JPS6156199A - 新規ヒトインタ−フエロンα類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ１発明の目的 産業上の利用分野 本発明は新規インターフェロンα類、すなわちインター
フェロンαＳ８０Ａ２、インターフェロンαＳ５１Ｂ１
０およびインターフェロンαＳ１７）１９に関する。さ
らにそれらインターフェロン類の発現を可能とするＤＮ
Ａ配列と組換えプラスミドおよび該プラスミドで形質転
換された微生物に関する発明である。上記インターフェ
ロンα類は各々抗ウイルス作用および抗腫瘍作用を有し
ており、医薬および動物薬として利用しうる物質である
。

村米五弦碧 ヒトインターフェロン（以下、ＩＦＮと略記する）には
、α、β、７の各種があり、いずれも抗ウィルス活性お
よび他の広範囲な生理活性を示す（１）タンパク質であ
る（　Ｗ、Ｅ、Ｓｔｅｗａｒｔ　ＩＩ　：ＴｈｅＩＦＮ
　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−■ｅｒｌａｇ、Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ−Ｗｉｅｎ　１９７９）。

とくにＩＦＮ−αには多くのサブタイプが存在すること
が知られ＜Ｓ、Ｐｅ５ｔｋａ：Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ２２！、　１−３７（１９８３）；
Ｃ，ＷｅｉｓｓｍＡｎｎら：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、　
ＵＣＬＡＳｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

２５．２９５−３２６（１９８２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ）、これらＩＦＮ−α各すブタイプの間で
、抗ウィルス、細胞増殖抑制、ＮＫ増強の各活性の間に
かなりの差があることも認められている（Ｅ、　Ｒｅｈ
ｂｅｒｇら；Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２５７）１４９
７（１９８２））。

ＩＦＮ−αを多くの産生する細胞として、白血球、Ｎａ
ｍａｌｖａ細胞、ＫＧ−１細胞らが知られ、これら各細
胞からｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡクローニングを経
てＩＦＮ−αの各サブタイプ遺伝子が単離きれているが
、含まれる各サブタイプの量比は、細胞によって異なっ
ている（Ｊ、　Ｈｉｓｃｏｔｔら：Ｎｕｃ１．　Ａｃ１
ｄｓ、　Ｒａｓ、　１２３７２７−３７４６（１９８４
））。

一方、三好らはヒトリンパ性白血病細胞から分離したＢ
ＡＬＬ−１細胞（１，Ｍｉｙｏｃｈｉら：Ｎａｔｕｒｅ
　２６７゜８４３−８４４（１９７７）ンがＩＦＮ−α
を多く産生ずることを見い出している（三好ら、医学の
あゆみＵ↓１５−１６（１９８０））。

口９発明の構成 明が　決しようとする−　１、 本発明者らはインターフェロン活性が強い新規なインタ
ーフェロンを得る目的でＢＡＬＬ−１細胞を培養し、公
知の組換えＤＮＡ技術を用いてｃＤＮＡバンクを作成、
これより既知ＩＦＮα　のどのタイプとも一致しない３
種のＩＦＮαのｃＤＮＡを分離した。これらのｃＤＮＡ
を用いて対応するＩＦＮαの発現を可能とする組換えプ
ラスミドを作成した。さらにこのプラスミドで微生物を
形質転換し、目的の３種の新規ＩＦＮαの製造を試み、
成功した。

口１発明の構成 。　　　　　する　段 ＢＡＬＬ−１細胞から分離したＩＦＮαのｍＲＮＡを鋳
型として多数の相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　）クローン
を調製した。同クローンのうち３種がその塩基配列およ
びそれからコードされるアミノ酸配列より新規と認めら
れ、それぞれ生成したインターフェロンをＩＦＮαＳ８
０Ａ、　ＩＦＮαＳ５１Ｂ１０およびＩＦＮαＳ１７Ｈ
９と命名した。これらインターフェロンをコードするＤ
ＮＡの各塩基配列は第１図、第２図および第３図に示す
とおりであり、その塩基配列から推定きれる各ＩＦＮα
のアミノ酸配列は各図のＤＮＡ配列の下に示されるもの
である。各アミノ酸は勿論り型であって、第１図から第
３図においては国際生化学会で定められた１文字略号に
より表わされている。同略号は各々以下のとおりを意味
する。

Ａ：アラニン Ｃニジスティン Ｄ＝アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フェニルアラニン Ｇニゲリシン Ｈ：ヒスチジン ■＝ゼインイシン に：リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ：アスパラギン Ｐ；プロリン Ｑ：グルタミン Ｒ：アルギニン Ｓ；セリン Ｔ：スレオニン ■：バリン Ｗニトリブトファン Ｙ：チロシン ＢＡＬＬ−１細胞ｍＲＮＡ由来（７）ＩＦＮαＳ８０Ａ
２．ＩＦＮαＳ５１Ｂ１０およびＩＦＮαＳ１７Ｈ９の
各ｃＤＮＡの主な制限酵素による制限酵素マツプを第４
図、第５図および第６図に示す。

第１図に示されるようにＩＦＮＳ８０Ａ２のアミノ酸配
列は、他の殆んどのＩＦＮαのサブタイプと同様に１６
６のアミノ酸残基からなり、制限酵素マツプからサブタ
イプＣ，！：Ｆに比較的低ているように見えるが、塩基
配列ではサブタイプＣとは約６％、サブタイプＦとは約
８％の差異を示す。また、アミノ酸配列では、サブタイ
プＣとは１６６アミノ酸残基中２５残基、サブタイプＦ
とは２９残基異っている。注目すべき点は、このアミノ
酸配列中にはこれまで報告されているＩＦＮ−αのいず
れかのサブタイプとも一致しないアミノ酸残基が１０ケ
所にも及び、非常に特異的な構造を持つＩＦＮ−αサブ
タイプであることである。

またこのクローンのアミノ酸配列には、ＩＦＮ−αサブ
タイプＨにみられるようなＮ−グリコシド型の糖鎖結合
配列は存在しない。きらに、これまでに知られているＩ
ＦＮ−αサブタイプの構造遺伝子のｔ　　　　　　　制
限酵素マツプをみると、ＥｃｏＲｌ、　Ｐｖｕ　ＩＩ　
、　Ｂｇｌ　Ｉ［。

Ｘｂａ　Ｉ　、　）ｌｉｎｅ　ＩＩ　、　Ａｃｅ　Ｉ等
の制限酵素のいずれかの切断部位が存在しているが、上
記クローンにはこれらの制限酵素部位が存在しない。し
たがって、ＩＦＮα８０Ａ２は新規なインターフェロン
であると断定した。

ＩＦＮ（Ｉ　５５１Ｂ１０　（第２図）はＩＦＮ　αＧ
（Ｇｏｅｄｄｅｌら：Ｎａｔｕｒｅ　２９０，２Ｏ−２
６（１９８１））およびＩＦＮ　（ｘ　５（Ｗｅｉｓｓ
ｍａｎ：前出）によく似ているが、αＧについては塩基
配列の一部が明らかにされていないためにＮ端から３５
のアミノ酸残基は推定できず、ＩＦＮαＳ５１Ｂ１０と
の類否が判断できない。Ｃ５についてはアミノ酸配列の
みが発表されており、アミノ酸配列を比較するかぎりに
おいては５１位のアミノ酸がＣ５ではリジンであるのに
対し、αＳ５１Ｂ１０ではアラニンである点でのみ差異
が認められるにすぎないが、後に記載のように、大腸菌
で作ったαＳ５１Ｂ１０はマウス細胞で抗ウィルス活性
を示すのに対し、同じように大腸菌で作ったＣ５はマウ
ス細胞では抗ウィルス活性を示さない（長円ら、日本ウ
ィルス学会抄録、１９８４　ｐ１３０　）。

このように、　ＩＦＮ−αサブタイプ５５１Ｂ１０は化
学構造的に既知αＳとよく似ているが、生物活性におい
て顕著な差が認められるため新規なＩＦＮαであると判
断した。

ＩＦＮαＳ１７Ｈ９（第３図）は既知のＣ８とよく似て
いる。しかし、ヒトＩＦＮα　のサブタイプは、アミノ
酸残基が１６５であるＣ２（またはαＡ）を除いてはす
べて１６６アミノ酸残基からなる（Ｓ。

ｐｅｓｔｋａ　’前出、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ　：前出）
のに対して、このサブタイプは１６１のアミノ酸残基を
有するために新規なＩＦＮα　であると認められる。

つぎに本発明のＩＦＮα類のｃＤＮＡを用いて、公知の
遺伝子操作法に準じて各ＩＦＮα　を発現する組換えプ
ラスミドを調製し、さらに得られるプラスミドを適当な
微生物に導入して形質転換した微生物を得る。この微生
物により所望のＩＦＮαの産生を行なう０本発明はこれ
らの一連の方法により得られるＩＦＮαＳ８０Ａ２、Ｉ
ＦＮαＳ５１Ｂ１０およびＩＦＮαＳ１７Ｈ９、それら
を発現する組換えプラスミド、該プラスミドで形質転換
した微生物を包含する。

以下に上記目的物の製造に用いる試薬類、方法および操
作を記載するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。なお、以下の記載において’　ＩＦＮα類」をＩ
ＦＮαＳ８０Ａ２、ＩＦＮαＳ５１Ｂ１０およびＩＦＮ
αＳ１７Ｈ９の総称として用いる。

１、ｃＤＮＡの調製 ｉ、試薬と方法 Ａ、使用微生物 使用する菌株は、既知大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）Ｋ−１２のＨＢＩＯｌ、χ１７７６、　Ｊ阻
０３．Ｃ６ＱＯ株などの菌株、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のＭａｒｂｕｒｇ　１６８株等
、酵Ｎ菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）などで、これらは公認の微生物寄託機関、た
とえばＡｍａｒｉ−ｃａｎ　Ｉｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎより入手可能である。

これらの菌株は、日本の組換えＤＮＡ実験指針に適合す
るもので、実験はすべて実験指針に従って実施された。

Ｂ、使用酵素、試薬および方法 各種制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４キナーゼ、Ｓ
１ヌクレアーゼ、末端デオキシヌクレオチトドランスフ
ェラーゼ、逆転写酵素、ＲＮａｓａ　ｌ。

ＤＮＡ　リガーゼなどはすべて市販のものを用いる。

ヒト胎盤ＲＮａｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒはＢｌａｃｋ
ｂｕｒｎの方法（Ｐ、　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ　：Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．１２４８４−１２４
８７（１９７９））に従って調製する。

プラスミドＤＮＡやベクターＤＮＡは市販のものを使用
しうるし、本発明の組換えプラスミドは標準のアルカリ
−５ＤＳ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍら：　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１
ｄｓ、Ｒｅｓ。

７、１５１３−１５２３＜１９７９））により調製し、
ＣｓＣ１により精製しうる。ＤＮＡ塩基配列の決定はＳ
ａｎｇｅｒらのＭ１３ファージを用いたチェインターミ
ネータ−法（Ｆ。

５ａｎｇａｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　、５４６３−５４６７（
１９７７））を用いて実施する。その他一般的な組換え
ＤＮＡ技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ（Ｒｅｃｏｍｂｉ−ｎａｎｔ　ＤＮＡ；Ｖｏｌ　
６８（ｐａｒｔＡ）、Ｖｏｌ　１００（ｐａｒｔＢ）、
■ｏ１１０１（ｐａｒｔ　Ｃ）に詳しく記述されており
、これに従って行なう。

Ｃ，オリゴデオキシヌクレオチドの化学合成オリゴデオ
キシヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドを構成ブ
ロックとして使用しくＢｒｏ　ｋａら、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８．５４６１−５４７）（１
９８０））、改良ホスホトリエステル固相合成法（Ｍｉ
ｙｏｓｂｉら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

８．５４９１−５５０５（１９８０））により合成でき
る。合成反応の材料および一般的方法は、Ｍｉｙｏｓｈ
ｉら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、旦、　５
５０７−５５１７（１９８０）により述べられているも
のを用いるとよい。

なお、後出のアダプターとしてのオリゴヌクレオチドは
、所定のジヌクレオチドまたはモノヌクレオチドを５一
方向に順次結合させて得る。後出の混合型のプローブは
、Ｉｋｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１１．４７７−４８８（１９８３））の方法により合成
するとよい。

ｉｉ、操作 本発明にかかるＩＦＮａ類のｃＤＮＡＩＩｌ製のために
用いる遺伝子操作は常法であるが、以下にその操作手順
を示す。

（ａ）、ＢＡＬＬ　−１細胞におけるＩＦＮ−αの誘導
トドリンパ芽球様細胞であるＢＡＬＬ−１細胞株を増殖
培地で培養し、必要に応じてブライミングを行ない、つ
いでＩＦＮ産生誘導体物質（例、センダイー１１＝ ウィルス）を加えＩＦＨの産生を促す。

（ｂ）、　ＩＦＮｍＲＮＡの調製と測定（ａ）の培養細
胞中に産生されるＩＦＮｍＲＮＡ１度の経時変化を調べ
、最高濃度のときの培養細胞より、Ｇｒｅｅｎら（Ａｒ
ｃｈ、　Ｂｉｌｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１７２
．７４−８９（１９７５））の報告するフェノール抽出
およびオリゴ（ｄＴ）セルロースのクロマトグラフィー
によりｐｏｌｙ（Ａ）含有のｍＲＮＡを調製する。

（ｃ）、ｃＤＮＡの合成とクローニング通常行なわれる
ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製する方法に準じて行ないう
るが、岡山とＢｅｒｇによって開発された岡山−Ｂｅｒ
ｇ法（Ｍａｄ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｇ、　１６
１−１７０．　（１９８２））に従ッてクローニングを
行なうと好都合にｃＤＮＡが得られる。

（ｄ）″Ｉｐ−オリコデオキシヌクレオチドブローブの
調製 上記で得られたｃＤＮＡからＩＦＮαのｃＤＮＡを探索
するためにＩ　ｊ　ｐ−オリゴデオキシヌクレオチドプ
ローブを調製する。例えば、Ｇｏａｄｄｅｌらの報告（
Ｎａｔｕｒｅ　２９０，２Ｏ−２６（１９８１））を参
考にして、ヒトＩＦＮαの各サブタイプＤＮＡ（７）　
ＡＴＧから数えて６２〜７７位に相補的な配列を用いる
。

（ｅ）上記プローブのよるｃＤＮＡのスクリーニング上
記のプローブを用いてＩＦＮαのｃＤＮＡを分離する。

分離手段としてはコロニーハイブリッド化法（Ｍ、　Ｇ
ｒｕｎｓｔｅｉｎｓら：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７２゜３９６１−３９６５（１９７
５））に従って行なうとよい。

（ｆ）　ＩＦＮαｃＤＮＡの分析 （ｅ）で分離されたクローンのうちヒトＩＦＮαのｃＤ
ＮＡを含むのに充分な鎖長をもつクローンを選び、制限
酵素マツプを作成する。既知のＩＦＮαの制限酵素マツ
プを有していないクローンを峻別し、そのＤＮＡ塩基配
列を決定してＩＦＮαＳ８０Ａ２、αＳ５１Ｂ１０、ａ
　５１７８９のｃＤＮＡを得る。

以上の方法で得られたｃＤＮＡの塩基配列に基づき本発
明のＩＦＮａ類の各々のアミノ酸配列を決定して第１〜
第３図に示される結果を得た。

なお、本発明はＩＦＮαＳ８０Ａ２、αＳ５１Ｂ１０お
よびαＳ１７）１９のアミノ酸配列をフードするすべて
のＤＮＡを包含し、第１〜第３図に示されるＤＮＡに限
定されるものではない。

■０発現プラスミドの調製 １、試薬と方法 上記ＩのＡ、Ｂおよび０項に例示された条件は本工程に
おいても同様であるが、その他の条件は以下のとおりで
ある。

Ｄ１発現ベクター 大腸菌の各種のベクター、例えばｌａｃ系、Ｔｒｐ系、
Ｔｒｐ−１ａｃ融合系（ｆｆａｃ＞、ファージλの主要
オペレーターおよびプロモーター系（ＰＬなど）、λフ
アージ改造プロモーター（ＣＩＰｍＰｔ）（Ｔｓｕｒｉ
ｍｏｔｏら：Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８
７．７９−８６（１９８２）など、が主に用いられるが
、酵母菌ベクター、例えばｐＦＲＰｎ　（Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎら：Ｎａｔｕｒｅ　２９３．７）７−７２２（１９
８１））や枯草菌ベクター、例えばｐＫＴＨ５３（Ｐａ
ｌｖａら：Ｐｒｏｃ、ｏｆ　ｔｈｅＩＶ　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓ、　（１９８２）２８７−２９１）など
も使用しうる。

ｒ　　　　　　　Ｅ３合成オリゴデオキシヌクレオチド
アダプター微生物中で成熟ＩＦＮを発現きせるためには
、ｃＤＮＡからシグナルペプチドを規定する遺伝子およ
び転写方向からみてそれより上流にあるＤＮＡ配列を取
り除いた後に、翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、プロモ
ーターに接続して微生物に導入しなければならないが、
Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ（ＳＤ）配列とＡＴＧ間に
オリゴデオキシヌクレオチドを挿入して外来蛋白発現量
の増加を図る方法によく用いられる。

例えば、本発明の実施例ではＩＦＮα類の発現増加をも
たらすオリゴデオキシヌクレオチドの挿入方法として、
成熟ＩＦＮａ類のＮ末端の最初のアミノ酸を規定するコ
ドンと第二番目のアミノ酸を規定するコドンの間を５ａ
ｕ３ＡＩで切断した。したがって、５ａｕ３ＡＩ消化に
より失われる第一番目のアミノ酸システィンを規定する
コドンＴＧＩと、開始コドンＡＴＧをもち、トリプトフ
ァンプロモーター（第７図（ｂ））につながるようにＣ
１ａ　Ｉ切断部を導入した合成オリゴマーを調製した。

その具体例を下に示す。

＜５’）ＣＧＡＴＡＣＡＴＧＴＧＴ ＴＡＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＡＧ（５’）Ｆ　、　ＡＴＧ
ベクター用合成デオキシヌクレオチドオリゴマー ＡＴＧベクターを用いて発現プラスミドを調製する場合
には、任意の塩基または長さの５Ｄ−ＡＴＧ間を規定す
る合成デオキシヌクレオチドオリゴマーを発現ベクター
に導入する。本発明においては５Ｄ−ＡＴＧ間に挿入す
る合成デオキシヌクレオチドオリゴマーをＩＦＮα　類
の性状に応じて変えるため（（ｎは７〜２０の整数）と
名付け、このオリゴマ一対を挿入したＡＴＧベクターを
用いて得られた発現プラスミドをｐＳｎ−ＩＦＮα　と
名付けた。具体的にはトリプトファンプロモーター（第
７図（ｂ））を用いるために一端にＣ１ａ　Ｉ切断部を
有し、他の１６一 端にＡＴＧとその直後にＥｃｏＲＩ修復塩基鋼を有する
下記のオリゴマーを挿入したＡＴＧベクターを用いて好
結果を得た。

Ｇ１発現プラスミドの調製方法 合成オリゴデオキシヌクレオチドアダプターを用いる方
法（Ｇｏｅｄｄｅｌら：　Ｎａｔｕｒｅ　２８７，４１
１−４１６（１９８０））とＡＴＧベクターによる方法
（Ｎｉｓｂｉら：ＤＮＡ　２゜２６５−２７３（１９８
３））を参考にするとよい。

Ｈ，ターミネータ−の挿入 大腸菌のＩＦＮの産生を増大させる目的で、発現プラス
ミドにおけるＩＦＮｃＤＮＡαの下流に、すでに知られ
ているターミネーター、例えば、Ｂｒｏａｉｕｓらの報
告しているリポゾームＲＮＡ遺伝子のターミネータ−（
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４８．１０７−１２７
（１９８１）、　Ｇｅｎｅ２７、１６１−１７２（１９
８４））や）Ｃｒｉｓｃｈらの報告しているファージ遺
伝子のターミネータ−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　２９．４９３７−４９４１（１９８４
）を挿入するとよい。

ｉｉ、操作 （ｇ）発現プラスミドの調製 ■のクローニングで（等たプラスミドｐＩＦＮａ類（第
４〜６図）のうちで成熟ＩＦＮαのアミノ酸配列を規定
するＤＮＡ配列（第１〜３図）を、適当なプロモーター
を有する発現ベクターに挿入する。

この操作において、上記のＥ、Ｆに記載の合成デオキシ
ヌクレオチドオリゴマーを用いる。両操作はＧに記載の
公知の方法に基づいて行なうとよい。さらに必要に応じ
てターミネータ−を挿入する。

以下にトリプトファンプロモーターを用いてＩＦＮαＳ
８０Ａ２の発現プラスミドを調製する具体例を示Ｃす。

（ｉ）合成オリゴヌクレオチドアダプター使用例■大腸
菌のトリプトファンオペロンのプロモーターオペレータ
ーおよびＳＤ配列をプラスミドｐＢＲ３２２のＣａｌ　
Ｉ切断端に導入した発現ベクターｐＴｒｐ　−プロモー
ターベクター（第７図（ｂ））をＣ１ａ　ＩとＡｃｅ　
Ｉで切断し、プロモーター含有切断を得る。

一方プラスミドｐＩＦＮ　ａ　５８０Ａ２　（第７図（
８））をＡｏｃＩ　、５ａｕ９６Ｉで切断、ＩＦＮ構造
遺伝子を含む断片を得て、先の断片とＡｃｅ　Ｉで連結
する。

■プラスミドルＩ　ＦＮαＳ８０Ａ２を５ａｕ３ＡＩで
消化し、５ａｕ９６Ｉサイトを含む１７６ｂｐ断片を得
る。この断片を５ａｕ９６Ｉで消化し、５ａｕ３Ａ１．
５ａｕ９６Ｉ端をもつ３４ｂｐと１４２ｂｐ断片の混合
物を得る。

■一方、上記Ｅに記載される、開始コドンＡＴＧとＮ端
最初のシスティンのコドンＴＧＩを有する合成オリゴデ
オキシヌクレオチドアダプターを合成する。

■上記の■、■、■で得られたＤＮＡ断片とオリゴマー
を連結させ、プラスミドｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２
を得る。

（Ｈ）　ＡＴＧベクター使用例 ■ｐＴｒｐ−プロモーターベクター（第７図（ｂ））を
Ｃ１ａ１．ＰｓｔＩで切断して得たトリプトファンプロ
モーターと、ＰｓｔＩ　、　ＥｃｏＲＩで切断したｐＢ
Ｒ３２２と、上記Ｆに記載されている合成オリゴマーを
連結してＡＴＧベクター（第７図（ｄ））を得る。

■ＡＴＧ−ベクターをＥｃｏＲｌ、　５１ヌクレアーゼ
で消化後ＰｓｔＩで切断して、Ｐｓｔ付着末端とＳｎで
規定された５Ｄ−ＡＩＧ間をもち、末端にＡＩＧの平滑
末端をもつトリプトファンプロモーター断片を調製する
。

■次にシグナルペプチドを規定する遺伝子および転写方
向からみてそれより上流にあるヌクレオチド配列を取り
除いたＩＦＮ−αｃＤＮＡを持つプラスミドを、合成デ
オキシヌクレオチドオリゴマー（（５ｉ５ＣＧＡＡＧＣ
ＴＴＧＴ、（づＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴ　）を用いて
調製する。このオリゴマーは、５ａｕ３ＡＩ消化により
失われる成熟ＩＦＮ−αの末端最初のアミノ酸であるシ
スティンを規定するコドンＴＧＴを補い、その直前に）
１ｉｎｄｌ［［切断部位を導入する（第７図（＠）、ｐ
オリゴマーＩＦＮαＳ８０Ａ２　）。

■ｐオリゴマーＩＦＮαＳ８０Ａ２を）ｌｉｎｄｌ［［
、５１ヌクレアーゼで消化し次いでｐｓｔＩで処理し、
一端がＴＧＴで始まる平滑末端であり、他端がＰｓｔＩ
付着部であるＩＦＮα６８０Ａ２構造遺伝子含有断片を
得る。

■トリプトファンプロモーター断片（（３）とＩＦＮα
Ｓ８０Ａ２構造遺伝子含有断片（■）をＴ、リガーゼで
連結してｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２、ｐＴｒｐ−Ｉ
ＦＮ　ａ　５８０Ａ２（（第７図（ｆ））を得る。

■　宿主への導入とＩＦＮαの発現 用いた発現ベクターに応じて、適当な微生物中へ■りで
得られたＩＦＮα発現プラスミドを導入する。大腸菌を
用いる場合はＨａｎａｈａｏらの方法（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１並、５５７−５８０（１９８
３）　）に従うとよい、得られた形質転換微生物を常法
により培養し、培養物より目的のＩＦＮα　を分離して
、必要に応じて精製する。

闘 本発明で得られるＩＦＮαＳ８０Ａ２、ＩＦＮαＳ５１
Ｂ１０およびＩＦＮαＳ１７８９は他のサプクイブのＩ
ＦＮαと同様に抗ウィルスおよび抗腫瘍作用を有してお
り、医薬、動物薬として有用な化合物である。投与量は
、投与対象、投与目的などにより大きく変動し、また投
与するＩＦＨの純度によっても変更されるが、通常成人
男子の１日量は約１０６〜１０７ｕｎｉｔ（国際単位）
でよい。

（以下余白） を 衷施落 以下に実施例により本発明の実施態様を示すが、この実
施例はなんら本発明を限定するものではない。

実施例Ｉ １、ＩＦＮαＳ８０Ａ２のｃＤＮＡ！！ｉ製（ａ）ＢＡ
ＬＬ−１細胞におけるＩＦＮｍＲＮＡの誘導ヒトリンパ
芽球細胞（ＢＡＬＬ−１細胞株）を増殖培地（１０％牛
脂児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地）に、１−２Ｘ
１０’細胞／ｍｌで植え込んだ後、３７°Ｃ炭酸ガス培
養器中で、３−４日間培養する。その細胞を１ｍＭ酪酸
を含む増殖培地で８Ｘ１０’細胞／ｍｌに懸濁した後、
３７℃で４８時間培養後、シｋｕｍａ１０Ｂ−２０−タ
ーで１２００回転／分、２０分間遠心分離し、１０ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ”を含む増殖培地（ｐＨ７，２）で５Ｘ１
０’細胞／ｍｌの濃度になるように懸濁し、回転培養フ
ラスコ（米、ライ−トン社製）中で、１００回転／分で
攪拌しながら、１００国際単位／ｍｌのＩＦＮ−αで処
理する。その後、５００〜１０００赤血球凝集単位／ｍ
ｌのセンダイウィルス（Ｃａｎｔｅｌ１株）を加え、６
〜１０時間培養を続けた後、Ｓａｋｕｍａ　１０Ｂ−２
０−ターで１２００回転／分、２０分間、遠心分離して
細胞を集める。

＊Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エ
タンスルホン酸 （ｂ　）ＩＦＮｍＲＮＡの調製と測定 ｍＲＮＡ中のＩＦＮｍＲＮＡが最も多く存在する時の細
胞を集めるために、センダウィルスで誘発してからＩＦ
Ｎが産生きれる経時変化をしらべた（第８図）。

ウィルス誘発後、７，８．９時間培養した細胞を集め、
それぞれからｍＲＮＡを調製した。得られた咄ＨＡ中の
ＩＦＮｍＲＮＡのおよその量を推定するために、Ｃａｖ
ａｌｉｅｒｉらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　７４　＋３２８７（１９７７））に従
ってｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細胞に注入し、
２０℃で４８時間培養した後培養液中のＩＦＮ活性を測
定した。

卵母細胞培養液中のＩＦＮは、水庖性口内炎ウィルスを
チャレンジしたＭＤＢＫ細胞での細胞病理効果（ＣＰＥ
）阻害活性により測定した。結果を表１に示す。

表　　　１ 表１の結果から、ウィルス誘発後７時間の細胞にＩＦＮ
ｍＲＮＡが多く含まれることが認められた。

ＩＦＮｍＲＮＡを濃縮するために、ウィルス誘発７時間
後の細胞（４Ｘ　１０’細胞）から調製したｍＲＮＡを
、５−２０％しよ精密度勾配遠心により分画し、各画分
の一部ずつをアフリカッメガエル卵母細胞に注入してＩ
ＦＮ活性をしらべ、常時ＩＦＮｍＲＮＡが得られる１２
５付近を分離した。

（ｃ）ｃＤＮＡの合成とクローニング １２５画分ｍＲＮＡを用いた岡山−Ｂｅｒｇ法による第
−鎖ｃＤＮＡの合成は、１−５μｇのｍＲＮＡ、　　５
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，１）、５０　ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１，１０ｍＭＭｇＣ１、，１０ｍＭ　ＤＴＴ、０　、
２　ｍｇ／　ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、２２０
ｕ／ｍｌのヒト胎盤由来のＲＮａｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ、５７／Ｃｉの（α−”ｐ）　ｄＣＴＰ、および２
ｍＭのｄＡＴＰＸｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、ｄｌ：ＴＰを
含む５０μｌの反応液中で行なう。プライマーとしては
、予めベクターとなるＤＮＡ断片の一端に約６０のデオ
キシチミジン残基をつけたベクタープライマーを用い、
ｍＲＮＡの分子数が過剰になるように、３．５μｇのベ
クタープライマー（１、７ｐｍｏｌ相当）を使用する。

５００ｕ／ｍｌの逆転写酵素を添加した後、３７℃６０
分インキュベートする。２μｍの０　、５　ＭＥＤＴＡ
とｐｏｌｙ（Ａ）　５μｇを加えて反応を止めた後、フ
ェノール−クロロホルム抽出し、等量の４Ｍ酢酸アンモ
ニウム（ｐＨ５，０）と、４倍量のエタノールを加えて
一７０℃で１５分間冷やし、１０分遠心して沈殿を得る
。沈殿を再び水にとかし、このエタノール沈殿の操作を
再度行ない、沈殿をエタノールで洗い、軽く減圧乾燥し
た後、水にとかして次のステップに移る。

先の沈殿（約１．４μｇベクターブライマー分に相当）
に、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭｈリス
ー塩酸（ｐＨ６、８）　１　ｍＭ　ＣｏＣ１ｔ。

０　、１ｍＭ　ＤＴＴ、０　、１　ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ
、　５０μＣ４の（Ｃ１−”ｐ）　ｄＣＴＰ、オヨび５
０１１ＨｄＣＴＰを含ム３５μｍの反応液中で、末端デ
オキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、３゛
末端に約２０のデオキシシチジン残基をつける。１６ｕ
の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを加え
、３７℃で１５分間インキュベートし、０℃に急冷して
反応を中断し、その間に１μｍのサンプルを使って［Ｉ
″ｐ］のＴＣＡ沈殿への取り込みを測り、デオキシシチ
ジン残基の長諮を見積もる。約２０塩基になっていれば
、そこで反応をやめ、短かすぎれば３７℃に戻して諮ら
に酵素を添加して適当時間反応を続行する。２μｍの０
　、５　ＭＥＤＴＡを加えて反応を止め、フェノール−
クロロホルム抽出をし、１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，３）、２　、５倍量ノエタノールを加え
て先と同様にエタノール沈殿、エタノール洗浄の操作を
行ない、軽く減圧乾燥して、水にとかして回収する。

回収した沈殿は、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）
、６０　ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ　ＭｇＣ１＊、　　０
　、１　ｗ＠／ｍ１ＢｓＡを含む２０μｍの反応液中で
、１ｉｎｄｌｌ［で消化する。Ｈｉｎｄｌ［［１２ｕを
添加し、３７°Ｃで６０分インキュベートし、フェノー
ル−クロロホルム抽出後、１０分の１量の３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５，３）２．５倍量のエタノールを加えて
エタノール沈殿を行い、軽く減圧乾燥して水にとかす。

約０．８Ｍｇベクターブライマーに相当するｃＤＮＡが
得られる。

この試料の０　、０７Ｈｇ（０、０３５ｐｍｏｌ）ベク
タープライマー相当分を、予めＤＮＡ断片の一端に約２
０のデオキシグアノシン残基をつけて調製しておいたリ
ンカ−ＤＮＡ　１３Ｍｇ（０、０７μｍｏｌ）と共に、
５μｍの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５＞、１　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、Ｏ、ＩＭ　ＮａＣ１中で、６５℃２分、
ついで４２℃３０分インキュベートした後０℃に冷やす
。これに次の成分を加え、液量を５０μｍにする。２０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、０．１Ｍ　ＫＣＩ、
４　ｍＭ　ＭｇＣ１＊、１０　ｍＭ　（ＮＨ４）＊ＳＯ
＊、０．１ｍＭ　β−ＮＡＤ、　　５０Ｍｇ／ｍｌ　Ｂ
ＳＡ、　　１５ｕのｌｌ：、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガー
ゼ。次いで１２℃で一夜インキユベートする。

この反応液に次の成分を指定の濃度になるように追加す
る。４０ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰ、　ｄＧＴＰ、　
ｄＴＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ、　　１０　ｕ　Ｅ
、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（追加分として）、２　、
８　ｕ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌ
ｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、０．９ｕ　Ｅ、ｃｏｌ
ｉＲＮａｓｅ　Ｈ，これを１２℃および２５℃で順次１
時間ずつインキュベートした。

この反応液を用い、Ｈａｎａｈａｎらの方法（Ｊ、Ｈｏ
ｌ。

Ｂｉｏｌ、　１６６　、５５７−５８０　（１９８３）
　）に従って、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２（χ７７６また
はＨ８１０１株）を形質転換し、ｃＤＮＡバンクを形成
した。

（ｄ）”ｐ−オリゴデオキシヌクレオチドプローブの調
製 ヒトＩＦＮ−αｃＤＮＡクローンを探索するためのプロ
ーブとして、鎖長１６塩基からなる２種類の混合プロー
ブを調製した。

■　　（５’　　）ＡＧＡＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡ（ｇ）
ＡＧ■　（５’　＞ＡＧＡＴ！ＡＣＡＧＣＣＣＡ（ε）
ＡＧこの配列はＧｏｅｄｄｅｌらの報告（Ｎａｔｕｒｅ
　２９０　。

２Ｏ−２６（１９８１））によると、ヒトＩＦＮ−αの
各サブタイプｃＤＮＡのＡＴＧから数えて６２〜７７位
に相補的である。しかし、１４以上の鎖長でまったく共
通な塩基配列を持つ部分位はないので、１個所のみ２種
の塩基を含む混合型とし、さらにもう１個所の違いは、
２種類の１６−ｍａｒを合成することでカバーした。

オリコ゛デオキシヌクレオチドの＄１ｐによる標識は、
Ｗａｌｌａｃｅらの方法（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　　６　＋３５４３〜３５５７（１９７９））に
従って、（７−”Ｉ））　ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて、りん酸化した。さらに未反応の（
７−■ｐ）ＡＴＰは５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５でのゲ
ル濾過により除去した。

（ｅ）ｓ＊ｐ−合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い
てのｃＤＮＡクローンのスクリーニング岡山−Ｂｅｒｇ
の方法で得たアンピシリン耐性の形質転換株をコロニー
ハイブリッド化法（Ｍ。

Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ７２゜３９６１−３９
６５（１９７５））に従ってヒトＩＦＮ−αｃＤＮＡを
含むクローンの検出を行なう。

ｉｏ、ｏｏｏ個のコロニーを１つずつ１２５枚のニトロ
セルロースフィルターに形成すせ、アルカリテ溶菌、Ｄ
ＮＡ変性後固定する。フィルターを４　Ｘ　ＳＳＣ”　
、　１０　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｂｉｏｃｈｅｍ
。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　　２３　、
６４１−６４６（１９６６））、１００　ａｇ／ｍｌ　
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡで６０°Ｃで４時間前処理後、新
たに調製した同溶濱に１ｊｐ−合成オリゴデオキシヌク
レオチド（鎖長１６）プローグ（５Ｘ１０″ｃｐｍ／フ
ィルター）を混ぜ、３５℃で１５時間ハイブリッド化す
る。フィルターを４ＸＳＳＣで２回、４℃で１５分間洗
浄し風乾後、コダックＭＡＲ−５Ｘ線フィルムにデュポ
ン・ライトニングプラスインテンシファイイングスクリ
ーンを用いて、−７０℃で露光する。（＄１×ＳＳＣは
０　、　１５Ｍ　ＮａＣ１と０　、　０１５Ｍ（７）７
−１−ン酸ナトリウムｐＨ７，９を含有する。）３ｌ− （ｆ）ヒトＩＦＮαのｃＤＮＡクローンの分析合成オリ
ゴヌクレオチドプローブとハイブリッド化した７９個の
クローンから、それぞれプラスミドＤＮＡを調製した。

まずベクターに２ケ所の切断点を持つｐｓｔ　Ｉにより
、直線状ＤＮＡとし、ヒトＩＦＮ−αｃＤＮＡを含むの
に必要な約８００塩基対以上の挿入ｃＤＮＡを持つクロ
ーン６０個を選び出した。

すでに知られているヒトＩＦＮα各サブタイプの制限酵
素マツプに基づいて６０個のクローンの制限酵素マツプ
の作成とサザンハイブリッド化法の変法（Ｗａｈｌら；
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６
　。

３６８３〜３６８７（１９７９））に従って、各ｃＤＮ
Ａクローンがどのようなサブタイプに属するかを推定し
、既知でないものを選別した。既知のものと全く一致し
ない三種類のｃＤＮＡクローン（ＩＦＮαＳ８０Ａ２、
αＳ５１Ｂ１０およびαＳ１７Ｈ９）の塩基配列を決定
した。第１〜第３図に各成熟インターフェロンをフード
する塩基配列とその塩基配列から推定きれるアミノ酸配
列を示す。第４〜６図には各ΦＮＡの主な制限酵素マツ
プを示す。

■発現プラスミドの調製 （ｇ）ＩＦＮαＳ８０Ａ２０発現プラスミドの作成（ｉ
）合成オリゴヌクレオチドアダプター使用例■プロモー
ターとしては、Ｅ、ｃｏｌｉのトリプトファンオペロン
のプロモーターオペレーターおよびオペロンのプロモー
ターオペレーターおよびＳＤ配列を、プラスミドｐＢＲ
３２２のＣ１ａ　Ｉ切断端に導入した発現ベクター（ｐ
Ｔｒｐ−プロモーターベクター（第７図（ｂ））を使用
する。この発現ベクター、を、Ｃ１ａＩ　、　ＡｃｃＩ
で二重切断し、トリプトファンプロモーターを含むＣ１
ａ　Ｉ　、　Ａｃｅ　Ｉ断片をポリアクリルアミドゲル
電気泳動で単離し、ゲルを切り取る。ゲル片は１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐ）１Ｂ）、１−ＥＤＴＡ内で粉砕し、
上清を集め、エタノール沈殿の操作を行なって、ＤＮＡ
断片を回収する。一方プラスミドｐＩＦＮαＳ８０Ａ２
（第７図（ａ））をＡｃｃＩ、５ａｕ９６Ｉで二重切断
し、ＩＦＮ構造遺伝子を含む断片を同様にゲルから単離
する。これをききのトリプトファンプロモーター含有断
片とＴ４リガーゼで連結させ、Ａｃｅ　Ｉ端で連結した
断片を再びゲルから単離する。

■プラスミドｐＩＦＮ　ａ　５８０Ａ２を５ａｕ３Ａ　
Ｉで消化し、５ａｕ９６　Ｉサイトを含む１７６　ｂｐ
断片をゲルから単離する。（第７図（ａ））、この断片
を５ａｕ９６　Ｉで消化したもの、即ち５ａｕ３Ａ　Ｉ
　、　５ａｕ９６　Ｉ端を持ツ３４ｂｐ断片と、１４２
ｂｐ断片の混ざりを得る。

■５ａｕ３Ａ　ＩはｐＩＦＮαＳ８０Ａ２の成熟ＩＦＮ
　Ｎ末端の最初のアミノ酸を規定するコドンと第二番目
のアミン酸を規定するコドンとの間を切断する。そこで
５ａｕ３Ａ　Ｉ消化により失われるＮ末端の最初のアミ
ン酸システィンを規定するコドンＴＧＴとＥ、ｃｏｌｉ
による発現に必要な翻訳開始のための１ｎｉｔｉａｔｉ
ｏｎｔｒｉｐｌｅｔ　ＡＴＧを持つ合成オリゴデオキシ
ヌクレオチドアダプター、（５’　）ＣＧＡＴＡＣＡＴ
ＧＴＧＴと＜５　’　）ＧＡｆｆＣＡＣＡＣＡＴＧＴＡ
Ｔを調製する。

■上記■のトリプトファンプロモーターＩＦＮ構造遺伝
子連結断片、■の３４ｂｐ断片と１４２ｂｐ断片の混を 合物および■のアニールさせた合成デオキシヌクレオチ
ドアダプターをＴ４リガーゼで連結させ、得られた組換
えＤＮＡを用いＨａｎａｈａｎらの方法に従い、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ−１２を形質転換する。

形質転換細菌は、アンピシリン含有平板上で選択する。

得られたアンピシリン耐性コロニーより数個ノコロニー
を選び、プラスミドＤＮＡを単離し、所望の断片の存在
を制限酵素分析により確認した。得られたプラスミドを
ｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２と名付けた（第７図（Ｃ
））。またこのプラスミドを含有する大腸菌抽出液は、
後記のように抗ウィルス活性を示した。

（ｉｉ）ＡＴＧベクター使用例 ■前述のｐＴｒｐ−プロモーターベクター（第７図（ｂ
））をＣ１ａ　Ｉとｐｓｔ　Ｉで二重切断し、トリプト
ファンプロモーターを含む断片をゲルより単離する。プ
ラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩで
二重切断し、ゲルより長い方の断片を単離する。この二
断片と、アニールさせた５Ｄ−ＡＴＧ間を規定する合成
デオキシヌクレオｆドオリゴｖ　−（Ｓｎ）、　（５’
　）ＣＧＡＴＡＣＴＡＴＡＴＧ、　（５°）ＡＡＴＴＣ
ＡＴＡＴＡＧＴＡＴ（ｎ−１１）を、Ｔ４リガーゼで連
結する。得られた組換えＤＮＡでＨａｎａｈａｎらの方
法（前出）に従い、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２を形質転換
する。

形質転換細菌をアンピシリン含有平板上で選択し、数コ
ロニーを選び、単離したプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析よりＡｒＧベクター（第７図（ｄ））の調製ができた
ことを確認する。

■上記ＡＴＧベクターをＥｃｏＲＩで切断し、次に突出
したＥｃｏＲＩ端を５１ヌクレアーゼで消化してフェノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作をした
のち、ＰｓｔＩで切断し、トリプトファンプロモーター
含有断片をゲルより単離した。同断片はＰｓｔ　Ｉ付着
末端とＳｎで規定される５Ｄ−ＡＴＧをもち、コード鎖
がＡＴＧで終わる平滑末端を有する。

■（ｉ）と同様にプラスミドｐＩＦＮαＳ８０Ａ２をＡ
ｃｅ　Ｉと５ａｕ９６　Ｉで二重切断し、ＩＦＮα構造
遺伝子を含む断片を得る。プラスミドｐＢＲ３２２をＣ
１ａＩとＡｃｅ　Ｉで二重切断し、最も長い断片をゲル
より単離して上記のＤＮＡ断片とＡｃｃ　Ｉ切断部でＴ
４リガーゼにより連結する。（ｉ）と同様にしてプラス
ミドｐＩＦＮαＳ８０Ａ２の５ａｕ３Ａ　Ｉ断片１７６
ｂｐを５ａｕ９６　Ｉで消化し３４ｂｐと１４２ｂｐの
混合物を得る。

一方、５ａｕ３Ａ　Ｉ消化により失われる成熟ＩＦＮα
のＮ末端最初のアミノ酸（システィン）を規定するコド
ンＴＧＴを末端に有し、ＴＧＩの直前にＨｉｎｄ　ＩＩ
［切断部位を導入する合成デオキシヌクレオチドオリゴ
マー、（５’　）ＣＧＡＡＧＣＴＴＧＴ　、　（５’　
）ＧＡＩＣＡＣＡＡＧＣＴＴを調製する。

アニール許せた上記のオリゴマーと、前記の郭Ｒ３２２
−ＩＦＮα構造遺伝子の連結断片と、３４ｂｐと１４２
ｂｐの混合物を混合し、Ｔ４リガーゼで連結させ、得ら
れた組換えＤＮＡで（ｉ）と同様に形質転換Ｅ、ｃｏｌ
ｉＫ−１２を得る。この菌より＜ｉ）同様にしてプラス
ミドＤＮＡを単離し制限酵素分析を行なって、所望のプ
ラスミドが調製できたことを確認する。得られたプラス
ミドはｐｏｌｉｇｏｍｅｒ　−ＩＦＮαＳ８０Ａ２と命
名した（第７図（ｅ））。

■上記で得られたｐｏｌｉｇｏｍｅｒ　−ＩＦＮαＳ８
０Ａ２を）ｆｉｎｄ■で切断し、次に突出した１ｉｏｄ
ｌ［Ｉ端をＳ１ヌクレアーゼで消化して、フェノール−
クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作後、ｐｓｔ　
Ｉ切断部、、ＩＦＮ−α構造遺伝子含有断片をゲルで単
離する。得られたＩＦＮα構造遺伝子含有断片は、Ｐｓ
ｔ　Ｉ付着末端と、コード鎖がＴＧＴで始まる平滑末端
を有する。

■上記の■で得られたトリプトファンプロモーター含有
断片と、■で得られたＩＦＮα構造遺伝子含有断片をＴ
４リガーゼで連結し、得られた組換え開Ａで前記と同様
にＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２を形質転換する。

形質転換細菌は、アンピシリン含有平板上で選択する。

得られたアンピシリン耐性コロニーより数個のコロニー
を選び、個々のクローンを生育許せ、後述のようにその
大腸菌抽出液の抗ウィルス活性を測定すると、陽性を示
す形質転換株が得られた。これら菌株のプラスミドＤＮ
Ａの塩基配別を分析したところ、いずれの場合もプロモ
ーター、５Ｄ−ＡＴＧ間、ＩＦＮ構造遺伝子のつながり
は、望むような結合になっていることが確認された。こ
の形質転換株から得られるプラスミドを“ＡＴＧベクタ
ー“に含まれる合成ヌクレオチドオリゴマーＳｎに対応
して、ｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２、ｐＴｒｐ−ＩＦ
Ｎ　ＣＩ　５８０Ａ２と名付けた（第７図＜ｆ＞）。

なお、形質転換により得られたＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２
Ｃ６００／ｐＩＦＮαＳ８０Ａ２の標準株は１９８４年
７月２５日より茨城県筑波郡谷田部町の工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第７７４５号として寄託
きれている。

実施例２ （ａ）　ＩＦＮαＳ１７）１９およびＩＦＮαＳ５１Ｂ
１０の発現プラスミドの調製 前記の実施例１、Ｉ、ｒで得られた二種のｃＤＮＡクロ
ー　ン（ＩＦＮｆｆ　５１７Ｈ９およびＩＦＮｃｒ　５
５１Ｂ１０　）　　について、実施例１と同様に操作し
て各発現プラスミドを調製する。両者のＩＦＮ構造遺伝
子は第５図と第６図に示されるように類似の制限酵素切
断部位を有するため、発現プラスミドの調製方法はほぼ
同一である。したがって以下の実施方法は両者の発現プ
ラスミドを調製する方法を示す。

（１）合成オリゴヌクレオチドアダプター使用例実施例
１　（ｇ）（ｉ　）に記載された方法でトリプトファン
プロモーターベクター（第７図（ｂ））をＣ１ａ　Ｉと
ｐｓｔ　Ｉで切断し、トリプトファンブロモ一ターを含
むＣ１ａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を単離する。

一方、プラスミドｐＩ　ＦＮαＳ１７Ｈ９またはｐＩＦ
ＮαＳ５１ＢＩＯをＰｓｔ　Ｉ　、　Ｘｂａ　Ｉで二重
切断し、ＩＦＮ構造遺伝子の後半部を含む約２．３Ｋｂ
ｐ断片を同様にゲルから単離する。これをききに単離し
たトリプトファンプロモーター含有断片とＴ４リガーゼ
で連結させ、Ｐｓｔ　Ｉ端で連結した断片を再びゲルか
ら単離する。

次にプラスミドｐＩＦＮαＳ１７８９またはｐＩＦＮα
Ｓ５１Ｂ１０をＸｂａ　Ｉで消化し、ついで５ａｕ３Ａ
Ｉで部分消化してＩＦＮα構造遺伝子の前半部を含む２
４５ｂｐ断片をゲルから単離する（第９図（ａ）参照）
。

この２４５ｂＰ断片と上記のトリプトファンプロモータ
ーを含むＣ１ａ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片を、開始コドン
ＡＴＧとＩＦＮαＳのＮ末端のアミノ酸システィンの対
応コドンＴＧＴを有するアニールきせた合成オリゴデオ
キシヌクレオチドアダプター（５’　）ＣＧＡＴＡＣＡ
ＴＧＴＧＴ、（５’　）ＧＡＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＡＴ
と混合し、Ｔ４リガーゼで連結させる。得られた組換え
ＤＮＡを用いて、）Ｉａｎａｈａｎらの方法にしたがっ
てＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２を形＝４０− 質転換した。

形質転換細菌は、アンピシリン含有平板上で選択した。

得られたアンピシリン耐性コロニーヨ１’１数個のコロ
ニーを選び、プラスミドＤＮＡを単離し、所望の断片の
存在を制限酵素分析により確認した。得られたプラスミ
ドをそれぞれｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ１７）１９　、　ｐ
Ｔｒｐ　−ＩＦＮ（２５５１Ｂ１０と名付けた（図９（
Ｃ））。またこのプラスミドを含有する大腸菌抽出液は
、後記のように抗ウィルス活性を示した。

（ｉｉ）ＡｆｆＧベクター使用例 ■実施例１　（ｇ）（ｉｉ）■と同様の方法でＡＴＧベ
クター（第７図（ｄ））を調製し、同■に記載きれるよ
うにＥｃｏＲＩ　、　ＳｌヌクレアーゼおよびＰｓｔ　
Ｉで消化して、Ｐｓｔ　Ｉ付着末端とＳｎで規定跡れる
５Ｄ−ＡＴＧ間をもち、コード鎖がＡＴＧで終わる平滑
末端を有するＤＮＡ断片を得る。

■（ｉ）と同様にプラスミドｐＩＦＮαＳ１７８９また
はｐＩＦＮαＳ５１Ｂ１０のＰｓｔ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ
断片を調製する。プラスミドｐＢＲ３２２をＣ１ａ　Ｉ
とＰｓｔ　Ｉで二重切断し、短い方のＣ１ａ　Ｉ　−Ｐ
ｓｔ　Ｉ断片を単離し、上記の断片とＰｓｔ　Ｉで連結
させる。一方、（ｉ）と同様にしてプラスミドｐＩＦＮ
α１７Ｈ９またはｐＩＦＮαＳ５１Ｂ１０から２４５ｂ
ｐよりなるＳａｕ　３Ａ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片を得る
。

■他方、５ａｕ３ＡＩ消化により失われる成熟ＩＦＮα
ＳのＮ末端最初のアミノ酸（システィン）を規定するコ
ドンＴＧｒを末端に有し、ＴＧＴの直前にＢｉｎｄ　ｍ
切断部を導入する合成デオキシヌクレオチドにオリゴマ
ー、（５’　）ＣＧＡＡＧＣＴＴＧＴ、　＜５　’　）
ＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴを調製する。

■アニール妨せた上記オリゴ−マーを、前記■で調製し
たｐＢＲ３２２−ＩＦＮα構造遺伝子の断片およびＩＦ
ＮａＳ１７Ｈ９（またはαＳ５１Ｂ１０　）の２４５ｂ
ｐよりなる５ａｕ３Ａ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片をＴ４リ
ガーゼで連結する。得られた組換えＤＮＡをＨａｎａｈ
ａｎの方法により大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＫ−１２の形質転
換に用いる。

形質転換細菌から（ｉ）と同様の方法でプラスミドを得
、制限酵素分析に付して、所望のプラスミドの調製を確
認した。

得られたプラスミドはそれぞれ、ｐｏｌｉｇｏｍａｒ−
ＩＦＮＣＩ　５１７Ｈ９、ｐｏｌｉｇｏｍｅｒ−ＩＦＮ
αＳ５１Ｂ１０と名付けた（第９図（Ｃ））。

■上記■のプラスミドをＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、次
に突出したＨｉｎｄｌ［端をＳ１ヌクレアーゼで消化し
て、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿の
操作後、ｐｓｔ　Ｉ切断し、ＩＦＮ−α構造遺伝子含有
断片をゲルで単離する。得られたＩＦＮ−α構造遺伝子
含有断片は、Ｐｓｔ　Ｉ付着末端とコード鎖がＴＧＴで
始まる平滑末端を有する。

■上記■で得られたトリプトファン含有断片と■で得ら
れたＩＦＮα構造遺伝子含有断片をＴ４リガーゼで連結
し、得られた組換えＤＮＡで前記と同様に大腸菌Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ−１２（Ｃ６００）を形質転換する。

形質転換細菌は、アンピシリン含有平板上で選択した。

得られたアンピシリン耐性コロニーより、数個のコロニ
ーを選び、個々のクローンを成育させ、後記のようにそ
の大腸菌抽出液の抗ウィルス活性を測定すると、陽性を
示す形質転換株が得られた。これら菌株のプラスミドＤ
ＮＡの塩基配列を分析したところ、いずれの場合もプロ
モーター、５Ｄ−ＡＴＧ間、ＩＦＮ構造遺伝子のつなが
りは、鼠むような結合になっていることがわかった。こ
の形質転換株から得られるプラスミドを”ＡＴＧベクタ
ー”に含まれる合成ヌクレオチドオリゴマージに対応し
てそれぞれｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２、ｐＴｒｐ−
ＩＦＮαＳ１７）１９．ｐｌｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２
、ｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ５１Ｂ１０と命名した（第９図
（ｄ））。

なお、上記操作で得られた形質転換細菌はそれぞれ、エ
シェリキア・＝＋す（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　）Ｋ−１２Ｃ６００／ｐＩＦＮαＳ１７Ｈ９，エシ
ェリキア・コリ　Ｋ−１２Ｃ６００／ｐＩＦＮαＳ５１
Ｂ１０と命名し、昭和５９年８月８日より工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第７７６６号、同第７
７６７号として寄託されている。

ハ０発明の効果 １、ＩＦＮαＳ８０Ａ２の発現 （ｉ）試験管内転写−翻訳系を用いてのプラスミド遺伝
子産物の分析 プラスミドＤＮＡのコードするタフパフ質が、Ｅ。

ｃｏｌｉ抽出液を用いて試験管内転写−翻訳系で、生成
できることがｚｕｂａｙら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

６５、８５６−８７７（１９８０））によって報告され
ている。

そこで、さきに調製したトリプトファンプロモーターを
持つ組換えプラスミドｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２を
５ａｐ−メチオニン存在下にｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写−翻
訳系キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、処方どおり
に反応を行なわせ、その反応生成物を１６％５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａｅｍｍｌｉ、　
Ｎａｔｕｒｅ２２７、６８０−６８５（１９７０））で
分析した。

その結果、ＩＦＮと思われる分子量約２０．０００の単
一ポリペプチドと少量のアンピシリン耐性遺伝子産物を
検出した。また、この試験管内転写−翻訳系反応液の抗
ウィルス活性を測定したところ（後記測定法により測定
）、約１００．０００ｕハｎのＩＦＮ活性を検出した。

また上記の分子量約２０，０００のバンドをゲルから抽
出し、その抽出液のＩＦＮ活性（後記測定法による）を
測定すると陽性を示した。

（ｉｉ）大腸菌中でのＩＦＮαＳＢ０Ａ２の発現上記で
調製したプラスミドｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２　（
第７図（Ｃ））を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ｋ−１２、Ｃ６
００株をＨａｎａｈａｎの方法に従って形質転換し、４
０８ｇ／−のアンピシリン含有平板上で生育したコロニ
ーを任意に採取する。

次いで各コロニーを、　４０ｕｇ／”’　アンピシリン
含有ＬＢ＜Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　）培地中で一
夜生育きせ、との培養液０．００５１ｆｆｉを、０．５
％グルコース、０．５％カザミノ酸および４０ｎｈＱア
ンピシリンを添加した５−のＭ９培地中へ植菌した。３
７℃で８時間インキュベートし、５１Ｑの試料を遠心集
菌した。細胞塊に、１％ＳＤＳを添加したＰＢＳ（ＩＪ
ン酸−食塩）緩衝液２ｎｍを添加し、超音波破壊によっ
て、Ｅ、ｃｏｌｉ抽出液を調製した。

ＩＦＨの力価測定は、シンドビス・ウィルスと几細胞を
用いた色票取り込み法（蛋白質・核酸・酵素（別冊）２
５巻、　３５５−３６３）により求めた値を、１ｔｌ）
１ヒト白面球ＩＦＮ標準品（Ｇ−０２３−９０１−５２
７）を用いて標準化し、国際単位に換算した。

ききに調製した各Ｅ、　ｃｏｌｉ抽出液のＩＦＮ力価測
定を行なったところ、Ｅ、ｃｏｌｉ培養液ＩＩＩＱ当り
に換算して１０．０００−５０．０ＯＯｕのＩＦＮ活性
を有していた。これらＩＦＮ活性はヒトＩＦＮ−αの抗
体によってのみ中和され、ヒトＩＦＮ−βおよび７に対
する抗体ではまつたく中和諮れなかった。

１［、ＩＦＮαＳ１７）１９およびαＳ５１Ｂ１０の発
現さきに調製したプロモーターを持つ組換えプラスミド
を用いて、大腸菌内での発現を行なう。

トリプトファンプロモーターを持つ組換えブラスミ　ド
ｐＴｒｐ−ＩＦＮ　Ｃ１５１７）１９またはｐｒｒｐ−
ＩＦＮαＳ５１Ｂ１０（第９図（ｂ））を用いて、例え
ばＥ、ｃｏｌｉ　ｋ−１２（Ｃ６００）株をＨａｎａｈ
ａｎの方法（前出）に従って形質転換し、４０μｇ／Ｉ
ＩＱのアンピシリン含有平板上で生育したコロニーを任
意に１０〜２０株採取した。

次いで各コロニーを４０５ｇ／ＩＩＱ　アンピシリン含
有ＬＢ（Ｌｕｒｉａ４ｅｒｔａｎｉ）　＠地中で一夜生
育させる。

０．００５ｄの培養液を、０．５％グルルコース、０．
５％カザミノ酸および４０５ｇ／ＩＩＱ　アンピシリン
を添加した５１党のＭ９培地中へ植菌した。３７℃で８
時間インキュベートし、５−の試料を遠心集菌して得た
細胞塊に、１％ＳＤＳを添加したＰＢＳ　Ｃリン酸−食
塩）緩衝液２−を添加し、超音波破壊によって、Ｅ。

ｃｏｌｉ抽出液を調製した。

ＩＦＨの力価測定は、シンドビス・ウィルスと几細胞を
用いた色素取り込み法（蛋白質・核酸・酵素（別冊）２
５巻、　３５５−３６３　）により求めた値を、ＮＩＨ
ヒト白血球ＩＦＮ標準品（Ｇ−０２３−９０１−５２７
）を用いて標準化し、国際単位に換算した。

さきに調製した各Ｅ、ｃｏｌｉ抽出液のＩＦＮ力価測定
を行ない、Ｅ、ｃｏ１１培養液培養液１リＱ当ＦＮ活性
を表２に示した。きらにヒトの細胞のほか、マウス細胞
（ＬＯ）における活性も測定し比較したところ、サブタ
イプ５１７）１９はマウス細胞では効果を示さないのに
対し、サブタイプ５５１Ｂ１０はマウス細胞でも効果を
示すという特徴が見られた。

表　　２

【図面の簡単な説明】

第１〜第３図は、それぞれＩＦＮαＳ８０Ａ２、ＩＦＮ
αＳ５１Ｂ１０およびＩＦＮαＳ１７）１９のアミノ酸
配列およびそれに対応するＤＮＡ配列を示す。 第４〜第６図はそれぞれＩＦＮ　ＣＬ　５８０Ａ２、Ｉ
ＦＮ　（Ｉ　５５１Ｂ１０およびＩＦＮａ　５１７Ｈ９
のＢＡＬＬ−１細胞由来ｍＲＮＡより得られたｃＤＮＡ
の制限酵素マツプを示す。 第７図はＩＦＮαＳ８０Ａ２発現の組換えプラスミドな
らびにその調製に用いられたプラスミドおよびベクター
を示す。 第８図はＢＡＬＬ−１細胞によるＩＦＮ産生の経時変化
を示す。 第９図はＩＦＮαＳ１７Ｈ９またはＩＦＮαＳ５１Ｂ１
０全Ｎ６５５１プラスミドならびにその調製に用いられ
たプラスミドおよびベクターを示す。 特許出願人　　塩野義製薬株式会社 手続ネ市正書（自発） 昭和５９年１１月１ｑ日 昭和５９年特許願第１７９１０５号 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロンα類 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　大阪府大阪市東区道修町３丁目１２番地４、代理
人 住所　大阪市福島区鷺洲５丁目１２番４号〒５５３塩野
義製薬株式会社　特許部 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書８頁下から２行の’　１９８４　ｐ１３０
　Ｊの次に’　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１．５０８６−５０９０　（１
９８４）　Ｊを挿入する。 （２）同書１１頁下から６行目ｒＤＮＡＪの次に「）」
を挿入する。 （３）同書１３頁５行の’　Ｂｉｌｃｈｅｍ　Ｊを’Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ４に訂正する。 （４）同書１５頁１２行の’（１９８２）、の次に「）
」を挿入する。 （９同書１６頁７行の「方法に」を「方法が」に訂正す
る。 （６）同書１９頁５行の’（１９Ｂ４）、の次に「）」
を挿入する。 （７）同書１９頁下から８行の１勝６作」を１同操作」
に訂正する。 （８）同書２２頁１０行の１■りで」を１１で」に訂正
する。 （９）同書３４頁９行の１プロモーターベクター」の次
に１）、を挿入する。 ０■同書３５頁３行の１０．を１■Ｊに訂正する。 （１１）同書３９頁下から８行の１塩基配別」を「塩基
配列」に訂正する。 （１２）同書４１頁下から６行のｒｌＦＮαＳ、を’Ｉ
ＦＮα」に訂正する。 （１３）同書４３頁４行＋７）’　ＩＦＮαＳ」を’　
ＩＦＮα」に訂正する。 以上 手続ネ市、正書く方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第１７９１０５号 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロンα類 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　大阪府大阪市東区道修町３丁目１２番地塩野義製
薬株式会社　特許部 昭和６０年　１月２９日（発送日） ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 願書に最初に添付した図面の浄書・別紙のとおり（内容
に変更なし） ８、添付書類の目録 図面　　　１通 以上 受託番号変更届 昭和６０年　９月７９日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１７９１０５号 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロンα類 ３、手続をした者 事件との関係　　特許出願人 ４、代理人 住所　大阪市福島区鷺洲５丁目１２番４号　〒５５３塩
野義製薬株式会社　特許部 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所７、新寄託
機関の名称 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所８、新受託
番号 微工研条寄第８４０号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８４０）微工
研条寄第８４１号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８４１）９、添付
書類の目録

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターフェロンαＳ８０Ａ２、αＳ５１Ｂ１０
   またはαＳ１７Ｈ９。
2. （２）インターフェロンαＳ８０Ａ２、αＳ５１Ｂ１０
   またはαＳ１７Ｈ９をコードするＤＮＡ。
3. （３）第１図、第２図または第３図に示される配列を有
   する特許請求の範囲（２）のＤＮＡ。
4. （４）形質転換された微生物中でインターフェロンαＳ
   ８０Ａ２、αＳ５１Ｂ１０またはαＳ１７Ｈ９の発現を
   可能とする組換えプラスミド。
5. （５）トリプトファンプロモーターを有する特許請求の
   範囲（４）の組換えプラスミド。
6. （６）ｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ８０Ａ２、ｐＴｒｐ−Ｓｎ
   −ＩＦＮαＳ８０Ａ２、ｐＴｒｐ−ＩＦＮαＳ５１Ｂ１
   ０、ｐＴｒｐ−Ｓｎ−ＩＦＮαＳ５１Ｂ１０、ｐＴｒｐ
   −ＩＦＮαＳ１７Ｈ９またはｐＴｒｐ−Ｓｎ−ＩＦＮα
   Ｓ１７Ｈ９である特許請求の範囲（４）の組換えプラス
   ミド。
7. （７）インターフェロンαＳ８０Ａ２、αＳ５１Ｂ１０
   またはαＳ１７Ｈ９の発現を可能とする組換えプラスミ
   ドで形質転換させた微生物。
8. （８）大腸菌である特許請求の範囲（７）の微生物。
9. （９）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
   ｃｏｌｉ）Ｋ−１２Ｃ６００／ｐＩＦＮαＳ８０Ａであ
   る特許請求の範囲（７）の微生物。
10. （１０）エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２
    Ｃ６００／ｐＩＦＮαＳ５１Ｂである特許請求の範囲（
    ７）の微生物。
11. （１１）エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２
    Ｃ６００／ｐＩＦＮαＳ１７Ｈ９である特許請求の範囲
    （７）の微生物。