si deve anche notare che in seguito all?iniezione (i.p.) di 3 g/chilo di peso corporeo, si osservarono livelli plasmatici di L-carnitina maggiori di 15 mM. Poich? la vita media della carnitina nel plasma ? di solamente circa 30 minuti, ? evidente che concentrazioni di carnitina di 10 mM, come illustrato nei seguenti esempi, potrebbero essere di importanza clinica e particolarmente poich? nell'esempio 1 si somministrarono ai ratti due iniezioni di carnitina a 3 g/chilo di peso corporeo per un lungo periodo di tempo senza effetti dannosi rilevabil i .

ESEMPIO 2

L-carnitina e D-carnitina furono iniettate in ratti femmina Sprague-Dawley con il tumore mammario come nell'esempio 1.

I ratti di controlo ricevettero iniezioni di una soluzione isotonica salina (0,15 molare). La L- e D-carnitina furono iniet: tate i.p.nelle quantit? specificate nell'esempio 1 (la D-carnitina fu iniettata nella stessa quantit? della L-carnitina).

Le iniezioni furono continuate su base giornaliera per 28 giorni. La misura dei tumori fu effettuata esattamente prima di cominciare il regime di iniezioni e alla fine del periodo di 28 giorni con i risultati illustrati in tabella 2.

L'ispezione visuale dei fibroadenomi sezionati dai ratti trattati con L-carnitina rivel? chq i tumori erano molto molli, di colore bruno e senza la crescita a forma lobulare sempre osservata nei fibroadenomi sezionati dai ratti controllo. Inoltre i fibroadenomi provenienti dai ratti trattati con L-carnitina risultarono avere livelli eccezionalmente elevati sia di carnitina libera che esterificata. Inoltre, l'esame patologico dei tumori da tali ratti trattati dimostr? che in tre ratti su quattro il tessuto tumorale era morto.

ESEMPIO 3

Si valutarono gli effetti di varie concentrazioni di L- e D-carnitina nei loro effetti sulla proliferazione della linea cellulare di cancro intestinale umano VACO 5 in cultura tissutale in accordo con procedimenti standard (Symposium - (book) Progress in Clinical and Biological Research, Voi. 48, "Cloning of Human Tumor Stem Cells", edito da S.E. Salmon , Publisher - Arthur R. Liss Ine., New York, pp. 332-338). La L- e D-carnitina furono aggiunte al mezzo di crescita fino ad ottenere le concentrazioni indicate in Tabella 3. I risultati sono illustrati in Tabella 3.

E' anche stato trovato che in studi in vitro con cellule tumorali, la presenza di acidi grassi a lunga catena, per esempio paimitico, miristico, oleico, stearico, nel mezzo di crescita sembra aumentare l'effetto inibitorio di L-carnitina sulla proliferazione di cellule tumorali come ? illustrato nei seguenti esempi.

ESEMPIO 4

Si prepar? una singola sospensione cellulare di cellule SKCO1 , una linea di cellule di un tumore del colon; a porzioni di questa sospensione si aggiunsero le diverse concentrazioni sia di D- che di L-carnitina specificate nella Tabella 4. Le rispettive porzioni furono quindi piastrate su agar soffice in bacinelle a pozzetto e incubate per permettere la crescita delle cellule. Tre pozzetti furono inoculati per ogni trattamento. I risultati furono calcolati contando le colonie cresciute in ogni pozzetto e facendo una media delle tre repliche. I risultati sono illustrati di seguito .

La crescita media rappresenta la media dell'effettivo numero di colonie contato nei tre pozzetti di ogni trattamento. La % di crescita di controllo rappresenta quanta crescita si sia verificata nelle prove di trattamento con carnitina rispet to alle prove di controllo. Questa fu calcolata dividendo la crescita media di ogni trattamento per 161 (la crescita media dei due controlli).

E' evidente dai dati precedenti che la D-carnitina sembra stimolare la crescita a tutte le concentrazioni illustrate raen tre la L-carnitina dimostra una diminuzione dipendente dalla concentrazione nell'efficienza di clonazione con quantit? crer scenti di L-carnitina

ESEMPIO 5

Si prepar? una sospensione di cellule SKCO1 come nello esempio 4.

Le diverse concentrazioni di L- e D-carnitina e acido paimitico e associazioni di L- e D-carnitina con acido paimitico specificate nella tabella 5 furono aggiunte a porzioni della sospensione cellulare e piastrate su agar soffice in bacinelle a pozzetto secondo la procedura dello esempio 4. I risultati ottenuti, espressi come percentuale di inibizione della crescita sulla media dei valori di controllo illustrata nella tabella 4, sono esposti nella tabella seguente.

E' evidente dai dati precedenti che la L-carnitina dimostra un effetto antiproliferativo verso la linea cellulare di tumore del colon SKCO1 e che tale effetto ? aumentato dall'associazione della L-carnitina con acido paimitico.

Utilizzando la stessa linea cellulare dell'esempio 5, cellule tumorali furono iniettate subdermicamente in topi nudi (? ben noto nell'arte che tale iniezione provoca la crescita di lesioni della pelle nei topi nudi). Immediatamente dopo l'iniezione subdermica si iniett? nei topi di controllo soluzione salina mentre nei topi di prova si iniett? L-carnitina in una quantit? pari a 3 g/chilo di peso corporeo .

Si osserv? che su quei topi trattati con l'iniezione salina le aspettate lesioni della pelle crebbero nel modo solito men tre quelli trattati con L-carnitina non mostrarono lesioni del^ la pelle.

In generale, possono essere utilizzate con sicurezza quantit? di carnitina da 1 a circa 5 grammi per chilo di peso di mammifero per lo scopo della presente invenzione e qualora si impieghi in associazione la cisteina, la quantit? di cisteina pu? variare da circa 0,5 a circa 1,5 grammi per chilo di peso di mammifero. Quando si impieghi in associazione un acido grasso con L-carnitina si possono impiegare delle quantit? che forniscano concentrazioni da circa 0*4 mM a circa 1,2 mM nel sangue dell'animale. Quantit? di acido grasso in eccesso a quelle che forniscono concentrazioni superiori a 1,2 mM dovrebbero essere evitate a causa di potenziali effetti tossici che potrebbero essere associati con tali concentrazioni pi? elevate .

Claims (13)

RIVENDICAZIONI

1. Metodo per il trattamento di tumori in mammiferi che com prende la somministrazione al mammifero di una quantit? di L-carnitlna inibente il tumore.

2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la L-carnitina ? somministrata in associazione con cisteina.

3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la L-carnitina ? somministrata in associazione con un acido grasso a lunga catena..

4. M?todo secondo la rivendicazione 1, in cui la L-carnitina ? somministrata in associazione con cisteina e un acido grasso a lunga catena.

5. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui l'acido grasso a lunga catena ? scelto fra gli acidi paimitico, miristico , oleico e stearico.

6. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui l'acido grasso a lunga catena ? l'acido paimitico.

7; Metodo secondo la rivendicazione 1i in cui la carnitina ? somministrata in una quantit? da circa 1 grammo a circa 5 grammi per chilo del peso del mammifero.

8. ' ?Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui si aggiunge cisteina in una quantit? da circa 0,5 grammi a circa 1,5 grammi per chilo di peso di mammifero.

9. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui l'acido gras so a lunga catena ? aggiunto in una quantit? sufficiente per indurre un livello di acido grasso da circa 0,4 mM a circa 1,2 mM nel sangue del mammifero.

10. Una composizione antitumorale contenente L-carnitina.

11. Una composizione antitumorale comprendente in miscela L-carnitina e cisteina.

12. Una composizione antitumorale comprendente in miscela L-carnitina e un acido grasso a lunga catena.

13. La composizione antitumorale secondo la rivendicazione 11, in cui l'acido grasso a lunga catena ? ?cido paimitico.