IT8422677A1

IT8422677A1 - Vettori plasmidi ad alto numero di copia. loro produzione e uso

Info

Publication number: IT8422677A1
Application number: ITMI1984A022677A
Authority: IT
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R T
Priority date: 1983-09-16
Filing date: 1984-09-14
Publication date: 1986-03-14
Also published as: CA1275631C; ZA847273B; AT384031B; AU578041B2; FR2552102A1; IL72952A0; DK439784D0; GB2148301B; BE900570A; IL72952A; PL152527B1; FI843600A0; AU3307784A; DE3434041A1; SE8404637D0; PL249593A1; CH667672A5; IT1178510B; SU1443806A3; IT8422677A0

Description

'VETTORI PLASMIDI AD ALTO NUMERO DI COPIA,LORO PRODUZIONE E USO".

RIASSUNTO

L'invenzione riguarda nuovi vettori plasmidi ohe hanno un numero di copia per cellula sostanzialmente pi? alto di quello dei plasmidi finora noti,per esempio il pBR322. L'aumento del numero di copia, e,quindi, del prodotto del gene ? il risultato di una mutazione nella sezione del gene responsabile della produzione del repressore della replicazione del piaemide. Nel caso del pBR322 o di un suo derivato che ha la stessa regione di replicazione, ei pu? raggiungere l'aumento del numero di copia richiesto mediante una mutazione del punto G_ >T in posizione 3074) seguendo la numerazione del pBR322 originale.

L'invenzione include sia i vettori plasmidi ad alto numero di oopia che i metodi per la loro preparazione. Rientrano anche nell'ambito dell'invenzione i microorgpniBmi contenenti e riproduoenti uno qualsiasi dei plasmidi ad alto numero di copia (plasmidi pHC).

DESCRIZIONE

La presente invenzione rigiarda vettori plasmidi nonch? la loro produzione e il loro uso; pi? particolarmente eesa riguarda vettori plasmidi che hanno un alto numero di oopia e la loro produzione e il loro uso.

La tecnica oosiddetta di manipolazione dei geni o, in altri termini, l'ingegneria genetioa sta divenendo sempre pi? importante nella pr?*4_ duzione di prodotti utili in medicina? Secondo una versione preferita di __ ' queeta tecni?a la parte del gene oodifioante la produzione del prodotto farmaceuticamente attivo riohlesto ? inserita in un vettore, per esempio piasmide, fornendo una molecola di plasmide "ibrida" ricombinante ohe ? poi usata per trasformare un microorganismo adatto? Il plasmide ? poi replicato insieme con l'ospite batterico e il gene inserito e funzionanente? La quantit? dei prodotti del gene dipende dalla intensit? della traslazione e trascrizione, dalla decomposizione del prodotto del gene entro la cellula e dal numero . di oopia del gene, cio? del plasmide ohe porta il gene? Di conseguenza se si riesce ad aumentare il numero di oopia di un plasmide in una cellula si pu? ottenere un aumento sostanziale nella quantit? di prodotti del gene mediante l'aumento del numero di copia del gene estraneo? (Per quanto concerne la tecnica di manipolazione dei geni si veda l'esposizione di brevetto statunitense No. 4-237*224).

Lo scopo della presente invenzione ? fornire vettori plasmidi ohe hanno un numero di oopia per cellula sostanzialmente pi? elevato di quello dei plasmidi noti e largamente usati?

Nella ricerca scientifica e nell'industria si usano anche variet? di differenti vettori plasmidi, generalmente costruiti artificialmente. Uno dei plasmidi pi? ampiamente usato ? il pBH322 che ? stato costruito per primo da Boyer ed altri Gene, 2, 9?? 13 (1977)_/? Poich? fino ad ora la richiedente ha le informazioni scientifiche pi? esaurienti oiroa (presto plasmide, e la maggiorpartedei procedimenti di "clonin^1del gene ? stata condotta oon questo plasmide o con suoi derivati, la richiedente ha usato questa sostanza coma materiale di partenza nei suoi esperimenti. La struttura del pBR322 ? sta-fca determinata da Sutoliffe / CSH Symp. Quant. Biol. 4^, 77-90 (1979)__/ ed ? illustrato nella figura 1? Qiesto plasmide ha una lunulezza molecolare di 43^2 bp. La replica del plasmide inizia in 00rispondenza del nuoleotide 2536 in senso antiorario e il suo numero di copia per cellula ? generalmente compreso tra 20 e 50. Il numero di copia ? controllato da un complicato meccanismo di regolazione j_ plasmid 2, 1, (1983)_/? Il frammento tra i nucleotidi 2978 e 3081 & reeponsabile della sintesi di un KNA di baseo peso molecolare ohe non codifica alcuna proteina e che viene trascritto in senso orario oon una intensit? relativamente alta* Questo ENA di haseo peso molecolare ? il regolatore negativo (repressore) della ripetizione del plasmide?

L'invenzione si basa sul riconosoimento che il numero di copia del plasmide pu? eseere sostanzialmente aumentato realizzandof nella parte del gene responsabile della produzione del repressore della replicazione del plasmide,una mutazione che m?noma questa funzionedi detta parte del gene? Nel laboratorio della richiedente il primo plasmide ad alto numero di copia (pHCl) ? stato isolato come prodotto di mutazione spontanea in un p s

esperimento effettuato con plasmidi fenotipi amp , tet contenenti un DNA estraneo tra i punti di spaccatura EcoRI e BamHI del plasmide pBR322f durante l'analisi di un gruppo di ricombinanti consistente di circa 5000 plasmidi indipendenti. Dalle cellule di batterio contenenti il plasmide pHC1, si potevano isolare senza amplificazione circa 20-30 volte pi? plasmidi DNA ohe dai oloni contenenti altre molecole ricombinanti con analoghistruttura. La ritrasformazione ripetuta del plasmide pHC1usando le cellule ospite di E. coli HB101 (pr??, leu?, thi , lao , str , r m rndol , reoA )j_ Boyer,H.W. ed altri: J.Hol. Biol. 41.459-472 (1979)_7? C600 (r^-, ?^?, thi?, thr?, leu-, lac?) l_Boyer, H*W* ed altri,ibid_/, ED8800 (supE, supF,hsdS , met , lacZM15, recA56)[_Murray,N*E? ed altrij Mol* gen* Qenet*15Q, 53-61 (l977)_/ dava luogo o&ii volta alla produzione di cloni amp2*, teiB contenenti un'alta quantit? di plasmide* Per spiegare questo aumentato numero di copia, che era circa 20-30 volte pi? alto di quello dei plasmidi pBR, la richiedente ha supposto una variazione ereditabile nel plasmide DNA.

Identificazione della mutazione responsabile dell'alto numero di copia

Il plasmide pHCI era digerito con le endonuoleasi di restrizione EcoHI e PvuII, e poi le estremit? a trefolo singolo erano riempite col subframmento di Klenow dell'enzima polimeraei I del MA in presenza di substrati dHTP* Le molecole di MA cos? prodotte con estremit? smussate venivano cireolarizzate con un enzima polinucletide lignei e trasformate in cellule HB101? Dalle colonie coltivate su un mezzo contenente atqpicillina si isolava plasmide MA, e i campioni di DNA,che potevano essere ieolati in alta quantit?, erano analizzati mediante elettroforesi con gel di ag^rosio e di poliacrilantnide, dopo digestione con le endonuoleasi di restrizione EcoRX,PvuII e BspHI* Il plasmide pH(?1 (figura 2) scelto per le ulteriori ricerche non poteva essere digerito con l'enzima PvuII ed era linearizzato con l'EcoHI. In base al peso molecolare totale del plasmide (2, 3 kb) e alla dimensione dei frammenti ottenuti per digestione oon BspRI (587,457143412?f, 240, 80 ??? bp) si stabiliva che il plasmide pHC8l conteneva la sezione tra i nucleotidi 2069 e 2 del plasmide pBR322 con una mutazione responsabile dall'alto numero di copia* Questa mutazione non pu? essere rilevata sulla base della dimensione di alcuno dei frammenti prodotti dagli enzimi impiegati* Per localizzare la mutazione siisolavano il frammento 1030 bp DNA ottenuto dalla diUJ ? A? O

gestione del pHC8l con le endonucleasi d? restrizione Peti e Taql, il framnento 78? bp DNAottenuto dalla digestione del pBR322 con gli enzimi Peti e C1al e il frammento 218 bp MA ottenuto dalla digestione del pBR329 oon enzima Taql* I tre frammenti di MA erano mischiati in proporzioni equimolari, essi erano ligati con una polinuoletide ligasi e poi le cellule HB101 venivano trasformate col llgato? Bai Bingoli cloni coltivati su mezzo contenente ampic?llina si isolava plaemide di DNA? Questi plasmidi presentavano il fenotipo ad alto numero di copia? Per digestione dei plasmidi DNA con endemicieasi di restrizione si stabiliva che OSB? erano prodotti dal collegamento di tre frammentiben distinguibili di origine diversa} nei plasmidi ottenuti la parte prossimale del gene della beta-lattamasi era di origine pBR322, la regione contenente l?origine della replica derivava dal plasmide pBR329 s il frammento isolato dal ??(?1 conteneva, in aggiunta alla parte distale del gene della -lattamasi, anche la mutazione che dava luogo ad alto numero di copia* Si concludeva quindi che la mutazione era fornata tra i nucleotidi 2573 (Taql) e 3612 (Peti) del DNA del plasmide pBR322* La sequenza dei nucleotidi di questa regione veniva determinata e confrontata con la sequenza nota del pBN322? Questo confronto dimostrava che avveniva ima transizione G_^T (G-desossiguanile,T?=timidile) in oorrispondenza del nucleotide 3074? che corrisponde ad una transizione C? > A nel filo di DNA complementare (c=desossioitosile, A=desoBsiadenile)?

Come risultato dell'avvenuta mutazione del punto, la terminazione della trascrizione del repressore RNA viene danneggiata e viene sintetizzato un RNA di pi? alto peso molecolare che non pu? pi? fungere da repressore della riproduzione* La terminazione della funzione del repressore d? luogo ad un pi? alto numero di copia* Con questa mutazione spontanea del punto, che pu? essere prodotta anche volutamente, il ninner? di copia del plasmide per cellula poteva essere aumentato di ciroa 20-30 volte (uguale oiroa 1000) in rapporto al valore originale? Con questa mutazione del punto il numero di copia di qualsiasi piasmide che abbia la stessa regione di ripeti? zione del pBR322 pu? essere aumentato in misura sostanziale*

E* stato tuttavia trovato che il plasmide originale pBR322 contenente una mutazione G _ ->T non ? pi? vitale* Cio?, a causa dell'alto numero di copia, sui geni del plasmide che determinano la resistenza all'antibiotico (??? - -lattamasi, Tc**? ? *=proteina (proteine) della membrana), la sintesi di entrambe le proteine viene aumentata e l'ultima proteina (proteina della membrana responsabile della resistenza alla tetraciclina) ? letale per la cellula nella quantit? aumentata* Lo stesso problema si osserva nel caso di qualeiasi derivato ad alto numero di copia del plasmide pBR322 che contiene il gene originale di resistenza alla tetraciclina in una forma inalterata*

Nei precedenti esperimenti della richiedente, essa non ha dovuto fronteggiare questo -problema poich? usava plasmidi in cui i frammenti di DNA estraneo erano stati clonati tra i punti BamHI e EcoRldel plasmide pBR322, e in questo modo il gene di resistenza alla tetraciclina era inattivato* Di conseguenza per poter ottenere un plasmide vitale ad alto numero di copia, il pBR322 o un suo derivato avente lamedesima regionedireplicazionedeveessere modificato per inattivazione 0 repressione della funzione del gene di resistenza alla tetraciclina*

Perci?, secondo una forma preferita di realizzazione dell'inven\<?v y? ?ione sono forniti nuovi plasraidi, derivanti del pBR322 o da suoi derivati ohe contengono la stessa regione di replicazioneycaratterizzati dal fattocheessi non contengono un gene di resistenza alla tetraciolina o lo contengono in una forma inattivata o foiraa modificata con funzione moderataf e che essi oontengono una mutazione del punto modificante la produzione di repressore sulla parte del gene che codifica il repressore HNA,

Secondo una forma realizzativa dell?invenzione maggiomente preferita, nel plasmile DNA pBR322 o in un suo derivatoaventela stessa regione d? replicazione, nella posizione 3074 (seguendo la numerazione del pBR322) la coppia d? base GC ? rimpiazzata da TA per mutazione controllata del punto o per rimpiazzamento di una parte contenente questa mutazione in un plasmile pHC, ?he sar? descritto qui di seguito, con ima parte del plasmile richiesto che, a parte questa mutazione! ? identica?

Come descritto prima, se si usa come sostanza modello il pBR322 o un suo derivato adatto, la mutazione del punto GC? ?TA deve essere prodotta su un derivato del plasmile di partenza in cui il gene di resistenza alla tetraciclina ? interamente mancante oppure la sua funzione ? inattivata o repressa? In questo contesto, repressione significa ohe il gene codificante la produzione della proteina della membrana respons?bile della resistenza alla tetraciclina ? alterato in modo da dirigere una produzione di proteina ridotta, Secondo una versione preferita e eliminato il DNA respons?bile della resistenza alla tetraciolina o la sezione totale fino all'origine della riproduzione del pBR322 e, se si desidera, ? rimpiazzato da un poiioollefetore di origine sintetica per cali, a causa dei siti addizionali di digestione con endonucleasi di restrizione inseriti nel plasmide, le possibilit? di applicarVf ? zione dei plasmidi ottenuti sono notevolmente estese, *

baov Costruzione dei plaaaidi pHC314ipHC312 e pHC624

Durante lTulteriore trasformazione dei plasmidi ottenuti negli esperimenti desoritti qui sopra, si inserivano dei policollegatori nel plasmide pHC8l allo soopo di preparare dei vettori adatti per l'inserimento di frammenti di DNA fonnati con svariate endonuoleasi di restrizione? Il DNA di piaemide pHC8l linearizzato con la endonuoleasi EcoRI e defosforilato oon fosfatasi alcalina 'batterica era ligato con frammenti di DNA plasmidico Vedi, B*: Nucleic Acid Research 11, 2427-2446 (1983)_/, e cellule HB101 di E? coli venivano trasformate col ligato? Dalle colonie batteriche resistenti alla &p si isolava plasmide DNA che era analizzato per elettroforesi con gel, dopo digestione oon le endonuoleasi di restrizione EcoRl e PstI? Per la ricerca sucoesB?va B? sceglieva il plasmide che poteva essere scisso nei frammenti di lun^iezza 2300 e 110 bp per mezzo di EcoRl e nei frammenti di lunghezza 1580 e 820 bp da Peti (pHC 314i fig? 3)? Da questo plasmide si costruiva il pHC312 contenente soltanto un punto EcoRl nel modo seguente: il plasmide veniva digerito con 1*endonuoleasi di restrizione BamHI e la molecola lineare ottenuta era parzialmente diferitacon un enzima Hinfl? I frammenti di DNA erano separati in un gel di agarosio all'1,2$ e si isolava il frammento lungo 2010 bp? Le estremit? della moleoola contenenti parti a singolo trefolo dovute alla digestione oon gli enzimi BaniHI e Hinfl erano convertire in estremit? smussate oon il sub-frammento di Klenow dell'enzima DNA polimerasi I e poi erano rieiroolarizzate oon polinuclebtideligasiindotta da T ? Il DNA ligato era trasformato in cellule HB101 e i singoli cloni venivano isolati? per le operazioni successive si sceglieva (figura 4) il plasmide pHC312 che non po? * teva essere scisso 00n endonucleasi BamHI ma poteva essere linearizza con EcoRIe produceva framnenti di lunghezza 1495 ?P e 516 ?? per digestione con HinfI? Per produrre un vettore ad alto numero di copia adatto per "clonare" frammenti di DNA con estremit? smussate si digeriva il plasmide pHC132 con le endonucleasi di restrizione EcoRI e HindiII e si isolava il frammento 1980 bp da gel di agarosio? Questo frammento era poi mischiato con DNA del plasmide JI AN7 / Vedi, B?: Nucleic Acide Research, 1^, 2427-2446 (1983)_/ digerito con gli enzimi EcoRI e Hindili e le molecole erano collegate con polinucleotideligasi?Cellule HB101 di E? Coli venivano trasformate col plasmide ligato e da singoli cloni di "batterio resistenti alla Ap si isolava DNA plasmidico? Il DNA plasmidico preparato in questo modo (pHC624, figira 5) non ha alcun punto C1al ma, diversamente dal plasmide pHC312,pu? essere linearizzato con le endonucleasi di restrizione Smal, Sali e BamHI,

Determinazione del numero di copia di plasmidi

Numero di copia relativo

Per determinare il numero di copia relativo di plasmidi pHC, si accrescevano delle colture di E? coli HB101 contenenti plasmidi di differenti dimensioni derivati da pBR322 ricombinante e da derivati ad alto numero di copia della medesima dimensione fino ad una identica densit? delle cellule* Da identiche quantit? delle sospensioni ottenute, senza amplificazione, si isolava il DNA plasmidico seguendo la tecnica descritta da Bimboim and Doly /Nucleic Acide Res. ?, 1513-1523 (l979)_/? Campioni prelevati dai preparati di DNA erano sottoposti a elettroforesi su gel di agarosioin diluizioni rispettivamentedi5,10,15,20, 25,30,40 e 50 volte, I plasmidi ad alto numero di copia e le loro coppie a numero di copia normale (aventi lo stesso peso raolecolare) venivano esaminati simultaneamente? I risultati sperimentali dimo5^"?^ etravano ohe il numero di copia dei plasmidi pHC era circa 20-30 volte pi? alto di quello dei corrispondenti derivati di pBR322 a "numero di copia normale"?

Numero di copia assoluto

Il numero di copia assoluto dei plasmidi pHC veniva determinato contrassegnando il DNA delle cellule contenenti il plasraide in vivo e misurando il rapporto della radio-attivit? separatamentenel BUA plasmidico e nel DNA cromosomico? Con questo metodo il numero di copia dei plasmidi avente la stessa dimensione del pHC3M (peso molecolare > 1,6 ? 10^ d) risultava essere circa 1000/per cellula (peso molecolare del oromoBoma *?2 ? 10^ d)? Dal 60 al 65$ del contenuto totale di DNA della cellula era DNA plasmidico? Per contrassegiare in vivo il DNA, le cellule contenenti i plasmidi erano coltivate su un mezzo di 001tura M9 integrato con i seguenti componenti: 0,5$ di casamino acido (Difco), 0,5$ di glucosio, 1 yUg/ral divitamina ?^, 1 minole di MgiSO^i 2 jcig/ml di timidina, 250 yu^ml di adenosina e 0,4 mBq/ral di J_ ? _y-timidina j_ 888tBq/mnole, Chemapol,Pragg/?

Le cellule contenenti plasraide erano digerite secondo Womble ed altri / J? Bacteriol, 130 (1977)? 148-153_/? H DNA cromosomico e plasmidico venivano separati fra loro mediante centrifugazione con gradiente di bromuro di etidio/cloruro di cesio alla densit? di equilibrio) del lisato delle cellule derivante da una sospensione batterica accresciuta fino a 2 mi (rotore della Beckman Tipo 65, (OD ? 4-5/4500 giri/minuto,40 ore, 20?C)?

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II numero di copia aumentato e illustrato nelle figure 6 e 7* Nella figura 6 sono mostrate le macchie corrispondenti ai DNA ?????<?\--'?V'AA/?;

T s VVoo5^ plasmidiciricombinantiAp t To di origine pBR322 dopo la separazione mediante elettroforesi con bromuro di etidio/gel di agarosio? Tutti i oampioni sono stati preparati con la medesima tecnica, dalla stesea quantit? di cellule HB101 contenenti piasmide j_ Bimboim and Doly, Nudeio Acide Ree. 2.? 1513~1523 (197S)J I campioni 1-2 e 4-6 sono plasmidi ricombinanti contenenti un DNA estraneo di 1,5-1?0 kb tra i punti di spaccatura E00RI e BatnHI del plasraide pBR322* Il campione 3 ? un plasmide della stessa dimensione che contiene la mutazione responsabile dell?alto numero di copia (pHCl)?

Nella figura 7 sono mostrate le macchie del DNA delle cellule ?

di Eccoli HB101 contenenti il plasmide p715 (campione A) e il plasmide pHC314 (campione B) dopo la separazione mediante centrifugazione 00n gradiente di bromuro di etidio/cloruro di cesio* (il plasmide p715 ha la stessa struttura del pHC314i tranne per la mutazione responsabile dell'alto numero di oopia)* La fotografia ? stata fatta dopo separazione del plasmide e del DNA cromosomi00 mediante centrifugazione, con illuminazione u*v* della provetta di centrifugazione contenente il DNA? Come ? chiaramente illustrato nella fotografia,nel DNA ottenuto dalle cellule contenenti il plasmide a numero di copia normale (campiona A) la striscia inferiore contenenteplasmide ? quasi completamente mancante* D?altro lato il DNA del plasmide pHC314 ottenuto dalla Btessa quantit? di cellule con la medesima tecnica forma una larga striscia sotto la striscia contenente il DNA cromosomico, a causa del numero di copia notevolmente aumentato del plasmide.

Negli esperimenti si usavano i segienti materiali e le seguenti tecniche: Ceppi di batteri e plasmidi:

pBR 322, amp1*, tot1*[_Bolivar, P* ed altri: Gene 2, 95-H3 (1977)_/J

p X* ? ?

pBR329 amp , chi , tet / Covarubbias, L?, Bolivar,F?: Gene 17, O -? (Oo'fr 79-890982)_7J

I preparati di DNA plasroidico V vX e AN7 sono stati preparati nell*Istituto di Biochimica, Centro di Ricerca Biologica dell?Accademia ungherese di Scienze, Szeged,Ungheria / Vedi, B?: Nucleic Acids Research, li, 2427-2446 (1983)_/.

I-preparati impiegati di endonucleasi di restrizione,polinuoleotide-chinasi indotta da T e polinucleotidi ligasi impiegati sono stati pre-4

parati nell?Istituto di Biochimica, centro di Ricerche Biologiche dell'Accademia Ungherese di Scienze; Szeged,Ungheria,usando metodi di purificazione pubblicati / Roberts, R#J*i Nucleic Acids Research 11, r135-r137 (1983); liirray,N?E# ed altri: J? Mei, Biol? 132,493-5?50979)* Panet A? ed altri; Biochemistry, 12, 5045-5050 (1973)_/? Il frammento di Klenow dell'enzima DNA polimerasi I era il prodotto dei New England BioLabs,mentre la fosfatasi alcalina batterica (BAP) era prodotta da Worthington*

_ *?

II Lf* - ?^p__/ATP (istituto Un^ierese degli Isotopi, Budapest) aveva una attivit? specifica di 22 TBq/mK#

Il mezzo di coltura ??? [_Miller, J*H?, ed* ExperimentB in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratoiy, New Yorie (1972)_/ conteneva 10 g/litro di Bacto Triptone (Difco), 5 ?/l di Bacto estratto di lievito (Difco) e 5 g di NaCl* Per preparare le lastre ???, il mezzo di coltura ??? era integrato con 15 g/l di Bacto Agar (Difoo)*

Per isolare plasmide di DNA, le razze batteriche HB101, C600 e ED88OO contenenti i plasmidi adatti erano coltivate su mezzo di coltura ??? contenente 100 <u^ml di ampioillina (pharmachim, Sofia)? Prima dell?isolamento di ciasoun plasnide non-pHC, a 0,7*-0|8 si aggiungevano 170 miorogrammi/ml d? cloranrfenicolo alle colture batteriche che erano poi agitate per altre 10-12 ore? I plasmiliadalto numero di copia (pHC) venivano isolati dalle cellule di una ooltura coltivata fino a fase stazionaria, senza amplificazioni? Quando si isolava DNA plasnidioo in quantit? preparativi (da 50 a 100 midicoltura batterioa nel caso di plasmili pHC, e da 1 a 3 H i coltura nel oaso di altri derivati), si preparava un lisato linpido con la V

tecnica di Clewell e Helinski J? Bacyeriol?, 110, 11350972)_/, e il DNA plasraidico era purificato su una colonna di Sephacryl S100 (Pharmacia)? Per isolare il UNA plasnidico per scopi analitici (da 1,0 a 1,5 mi di coltura bacterioa) si ueava il metodo .all?acetato potassico sviluppato da Bimboira e Doly e modificato da D.Ish-Horowich /^Maniatis,T? ed altri: Molecular Cloning, C!old Spring Harbor Laboratory, New York (1982)_/?

La digestione dei campioni di DNA ad opera dell'endonucleasi di restrizione era effettuata nelle condizioni di reazione raccomandate dai New England BioLabs*

Per trasfornare i frammenti di DNA con estremit? a singolo trefolo in frangenti con estremit? smussate, si precipitava il DNA con alcol dopo digestione coll?enzima di restrizione, e poi si scioglieva in un tampone comprendente: 50 mM di Tris-HCl pH 7?4? 7 mM di MgCl^, 1 mM di ditiotreitolo, 0,1 mM di dATP, 0,1 mM di dCTP, 0,1 mM di dOTP, 0,1 mM di TTP (volume finale: 10-20 yulitri, concentrazione di DNA: 200-250 yU^ml)? La soluzione era poi incubata con 1-2 U di frammento di Klenow della DNS polimerasi I a 37?C, per 15 minuti [_Maniatia, T? ed altri: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratoiy, NeviYork (1982)_/?

La miscela di reazione (30-^40 ^ul)usata per ligare frammentin osi'' DNA con estremit?*'appiccicose" conteneva 0,5?1f0 yug di DNA, 66 mM di Tris-HC1 (pH 7,6), 5 mM di MgClg, 5 mM di ditiotreitolo, 1 mM di ??? e 1 U di polinucleotide ligasi indotta da T^? La lig^zione era condotta a 14?C per 2-3 ore f_ Maniatis,T ed altrii Molecular Cloning, Cold ?>ring Harbor Laboratory, New York (1982)_/? I franmenti con estremit? smussate erano ligati in un tampone contenente: 30-40 yU?/ml di DNA, 25 mM di Tris-ECl (pH 7?4)? 5 mM di MgClg, 5 niM di spermidina, 1 mM di AH?P, 10 yu^ml di BSA (Sigma, l?ype V). Alla miscela di reazione si aggiungevano da 4 EL6 U di polirmele?ide ligasi indotta da e B? incubava a 14?C per 8-12 ore Maniatis ed altri: Moleoular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)7 ?

L'elettroforesi su gel dei campioni di DNA era attuata in .geli di agarosio allo 0,8-2,0$ (tipo I, Sigma), in apparecchi per elettroforesi orizzontali, seguendo la teanica descritta da Helling ed altri [_J* Vinci. 14? 1235 (1974)7? L'elettroforesi su gel di poliaorilammide (usando 1$ e 8$, spessore 1 mm, geli verticali) era attirata secondo Maniatis ed altri /?Bioohemistiyf14.3787-3794 (1975)7 ?

Per isolare frammenti di DNA da geli di a^zosio e di poliacrilamnide B? usava la tecnica sviluppata da Wiriberg ed altri (_ Nudeio Aoids Res* 8, 253-264 (1980)_/ impiegando carta DEAE.

Le cellule competenti per la trasformazione delle razze batteriche HB101, C600, e ED8800 venivano preparate col cosiddetto metodo al CaCl^ riportato da Mandai e Higa f J? Mol? Bici,,52. 154 (1970)7.

La defosforilazione dell'estremit? 5*-dei frammenti di DNA, il contrassegno delle estremit? con polinuoleotidechinasie con f _JATP 'J u

Q

S?* %O e la determinazione della sequenza dei nucletidi venivano effettuate ee? condo il procedimento descritto da Maxam and Gilbert ^ Methods Enzymol* 65. 499 (1977)J?

Sei plasmidi seoondo l'invenzione sono particolarmente preferiti i vettori plasmidi con alto numero di copia aventi la stessa regione di replicazionedelpBR322,una mutazione del Punto G?? T nel gene del piccolo HNA funzionante oome.repressore della replica, e

a) contenenti il gene di resistenza all'ampicillina del pBR322 come marcatore genetioo selettivo, e in cui il gene per la resistenza alla tetraciclina ? mancante o inattivato, o

b) contenenti i geni per la resistenza all'ampicillina e alla tetraciclina del plasmide pBR322 come marcatore genetico selettivo, e in cui la trascrizione del gene per la resistenza alla tetraoiclina ? attuata da un mutante che ? pi? debole di quello naturale o da un promotore estraneo?

I plasmidi illustrati nelle figure 3,4 e 5 sono esempi preferiti dei plasmidi ad alto numero d? copia secondo l'invenzione ohe hanno le seguenti propriet? caratteristiche:

1, In conseguenza di una modificazione nella struttura del gene codificante lo SNA d? basso peso molecolare funzionante oome repressoredireplicazione,la loro replicazione?de?repressa, perci?ilnumero di oopia entrola,cellula ? sostanzialmente aumentato ed e generalmente attorno a 1000 (oirca il 6jfodel contenuto totale di DNA della cellula)? Questo alto numero di copia non ha influenza sulle cellule di E? ooli usate come cellule ospiti?

2? I plasmidi di questa serie contengono i punti di scissione per numerose ?ndonucleasi di restrizione, perci? in queeti plasmidi possono essere inser?? ol i>

?x?1) ti facilmente frammenti di MA digeriti da questi enzimi, da loro combini ? zioni o da altre endonucleasi producenti le medesime estremit??

Punti adatti per la donazione nei plasmidi preferiti secondo l'invenzione sono i seguenti:

pHC 314: C1al, HindlII, XbaI,BamHI,Bg1II e combinazioni a piacere di questi punti;

pHC 312: C1al,HindlII, XbaI, Bg1II,EcoRI e combinazioni a piacere di questi punti;

pHC 624; EcoRI,HindlII,BamHI, XbaI,BglII, Smal, (Xmal), Sal? e loro combinazioni con qualche limitazione?

3? La dimensione dei plasmidi pHC preferiti ? notevolmente pi? piccola di quella del pBR322 di partenza, cos? la dimensione dei plasmidi illustrati nelle figure 3?4 e 5 ? 2405 bp, 2010 bp e 2015 Lp? Ci? ? vantaggio? so poich? il numero di copia della maggior parte dei plasmidi vettori entro la cellula ? inversamente proporzionale alla dimensione del plasmide? In esperimenti di clonazione dei geni, il gene pi? grosso pu? essere efficacemente clonato se si impiegano vettori pi? piccoli?

4? Questi plasmidi hanno il gene di resistenza all'ampicillina del pBR322 originale come marcatore genetico selettivo?

5? Essi contengono l'origine di replicazionedell'originalepBR322, Secondo un altro aspetto dell'invenzione ? fornito un procedimento per la preparazione di vettori plasmidi ad alto numero di copia che comprende la produzione,nella parte del gene responsabile della produzione del repressore della replica plasmidioa di un plasmide, di ima mutazione modificante la produzione di repressore?

Vo Seoondo una forma realizzaiiva preferita del processo fornito dall*invenzione una mutazione del punto modificante la produzione di repressore ? realizzata nella parte del gene codificante il repressore RNA in un derivato del pBR322 o in qualsiasi altro plasmide avente la stessa regione di replicazione,in cui ilgene per la resistenza alla tetraciclina?inattivato o presenta un funzionamento represso e, se si desidera, la parte di DNA responsabile della produzione della proteina della membrana per la resistenza alla tetraciclina ? rimpiazzata da un polioollegatore DNA sintetico in uno o pi? stadi?

Come descritto qui prima, la mutazione ? preferibilmente tuia mutazione del punto G ?-V T nella posizione 3074? seguendo la numerazione originarle del pBR322?

per l'eliminazione dei problemi provocati dalla resistenza alla tetraciclina sono disponibili diversi sistemi alternativi? Secondo una possibilit? la parte di DNA r?sponeabile della produzione della proteina della membrana per la resistenza alla tetraciclina ? rimpiazzata da un polioollegartore di DNA di origine sintetica che pu? essere scisso da uno o pi? importanti enzimi di restrizione* Alternativamente,una frazione di DNA estranea, pu? essere inserita nel gene per la resistenza alla tetraciclina ohe ne inattiva la funzione. Seoondo un'altra possibilit?, la trascrizione del gene per la resistenza alla tetraciclina viene ridotta da una mutazione nella regione del promotore o rimpiazzando il promotore naturale con un promotore "estraneo" che assicura una trascrizione meno intensa? Tutte queste tecniche e le loro ovvie modificazioni rientrano nell'ambito dell'invenzione?

I vettori plasmidi ad alto numero di copia secondo l'invenzione han- IO - ?<?1 no svariate possibilit? di applicazione, come per esempio la preparazione di qualsiasi parte olonata dell'intero plasmide o dell'intero plasmide "ohimaera" in una forma pura,per prove di controllo,verifioa di struttura, modificazione transolonazione, eoo? Quando ei usano i plasmidi seoondo l'invenzione, si pu? ottenere la stessa quantit? di DNA da una quantit? di materiale di partenza notevolmente inferiore ohe nel caso dei plasmidi generalmente usati noti dalla letteratura? Nel caso dei plasmidi pHC esemplificati, ? necessario oiroa 20-30 volte meno materiale di partenza ohe non dal pBH322 per produrre la stessa quantit? di DNA? Il plasmide DNA, che pu? essere isolato da una singola colonia di un batterio portante plasmidi pHC, e sufficiente per 3-4 analisi di restrizione? Da un litro di coltura di batterio si possono isolare pi? di 10 mg di plasmide puro?

Se la maggior quantit? del prodotto del gene clonato ? tollerabile per la cellula ospite, la sintesi di qualsiasi prodotto gene pu? essere migliorata usando plasmidi pHC secondo l'invenzione? In un caso optimum, l'aumento di resa ? di circa 20-30 volte,poich? si pu? raggiungere questo grado di aumento della dose del gene? In certi casi l'aumento sar? alquanto minore per il ruolo limitante di altri fattori*

L'inserimento di parti di policollegatore nei plasmidi pHC d? loro un'alta flessibilit?? Se i punti di scissione disponibili non sono adatti per il gene ohe deve essere clonato, questi possono essere rimpiazzati o possono essere resi adatti alla clonazione con altri frammenti per mezzo di adattatori sintetici?

Per quanto riguarda l'applicazione industriale va citata la produzione di insulina, vasopressina, eco?

Ta osservato ohe gli esperimenti usati per l'illustrazione della invenzione sono soltanto a scopo esemplificat?vo e non limitano l'ambito dell'invenzione? Oltre alle soluzioni tecniche esemplai*icate,vi eono altre numerose possibilit? di applicazione dell'invenzione? Per esempio,usando rispettivamente gli enzimi Fuu4HI e Tthi II si possono staccare dal pBR322 originale le corrispondenti parti DNA contenenti rispettivamente 21 nuoleot?di e 32nucleotidi,si possono Bintetizzare ohimioamente i corrispondenti frammenti contenenti una mutazione del punto G __ ^ T e inserirli poi nella molecola di pBR322 in luogo dei frammenti eliminati*

Analogamente, si pu? inserire nella molecola un'ampia variet? di frammenti di policollegatore DNA sintetico in luogo della parte del DNA parzialmente o interamente eliminata aresponsabile della resistenza alla tetaraoiclina.

Queste ed analoghe soluzioni ed i plaemidi ottenuti con questi metodi rientarano nell'ambito dell'invenzione?

I plasmili pHC 312,pHC 314 e pHC 624 sono stati depositi presso la collezione Nazionale di Microorganismi (OKI,Ungheria) con rispettivamente i Nn* 00279, 00280 e 00281, il 7 Marzo 1984.

Le razze di micreorganismi oitate sotto e, rispettivamente, i plasmili, sono stati depositati presso la Collezione Nazionale di Micreorganismi (OKI,Ungheria) il 25 Luglio 1984 i seguenti numeri:

oo NO

E, coli HB 101 00290

E. coli ED 8800 00291

E. coli C 600 00292

P 715 00293

pHC 1 ??294

pHC 81 ??295

ITAU7 00296

??vx 00297

_o_?_ocoeo_

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4 ?

Claims

RIVENDICAZIONI

1?Vettori plasmidi ad alto numero di copia contenenti nella parte del gene responsabile della produzione del repressore della replicazione del plasmide una mutazione modificante la produzione di repressore*

2* Vettori plasmidi ad alto numero dicopia aventilastessa regione di replicazione del pBR322 e una mutazione del punto 0 ? yT nel gene del piccolo HNA"fungente da repressore di replicazione, e

a) contenenti il gene di resistenza all'ampioliiina del plasmide pBR322 come marcatore genetico selettivo, in detti vettori plasmidi il gene di resistenza alla tetraciclina essendo inattivato o interamente mancante o avendo una funzione repressa, o

b) contenenti i geni di resistenza all*ampicillina e alla tetraciclina del plaemide pBR322 come marcatori genetici selettivi, in detti vettori plasmidi la trascrizione del gene di resistenza alla tetraciclina essendo attuata da un mutante pi? debole del naturale o da un promotore estraneo*

3* Vettori plasmidi pHC 314? pHC 312 e pHC 624*

4* Microorganismo contenente e riproducente uno qualsiasi dei vettori plasmidi secondo le rivendicazioni da 1 a 3.

5 Procedimento per la preparazione di vettori plasmidi ad alto numero di oopia il (piale comprende la produzione, nella parte del gene responsabile della produzione del repressore della ripetizione plasmidica, di una mutazione modificante la produzione di repressore,

6* Procedimento secondo la rivendicazione 5 ??? la produzione di derivati ad alto numero di copia del pBR322, di suoi derivati o di altri plasmidi aventi la stessa regione di ripetizione del pBR322, in cui, in un derivato del pBR322 o in qualsiasi altro plasmide avente la stessa regione di ri? T;

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??4 petizione, contenente il gene per la resistenza alla tetraciclina in una forma inattivata o in una forma presentante una funzione repressa, nella parte del gene codificante il repressore RNA B? produce una mutazione del punto modificante la produzione di repressore e, se si desidera, la parte DNA responsabile della produzione della proteina della membrana per la resistenza alla tetraoiclina ? rimpiazzata da un policollegatore DNA sintetico, in uno o pi? stadi?

7 Procedimento secondo la rivendicazione 5 ? 6, in cui si produce una mutazione del punto G __ nella posizione 3074 della parte del gene codificante il repressore HNA, seguendo la numerazione originale del pBR322?

8 Procedimento secondo la rivendicazione 5 o 6 in cui, in un plasmide contenente una mutazione del punto G _ ? T, la parte di DNA responsabile della produzione della proteina della membrana che determina la resistenza alla tetraoiclina ? rimpiazzata da una parte DNA di policollegatore sintetico scindibile con uno o pi? enzimi di restrizione, oppure una parte di DNA estraneo disattivante la sua funzione ? inserita nel gene e di resistenza alla -tetraciclina, oppure la trascrizione del gene di resistenza alla tetraciclina ? repressa da una mutazione nella regione del promotore, oppure rimpiazzando il promotore naturale oon un promotore estraneo che fomisoeunatrascrizione meno intensa?