ITCA20120004A1 - Unico reattivo disidratante e diafanizzante per istologia e citologia non nocivo e non tossico, biodegradabile 88%, a bassa volatilita' - Google Patents

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Description

Unico reattivo disidratante e diafanizzante per istologia e citologia non nocivo e non tossico, biodegradabile 88%, a bassa volatilità
La presente invenzione concerne un unico reattivo disidratante e diafanizzante per istologia e citologia non nocivo e non tossico, biodegradabile 88%, a bassa volatilità. In particolare, l'invenzione concerne una composizione per la processazione di campioni istologici, citologici o campioni simili per la loro analisi, detta composizione essendo non nociva e non tossica e in grado di produrre la disidratazione e diafanizzazione dei campioni biologici in breve tempo.
Le procedure pre-analitiche impiegate in anatomia patologica prevedono una fase di trattamento (o di processazione) dei campioni biologici, preventivamente fissati in formalina, consistenti ad esempio in tessuti o cellule prelevati da un paziente oppure post-mortem, che consente di solidificare il campione e poterlo tagliare nelle sezioni da analizzare.
La fase di processazione dei campioni biologici comprende generalmente le seguenti fasi: a) fase di fissazione; b) fase di disidratazione c) fase di diafanizzazione; d) fase di inclusione.
Nella fase di fissazione, i pezzi anatomici, provenienti, ad esempio, dalle sale operatorie o sale settorie o da ambulatori chirurgici, vengono immersi in un liquido fissativo, in genere formalina tamponata 10% o alcool o altri fissativi specifici a seconda della particolarità dell'analisi istologica o immunoistochimica successiva. La funzione di questa fase à ̈ di bloccare la denaturazione delle proteine impedendo il distacco delle catene proteiche. Pertanto, la fissazione ha lo scopo di conservare la struttura del tessuto.
La fase di disidratazione consiste nella eliminazione dell'acqua (la formalina à ̈ una soluzione acquosa di aldeide formica) dal campione biologico per poterlo in seguito includere in paraffina, quest'ultima non essendo miscibile in acqua. Questa fase viene condotta per immersione del campione in un solvente idrosolubile anidro.
La fase di diafanizzazione permette al campione biologico di essere successivamente incluso in paraffina. A questo scopo si impiegano solventi compatibili con l'agente impregnante (ad esempio paraffina) che in questa fase sostituiscono il solvente idrosolubile. Composti diafanizzanti sono, ad esempio, solventi della paraffina, xilene o sostituti dello Xilene quali, ad esempio, D-limonene, Isoparaffine, Ottano, Acetone.
Infine, il campione viene sottoposto alla fase di inclusione in paraffina consistente nell'immersione del campione in paraffina fusa a circa 54 - 58 °C. In questa fase, il solvente diafanizzante contenuto nei tessuti é sostituito dalla paraffina. Dopo aver incluso i campioni in una formella, si procede al raffreddamento e solidificazione del campione che permetterà di effettuare il taglio con il microtomo delle sezioni in micron desiderate per l'osservazione al microscopio.
Attualmente la processazione dei campioni viene condotta automaticamente mediante apparecchiature che consentono di programmare i tempi di stazionamento, la temperatura, la pressione e il vuoto in ciascun reattivo. Normalmente le stazioni sono 12 o 15 e il tempo medio dell'intera fase di processazione à ̈ di 12 -18 ore. Il tempo dipende dal tipo di tessuto. Mediante il metodo standard convenzionale, la processazione viene condotta mediante passaggi in alcool avente gradazione crescente per poter disidratare il tessuto biologico. I passaggi avvengono prima in un alcool con un volume di 50%, poi un successivo passaggio in un alcool 70%, un successivo passaggio in un alcool 80%, un successivo passaggio in alcool 90%, tre passaggi in alcool 96%, tre passaggi in alcool assoluto anidro 99,99%. Al termine di questa fase tutta l'acqua presente nel tessuto del campione à ̈ sostituita con alcool etilico.
I successivi passaggi corrispondo alla fase di diafanizzazione avente lo scopo di sostituire l'alcool con un solvente compatibile con la paraffina. Normalmente in questa fase si impiega Xilolo o un suo sostituto e si effettuano 3 passaggi in 3 diverse stazioni perché à ̈ necessario che il tessuto, dopo aver rilasciato l'alcool nel primo passaggio, passi ad un'altra stazione con il solvente pulito.
Infine, nella fase di inclusione il tessuto à ̈ processato in 3 o 4 stazioni di paraffina fusa a 54 58°C.
Riassumendo, la tecnica nota, dopo la fissazione in formalina al 10%, prevede le seguenti stazioni e tempi :
1,00 ora in Alcool 50%
1,00 ora in Alcool 70%
1,00 ora in Alcool 80%
1,00 ora in Alcool 96%
1,00 ora in Alcool 96%
1,30 ora in Alcool 99,99%
1,30 ora in Alcool 99,99%
1,00 ora in Xilolo o sostituto
1.00 ora in Xilolo o sostituto
1,30 ora in Xilolo o sostituto
1,30 ora in Paraffina
2.00 ore in Paraffina
2,00 ore in Paraffina.
Sulla base di quanto sopra descritto, à ̈ evidente che i metodi noti presentano numerosi svantaggi: utilizzano diversi reattivi rendendo necessaria la preparazione di gradazioni crescenti di alcool, xilolo o suoi sostituti; impiegano solventi con alta volatilità d'evaporazione (alcool o Xilolo); prevedono l'impiego di sostanze che provocano allergie, quali ad esempio xilolo, toluolo, ottano, d-limonene, terpene, acetone, isoparaffine, o che sono nocivi e in alcuni casi tossici per gli operatori, quali ad esempio xilolo, toluolo, ottano, acetone, isoparaffine; prevedono tempi lunghi e numerose stazioni per la processazione .
Sono noti altri metodi di processazione che utilizzano, in sostituzione dell'Alcool e dello Xilolo o di un sostituto dello Xilolo, una miscela di alcool Etilico, alcool Isopropilico e Idrocarburi derivati della raffinazione del petrolio quali, per esempio, Ottano oppure Isoparaffine. In particolare, i brevetti EP0822403 e EP1508026 descrivono un metodo per la processazione di tessuti basato sull'utilizzo di una miscela che permette di effettuare contemporaneamente la disidratazione e la diafanizzazione dei campioni. Tale miscela à ̈ costituita da ottano (o isoparaffine), alcol isopropilico ed etanolo. Tuttavia, anche se questi metodi riducono i tempi di processazione dei campioni, presentano il grave svantaggio di impiegare sostanze, quali ottano oppure isoparaffine, aventi alta volatilità d'evaporazione e nocività verso gli operatori .
Alla luce di quanto sopra esposto risulta, pertanto, evidente l'esigenza di poter disporre di nuovi reattivi in grado di superare gli svantaggi dei reattivi noti.
Gli inventori della presente invenzione hanno ora trovato che l'estere 2-etilesil benzoato ha capacità diafanizzante . Pertanto, gli inventori hanno preparato una composizione disidratante e diafanizzante per la processazione dei campione biologici da sottoporre ad analisi, detta composizione essendo esente da idrocarburi policiclici aromatici cancerogeni per l'uomo. La composizione secondo la presente invenzione, a differenza dei reattivi noti, non à ̈ nociva né tossica per gli operatori, in conformità alla direttiva europea in materia di protezione dei lavoratori contro i rischi derivanti da esposizione ad agenti chimici, fisici e biologici durante il lavoro, e riguardanti il miglioramento della sicurezza e della salute dei lavoratori. Inoltre, la composizione della presente invenzione presenta bassa volatilità sempre in conformità alle direttive europee in materia di sicurezza nell'ambiente di lavoro e alta biodegradabilità (circa 88%) per un maggior rispetto dell'ambiente .
L'impiego della composizione secondo la presente invenzione permette di ridurre notevolmente i tempi di processazione dei campioni e facilitare le fasi di pro cessazione. La composizione secondo l'invenzione, infatti, sostituisce i reattivi delle fasi di disidratazione e diafanizzazione della tecnica nota. Pertanto, direttamente o a seguito della fissazione in formalina 10%, il campione viene processato con la composizione dell'invenzione, come unico reattivo, evitando le fasi distinte di disidratazione in alcool etilico e di diafanizzazione in xilolo o nei suoi sostituti. Inoltre, secondo il metodo della presente invenzione, le stazioni di processazione sono ridotte a 3 con un tempo medio di stazionamento nel reattivo di 1,30 ore. Più precisamente, la processazione del tessuto, dopo la fissazione, comprende 3 passaggi del tessuto nello stesso reattivo in tre stazioni differenti per poi passare alla fase d’impregnazione in paraffina con dei tempi di 1,30 ore ciascuno.
Il tempo di processazione quindi, rispetto alla tecnica preesistente, à ̈ ridotto a circa 9 ore per la processazione completa, contro le 15 oppure 18 ore della processazione convenzionale. Di seguito si riporta un esempio di processazione secondo l'invenzione che si riferisce ad un tessuto con alta percentuale di sostanza lipidica (quindi critica) e con uno spessore di 4 min. Tessuti con bassa percentuale di sostanza lipidica e con uno spessore più sottile hanno portato alla notevole riduzione dei tempi di processazione e delle stazioni.
Un esempio di processazione mediante l'impiego della composizione dell'invenzione, dopo la fissazione, può comprendere le seguenti stazioni e tempi:
1,30 ora Reattivo oggetto dell'invenzione;
1,30 ora Reattivo oggetto dell'invenzione;
1,30 ora Reattivo oggetto dell'invenzione;
1,30 ora Paraffina;
1,30 ora Paraffina;
1,30 ora Paraffina.
In alternativa, per piccole biopsie, il metodo può comprendere :
5 minuti Reattivo oggetto dell'invenzione;
5 minuti Reattivo oggetto dell'invenzione;
5 minuti Reattivo oggetto dell'invenzione;
5 minuti Reattivo oggetto dell'invenzione;
5 minuti Paraffina;
5 minuti Paraffina.
Nelle prove sperimentali in cui à ̈ stata utilizzata la processazione dei campioni biologici mediante l'impiego della composizione secondo la presente invenzione, à ̈ stato osservato un miglioramento della struttura cellulare del tessuto, ossia una preservazione della morfologia e della colorazione del preparato diagnostico.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una composizione comprendente o consistente in 2-etilesilbenzoato e una miscela di alcol etilico e alcol isopropilico, in cui la concentrazione di 2-etilesilbenzoato varia da 30 a 70 %, la concentrazione di alcol etilico varia da 30 a 60 % e la concentrazione di alcol isopropilico varia da 10 a 30%, in cui dette percentuali sono percentuali in volume rispetto al volume totale della composizione.
Il 2-etilesilbenzoato può essere sostituito da una miscela di diisobutil o dimetil glutarato alla concentrazione da 55 a 70%, diisobutil o dimetil adipato alla concentrazione da 10 a 30% e diisobutil o dimetil succinato alla concentrazione da 10 a 25%, in cui dette percentuali sono percentuali in volume rispetto al volume totale della miscela di diisobutil o dimetil glutarato, adipato e succinato.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso di una composizione comprendente o consistente in 2-etilesilbenzoato e una miscela di alcol etilico e alcol isopropilico per la processazione di campioni biologici quali, ad esempio, campioni isologici, citologici o simili. Detti campioni possono essere sottoposti ad analisi microscopica. Preferibilmente, nella composizione della presente invenzione la concentrazione di 2-etilesilbenzoato varia da 30 a 70 %, la concentrazione di alcol etilico varia da 30 a 60 % e la concentrazione di alcol isopropilico varia da 10 a 30%, in cui dette percentuali sono percentuali in volume rispetto al volume totale della composizione.
La presente invenzione concerne inoltre un procedimento di processazione di campioni biologici quali, ad esempio, campione istologico, citologico, o simili, comprendente o consistente la fase di trattamento del campione biologico con la composizione come definita sopra.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso di 2-etilesilbenzoato come agente diafanizzante di campioni biologici quali ad esempio campioni istologici, citologici o simili.
La presente invenzione sarà ora descritta, in modo illustrativo e non limitativo, secondo forme preferite di realizzazione.
ESEMPIO 1: Processazione di biopsie di piccole dimensioni (polmonari, renali, epatiche) di circa 1 mm di spessore e di 1 cm di lunghezza
Il prelievo bioptico appena effettuato (TAC guidato, o per via endoscopica, o per via percutanea) viene immerso immediatamente nella composizione della presente invenzione per 1 ora (per 30 minuti se il campione à ̈ già fissato in formalina) . Quindi il campione si include in paraffina e si affetta al microtomo. Le sezioni ottenute si mettono in stufa a 60° per circa 20 minuti. Successivamente si procede alla colorazione preliminare con Ematossilina Eosina (la fase di colorazione ha durata standard di circa 1 ora compreso il montaggio del vetrino). Quindi si porta il vetrino alla lettura al microscopio.
Conclusioni: dal momento del prelievo bioptico al momento della formulazione diagnostica (anche se preliminare, ma in ogni caso MORFOLOGICA) occorrono solo tre ore nel caso di biopsie non "fissate"; circa due ore e mezzo nel caso di biopsie arrivate in laboratorio già "fissate in formalina 10%".
Una parte degli stessi campioni biologici à ̈ stata sottoposta a una processazione con soluzioni contenenti alcool isopropilico, alcool etilico e ottano o in alternativa isoparaffine. I campioni processati con la composizione dell'invenzione hanno dimostrato che dopo le colorazioni d'istochimica in Ematossilina - Eosina la struttura cellulare era superiore dal punto di vista sia morfologico sia della resa cromatica. Si poteva quindi osservare una maggiore definizione dei particolari della struttura cellulare. Inoltre, le prove d’immunoistochimica hanno dimostrato che i risultati erano sovrapponibili per quanto riguarda la positività e la negatività della reazione antigeneanticorpo. Tuttavia, i campioni processati con la composizione oggetto dell'invenzione, in fase di lettura al microscopio, avevano una migliore definizione del cromogeno nei siti positivi antigeneanticorpo. Pertanto, soprattutto nei casi in cui à ̈ necessario fare, per fini diagnostici, un'analisi quantitativa di positività della area del tessuto, la pro cessazione secondo la presente invenzione rende la diagnosi più attendibile.
ESEMPIO 2: Processazione di un prelievo di tessuto polmonare formato per circa il 50% in volume da tessuto apparentemente normale e 50% da tessuto apparentemente non normale , ossia patologico (possibile tumore), avente la forma di un parallelepipedo di dimensioni di 1 cm x 1 cm x 0,5 cm.
Il campione di tessuto appena prelevato in sala operatoria lo si riduce alle dimensioni sopra citate e lo si immerge per 3 ore in nella composizione dell'invenzione. Quindi lo si include in paraffina (circa 1 ora), si affetta al microtomo, si porta in stufa per circa 20 minuti e si colora con ematossilina eosina (durata della colorazione circa 1 ora).
Conclusioni: dal momento del prelievo in sala operatoria al momento della formulazione diagnostica occorrono circa 6 ore, considerando anche i tempi medi di trasporto del materiale dalle sale ai laboratori.
Come nel caso precedente, i campioni sono stati processati anche con soluzioni contenenti alcool isopropilico, alcool etilico e ottano o in alternativa isoparaffine. I risultati con i campioni processati con la composizione oggetto dell'invenzione sono stati considerati sovrapponibili rispetto ai risultati ottenuti sia con la composizione con ottano sia con la composizione contenente le isoparaffine. Le prove d'immunoistochimica hanno dimostrato, come precedentemente, che i campioni processati con la composizione oggetto dell'invenzione, in fase di lettura al microscopio, avevano una migliore definizione del cromogeno nei siti positivi antigeneanticorpo. Pertanto, soprattutto nei casi in cui à ̈ necessario fare, per fini diagnostici, un'analisi quantitativa di positività della area del tessuto, la processazione secondo la presente invenzione rende la diagnosi più attendibile. La stessa prova à ̈ stata effettuata con la processazione tradizionale e le conclusioni sono state le stesse, con aspetti morfologici e di reazioni immunoistochimiche nettamente migliori nel caso di processazione con la composizione oggetto dell'invenzione.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1) Composizione comprendente o consistente in 2-etilesilbenzoato e una miscela di alcol etilico e alcol isopropilico in cui la concentrazione di 2-etilesilbenzoato varia da 30 a 70 %, la concentrazione di alcol etilico varia da 30 a 60 % e la concentrazione di alcol isopropilico varia da 10 a 30%, in cui dette percentuali sono percentuali in volume rispetto al volume totale della composizione.
  2. 2) Uso di una composizione comprendente o consistente in 2-etilesilbenzoato e una miscela di alcol etilico e alcol isopropilico per la processazione di campioni biologici .
  3. 3) Uso secondo la rivendicazione 2, in cui la concentrazione di 2-etilesilbenzoato varia da 30 a 70 %, la concentrazione di alcol etilico varia da 30 a 60 % e la concentrazione di alcol isopropilico varia da 10 a 30%, in cui dette percentuali sono percentuali in volume rispetto al volume totale della composizione.
  4. 4) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 2-3 , in cui i campioni biologici sono scelti nel gruppo che consiste in campione istologico, citologico.
  5. 5) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 2-4, in cui i campioni biologici devono essere sottoposti ad analisi microscopica.
  6. 6) Procedimento di processazione di campioni biologici comprendente o consistente nella fase di trattamento del campione biologico con la composizione comprendente o consistente in 2-etilesilbenzoato e una miscela di alcol etilico e alcol isopropilico.
  7. 7) Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui la concentrazione di 2-etilesilbenzoato varia da 30 a 70 %, la concentrazione di alcol etilico varia da 30 a 60 % e la concentrazione di alcol isopropilico varia da 10 a 30%, in cui dette percentuali sono percentuali in volume rispetto al volume totale della composizione.
  8. 8) Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni 6-7, in cui il campione biologico à ̈ scelto nel gruppo che consiste in campione istologico, citologico. 9)Uso di 2-etilesilbenzoato come agente diafanizzante di campioni biologici .
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