IT8347557A1 - Polipeptide avente attività di interferon, composizione che lo contiene o procedimento di preparazione. - Google Patents

Description

TAZIO

RILEGATA DESCRIZIONE 47557 A 83 a corredo di ina domanda -di Brevetto per invenzione idal titolo:

: "Polipeptide avente attivit? di interferon, composii

!zione che lo contiene e procedimento di preparazione " j ; !a nome della; CETUS CORPORATION

! . RIASSUNTO . . -d o? : . Oggetto dell' invenzione ? un nuovo polipep? O

a tide , denominato IFN- ot6l , prodotto da E. coli trasfo' JXi O

a OC. ;mato con un gene di IFN-fumano da poco isolato e .

-< caratterizzato. Il polipeptide presenta attivit? di.

?

;interferon, per esempio attivit? antivirale, regola- zz: ! oc ' zione di cresc ita delle cellule e regolazione di pr? ?aa O

; duzione delle sostanze prodotte dalle cellule.

;

I DESCRIZIONE

Campo tecnico .

La presente invenzione si riferisce al campo della biotecnologia. Pi? particolarmente, essa si riferisce ad un polipeptide avente attivit? di inter? feron (IFN), DNA che codifica il polipeptide, un vettore ricombinante che comprende il DNA, un organismo ospite trasformato con il vettore ricombinante che produce il polipeptide, le composizioni farmaceutiche contenenti il polipeptide e le procedure terapeu(

!

: tiche in cui il polipeptide trova utilizzazione.

I ?

| - ? Tecnica precedente

-r .Gli IFN sono proteine con attivit? antividi rale , imrauno modulatori a ed antiprolif erativa, prodot-; te dalle cellule dei mammiferi in risposta ad una va-, riet? di agenti induttori (si veda Stewart, W.E., The

1 Interferon System, Springer-Verlag, New York, 1979). CL. ( L'attivit? di IFN ? largamente specifica in funzione della specie (Colby, C. and Morgan M. J., Ann.Hev. ci i o oc Microbiol. 25:333-360 (1971) e perci? soltanto ?' IFN

rvi umano pu?. essere usato per studi clinici sugli esseri

?

. umani. Gli IFN umani sono classificati in tre gruppi, zz:

| I-'NI c*: OC .? e ? (Nature. 286:110, (1980)). I geni di IFN- _ QQ o ; umani compongono una famiglia di una pluralit? di geni che hanno in comune una omologia di sequenza fra

1*85# ed il 95^ (Goeddel, D.V., et al, Nature 290:20-27

_, _( 19.81 ). Nagata, S. , et al. J. Interferon Research _ _

1 : 333-336 (1981)). Diversi geni di IFN-at sono stati

sottoposti a clonazione e sono stati espressi in E. _

coli (Nagata, S. et al, Nature 284:316-320 (1980);

; Goeddel, D.V., et al, Nature 287:411-415 (1980);

Ye3,verton, E., et al, Nucleic Acids Hesearch, 9:731-741

(1981); Streuli, ML , et al, Froc Nat Acad Sci (USA) ,

78:2848-2852. I risultanti polipeptidi sono stati purificati c saggiati per le attivit? biologiche asso

ciate agli IFN umani nativi parzialmente purificati ed hanno dimostrato di possedere analoghe attivit?.

In accordo con ci?, tali polipeptidi sono potenzialmente utili come agenti antivirali, immuno modulato ri

ed an ti proliferai ivi.

Uno scopo principale della presente invenzione consiste nel fornire un polipeptide avente attivit? di interferon, il quale viene prodotto da un organismo trasf or nato con un gene di IPN- ci* da poco

c, tr. isolato e da poco caratterizzato. Questo polipeptide qualche volta viene riferito nella presente descrizio

C

ne come IFN-cL 61. Altri scopi dell?invenzione sono e

diretti alla realizzazione delle composizioni e de-?di ? gli organismi che sono usati per produrre questo por-v cu lipeptide ed alle composizioni terapeutiche ed alle ca procedure nelle quali questo polipeptide viene usato come principio attivo.

Esposizione de 11 1 invenzione

Un aspetto dell' invenzione consiste in un polipeptide avente attivit? di interferon e comprendente la sequenza di amminoacidi:

Cys AspLeuProGl n ThrHisSerL?uSer A s nA r g A r gTh r L e u MetlleMetAlaGln

Me tG 1 y A r gl 1 cSe r P roPh eSe rCy s Le u LysAspAr gH isAsp PheGlyPheProGin

G 1 uG 1 uPh eAs ;>G L y AsnG 1 nPh r?G 1 nLys A 1 uG 1 nA 1 a 11 cSe r Va1LeuItisG1uMet:

1 1. eG 1 ni > 1 nTh ri'h e AB n Leu Pii e G? rTh r Ly sAs pSe rSe r A 1 a ThrTrpAspG1uThr

Leu Leu A. spLy sP?ie T y rTh rG l u LeuTy r G L nG l nleuAsnAs |> LeuGluA1aCyrsMot

Me tG 1 nG 1 uV? LG 1 y Va le; 1 uAa pTh i Pr o LIJUMC tAs nValAnp Ser11eLeuThrVai

? r g L y s T y r P h eG In A r y T 1. eTh rL e uT y r L euTh.i G 1 u L y s I., y s TyrSerProCysAla

T r j Gl uV a J. Va 1 A r y A L aG 1 u 11 cMo t Ar y Se rPhcSe rLcuSe r ALaAynLeuGlnGLu

A ryLeuArgA ryLys Giu

. ..... Un secondo aspetto dell' invenzione ? _co- _

stituito da un frammento .od .unit? di DNA comprendente una sequenza^di nucleotidi che codi fica .il polipepti de precedentemente descri tto. _ _ _ _

_ Un terzo aspetto dell'invenzione _? costituito da un vettore o veicolo di clonazione che com ? ?S?

?s prende il DNA precedentemente descritto. _ 32 oc _ Un quarto aspetto dell' invenzione ? costi O CL. c :? . tuito da un organismo ospite il quale viene trasforr--mato con_ il veicolo di clonazione precedentemente de

scritto e che produce il polipeptide precedentemente r-'j -?C-flO mente descritto

CD

Un quinto aspetto dell'invenzione ? costi-^ _

tuito da_un pr? cedi mento per produrre il polipeptide precedentemente descri tto consistente nel coltivare _ _

detto organismo ospite trasformato e nel raccogliere

il po li peptide_ dalla risultante coltura._

Un altro aspetto dell'invenzione & costituito da una composi zione farmaceutica avente atti- _

vit? di interferon comprendente una quantit? efficace

del polipeptide precedentemente descritto mescolato

con ua supporto farmaceuticamente accettabile.

?ncora un altro scopo dell'invenzione ?

costituito da un procedimento per fornire terapia a

base di interferon ad un essere umano consistente nel somministrare all?essere umano una quantit? terapeu-| ?ticamente efficace del polipeptide precedentemente 1 descritto.

Breve descrizione dei disegni

La figura 1 rappresenta una mappa di restrizione parzi ale che mostra i due siti o posizioni di I ;

{ re strizione XhoII che produce un frammento di DNA a

i i 260 coppie di base omologo dai geni strutturali di i - (? j ' " ? ' ?? ;IFN-(\1 ed IFN-Q[2. I dati relativi a questa mappa

i

I

isono ricavati da Streuli, M., et al Science. 209:1343-1347 (1980). !

La figura 2 rappresenta la strategia di impostazione delle sequenze usata per ottenere la ?-? "?-? se co ^qu .e..nz ?a com . -pl ?eta di DNA della re 'gione di codifica- -J

! zione del gene di ???-??^?? . Il batteriofago mp7:dJ5l-1 DNA e servito come base di partenza per le sequenze : ottenute con gli agenti innescanti A, H e F ed il batter iof ago ???7:<?6?-2 DNA ? stato usato come base

i di partenza p er le sequenze ottenute con gli agenti innescanti E e 0. L?area a tratteggio incrociato del

| I gene rappresenta la regione che codifica il polipepti? de di segnale a 23 amminoacidi ed il riquadro aperto ' rappresenta la regione che codifica il polipeptide maturo. La scala, in coppie di base, ? numerata con

0 che rappresenta il codone di partenza di ATG del preinterf eron. Le frecce indicano la direzione e la

estensione delb. sequenza ottenuta con ciascun agente innescante.

La figura 3 rappresenta la frequenza di

nucleotidi del gene strutturale che codifica L' IFN-0(.61 comprendente alcune delle regioni collaterali 5*- e

3' - non codif icanti del gene. La codificazione di

regione per il preinterf eron e per il polipeptide maturo inizia con il codone di ATG nella posizione 92

e termina con il codone di TGA nella posizione 659.

La figura 4 rappresenta una mappa di restrizione parzi ale della regione di codificazione del gene di IFN-c^l . Il doppio tratteggio rappresenta la OC, regione che codifica il peptide di segnale da 23 amminoacidi ed il riquadro aperto rappresenta la sequenza di codificazione del gene per il polipeptide

maturo . La scala, in coppie di base, ? numerata con

0 che rappresenta il codone di partenza di ATG del

preinterf eron. !

La figura 5 rappresenta la sequenza di amminoacidi del polipeptide di segnale da 23 amminoacidi e dell* IFN-G4.61 maturo con 166 amminoacidi codificato dal gene rappresentato nella figura 3? La sequenza di 189 amminoacidi ? presentata al disopra

della corrispondent e sequenza di nucleotidi. L? ammi

noacido 24, cisteina, ? il primo amminoacido della

! . f proteina di IFN-Q(61 matura.

; . !

| _ La jfigura 6 rappresenta la sequenza di DNA

1 1 ( del promotore di trp E, coli ed il gene della figura 3 I '

; ? stato inserito fra i siti EcoRl ed HindlII del piaci c A i smide_ P_BW1_1 ? La sequenza di amminoacidi delb, figura ' j i

^ 5 ? scritta al di sopra_della_ corrispondente sequenza O e 1 i O a i di DNA e_JLa posizione dei siti di restrizione usati c ? nella costruzione del plasmide di espressione ? indi? iti QCJ

! cata* < ^T? ?

La figura 7 rappresenta un diagramma del C-i CO

plasmide di espressione pGW20. CD ar | _ _ _ Modi per eseguire l' invenzione _ _ I j_ _ In termini generali , lf IFN-d.61 ? stato prodotto me diante identificazione ed isolamento del gene di_ IFN-Q?6 1 mediante valutazione di una biblioteca 0 libre ri a di MA genomico umano con una appropri at a

so nda di_JDN A di _IFN- ? , cost ru zione di un vettore contenente il gene di IFN-ol6l t trasformazione dei _ _ microorganismi con il vettore, coltivazione dei trasformanti che esprimono IFN-oi 61 e raccolta di IFN-oip1 dalla coltura. Una preferita forma di realizzazione di _ questa procedura verr?_ descritta nel seguito. J Preparazione della sonda di DNA

Il SNA citoplasmi co totale ? stato estrato dalle cellule linfoblastoi.di umane Namalwa, che erano

state indotte per la produzione di IFN mediante trattamento preliminare con 5-bromodeossiuridina (Tovey,

M. G. , et al, Nature 267: 455-457 ( 1.977) ) e con il virus

Newcastle Disease Virus (NDV) . Il RNA messaggero con-? rcitenente poli (A) (acido poliadenilico) (mHNA) ? stato tA isolato dal detto RNA totale mediante cromatografia

su oligo (dT)-cellulosio (tipo 3 da Collaborative

Research; Avivi , H. , e Leder, P. , Proc Nati Acad Sci

(USA) , 69 : 1408-1412 ( 1972) ) ed arricchito per mHNA

di IFN mediante centrifugazione a gradiente di densit? su gradienti di saccarosio fra il 5 $ ed il 20$.

JA. Le frazioni contenenti mHNA di IFN sono state identificate mediante traslazione di detto mRNA mediante

mi ero iniezione di aliquote di ciascuna frazione in

oociti Xeno pus e determinando 1* attivit? di IFN dei

prodotti delle operazioni di traslazione in conformit? ad una procedura descritta da Colman, A. , e Morser,

J. , Celi. 17: 517-526 ( 1979) . i

Detto mRNA arricchito di IFN umano delle

cellule Namalwa ? stato usato per la co struzione di _ _

cloni di DNA complementari (cDNA) in E, coli mediante

la procedura di prolungamento G/C usando il sito PstI

del vettore di clonazione pBR322 (Bolivar, F. , et al,

Gene, 2 : 95-1 13 ( 1977) ) . Una popolazione di trasforman

i CUNA individuali ? Ebata fatta crescere su un litro ! ; del me zzo di coltura per tutta la notte ed il Hi A de tL i

l?asm?de totale ? stato isolato.

] Le sequenze di 2 cloni di IFN-c*. (IFN-0^1 e ???-??.2) sono state pubblicate (Streuli, M., et al, ;

i Science, 209 ? 1343? T .347 (.1980) ) . L' esame delle sequen-! _ze di DNA di questi due cbni ha rivelato che l' enzima di restrizione XhoII separerebbe un frammento di 260 bp dal gene di IFN-^1 oppure dal gene di IPN-^2 i si veda la figura 1 ) . L' enzima XhoII ? stato prepari i rato in conformit? con i! pr? cedi mento de se ri tto _ i : da G-ingeras, _T.H. e Roberts, R. J. . J. Mol Biol , ? ' ? ? ' ? |18: 11.3-122 ..(1.978) . _ j _

Un mg del preparato di DNA di plasmide toi tale purificato ? stato digerito con XhoII ed i fram-

i " " ? ? . . ? ' " ? menti di DNA sono stati separati su gel di po li ac ri .1-^ ammide al preparativo. Il DNA proveniente dalla r e gi o ne d e1 gel che corri sponde a 2 60 bp ? st ato ri-_ ; cuperato me di ante elettroelui zione e sottoposto nuovamente a clonazione mediante legamento nel sito cLi BamH I del batte rio f ago a. _s in golo f il ame n t o m 13 : mp 7 ? ; Trentasei cloni__spnq a _ c a so , _il_ JDN A a singolo filamento ? stato isolato da essi ed il | DNA ? stato ordinato in sequenza,. Le sequenze di DNA di quattro di questi cloni sono risultate omologhe _ _ alle note. sequenze . di DNA di IFN-?L . Il clone mp7:0C-260, con una .sequenza di DNA .identica al .DNA di IFN-otl _ . _ (Streuli,. M. , et al?,. .Science. 209 ; .1343-1 347 . ( 1980) ) . ? _

1

-4 stato scelto come sonda di ..ibridizzazione altamente _ -? ? ? ? specifica per la. identificazione . d.i. ulteriori, sequen- _ ?4.

S

ze di DNA di IFN-Q^. Questo clone verr? nel seguito _ _ riferito come " sonda di 260". _ _ _ _

f *4 _ Valutazione della biblioteca di DNA genomico

_ _ Allo scopo, di isolare altre sequenze del ge- - si-" ne di IFN-OC ,. ura sonda .260. etichettata con. _ P. ? sta-. . CO c? ta usata_per la salutazione di una .libreria o biblioteca. di_DNA genomi co umano, mediante .ibridizzazione _

in si tu. La banca del gene umano, preparata da. Lawn, _

et al, Celi. 15 : 1 157? 1174 ( 1978) ? . stata gene- _

rata mediante scissione parziale del DNA umano feta- _

le con HaelII ed AluI e . sottoposta a. clonazione nel. _ batteriofago Charon 4A con agenti concatenanti .di

EcoHI sintetici. Sono stati , valutati approssimativa- _

mente.. 800.000 cloni dei quali circa.. 160 ibridi zzavai

no con sonda 260. Ciascuno dei 1 60. cloni ? stato ul- .. . teriorraehte caratterizzato dalla mappatura con enzima di restrizione e confronto con le mappe di restrizione pubblicate relative a 10 geni di IFN cromosomici (Nagata, S, , et al, J Interferon Hesearch, , 1 : 333

Jcontenente un inserto di 18 kb ? stato caratterizzato I ; come segue . Un preparato di DNA di /\4A ':CJL61 ? stat 'o ! scisso con HindlII. BglII. ed EcpRI rispettivamente, i . .. ' ! ' " i frammenti sono stati separati su gel di agarosio, trasferiti ad un filtro alla nitrocellulosa (Southern, E.M. , J Mol Biol, 98: 503-517 ( 1977) ) ed ibridizzati . 32 i ? con sonda 260 etichettata o marcata con P. Questa procedura ha localizzato il gene di ????-?(61 ad un

! frammento di restrizione di BglII da 1 , 9 kb che ? sta? i

;to quindi isolato e sottoposto a nuova clonazione,

" " ?" in ambedue gli orientamenti, mediante legamento del . . . 1 frammento in m1 3:mp7 scisso con BamHI. I due subcloni sono stati designati con mp7:<^6l-1 e con mp 7: ^?? -2 ad CD ?La designazione -1 indica che il batteriofago a singo- Ss lo filamento contiene DNA di inserto complementare

!al mRNA (il filamento negativo) e la designazione

i-2 indica che il DNA di inserto presenta la stessa sequenza del mHNA (il filamento positivo).

Sequenza del gene di IFN-/x61

La tecnica di dideossi di Sanger ? stata usata per determinare la sequenza di DNA del gene di IFN-0^61. La strategia impiegata ? rappresentata schematicamente nella figura 2, la sequenza di DNA cos? ottenuta ? indicata nella figura 3 ed una mappa dell' enzima di restri zione parziale del gene di IFN-o(61 .. ? illustrata ne Ila ..figura 4. Diversamente da molti . geni preiarati da organi smi eucariotici , ma analoghi ._ ad altri geni cromosomici di IFN che sono stati ca- _ ratterizzati, la sequenza di DNA di questo gene j?imo-_ stracche _esso_ manca di intjron. _La _o mo lo gi? _all*infor-_ mazione relativa alle sequenze proteiche da questi _ _ noti geni di IFN-&< ha reso possibile di determinare il corretto quadro di lettura di traslazione e per-_ ci? ha permesso di prevedere 1* intera_sequenza di _ 166 amminoaci di dell' IFN-0^63 partendo dalla sequenza i : " ' - - - - ' '

j di DNA, come anche un segmento precursore o polipepti-! de di segnale di 32 amminoacidi (figura 5) * _ ? i _ La sequenza di_DN A. del gene di IFN-3>(61_ ? la, sequenza di a.mmino ac idi prevista sulla base di esso differiscono sostanzialmente da altre note sequenze di DNA di IFN-p( e di amminoacidi di IFN -p( . ' A questo ri guardo , Do eddel, D.V. , et al Nature ( 1981 ) ; 290 :20-26 descrive le sequenze di DNA di un clone di cDNA di IFN parziale, de signalo LelF-G?. La sequenza del clone parziale e simile all' estremit? 3* della sequenza di DNA dell* IFN- (?j51 , eccetto per una variazione dei nucleotidi nel codone per 1* amminoacido 128. In confronto con il clone parziale, il ; gene di !FN-c<p1 contiene ulteriore DNA che codifica Preparazione del plasmide e trasformazione dell* ospite

La combinazione del. plasmile per l?espresj sione diretta del gene di IFN-???? implicava la sostituzione del frammento di DNA che codifica il polipeptide d.i_ segnale di 23 amminoacidi del preinterf eron ?

i ex I ?/5 con un frammento di promotore di EcoRl/Sau3A da 120

"3*~ O

bp (promotore di trp di E. coli, operatore e sito di oc O

| O fi ssaggio del ribosoma anteriore di trp che precede oc un codone di ini zio di ATG?) ed impiegando il sito di HindIXI che _ e stato inserito , J59 nucleo tidi 3*- del ? _

1 ? 1 codone di arresto di traslazione di TGA., per inser?? o-r

lre_ il gene nel plasmile pBW1 1 (un derivato di pBR322' _ CJD 3C avente una cancellazione fra i siti di HinAIII e PvuII) La sequenza comple ta del DNA dei frammenti di proraotore e di gene inseriti fra_i siti EcoHI ed. HindlII del pBWl 1 ? rapresentata nella figura 6 la quale mo- _ stra anche la posizione esatta dei siti di clonazione irilevanti , I dettagli della costruzione sono descritti nel seguito .

La regione di codifi cazione per l' IFN? 0(61 maturo presenta tre si ti di Sau3A , uno dei quali si^ ?

trova fra i codoni per gli amminoacidi 2 e 3. Un sito di HindlII sintetico ? stato inserito 59 nucleo tidi

I ? 3*? della regione di codificazione e la risultante

f t

costruzione ? stata so ttoposta ad una digestione con ?IiindIIl/Sau3A parziale . Un frammento di 560 bp ? sta-: to i solato dal prodotto di digestione. Questo fram-| mento ed un frammento del promotore di E, coli da EcoRI

-<s ' a 5au3A da 120 bp sono stati legati insieme in un do? ' | ' . ! ' 'legamento diretto a tre vie nel sito da EcoRI a HindlII o del pBWl1. Il frammento del promotore conteneva un o di ! i

sito di restrizione di HindlII sintetico, un codone

'di inizio di ATG, un codone cisteina iniziale (TGT)

comune a tutti i noti IPK-oC ed una "estremit? collosa"

et di Sau3A. Il miscuglio di legamento ? stato usato per

1 . . ' . ? ! . " trasformare E. coli ML5294 (Backraan, K. , et al, Proc

I ?

Nati Acad Sci (USA) 73:4174-4178 (1961)). I deside-!

rati prodotti corretti di trasformazione , 8 sui 24

valutati , sono stati identificati mediante la mappatura con enzimi di restrizione delle colonie che for-? ' . ? ' . " " ~ 1 i '

mavano ibridi in modo da dar luogo ad un frammento

genomico di IFN-O^marcato con P. La figura 7 rappresenta un diagramma del plasmi?e di espressione finale

ottenuto , che ? designato con pGW20. Altri o spiti procariotici , per esempio batteri diversi da E, coli, possono naturalmente essere trasformati con questa oppure altre convenienti costruzioni per replicare il gene di IFN-^.61 e/o per produrre IFN-d.61

venzione si ritiene che sia distinto dalla corrispon-1 dente proteina nativa sotto diversi aspetti . In primo ! luogo, poich? il gene di IFN-cJ- 61 ? stato espresso

( da ospiti batterici che utilizzano N-formil? metionina I e/o meticnina per iniziare la traslazione, alcune oppure tutte le molecole di IFN-0?51 prodotte per via batterica 3ono precedute da un gruppo di me tionina

0 di N-formil-metionina. Una parte dei gruppi di me- ? i i . . ' tionina o di N-formil-me tionina potrebbero essere

j rimossi mediante meccanismi di scissione batterica r i

j naturali in vivo . Ci? comporterebbe un miscuglio di

? . . :

JOlecole , alcune delle qu?Li potrebbero includere un

-gruppo iniziale di metionina o di N-formil-metionina diversamente da altre. Tutte que ste molecole di IFN-0? 61 ^ i

! ^ . quelle contenenti un gruppo iniziale di metionina o .

I di N-formil-metionina, quelle non contenenti metionina . o N-formil-metionina ed un qualsiasi . loro miscuglio . ... sono comprese nella presente invenzione . In secondo .

; luogo; i residui di ammioacidi del polipeptide pr?- , _ dotto per via batterica sono non sostituiti , mentre

1 residui della proteina nativa possono essere sostituiti con gruppi di zucchero, ACTH oppure altre fra- . zioni. Inoltre, gli estratti di IFN-cMiativo consistono di miscugli di varie molecole di IFN mentre

? detto TFN-?61 prodotto per via batterica ? omogeneo ;

?

' in altre parole, l' IFN-<*61 prodotto per via batteri- ;

ca non contiene polipeptidi in relazione funzionale.

; In accordo con ci?, l'invenzione prevede di produr-! j

, re composizioni contenenti IFN-?61 aventi attivit? . esco _ biologica che pu? essere attribuita semplicemente

o ??. a IFN-0^61 e/o ai suoi derivati contenenti gruppi ter- o.

o o< ' minali di metionina o N-formil-metionina. -<

r-j ! Coltivazione dei trasformanti

! ? ' _ I batteri trasformati con il gene di IFN-t?U51

e t ^ possono essere coltivat^n un appropriato mezzo di cci c ri ?crescita, per esempio un mezzo essenziale minimo, _ _ 51

che soddisfi le esigenze nutritive ed altre esigen-

ze necessarie per permettere la crescita dei batte-

ri e la produzione di IFN-^61 . Se i batteri sono tali

che la proteina ? contenuta nel loro citoplasma, det-

to IFN-OL61 pu? essere estratto dalle cellule mediante

; lisi delle cellule, per esempio con trattamento soni-

co e/o trattamento con un agente solubili zzante anio-

nico forte, per esempio sodio dodecil solfato. Ulte-

ri ore purificazione dell'estratto pu? essere ottenu-

ta mediante cromato grafi a per affinit?, elettroforesi

oppure altre tecniche di purificazione delle pro tei-

ne.

Salalo bio lori-co di IFN-olfil .

I prodotti con trattamenti sonici delle cellule contenenti IFIJ-dl61 sono stati saggiati in

I ; vitro ed hanno dimostrato di avere le seguenti atti-1 vi ta: ( 1) inibizione della replicazione virale del . ivirus di stomatite vesicolare (VSV) e del virus -1 di . 'herpes simplex (HSV-1 ) ; (2) inibizione della cresci-. . ' " . i ? , ta - delle cellule tumorali; (3) inibizione della forma- ^ Q-| : </5 j zione di colonie dalle cellule tumorali in agar morbi-^i i ? ;do; (4) attivazione delle cellule Killer (di soppres- 3? ; ^ j Sione ) naturali (NK) ; (5) esaltazione del livello di 12,-5,-oligoadenilato sintetasi (2* , 5 '-A) ; e (6) esalj

: tazione della cinasi proteica dipendente da HNA a dop- -pio filamento. I prodotti ottenuti con trattamenti so-I ' " ' 1 ,nici sono risultati attivi nell' inibizione delle in? 1 fazioni virali sia nelle cellule degli esseri umani ? ! sia nelle cellule di altri mammiferi, per esempio criceto, scimmia, topo e cellule di coniglio.

___ _ I saggi dimostrano che detto IFN-^.61 preseni

;ta attivit? antivirale contro i virus di DNA e di ..HNA, l' attivit? di regolazione della crescita delle cellule ed una capacit? di regolare la produzione degli enzimi intracellulari ed altre sostanze prodotte dalle cellule . In accordo con ci?, si prevede che l' IFN-o^61 ' possa essere usato per il trattamento delle infezioni virali con potenziale per la terapia a base di interferon, per esempio l'infezione della epatite cronica

t '

: B, le infezioni oculari, locali 0 sistemiche da herpes

virus, le infezioni dal virus dell' influenza ed altre

' infezioni del tratto respiratorio di origine virale ,

!

' le rabbie ed altre - zoonosi virali, le infezion.i . da l __

i arbovirus e le affezioni da virus lento , per esempio

; .. r -: Kuru e la panencefali te scleroti zzante. Tale prepa-?-rato pu? anche essere utile per il trattamento delle

: infezioni virali in pazienti immunocompro messi , per

esempio herpes zoster e varicella, ci tome gaio virus, ?

infezioni da virus di Epstein-Barr, infezioni da

herpes simplex, rubella e leuco encefalopatia multifo-| ' ?l " '

l

cale progressiva. La sua attivit? di regolazione della

i

crescita delle cellule lo rende potenzialmente utile

per il trattamento di tumori e cancri , per esempio

sarcoma osteogenico , mieloma multiplo, morbo di Hodgkin,

linfoma nodulare scarsamente differenziato , leucemia

I ' ' . " . . . .. ;

; linfocitica acuta, carcinoma del seno , melanoma e carcinoma nasofaringeale . Il fatto che detto IPN- OC.61 aumenti la cinasi proteica e la 2 ' , 5 '-oligoadenilato

sintetasi indica che esso pu? anche aumentare la sintesi di altri enzimi o sostanze prodotte dalle cellule comunemente influenzate dagli IFN, per esempio

i stammina, acido ialuronico , pr? stagi andina E, t?NA

meti lasi ed arii idrocarburo idrolasi. Analogamente,

esso pu? essere utile per inibire gli enzimi comunei

I mente inibiti dagli IFN, per esempio tirosina animinoi transferasi, gli cerol-3-f osf ato deidrogenasi, glutam-

.

j i mina sintetas - i - , o . miti .na decarbossilasi, S-adenosi . l.?..

! 1-metionina decarbossilasi ed UDP-N-acetilglucosa .m-| mina-do li col monofosfato transferasi. La capacit? di

ex [ detto IFN-O(61 di stimolare l'attivit? delle cellule 6? I ? NK ? indicativa del fatto che e sso pu? anche posse-) I O a? ! ? i O ! dere altre attivit?, per esempio la capacit? di indur? a 2? ss ; re attivit? dei macrofagi e la pro duzione di anticor- ? re-. ?? ; pi e di influenzare le alterazioni superficiali delle <3

cellule, per esempio le variazioni della densit? del- r- ? r . ! . ~ . . ~

1la membrana del plasma oppure la carica superficiale i :

| delle cellule, una modificata capacit? di fissare

I

, le sostanze, per esempio la tossina, del colera, la

: concanavalina A e l'ormone di stimolazione della tiroi?

| de e variare l'esposizione dei gangliosidi superfi-

ciali

Le . composizioni farmaceutiche, che _ contengo-

no gli IPN-ct61 in qualit? di ingrediente o principio

attivo normalmente saranno formulate con un appropria-

to supporto liqui do o solido dipendente dal partico- .

lare modo di somministrazione che viene usato. Per

esempio, le formulazioni parenterali sono usualmente

costituite da fluidi inie ttabili che utilizzano flui; di farmaceuticamente e fisiolqgicamente accettabili ,

; per esempio soluzione salina fisiologica, soluzioni

! ' 1

! saline- bilanciate o simili , in qualit? di veicolo. ?

le formulazioni orali, d* altra parte, possono esse-(

! | re solide , per esempio compresse o capsule, oppure '

? sospensioni o soluzioni liquide. L? IFN-ot?l usualmente

| sar? formulato come dosaggio unitario che contiene

! 4 7

; nell?intervallo fra 10 e 10 unit? internazionali

? s ? *

i t p - i? usualmente fra 10 e 10 unit? intemazionali I ?

| i

per do se. |

' Detto TFN-CJC61- pu? essere somministrato

i agli esseri umani in varie maniere, per esempio per

via orale, endovenosa, intramuscolare, intraperitonea?

| le , intranasale , intradermica e sottocutanea. Il par-

?

ticolare modo di somministrazione ed il regime di

i !

dosaggio saranno scelti dal medico curante tenendo

conto dei particolari del paziente, della affezione ?? SMG :p, ; e dello stato della affezione implicato . Per esempio,

le infezioni virali sono trattate usualmente con do-: saggi giornalieri o due volte al giorno per alcuni

: giorni fino ad alcune settimane; mentre il trattamento dei tumori o dei cancri implica dosaggi giorna-1 He ri o multi giornali eri per mesi oppure anni. La terapia a base di IPN-c^?l pu? essere combinata con altri trattamenti e pu? essere combinata oppure usata

in associazione con altri agenti chemioterapeutici

i iO chemiopreventivi per fornire una terapia contro

I!

le infezioni virali, le formazioni neoplastiche oppure altre condizioni contro cui tale preparato ? efficace. Per esempio, nel caso del trattamento della cheratite da virus,herpes, la.terap?a,con IFN ?.?.

J ! stata integrata da terapia con termocauterio, sbri?.

I l giramento e trifluorotimidina. I.

j ! ; . . . Modificazioni dei modi precedentemente . Ct c-? ?

. ; descritti per la esecuzione dell* invenzione, per . ! i

I esempio senza limitazione l?uso di vettori altema-' !

/ tivi , alternativi sistemi di controllo di espre ssi oj ne . nel vettore ed alternativi microorganismi ospiti .

(

* ed altri ? si terapeutici od associati di IFN-^- 61..

? ? * ; che sono ovvi a coloro aventi normale esperienza nel i

| campo della biotecnologia, farmaceutico, medico e/o

* in camp i associati, sono da interpretare come rien-? trarrti nell?ambito delle seguenti rivendicazioni .

4 _ _ _ . . H IV END IC A Z IO NI _ _ _ _ 4.

1. Polipeptide avente attivit? di interferon e comprendente la sequenza di amminoacidi :

CysAspLeuProGln ThrHisSerLeuSer AsnArgArgThrLeu MetlLeMetAlaGln MetGlyArglleSer ProPheSerCysLeu LysAspArgHisAsp PheGlyPheProGln GluGluPheAspGly AsnGlnPheGlnLys AlaGlnAlalleSer ValLeuHisGluMet IleGlnGlnThrPhe AsnLeuPheSerThr LysAspSerSerAla ThrTrpAspGluThr LeuLeuAspLysPhe TyrThrGluLeuTyr GlnGlnLeuAsnAsp LeuGluAlaCysMet MetGlnGluValGly ValGluAspThrPro LeuMetAsnValAsp SerlleLeuThrVal ArgLysTyrPheG?n ArglleThrLeuTyr LeuThrGluLysLys TyrSerProCysAla TrpGluValValArg A.laGluIleMetArg SerPheSerLeuSer AlaAsnLeuGlnGlu ArgLeuArgArgLys Giu

. - ZZ - ' I

_ _ 2. Polipeptide secondo la rivendicazione

!

1,_in cui il polipeptide consiste essenzialmente di;

?

detta sequenza di..amminoacidi, ... __ _ _ !.

?. Polipeptide secondo la rivendicazione \

0. 2,. in cui il residuo di cisteina iniziale della .

! >

_| sequenza di amminoacidi ? preceduto da un. gruppo dij

I

i N-formil-metipnina. _ _ _ _

i

_ _ 4._JPolipeptide secondo .la. rivendi c azione

1 _o _2,._in cui i_ residui di amminoacidi di detta se- ?

? i i O Cui quenza sono non sostituiti.. .. _ _ o Q

j _ IFN-Ol 61. _ _ _ _ _j__

r^j _ 6. Composi z?one avente attivit?, di . interfe- -03

<3 ron e c omprendent e. un . mi scu gl io. .di : _ _ j.... 3G

_ a) un polipeptide . avente . la sequenza di _am-_ ??

CD

minoacidi : IL?

_ ,CysAspLeuProGln ThrHisSerLeuSer AsnArgArgThrLcu MetlleMetAlaGln MetGlyArglleSer ProPheSerCysLeu LysAspArgHisAsp .PheGlyPheProGln

.GluGluPheAspGly AsnGlnPheGlnLys AlaGlnAlalleSer ValLeuHisGluMet

~ IleGlnGlnThrPhe AsnLeuPheSerThr LysAspSerSerAla ThrTrpAspGluThr

LeuLeuAspLysPhe TyrThrGluLeuTyr GlnGlnLeuAsnAsp LeuGluAlaCysMet MetGlnGluValGly ValGluAspThrPro LeuMetAsnValAsp SerlleLeuThrVal

- ArgLysTyrPheGln ArglleThrLeuTyr LeuThrGluLysLys TyrSerProCysAla ?

TrpGluValValArg AlaGluIleMetArg SerPheSerLeuSer AlaAsnLeuGlnGlu

_ ArgLeuArgArgLys Giu

e;

_ b ) un po li peptide avente detta sequenza .di

amminoacidi , in cui il residuo di cisteina iniziale

della sequenza ? preceduto da un gruppo di metionina

o di N-formil-metionina.

7. Composizione secondo la rivendicazione

? 6f in-cui i residui di amminoacidi di detta sequenza

[" .

' i Isono non sostituiti. i 8. Composizione avente attivit? di interferon comprendente un polipeptide avente la sequenza di amminoacidi :

CysAspLeuProGln ThrHisSerLeuSer AsnArgArgThrLeu MetlleMetAlaGln MetGlyArglleSer ProPheSerCysLeu LysAspArgHisAsp PheGlyPheProGln GluGluPheAspGly AsnGlnPheGlnLys AlaGlnAlalleSer ValLeuHisGluMet IleGlnGlnThrPhe AsnLeuPheSerThr LysAspSerSerAla ThrTrpAspGluThr LeuLeuAspLysPhe TyrThrGluLeuTyr GlnGlnLeuAsnAsp LeuGluAlaCysMet MetGlnGluValGly ValGluAspThrPro LeuMetAsnValAsp SerlleLeuThrVal ArgLysTyrPheGln ArgIleThrLeuTyr LeuThrGluLysLys TyrSerProCysAla ^ TrpGluValValArg AlaGluIleMetArg SerPheSerLeuSer AlaAsnLeuGlnGlu ^ ArgLeuArgArgLys Giu ?? i ; Si ? : oppure un miscuglio d . i detto . po .lipeptid . e . e di un .. po- . d O Chi i lipeptide avente detta sequenza in cui il residuo di ir h? ; ci steina ini ziale ? preceduto da un gruppo di metio

~o nina o di N-formil-metionina, in cui l?attivit? di interferon della composizione pu? essere attribuita a detto polipeptide oppure a detto miscuglio .

9. Unit? di DNA consistente di una sequenza idi nucleotid? che codifica il polipeptide della rivendi casio ne 1 o 5.

10. Unit? di DNA secondo la rivendicazione 9, in cui la sequenza di nucleotidi ?:

(segue tabella)

TGT GAT CTG CCT CAG ACC CAC AGC CTG AGT AAC AGG AGG

ACT TTG ATG ATA ATG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CCT TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCT CAG GAG GAG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT ACT TGG GAT GAG ACA CTT CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTT TAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT ATG ATG CAG GAG GTT GGA GTG GAA GAC ACT CCT CTG ATG AAT GTG GAC TCT ATC CTG ACT GTG AGA AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCA TGG GAG GTT ~

GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTA TCA GCA AAC TTG CAA GAA AGA TTA AGG AGG AAG GAA QL

11. Veicolo di clonazione che comprende - - a oc

O

.l?unit? di DNA secondo la rivendicazione 90 10. oc

r?' * . .. - 12. Veicolo di clonazione secondo la riven -o -dicazione 1 1 , in cui il veicolo di clonazione ? un

r>- J c , ?pi asmi de -?S QQ

co 13* Veicolo di clonazione secondo la ri X

vendicazione 1 1 , in cui il veicolo di clonazione ? -

il plasmile pGW20. . -

14. Ospite che viene trasformato con il vei-

colo di clonazione della rivendicazione 1 1 e produ-

ce gli IFN-G?.61. - - . : -

15. Ospite secondo la rivendicazione 13?

in cui l?ospite ? un procariote.

16. Ospite secondo la rivendicazione 14,

in cui l'organismo ospite ? E. coli.

I

17. Ospite che viene trasformato con il veicolo di clonazione secondo la rivendicazione 13 e produce IFN-c/,61 , in cui l?ospite ? Eccoli.

18. Procedimento per produrre IFN-C\61 consi-I

: stente nel coltivare l?ospite secondo la rivendicazio?ns_ 14_ e nel raccogliere IFN-o(fi1 dalh risu lt ante _coltu-

19. Procedimento per produrre IFN-oCS1

'consistente nel coltivare l?organismo ospite secondo d. la rivendicazione 16 e nel raccogliere IFN-o(.61 dalla 00 'risultante coltura. o :? o 20. Procedimento per produrre IFN-oC61 con- o sistente nel coltivare l?organi smo ospite della ri-: ; o ?vendicazione 17 e nel raccogliere IFN-0C61 dalla ri- o isultante coltura 1 C-i 21 . Composizione f armaceutica comprendente jj una quantit? efficace del polipeptide secondo la rivendicazione 1 , 2 o 5 , mescolato con un_ supporto o veicolo farmac-eu ti c amente accettabile

22. Composizione farmaceutica comprendente una quantit? efficace della composizione secondo la rivendicazione 6 o 8r mescolata con un supporto o vei? colo farmaceuticamente accettabile .

23. Procedimento per fornire terapia a base di interferon ad un essere umano cons?stente nel som? ministrare a detto essere umano una quantit? terapeuti camente efficace del polipeptide secondo la rivendicazione 1 , 2 o 5.

24. Procedimento per fornire terapia a bai

se di interferon ad un essere umano consistente nel sommini strare a detto essere umano una quantit? terapeuticamente efficace della composizione secondo la rivendicazione 6 oppure 8.

25. Procedimento secondo la rivendicazione ; 23? in cui la terapia serve per il trattamento di una infezione virale , per fornire una regolazione di crescita delle cellule oppure una regolazione della produzione di una sostanza prodotta dalle cellule .

26. Procedimento secondo la rivendicazione 24, in cui la terapia serve per il trattamento di una infezione virale , per fornire una regolazione di crescita delle cellule oppure per regolare la produzione ? .. ? ! ? di una sostanza prodotta dalle cellule ,

27. Procedimento per fornire terapia antivirale ad un mammifero consistente nel somministrare al mammifero una quantit? inibitri ce di infezioni virali del polipeptide secondo la rivendicazione 1 , .2 ? 5? . . . /' b Roma, 14 GEN. 1983

p. : CETUS CORPORATION

pe : INO. BAR ZM 01 ?<? Z AN ARDO ROM S.p. A, TA/ cog/885 1 No. di serie: 414054

Data di deposito : 2-9-82

Classe : 424 47 557 i/83 Gruppo No . : 125

Richiedente: MICHAEL A. INNIS, OAKLAND, CA.

DATI DI CONTINUAZIONE . questa domanda ? una continuazione in parte della domanda No. 339.825 depositata

il 15-1-82

DOMANDE DEL PCT/ESTERE........VERIFICATO

Come depositata: Stato o Contea: CA Tavole disegno: 6 Rivend.totali: 27 Rivend.indipendenti: 4 Tassa di deposito ricevuta: $_1_59 No. di praticando! rapp.j^005785-004 Indirizzare la corrispondenza: Bum s, Doane, Swecker & Mathis P.O. Box 1404 Alexandria, VA 22313-1404.

Titolo dell*invenzione:

"ALFA INTERFERON 61"

Si certifica con la presente che l'allegato costituisce copia fedele ed esatta tratta dai Registri dell'Ufficio Brevetti e Marchi degli Stati Uniti della domanda originariamente depositata come sopra identificata.

Per autorit? del COMMISSARIO BREVETTI E MARCHI

F.to: Illeggibile

Ufficiale Certificante

(SIGILLO)

Data: 8 Dicembre 1982

Data :

2 Settembre 1982

- - .. . No...di serie:

. .. _ _ 414054

Titolo dell*invenzione;

_ "ALFA INTERFERON 6.1 "

_ . ^ . ^??iferimento a _domande sullo stesso _

^argomento , _

_ La presente _d_o manda, ?.. una continuaziorLe_?u_

parte-delia domanda US -copendenle~numero~liir~Ser?e ? - ^839--52-5-depoaitata il 15 G-erma-io- 4-9.82-, - -

H_ DESCRIZIONE _

Campo tecnico

La presente invenzione si riferisce al cam-

--po dell-a biot--ec-n-ologia. Pi? partico-larmente,--essa sil?? riferisce ad un polipeptide avente attivit? di inter-

-i-feron (IFN), D-NA--che codi--fica il polipeptide, un vet?--tore ricombinante che comprende il DNA, un organismo; ospite trasformato con il vettore ricombinante che produce il polipeptide, le composizioni farmaceutiche contenenti il polipeptide e le procedure terapeu_ tiche_ in cui il polipeptide trova utilizzazione. _ Tecnica precedente _ _ j _ _ Gli_IFN sono, proteine con attivit? .untivi- _ i _ rale, immuno modulatori a ed antiprolif erativa, prodoti -i- ' ! __?.te._dalle c?LLule dei mammiferi.. in risposta ad una va- _ i : _ riet?. di. agenti induttori (si veda Stewart, W.E. . The . .... Tnterf eron System, Springer-Verlag, New York, 1979). _ L'attivit? di IFN ? largamente specifica in funzioni ne ...della . specie (Colby, C. and Morgan M. J., Ann.Rev. _ Microbio!? 25: 333-360 (1971) e perci? soltanto 1_* IFN _ umano pu? essere usato per studi clini ci_ su gli esseri _ umani._&li_.IPN._umani sono classificati in tre gruppi, _ ...OC ,0e ?_ (Nature. 286:110, (1980)). I geni di IFN- _ ^ J umani, compongono una famiglia di una pluralit? di ge-__ J_ni_ch e h anno in co mun e una omologia di sequenza fra _ I 1' 85# ed il 95# (Goeddel. D.V., et al, Nature 290:20-27 _ ! (1981) Nagata, S. , et al. J. Interferon Research

_ ! _ lj_333? 336 ( 798 1 ).).-.. Diversi geni di IFN-d. sono stati _ ! sottoposti a clonazione e sono stati espressi in E. i

I i coli (Nagata. S. - et . al -, Nature 284:316- -320 (1980...); .1. _.. i Goeddel, D.V., et al, Nature 287:411-415 (1980);

: Yelverton, E., et al, Nucleic Acids Research. 9:731-741 ; (1981); Streuli, M. , et al, Proc Nat Acad Sci (USA). 1

; 78:2848-2852. I risultanti polipeptidi sono stati pui rificati e saggiati per le attivit? biologiche assodate agli H'N umani nativi parzialmente purificati ed hanno dimostrato di possedere analoghe attivit?. In accordo con ci?, tali polipeptidi sono potenzialmente utili come agenti antivirali, immuno modulato ri ed an ti proliferativi.

Uno scopo principale della presente invenzione consiste nel fornire un polipeptide avente attivit? di interi eron, il quale viene prodotto da un organismo trasformato con un gene di IFN-ck da poco isolato e da poco caratterizzato. Questo polipeptide qualche volta viene riferito nella presente descrizio-#

ne come IPK-cL 61. Altri scopi dell'invenzione sono diretti alla realizzazione delle composizioni e degli organismi che sono usati per produrre questo polipeptide ed alle composizioni terapeutiche ed alle procedure nelle quali questo polipeptide viene usato come principio attivo.

Esposizione dell'invenzione

Un aspetto dell'invenzione consiste in un polipeptide avente attivit? di interferon e comprendente la sequenza di amminoacidi:

Cys AspLeuProGln ThrHisSerLeuSer AsnArgArgThrLeu MetlleMetAlaGln MetGlyArglleSer ProPheSerCysLeu LysAspArgH isAsp PheGlyPheProGln GluGluPheAspGly AsnGl nPhcG 1 nLys AlaGlnAlalleSer ValLeulIisGluMet I leGl nGl nTh rPhe As nGeuPheSe rTh r LysAspSerSerALa Th rTr pAs pG 1 uTh r LeuLeu AspLysPhe TyrThrGluLeuTyr G 1 nG 1 nPeuAs nAs p LeuGluAlaCysMet MetGlnG?uVa lGIy Va IG 1 uAs pTt? r. P r o LouMo tAs nVa lAsp Seri leLe uTh rVa 1 ArgLysTyrPheGI a ArgI le'PhrLeuTyr LeuThrG luLysLys TyrSe rProCysA la TrpG luVa '.Va lAv g AlaGlul leMetArg Se rPheSe rPouSe r AlaAs nLeuGl nGlu ArgLouArgArgLys Clu

i

I_ Un secondo aspe tto dell* invenzione ? co- _ i

i_st i tu ito_da_ un .frammento _od.juni.t? _di_ .DNA.compre nden- _ *

' te una_ se quenza_di nucleo tidi_che codifica il. poli pop -! . ; l ti de precede n t e me nt e de scritto. _ _ _ i _ I ? | , _ Un terzo aspetto dell1 invenzione h costi- _ j tuito da un ve ttoreo v ei co lq__di_clo_nazi one .che c om- _ ! prende_ il DNA precedentemente deaeri tto. _ _ [ _ [ _ Un quarto aspe tto dell ' i nvenz i one J> co s t i-4 _ i ' _ tu i t o _d a_un o r gan i s mo o sp i t e i l qual e vi ene _tr as f o r- _ ^ mato con il veicolo di clonazione precedentemente de-1 . ' ? ~ ?

! scritto e che produce il polipeptide precedentemente-'?

! j j mente descritto. _ j _ _ Un quinto aspe tto dell'invenzione ? costi-__tu i to da un procedi mento per pr? dur re __il_ poli p_ept_i de ? i j prec edentement e descritto consistente nel coltivare _ ; detto organismo ospite trasformato e nel raccogliere _ 1 il polipeptide dalla risultante coltura.

> \ _ Un altro aspetto dell' invenzione ? cos ti- _ ! ^ 1 tuito da una composizione farmaceutica avente atti- _ ?

vita di interferon comprendente una quantit? efficace del polipeptide precedentemente descritto mescolato con m supporto farmaceuticamente accettabile.

Ancora un altro scopo dell?invenzione ? costituito da un procedimento per fornire terapia a ' base di interferon ad un essere umano consistente nel somministrare all* essere umano una quantit? terapeui ! ticamente efficace del polipeptide precedentemente descritto. _ _ .

_ ... Breve descri zione dei di segni _ _ La figura 1 rappresenta una mappa di restri 1 zione parziale che mostra i due siti o posizioni di ' restrizione XhoII che produce un frammento di DNA a i 260 coppie di base omologo dai geni strutturali di j IFN-C\ 1 ed IFN-Q^ 2. I dati relativi a questa mappa , i sono ricavati da Streuli , M. , et al Sci ence, 209 : 1343-1347 (1980). _i La figura 2 rappresenta la strategia di impostazione delle sequenze usata per ottenere la sequenza completa di DNA della regione di codifica-!

.

! zione del gene di IFN-C^61 . Il batteriofago mp7:c^6l-1 DNA ? servito come base d? partenza per le sequenze^ ottenute con gli agenti innescanti A, H e ? ed il j batteriofago mp7:oL.6l-2 DNA ? stato usato come base di partenza per le sequenze ottenute con gli agenti : ! innescanti E e G. L'area a tratteggio incrociato del gene rappresenta la regione che codifica il polipeptide di segnale a 23 amminoacidi ed il riquadro aperto ' rappresenta la regione che codifica il polipeptide ' maturo. La scala, in coppie di base , ? numerata con 0 che rappresenta il codone di partenza di ATG del i

!

- 6 - !

1

>

preinterf eron. Le frecce indicano la direzione e la

-estensione delb, sequenza ottenuta con ciascun agente

j innescante. j

I 1

, La figura 3 rappresenta la frequenza di

nucleotidi del gene strutturale che codifica L' IFN-0C61 comprendente alcune delle regioni collaterali 51 ? e

3* - non codificanti del gene. La codificazione di 1

regione per il preinterferon e per il polipeptide maturo inizia con il codone di ATG? nella posizione 92

| s

j e termina con il codone di TGA nella posizione 659.

La figura 4 rappresenta una mappa di restri?

zione parziale della regione di codificazione del gene di IFN-C?61 . Il doppio tratteggio rappresenta la

! :

! regione che codifica il peptide di segnale da 23 am-!

! minoacidi ed il riquadro aperto rappresenta la se- ;

% i quenza di codificazione del gene per il polipeptide

! ' I

maturo . La scala, in coppie di base, ? numerata con

0 che rappresenta il codone di partenza di ATG? del :

l preinterferon. |

j La figura 5 rappresenta la sequenza di am-

? i minoacidi del polipeptide di segnale da 23 amminoaci-! d? e dell* IPN-C4.61 maturo con 166 amminoacidi codifii cato dal gene rappresentato nella figura 3? La se-1 ;

; quenza di 189 amminoacidi ? presentata al disopra

i della corrispondente sequenza di nucleotidi . Lf amm?

nqacido 24,_cisteina, ? il primo amminoacido della proteina di IFN-c(61 matura. _ _ _ _ j _ La figura 6 rappresenta la sequenza di DNI del promotore di_trp E.coli ed il gene della figura h stato inserito fra i siti EcoRI ed Hindili del pldsmide pBW-11? La sequenza di amminoacidi deHt figura] 5 ? scritta al disopra della corrispondente sequenza di DNA e la posizione dei siti di restrizione usati j nella c ostruzio ne d e_l plasmi de di espressi one _? i nd i -cata.

La figura 7 rappresenta un diagramma del i _ plasmide di espressione pGW2Q. _ _

_ j _ ?<todi per eseguire 1T invenzione _ _ _

' In termini generali , 1* IFN-oi61 ? stato pro-?!dot 'to "mediante identific "azione ed isolament .o de .l gen |e ,di IFN-?.S1 mediante valutazione di una biblioteca q . | j ' libreria di DNA genomico umano con una appropriata ; i - - -sonda di DNA di IPN? ?(, , costruzione di un vettore J contenente il gene di IFN-ol61 , trasformazione dei _ j _ I microorganismi con il vettore, coltivazione dei tra-? _ sformanti che esprimono IFN-?\ 61 e raccolta di IPN-c?p1 1 = - ' i ? dalla coltura.Una preferita forma di realizzazione di questa procedura verr? descritta nel seguito.

!

_ Preparazione della sonda di DNA ^

Il RNA citoplasmi co totale ? stato estratto ? dalle cellule linfoblastoidi umane Namalwa, che erano ! state indotte per la produzione di IFN mediante trattamento preliminare con 5-bromodeossiuridina (Tovey, ; M. G. , et al, Nature 267:45 5? 457__ (.1.977) ) e con il virus | Newcastle Disease Virus (NDV) . Il HNA messaggero contenente poli (A) (acido poliadenilico) (mRNA) ? stato ; isolato dal detto RNA totale mediante cromatografia I

su oligo (dT)-cellulosio (tipo 3 da Collaborative ' Research; Avivi , H. , e Leder, P. , Proc Nati Ac ad Sci ! (USA) , 69 : 1408-1412 ( 1972) ) ed arricchito per mRNA ! di IFN mediante centri fugazione a gradiente di densit? su gradienti di saccarosio fra il 5$ ed il 20$. ? Le frazioni contenenti mRNA di IFN sono state identi-! ficate mediante traslazione di detto mRNA mediante ? j mi ero iniezione di aliquote di ciascuna frazione in oociti Xeno pus e determinando l'attivit? di IFN dei ! prodotti delle operazioni di traslazione in conformit? ad una procedura descritta da Colman, A. , e Morser, ! J. , Celi. 17: 517-526 ( 1979) .

Detto mRNA arricchito di IFN umano delle ^ cellule Namalwa ? stato usato per la co struzione di _ : cloni di DNA complementari (cDNA) in E, coli mediante la procedura di prolungamento G/C usando il sito PstI ! del vettore di clonazione pBR322 (Bolivar, F. , et al, ? Gene, 2:95-1 13 ( 1977) ) . Una popolazione di trasformardi quattro di questi cloni sono ri sultate omo lo ghe _ |_alle jnp_te__sequenze_ di__DNA_ di . IFN-A?..,. .11 clone mp7:0C-260, con una sequenza di DNA identica al .DNA _d?_IFN-oll _ (Streuli, M,_,_e t _al Science ,..209: 1343-1347- ( 1980) )_.. h.

t ? 1

; stato scelto come sonda di ibrjdizzazione altamente _

! specifica per la i dentiti caz ione .di__u.lt e ri ori . se qu eni 1

; ze di DNA di _IFNr.ot. ? . Questo clone verr? nel. .seguito .

i riferito come _ '_'_so_nda . di__260 ?

Valutazione della biblioteca di DNA genomico i _ _A_llq_scopo___di .isolare altre .sequenze del . ge-I

i ne di IFN-Q{ , ura sonda 260__e_ti che.ttata. con _ P ? sta-!

I

Uba_.us ata pe r la valuta zi one__d i . una. li br e r ia. . o b i b li o Titoli a__di_.J)M3 genomico umano mediante ibridi zzazione

? in.. situ . _LajDanc.a_.del_ gene, umano, ..preparata ..da . Lawn, ! R. M. et al. Celi. 15 : 1 157-1174 ( 1978) .? stata .gene- _ i rata mediante scissione p_arzi.ale?d.el__ DNA.u mano .fe.t a~_... I le con HaelII ed AluI e sottoposta a clonazione nel_

! ! Zatteriofago 7V. Charon. 4A con ..agenti .concatenanti _di .

1 EcoRI sintetici. Sono, stati .valutati , approssimativa- _ mente 800.000 .cloni . dei . quali, c ire a__160 _ ibri di zzavamo con sonda. 260. Ciascuno dei 160 cloni ? stato ul-? teriormehte caratterizzato dalla mappatura con enzi-; ma di restrizione e confronto con le mappe di restrizione pubblicate relative a 10 geni di IFN Cromosomi-Zi (Nagata, S. , et al, J Interferon Research. . 1 : 333ti contenenti approssimativamente 50.000 cloni di '

| cDNA individuali ? sbata fatta crescere su un litro ;

" i del me zzo di_ coltura per tutta la notte ed il INA del ^Lasmi de totale ? stato isolato.

J. _ Le sequenze di 2 cloni di IFN-cJ- ( IFN-cO e IFN-C^.2) sono state pubblicate (Streuli ,.. MVf__e_t..al, J__ Science . 209 > 1343?^347 (1980)) . L* esame delle sequenze di DNA di questi due de ni ha rivelato che l'enzi- _ ma di restrizione XhoII separerebbe un frammento di ? i 260 bp dal gene di IFN-^1 oppure dal gene di IFN-t^2 _ si veda la figura 1). L?enzima XhoII ? stato prepa- :

I

I

rato in conformit? con il procedimento descri tto _ _ i da Gingeras, T.R. e Roberts, R.J.. J. Mol Biol, _ !_ 1 18 : 113- 122_(1978)_ '. _ _ ~ T~

Un mg del preparato di DNA di plasmide toi tale purificato ? stato digerito con XhoII ed i framt "" . ' ? ? i" ? menti di DNA sono stati separati su gel di poli acri 1-ammide al Qfo preparativo. Il DNA proveniente dalla re gione del gel che corrisponde a 260 bp ? stato r i -cupe rato jne di ante elettroeluizi one e sottoposto nuovamente a clonazione mediante l?gamento nel sito di BamHI del batteriofago a singolo filamento m!3; mp7. Trentasei cloni sono stati prelevati a caso , il DNA i

? a singolo filamento ? stato .isolato da essi ed il . DNA e stato ordinato in sequenza. Le sequenze di DNA 336 ( 1981 )) . Uno dei cloni, batteriofago ibrido \ 4A:e^61 contenente un inserto di 18 kb e stato caratterizzato come segue . Un preparato di DNA di 7^4A:d.61 ? stato scisso con HindlII, BglII, ed EcoHI rispettivamente/ i frammenti sono stati separati su gel di agarosio, ? ?' i ? ? trasferiti ad un filtro alla nitrocellulosa (Southern, ;E. M. , J Mol Biol, 98: 503-517 ( 1977) ) ed ibridi zzati ( l o

|con sonda 260 etichettata o marcata con P. Questa procedura ha localizzato il gene di IFN-c<61 ad un ! frammento di restrizione di BglII da 1,9 kb che ? st ?a .-ito quindi isolato e sottoposto a nuova clonazione, [in ambedue gli orientamenti, mediante legamento del tf rammento in m13 :mp7 scisso con B amili. I due subdo T li sono stati designati con mp7:<*j61-1 e con mp7:(^61-2. ! 7 ! ila designazione -1 indica che il batteriofago a singo-,lo filamento contiene DNA di inserto complementare

? ~j lai mRNA (il filamento negativo) e la designazione j ;-2 indica che il DNA di inserto presenta la stessa isequenza del mHNA (il filamento positivo).

Sequenza del gene di IFN-/?(61

La tecnica di dideossi di Sanger ? stata usata per determinare la sequenza di DNA del gene di IPN-t?(61. La strategia impiegata ? rappresentata sche-I

maticamente nella figura 2, la sequenza d? DNA cos? ottenuta ? indicata nella figura 3 ed una mappa del

- 12 -

1* enzima di restrizione parziale del gene di IFN-c(61 _?_ i llusjtr ata_ ne 1 la fi gura 4 ? P i ver same nte da_mo Iti geni prelevati da organismi eucariot ici ,, ma analo ghi_ _ad__alt ri geni cromo so mi ci di IFN che sono stati caj ratt eri zzati, la sequenza di DNA di que sto gene di mostra che esso manca di intron. La omolo gi? ^^ informazione relativa alle sequenze proteiche da que sti j noti geni di TFN-CH. ha reso po s si b ile di determinare il corre tto_ quadro di le ttura di jtraslaziqne _e_ per- _ !

_ ci? ha pe rmesso di prevedere 1* intera sequenza di _ _ 166 aromi noacidi dell* IFN-oSjSl partendo dal la sequenza di DNA , come anche un segmento precur sore o po lipeptide di segnale di 32 amminoacidi (figura 5). _ / _ _ La sequenza di DNA del gene di IFN-o(61 ' ? la sequenza di amminoacidi prevista sulla base di I esso differiscono sostanzialmente da altre note se-| quen ze di DNA di IFN-oC e di aromi noac i di di IFN? U. . j A que sto ri guardo^ Go eddel , D. V. , e t al^ Nature ( 1981 ) i 29P: 20-2 6 descrive le_ sequenze^ di _DNA di un_ clone _ _

I

di cDN A di IFN p ar zi ale , de s ijgn ato_ Le XF - La se- _ quenza del clone parziale h simile all* estremit? 3* della sequenza di DNA dell f IFN? 0^61 , eccetto per una variazione dei nucleotidi nel codone per Camminoacido .128.. In. c. .onfr.onto con il clon *e parziale, il gene di IFN-o^61 contiene ulteriore DNA che codifica i primi 33 amminoacidi di IFN-Q(61.

.

j _ Preparazione del plasmide e trasformazione ? t

_ [ dell1 03pite _ _ _ _ _ _ _

_ _ La combinazione del plasmide per l?espres- _

sione diretta del gene di IFN-C?(61 implicava la sosti-! ' . ".. ' ' ' ' . . j J ]tu.zi ?one del frammento di DNA ch -e codifica il polipep-_ tide di segnale di 23 amminoacidi del preinterf eron ! _

con un frammento di promotore di EcoRl/5au3A da 120 ! ? < ^

bp (promotore di trp di E. coli, operatore e aito di

iifi ss.aggio . del rib.osoma anteriore - .di tr-p c..h.e p.r.e.cede- j;? -_ [un codone _di_ inizio di ATG)_ ed_ impiegando il sito dl_ _ j Hindi II che _ ? stato inserito , 59 nucleotidi 3'- del

. ~ ' ? ' .. . ?? . . ' ? ' " "? _ codone di arresto di traslazione di TGA, per inser?- _

! _ jre il gene nel plasmide pBW1 1 _ (un derivato di pBR322' _

_ avente una cancellazione fra i_ siti di HindlII e PvuII) . F .. ? ? _iLa sequenza comple ta del DNA dei frammenti di promo- _ i ? ? ? ? " . " " ? 'tore e di gene inseriti fra i siti EcoRI^ed HindlII 1 _

_ -del pBWl 1 _ h rapresentata nella figura 6 la quale mo- _

_ !stra anche la posizione esatta dei siti di clonazione _

_ rilevanti . I dettagli della costruzione sono descritti _ ; I nel seguito .'

- i - 1 | _ _ La regio ne di codificazione pe r l1 IFN-o(6 1 _ i

_ maturo presenta tre siti di SaujA . uno dei quali si' _ ! 1 __ trova fra i codoni per gli amminoacidi 2 e 3. Un sito

di HindlII sintetico ? stato inserito 59 nucleotidi ! 3*- della regione di codificazione e la risultante ' costruzione , ? stata sottoposta ad ma digestione con ! !HindIII/S?u3A parziale. Un frammento di 560 bp e stato isolato dal prodotto di digestione. Questo fram- ! . _ . ? . - ? - . . ' " . 1 mento ed un frammento del promotore di? E. coli da EcoSI a Sau3A da 120 bp sono stati legati insieme in un

? legamento diretto a tre vie nel sito da EcpHl a HindlII i del pBWl1. Il frammento del promotore conteneva un ; sito di restrizione di HindlII sintetico, un codone ? di inizio di ATG, un codone cisteina iniziale (TGT) ; ? I comune a tutti i noti IFN-o( ed una "estremit? collosa" i di Sau3A. Il miscuglio di legamento ? stato usato per trasformare E. coli MK294 (Backman, K. , et al, Proc Nati Ac ad Sci (USA) 73:4174-4178 ( 1961 ) ) . I de side? [rati prodotti corretti di trasformazione , 8 sui 24 j valutati, sono stati identificati mediante la mappaitura con enzimi di restrizione delle colonie che for-! mavano ibridi in modo da dar luogo ad un frammento | , 32 i ?genomico. di IFN-o\marcato con P. La figura 7 rappre-; senta un diagramma del plasmide di espressione finale 'ottenuto , che ? designato con pG\V20. Altri ospiti procariotici, per esempio batteri diversi da E, coli, possono naturalmente essere trasformati con questa oppujre altre convenienti costruzioni per replicare il gene di IFN- .61 e/o per produrre IFN-d.61.

L* IFN-jySI prodotto in conformit? con l*inj venzione si ri tiene che sia distinto dalla corrispondente proteina nativa sotto diversi aspetti . In primo i luogo, poich? il gene di IFN-c?61 ? stato espresso .

I da ospiti batterici che utilizzano N-formil-metionina e/o meticnina per iniziare la traslazione, alcune opj pure tutte le molecole di IFN-OtS1 prodotte per via | i I batterica sono precedute da un gruppo di metionina 1 [o di N-formil-metionina. Una parte dei gruppi di me? I ? tionina o di N-formil-metionina potrebbero essere

[ rimossi mediante meccanismi di scissione batterica

; naturali in vivo . Ci? comporterebbe un miscuglio di j

mlecole , alcune delle qu?L? potrebbero includere un

| gruppo iniziale di metionina o di N-forndl? metionina . diversamente da altre. Tutte . que ste molecole di IFN-0L 61 '.quelle contenenti un gruppo iniziale di metionina o . . di N-formil-metionina, quelle non contenenti metionina ,_o .N-formil-metionina ed un qualsiasi loro miscuglio sono comprese nella presente invenzione . In secondo . luogo; i residui di amm?oacidi del polipeptide pr?- . do tto per via batterica sono non sostituiti , mentre . . 1 residui della proteina nativa possono essere sostituiti con gruppi di zucchero , ACTH oppure altre frazioni. Inoltre, gli estratti di IFN-c^-nativo consistono di miscugli di varie molecole di IFN mentre

detto IFN-?j51 prodotto per via batterica ? omogeneo;

i in altre parole , 1* IFN-c<61 prodotto per via batterica non contiene polipepti di in relazione funzionale.

I

In accordo con ci?, l?invenzione prevede di produr? . ?re composizioni contenenti IFN-o(61 aventi attivit? : ! . . . . . . ^ " ; ' ! biologi ca_ che pu? essere attribuita semplicemente |_a IFN-Q^61_e/o ai suoi derivati contenenti gruppi ter-! i [ minali di metionina o N-forrail-me tionina.

; ? ? "V T ? " ! _ _ Coltivazione dei trasformanti j I batteri trasformati con il gene di IPN-CL51 possono essere coltivatjdn un appropriato mezzo di

l jirescita, per_esempio_un mezzo essenziale minimo, che soddisfi le esigenze jiut riti ve ed alt re esigenze necessarie per permettere la crescita dei batte? ri e la produzione di IFN-(Jj51 . Se i batteri sono tal i_ che la proteina ? contenuta nel loro cito plasma., de tto IPN-oL?l pu? essere estratto dalle cellule mediante lisi delle cellule, per esempio con trattamento soni* co e/o trattamento con un agente solubili zzante anionico forte, per esempio sodio dodecilsolfato. Ulte? ' riore purificazione dell?estratto pu? essere ottenuta mediante cromatografia per affinit?, elettroforesi oppure altre tecniche di purificazione delle proteine.

Saggio biologico di IFN~O(61 .

I prodotti con trattamenti sonici delle cellule contenenti IFN-dt61_ sono stati saggiati in vitro ed hanno dimostrato di avere le seguenti attivit?: ( 1 )' inibizione della r .ep .licazione . virale ~ del ' i i virus di stomatite vesicolare (VSV) e del virus -1 di herpes_simplex (HSV-1 ) ; (2) inibizione della cresci-! ta delle cellule tumorali; (3) inibizione della formazione di colonie dalle cellule tumorali in agar morbi-! do ; (4) attivazione delle cellule Killer (di soppressione ) naturali (NK) ; (5) esaltazione del livello di ?2*-5 ,-oligoadenilato sintetasi (2* , 5 * ?A) ; e (6) esal-I

tazione della cinasi proteica dipendente da SNA a dop-!pio filamento. I prodotti ottenuti con trattamenti so-1 ? . I jnici sono risultati attivi nell* inibizione delle infezioni virali sia nelle cellule degli esseri umani isia nelle cellule di altri mammiferi , per esempio 'criceto, scimmia, topo e cellule di coniglio.

I

j _ I saggi dimostrano che detto IFN-^61 presenta attivit? antivirale contro i viius di DNA e di SNA, l? attivit? di regolazione della crescita delle cellule ed una capac it? di regolare la produzione degli enzimi intracellulari ed altre sostanze prodotte dalle cellule . In accordo con ci?, si prevede che l? IPN-o^bl possa essere usato per il trattamento delle infezioni virali con potenziale per l? terapia a base di interferon, per esempio l?infezione della epatite cronica B, le infezioni oculari, locali o si stemiche da herpes virus, le infezioni dal virus dell'influenza ed altre infezioni del tratto respiratorio di origine virale ,

j le rabbie ed altre aonosi virali, le infezioni da arbovirus e le affezioni da virus lento, per esempio Kuru e la panencef alite scleroti zzante. Tale preparato pu? anche essere utile per il trattamento delle . infezioni virali in pazienti immunocompromessi , per ' i esempio herpes zoster e varicella, ci tome gaio virus, infezioni da vi rus di Epstein-Barr, infezioni da

-4 herpes simplex, rubella e leuco encefalopatia mul tifocale progressiva. La sua attivit? di regolazione della crescita delle cellule lo rende potenzialmente utile j per il trattamento di tumori e cancri , per esempio j sarcoma osteogenico , mieloma multiplo , morbo di Hodgkin, linfoma nodulare scarsamente differenziato , leucemia I linfocitica acuta, carcinoma del seno, melanoma e carcinoma naso faringe ale , Il fatto che detto IFN- 0461 aumenti la cinasi proteica e la 2' , 5'-oligoadenilato r~

sintetasi indica che esso pu? anche aumentare la sintesi di altri enzimi o sostanze prodotte dalle cellu

? le comunemente influenzate dagli IFN, per esempio

; i stammina, acido ialuronico , pr? stagi andina E, tHNA metilasi ed arii idrocarburo idrolasi. Analogamente, esso pu? essere utile per inibire gli enzimi comunemente inibiti dagli IFN, per esempio tirosina amminotransf erasi , glicerol-3-^fpsfato deidrogenasi, glutammina sintetasi, omitina decarbossilasi, S-adenosil? 1? metionina decarbo ssilasi ed UDP? N-acetilglucosamraina? dolieoi monofosfato transferasi. La capacit? di detto IFN-o(61 di stimolare lf attivit? delle cellule NK ? indicativa del fatto che esso pu? anche possedere altre attivit?, per esempio la capacit? di indurre attivit? dei macrofagi e la pro duzione di anti corpi e di influenzare le alterazi oni superf iciali delle cellule, per esempio le vari azioni della densit? della membrana del plasma oppure la carica superficiale delle cellule , una modificata capacit? di fissare le sostanze, per esempio la tossina del colera, la i concanavalina A e l'ormone di stimolazione della tiroi-* !

; de e variare l? esposizione dei gangliosidi superfii

ciali.

i_ Le composizioni farmaceutiche che . contengoj

no gli IFN-C?61 in qualit? di ingrediente o principio ., .attivo normalmente saranno formulate con un approprialo supporto liquido o solido dipendente dal parti co-. . ; ? lare modo di somministrazione che viene usato. Per esempio, le formulazioni parenteral? sono usualmente costituite da fluidi iniettabili che utilizzano fluidi farmaceuticamente e fisio?gicamente accettabili , per esempio soluzione salina fisiologica, soluzioni

i saline bilanciate o simili, in qualit? di veicolo.

Le formulazioni orali, d?altra parte, possono esse-,

. . . ' ' ' . . . ' ' I '

re solide, per esempio compresse o capsule, oppure sospensioni o soluzioni liquide? L? IFN-0L61 usualmente . i sar? formulato come dosaggio unitario che contiene > nell?intervallo fra 10 4 e 10 7 unit? internazionali i

! pi? usualmente fra 10'" e 10 * unit? intemazionali per dose.

Detto IFN-oC61-pu? essere somministrato | agli esseri umani in varie maniere, per esempio per. via orale , endovenosa, intramuscolare, i nt rape rito ne ale , intranasale , intradermica e sottocutanea. Il particolare modo di somministrazione ed il regime di ! do saggio saranno scelti dal medico curante tenendo ; conto dei particolari del paziente, della affezione e dello stato della affezione implicato. Per esempio , le infezioni virali sono trattate usualmente con dosaggi giornalieri o due volte al giorno per alcuni ! giorni fino ad alcune settimane ; mentre il trattamen-: to dei tumori o dei cancri implica dosaggi gioma-> li e ri o multi giornali eri per mesi oppure anni. La te-; rapia a base di IFN-c(61 pu? essere combinata con al-!

! tri trattamenti e pu? essere combinata oppure usata j in associazione con altri agenti chemioterapeutici ! o chemiopreventivi per fornire una terapia contro ! ? S ] le infezioni virali , le_ formazioni neoplastiche op~ ' pure altre condizioni contro cui tale preparato ? J efficace. Per esempio , nel caso del trattamento del-j-! ._la. che rati te _da virus _ .herpes, , la. terapia con IFN ? j..

J

stata integrata da terapia. .con., termocauterio , sbri- .

? giramento e tri flu ?oro timidina. ~ _ - _ - . _ . _ _ Modificazioni dei modi precedentemente

I

? descritti . per la esecuzione dell* invenzione , . per _ [. ^ esempio senza limitazione l'uso di vettori alterna-, 1 , * ] . ^ tivi , alternativi . sistemi di controllo di espre ssio-J ne nel vettore ed alternativi microorganismi ospiti , 1 1 1 ed altri "usi terapeutici od associati di IFN-**? 61 ! i i che sono ovvi a coloro aventi normale esperienza nel _ campo della biotecnologia, farmaceutico, medico e/o ; in campi associati, sono da interpretare come rientranti nell' ambito delle seguenti rivendicazioni . _! ! RIVENDICAZIONI ! _ 1. L Polipeptide avente attivit? di. interfe-.. ron e comprendente la sequenza di amminoacidi :

CysAspLeuProGln ThrHisSerLeuSer AsnArgArgThrLeu MetlleMetAlaGln MetGlyArglleSer ProPheSerCysLeu LysAspArgHisAsp PheGlyPheProGln GluGluPheAspGly AsnGlnPheGlnLys AlaGlnAlalleSer ValLeuHisGluMet IleGlnGLnThrPhe AsnLeuPheSerThr LysAspSerSerAla ThrTrpAspGluThr LeuLeuAspLysPhe TyrThrGluLeuTyr GlnGlnLeuAsnAsp LeuGluAlaCysMet MetGlnGluValGly ValGluAspThrPro LeuMetAsnValAsp SerlleLeuThrVal ArgLysTyrPheGln ArglleThrLeuTyr LeuThrGluLysLys TyrSerProCysAla TrpGluValValAr g AlaGluIleMetArg SerPheSerLeuSer AlaAsnLeuGlnGlu ArgLeuArgArgLys Giu

_ 2? JPq.llpeptide secondo la .rivendicazione i .? ,.,?? cui il polipeptide consiste essenzialmente di ; detta, sequenza .di_amminoaci di . _

_ 3....Polipeptide secondo. _la_ rivendicazione.

1 o 2. in cui il residuo di__cisteina. iniziale, della ] i sequenza di amminoacidi ? preceduto da un gruppo.._diJ N-formil-metionina. _ . _ j _ _

_ 4? Polipeptide secondo la rivendicazione _ ! 1 0 2, in cui i residui di animino ac idi di . dett a_s_e-J quenza sono non sostituiti. ? ? i _ 5. IFN? oL 61 . _ ! _ 6. Composizione avente attivit? di interfe-. ! ron e comprendente un mi s cu gl io di ; _ _ j _ a) un polipeptide avente la sequenza di amminoacidi : _

CysAspLeuProGln ThrHisSerLeuSer AsnArgArgThrLeu MetIleMetAlaGln MetGlyArglleSer ProPheSerCysLeu LysAspArgHisAsp .PheGlyPheProGln GluGluPheAspGly AsnGlnPheGlnLys AlaGlnAlalleSer ValLeuHisGluMet IleGlnGlnThrPhe AsnLeuPheSerThr LysAspSerSerAla ThrTrpAspGluThr LeuLeuAspLysPhe TyrThrGluLeuTyr GlnGlnLeuAsnAsp LeuGluAlaCysMet MetGlnGluValGly ValGluAspThrPro LeuMetAsnValAsp SerlleLeuThrVal ' ArgLysTyrPheGln ArglleThrLeuTyr LeuThrGluLysLys TyrSerProCysAla TrpGluValValArg AlaGluIleMetArg SerPheSerLeuSer AlaAsnLeuGlnGlu ArgLeuArgArgLys Giu

_ b) un polipeptide avente detta sequenza di j amminoacidi , , in cui il re siduo di ciste ina iniziale della sequenza e preceduto da un gruppo di rnetionina o di N-formil-metionina. _

7. Composizione secondo la rivendicazione : 6, in cui i residui di amminoacidi di detta sequenza I

sono non sostituiti . (

_ 8 _ . C _o . mpo -sizio .ne .. avente atti . .vit? d .i int . er- ~ ; j feron comprendente un polipeptide avente la sequenza . ? i di amminoacidi:

CysAspLeuProGln ThrHisSerLeuSer AsnArgArgThrLeu MetlleMetAlaGln MetGlyArglleSer ProPheSerCysLeu LysAspArgHIsAsp PheGlyPheProGln GluGluPheAspGly AsnGlnPheGlnLys AlaGlnAlalleSer ValLeuHisGluMet IleGlnGlnThrPhe AsnLeuPheSerThr LysAspSerSerAla ThrTrpAspGluThr - LeuLeuAspLysPhe TyrThrGluLeuTyr GlnGlnLeuAsnAsp LeuGluAlaCysMet MetGlnGluValGly ValGluAspThrPro LeuMetAsnValAsp SerlleLeuThrVal _ ArgLysTyrPheGln ArgIleThrLeuTyr LeuThrGluLysLys.TyrSerProCysAla TrpGluValValArg AlaGluIleMetArg SerPheSerLeuSer AlaAsnLeuGlnGlu ArgLeuArgArgLys Giu

! oppure un miscuglio di detto polipeptide e di un po?

' ? . . . . .

j lipept-ide avente detta sequenza in cui il residuo di lei steina ini ziale ? preceduto da un gruppo di metio-!nina o di N-formil-rae tionina, in cui Cattivit? di ? interferon della composizione pu? essere attribuita : a detto polipeptide oppure a detto miscuglio.

! 9. Unit? di DNA consistente di una sequenza i ? " '

jdi nucleotidi che codifica il polipeptide delh rivenidicazione 1 o 5.

10. Unit? di DNA secondo la rivendicazione ! 9f in cui la sequenza di nucleotidi ?:

(segue tabella)

TGT GAT CTG CCT CAG ACC CAC AGC CTG AGT AAC AGG AGG

ACT TTG ATG ATA ATG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CCT

_ TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCT -CAG GAG GAG TTT GAT GGC AAC.CAG TTC CAG AAG GCT CAA

" GCC ATC TCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC

AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT ACT TGG GAT _

GAG ACA CTT CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTT TAC CAG

- . CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT ATG ATG CAG GAG GTT

?j GGA GTG GAA GAC ACT CCT CTG ATG AAT GTG GAC TCT ATC _

CTG ACT GTG AGA AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT CTC TAT

- CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCA TGG GAG GTT

GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTA TCA GCA _ __

% AAC TTG CAA GAA AGA TTA AGG AGG AAG GAA

'? . I :

_ { _ _ . 11. Veicolo di . clonazione che comprende - - - ? -i ,

_ ;l!unit? di DNA secondo la rivendicazione 9 o 10. -

12. Veicolo di clonazione secondo la riven? - - -

i ? |

idicazione 1 1 , in cui il veicolo di clonazione ? un -1 I

I

iplasmide. - - - - -- - ? - . - - . ; ? .

? _ - - 13. Veicolo di clonazione secondo la ri-

_ vendicazione 1 1 , in cui il veicolo di clonazione ?

. ? il plasmide pGW20. ? - - - -

_ l _ _ 14. Ospite-che viene trasformato con il vei -

_ ?colo di clonazione della rivendicazione 1 1 e produ- -

. ce gLi IFN-ci.61 . ? -- ? ? - . -

. . . . 15. Ospite secondo la rivendicazione 13,

in cui l*ospite ? un procariote.

16. Ospite secondo la rivendicazione 14,

in cui 1 ?organismo ospite ? E, coli.

17. Ospite che viene trasformato con il veicolo di clonazione secondo la rivendicazione 13 e produce IFN-gL61 , in cui l'ospite ? E. coli.

18. Procedimento per produrre IFN-?61 consistente nel coltivare l'ospite secondo la rivendi cazio* ne 14 e nel raccogliere IFN-<XjS1 dalla risultante coltura.

19. Procedimento per produrre IFN-c461 consistente nel coltivare l'organismo ospite secondo la rivendicazione 16 e nel raccogliere IFN-o(.61 dalla 'risultante coltura.

20. Procedimento per produrre IFN-o(61 consistente nel coltivare l' organi smo ospite della ri-[vendicazione 17 e nel raccogliere IFN-<X-61 dalla risultante coltura.

21. Composi zione farmaceutica comprendente una quantit? efficace del polipeptide secondo la rivendicazione 1 , 2 o 5 , mescolato con un supporto o vei-;colo farnac-euticamente accettabile.

22. Composizione farmaceutica comprendente una quantit? efficace della composizione secondo la rivendicazione 6 o 8, mescolata con un supporto o veicolo farmaceuticamente accettabile.

23. Procedimento per fornire terapia a base d? interi eron ad un essere umano consistente nel som

- 26 -

ministrare a detto essere umano una quantit? terapeu? ti camente efficace del polipeptide secondo la rivendi j cazione 1 , 2 o 5.

24. Procedimento per fornire terapia a base di interferon ad un essere umano consistente nel j somministrare a detto essere umano una quantit? tei rape ut i carne n te efficace della composizione secondo la rivendicazione 6 oppure 8.

25. Procedimento secondo la rivendicazione 23* in cui la terapia serve per il trattamento di una infezione virale , per fornire una regolazione di cref

' scita delle cellule oppure una regolazione della produzione di una sostanza prodotta dalle cellule .

26. Procedimento secondo la rivendicazione ' 24, in cui la terapia serve per il trattamento di una ' infezione virale , per fornire una regolazione di cre-| scita delle cellule oppure per regolare la produzione j

' di una sostanza prodotta dalle cellule.

I

| 27. Procedimento per fornire terapia anti-,

Svirale ad un mammifero consistente nel somministrare al mammifero una quantit? inibitrice di infezioni virali del polipeptide secondo la rivendicazione 1 , 2 o 5.

Titolo:

"ALFA INTERFERON 61 "

RIASSUNTO

Oggetto dellfinvenzione ? un nuovo polipeptide, denominato ???-<? 61, prodotto da E. eoli trasformato con un gene di XPET-c^,umano da poco isolato e caratterizzato. Il polipeptide presenta attivit? di interferon, per esempio attivit? antivirale, regolazione di crescita delle cellule e regolazione di pro-_ duzione delle sostanze prodotte dalle cellule.

DICHIARAZIONE E PROCURA

Io, come un sotto menzionato inventore, dichiaro che:

la mia residenza, 1?indirizzo postale e la cittadinanza sono stati riportati sotto vicino al mio nome: che in verit? ritengo di essere 1*originale, primo

+

I e solo inventore se una pluralit? di inventori sono1 nominati nel paragrafo 201 , o un co-inventore se un Ia pluralit? di inventori sono nominati nei paragrafi 201- 203, dell ' invenzione intitolata:

" INTERFERON-ALFA 74"

che ? descritta e rivendicata nell ' allegata descrizione;

che questa domanda in parte descrive e rivendica ar-. ? .- . I gomenti_descritti nella mia precedente domanda co-pendente, No . di serie 339 - 825 depositata il 15- 1- 1982; _

I

i che io sono a conoscenza del mio dovere di descrivere tutte le informazioni a me note che sono materiale di esame per questa domanda; che per quanto_ riguardo l ' argomento di detta domanda che ? comune a detta precedente domanda, io non so e non ritengo che il medesimo sia jnai stato conosciuto od usato negli^ Stati Uniti d 'America prima della mia o nostra in- |

? . ' ? venzione di esso , o brevettata o descritta in alcu-i n? pubblicazione in alcun paese prima della mia o j nostra invenzione, o pi? di un anno prima di detta precedente domanda, o in uso pubblico od in vendita' negli Stati Uniti d 'America pi? di un anno prima di? detta domanda; che detto comune argaiento non ? stato brevettato oppure fatto oggetto di un certificato di;

i inventore rilasciato orima della data di detta do- ? manda?-pr? ce dente in alcun paese estero agli Stati U-niti d'America su una domanda depositata da me o dai miei^ Regali rappresent?nti_ o cessionari da pi? di_ dodici _me_si_ pr ima di detta precedente domanda; e _ che nessun^ domanda di brevetto o di certificato di inventore su detta inven zione_ ? stata depositata _in alcun paese estero agli Stati Uniti d 'Amer icajprima di detta precedente domanda da me o dai miei rappresentanti legali o cessionari; _ _

che per quanto riguarda 1 ' argomento di detta domanda che non e comune a detta precedete domanda? io non so e non ritengo che il medesimo sia mai stato conosciuto od usato negli Stati Uniti d 'America prima della mia o nostra invenzione o brevettata o descritta in alcuna pubblicazione in alcun paese prima della mia o della nostra invenzione ? o pi? di un anno prima di detta domanda? o in uso pubblico od in vendita negli Stati Uniti d'America pi? di un anno prima di detta domanda; che detto argomento non comune non ? stato brevettato oppure fatto oggetto di un certificato _ di inventore depositato prima della data di detta j domanda in alcun paese estero agli Stati Uniti d'America su una domanda depositata da me o dai miei legali rappresentanti o cessionari pi? di dodici mesi prima di detta doman-da; e

che nessuna domanda di brevetto o di certificato di inventore su detta invenzione ? stata depositata in alcun paese estero agli. Stati Uniti d'America prima

di detta domanda .da me o_ dai miei_ legali rappresentanti o cessionari.

!PROCURA: Come menzionato inventore! io inoltre nomino con la presente procuratori e/o agenti a pr? seguire_ detta domanda e a trattare tutte le pratiche ad I __ essa inerenti presso l 'Ufficio Brevetti e Marchi, interessato .

Thomas E. Ciotti! _No . di Reg. 21 .013? William H. Benz, No ^ di J?eg. _25..9.5_2;_Kprman_H._Sjtepno f No_._ di Reg. _ 22.716 e Sfrymala T. Raj ender. No . di Reg. 29. 103. _

In d i r i z z are la _c or r i spondenza a: _ _ _ _ _

? Burns, Doane, Swecker & Mathis t Post Office Box .1404! Alexandria! Virginia 22313- 1404. _ _ ? _ Inviare JLe chiamate telefon i eh e_a: Thoma.s E. Ciotti al telefono N o . (415) 397-8100. _ _ Riquadro_20 1 . Nome dellJJLnventore : Innis_Michael A,^

! Residenza cittadinanza: _Oakland!_Califomiaf _Stati Uhiti/ r Indirizzo : 3133 Carlson 5t? ! Oakland! CA 94602. _ [

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Io inoltre dichiaro che tutte le afferma- j zioni qui fatte di mia propria conoscenza sono verei

i e che tutte le affermazioni fatte in base ad infor- [ mazioni e fede debbono essere considerate come vere e che inoltre! queste affermazioni sono state fatte sapendo che tutte le affermazioni volontariamente

Claims (1)

1. jfalse o simili? fatte con tali intenzioni sono poni-!

   [bili con ammenda o reclusione, oppure ambedue, in |base__al Paragrafo 1001 dell Articolo 18 del Codice

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   degli Stati Uniti, e che tali- affermazioni volont? -riamente false possono annullare la validit? della. domanda oppure di un qualsiasi brevetto rilasciato

   in base alla stessa.

   Firma dell ' inventore di cui al 201

   Michael A. Innis

   Data: 31 Agosto ? 1982

   iPer traduzione conforme

   UN MANDATA tilO TA/nag per se e per gli altri

   Antonio Taliercio

   gl ?Asf

   .? k 0.