ITMI20082037A1 - Idrogelo idoneo a contenere e veicolare cellule - Google Patents
Idrogelo idoneo a contenere e veicolare celluleInfo
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
“IDROGELO IDONEO A CONTENERE E VEICOLARE CELLULE” POLITECNICO DI MILANO
La presente invenzione ha per oggetto un idrogelo a doppia matrice polimerica interpenetrante formata da un polimero di acido acrilico o carbomerico, un polimero naturale, un agente di reticolazione, detto idrogelo contenendo cellule appoggiate sulla sua superficie esterna o alloggiate all’interno del reticolo tridimensionale formato da detta matrice polimerica.
CONTESTO DELL’INVENZIONE
Nella cura di molte patologie che portano alla degenerazione di specifici organi, spesso, l’unica alternativa terapeutica possibile è rappresentata dal trapianto d’organi. Laddove possibile, esso è però associato a un grado di rischio elevato per il paziente, dato che sono possibili complicazioni quali la trasmissione di patologie da donatore a ricevente o il rigetto dell’organo stesso, unito alla cronica scarsità di organi disponibili. Inoltre, questo tipo di approccio non può essere applicato a tutti i distretti corporei soggetti a patologie degenerative. Infatti a tutt’oggi non esiste la possibilità di applicare terapie di trapianto in molte patologie degenerative quali, in alcuni casi, quelle a carico di alcuni distretti con tessuti connettivi, quelle del tessuto osseo, del derma e dell’epidermide, oltre che del sistema nervoso centrale.
Un caso emblematico, ed assai noto, è quello delle patologie legate all’infarto del miocardio. Esse infatti sono una comune causa di morte e di abbattimento della qualità della vita in tutto il mondo. In seguito ad un attacco di cuore il miocardio subisce un danno più o meno esteso che porta alla perdita di funzionalità del muscolo cardiaco ed alla formazione di tessuto necrotizzante e non funzionale. Quando il decesso è una conseguenza evitata, l’insufficienza cardiaca cronica, a diversi livelli di gravità, è una prospettiva certa. Allo stato attuale per gli stadi più gravi di questa patologia non sono ancora disponibili delle cure farmacologiche efficaci e pertanto il trapianto spesso è l’ultima possibilità terapeutica ma non sempre purtroppo è perseguibile. Per i casi meno gravi, le cure disponibili permettono solamente un mantenimento dello status quo clinico. Non sono infatti disponibili terapie che portino significativo miglioramento e recupero per il miocardio [si veda al riguardo la monografia J.O. Mudd, D.A. Kass, Nature, volume 451: pgg. 919-928, 2008]. La possibilità di iniettare specifiche cellule sane nelle zone infartuate al fine di indurne la rigenerazione sta emergendo come la via con maggiori possibilità di successo [come risulta evidente per esempio nelle seguenti monografie: M.N. Giraud et al., Tissue Eng 13(8): 1825-1836; 2008. V.F.M. Segers, R.T. Lee, Nature 451: 937-942; 2008. S.J. Dimmeler et al., Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 28: 208-216, 2008].
Il minore livello di specializzazione cellulare nei tessuti a forte componente connettivale rappresenta una situazione forse migliore per certi versi poiché esistono alcune possibilità di realizzare strutture bi- e tridimensionali artificiali in grado di ospitare e veicolare cellule specifiche per il reintegro funzionale delle strutture danneggiate. Questi dispositivi artificiali, noti anche come scaffolds, rappresentano una delle colonne portanti dell’ingegneria dei tessuti ma non sono certo esenti da problematiche [si veda a titolo esemplificativo quanto riportato nella monografia C.H. Evans et al., Tissue Engineering, Volume 13(8), pgg. 1987-1993, 2007]. In questo ambito una tipologia ben nota di danni riguarda quelli a carico delle cartilagini, soprattutto quelle articolari. Il tessuto cartilagineo è un tipo particolare di tessuto connettivo caratterizzato da notevoli doti di resistenza e di elasticità, che svolge un ruolo di sostegno strutturale all'interno dell'organismo. È un tipo particolare di tessuto connettivo e, come tale, è costituito da cellule disperse in una abbondante matrice extracellulare gelatinosa, ricca di fibre (responsabili dell'elasticità) e di sostanza amorfa di origine proteica. Le cartilagini articolari sono quelle che rivestono le superfici delle articolazioni e quelle più note per essere soggette a traumi sono quelle del ginocchio. Non si tratta certo di patologie mortali ma sono fastidiose e possono ridurre la qualità della vita e risultare invalidanti. Le tecniche chirurgiche sviluppate mirano sostanzialmente a ridurre il difetto eliminando la zona lesa ma questo espone l’articolazione ad attriti maggiori e maggior usura nel tempo. Non vi sono terapie farmacologiche sostanzialmente efficaci. La medicina rigenerativa è pertanto guardata come la frontiera per la cura di queste patologie, soprattutto quelle di origine traumatica. Veicolare condrociti e farli permanere vivi in situ è l’impostazione di base delle terapie in corso di sviluppo che si basano principalmente su due approcci similari: a) portare le cellule attraverso l’uso di matrici solide planari della forma del difetto da integrare, b) portare le cellule attraverso gel che vengono iniettati sino a riempire il difetto da integrare. In entrambi i casi le soluzioni propendono per l’uso di materiali biodegradabili al fine di meglio favorire l’integrazione [come dimostrato per esempio nelle seguenti monografie: Jorgensen C et al., Best Practice & Research In Clinical Rheumatology 22(2), Pgg 269-284, 2008. Grayson WL et al., Trends In Biotechnology, (26)4, Pgg. 181-189, 2008].
Analogamente, le patologie degenerative a carico del tessuto osseo possono risultare in una fragilità strutturale particolarmente grave e le principali terapie sono quelle farmacologiche che non sempre però danno garanzia di efficacia e non sono prive di gravi effetti collaterali. Tuttavia anche il settore dell’ingegneria dei tessuti sta portando nuove prospettive alla rigenerazione dell’osso [come può essere riscontrato dalle osservazioni riportate nel seguente lavoro: Waese EYL, Kandel RR, Stanford WL, Skeletal Radiology 37(7), Pgg. 601-608, 2008]. In questo ambito il ruolo fondamentale è giocato dalle proprietà meccaniche dei materiali utilizzati per la realizzazione degli scaffolds, che sono i dispositivi maggiormente impiegabili [come riportato in numerosi lavori monografici tra i quali possiamo citare i seguenti: Stevens MM, Materials Today 11(5), Pgg. 18-25, 2008. Barrere F et al., Materials Science & Engineering R-Reports, 59(1-6), Pgg. 38-71, 2008]. Per dovere di completezza va anche ricordato che in ambito rigenerativo osseo, tendineo e cartilagineo vi sono numerosi studi che vedono l’uso di scaffolds ad alta porosità imbibiti da matrici a base idrogelica contenenti a loro volta le cellule [si veda a tal proposito, per esempio, l’ampia bibliografia citata nel brevetto statunitense US6171610].
A livello generale, brevemente, la letteratura scientifica individua sostanzialmente quattro possibili strade per la rigenerazione dei tessuti:
a) la stimolazione di meccanismi di rigenerazione autonoma endogena – approccio fondato su basi ancora non solide e con procedure non ancora ben identificate, nel complesso ad oggi considerato poco promettente; b) il trapianto di cellule isolate direttamente nel sito danneggiato – approccio empirico basato su un buon principio funzionale ma che porta con sé numerosi svantaggi e problemi quali l’alta perdita cellulare e la conseguente bassa integrazione col tessuto adiacente;
c) il trapianto di tessuto generato in vitro (detto anche graft) – approccio empirico basato su un buon principio tissutale ma con notevoli complessità poiché il graft deve integrarsi al meglio con il tessuto adiacente, essere in grado di sopportare le eventuali sollecitazioni meccaniche a cui va sottoposto una volta in vivo ed eventualmente avere una caratteristica di bioriassorbibilità adeguata con il tessuto bersaglio;
d) l’utilizzo di materiali avanzati micro e nano strutturati che siano in grado di ospitare specifiche popolazioni cellulari fornendo un ambiente compatibile e favorevole e che successivamente possano essere utilizzati come veicolo per l’impianto – approccio avveniristico basato su principi razionali ma che necessita ancora di una piena comprensione di tutti i fenomeni coinvolti.
Quale che sia l’approccio perseguito, le procedure ad oggi disponibili permettono spesso il raggiungimento di una ricostruzione solo parziale e spesso nemmeno di quella. Le ragioni di questo limitato successo sono molteplici e principalmente vanno ricercate negli aspetti cellulari e nella mancanza di un supporto fisico adeguato per le cellule così trapiantate, o iniettate, nel lasso di tempo che intercorre tra l’impianto e l’integrazione con i tessuti adiacenti. Inoltre, in assenza di un adeguato supporto permeabile ai nutrienti le cellule non riescono ad approvvigionarsi dei nutrienti stessi necessari alla loro sopravvivenza.
Le precedenti ragioni stanno portando la ricerca ad orientarsi verso lo sviluppo di matrici di supporto che permettano la veicolazione delle cellule aumentando la sopravvivenza delle stesse e l’integrazione con il tessuto bersaglio, al fine ultimo di dar origine ad un nuovo tessuto funzionale ed integrato istologicamente con le strutture adiacenti.
Alla luce di quanto precedentemente detto, oltre alle cellule, un elemento essenziale nell’ingegneria tissutale è pertanto rappresentato dai materiali utilizzati, tra questi gli idrogeli svolgono un ruolo di primo piano essendo particolarmente utili come sistemi per il sostegno e la veicolazione di cellule e di popolazioni cellulari. In alcuni casi le richieste di funzionalità meccanica rendono imprescindibile l’uso di scaffolds ma molto spesso i tessuti bersagli richiedono di essere inondati da un flusso cellulare che sia stabile e ne permetta il reintegro e questo si può facilmente realizzare con l’uso di appositi idrogeli. Come si è detto, in alcuni casi è possibile anche l’uso di soluzioni miste in cui scaffolds solidi sono imbibiti di idrogeli contenenti o supportanti le cellule.
Gli idrogeli sono strutture polimeriche tridimensionali in grado di rigonfiare trattenendo acqua, o altri liquidi, al loro interno. Le catene polimeriche sono legate tra loro tramite legami intermolecolari che possono essere di diversa natura. Gli idrogeli possono essere prodotti in numerosi modi, uno dei quali consiste nella reazione di uno o più monomeri oppure grazie all’associazione di ponti a idrogeno o forti interazioni di van der Waals tra catene polimeriche. A seconda dei componenti utilizzati, gli idrogeli possono risultare biodegradabili oppure biostabili, biocompatibili o citotossici. Molti idrogeli biocompatibili, biodegradabili e non, stanno ottenendo notevole attenzione da parte del mondo scientifico-tecnico grazie alle loro caratteristiche intrinseche che li rendono particolarmente adatti ed ideali per molte applicazioni in ambito biomedico.
Da un punto di vista strettamente chimico, gli idrogeli possono essere classificati in diversi modi, in base al loro metodo di preparazione, alla carica ionica distribuita o alla loro struttura fisica. Per quanto riguarda il metodo di preparazione, gli idrogeli possono essere classificati come omopolimerici, copolimerici, multipolimerici o polimerici interpenetranti. I primi sono costituiti da reti polimeriche legate tra di loro da un’unità monomerica che deve essere idrofila. I secondi sono costituiti da due comonomeri, almeno uno dei quali deve essere idrofilo. I multipolimerici sono ottenuti partendo da tre o più comonomeri intereagenti tra loro, di cui almeno uno idrofilo. Infine, i polimerici interpenetranti sono ottenuti attraverso il rigonfiamento di una prima rete attorno alla quale successivamente si forma una struttura tridimensionale.
Le proprietà chimiche e fisiche degli idrogeli li rendono pertanto particolarmente adatti per l’utilizzo in campo biomedico e farmaceutico. In particolare, la loro biocompatibilità costituisce il primo requisito fondamentale per tali applicazioni. La loro idrofilia può garantire ottime caratteristiche in termini di permeabilità ai gas e ad altre sostanze, permettendo anche il rilascio controllato di principi attivi e sostenendo la presenza di popolazioni cellulari al loro interno o sulla loro superficie. Una delle prime applicazioni sviluppate, ancor oggi massivamente diffusa, è legata alla fabbricazione di lenti a contatto dove gli idrogeli sono utilizzati grazie alla loro buona stabilità meccanica, il favorevole indice di rifrazione e l’elevata permeabilità all’ossigeno. Altre applicazioni, quali quelle descritte in questa domanda, includono l’uso degli idrogeli quali materiali artificiali bioadesivi, membrane artificiali, cartilagini articolari, pelle artificiale, materiali per la ricostruzione maxillo-facciale e delle corde vocali.
Va sottolineato che gli idrogeli hanno un vasto impiego anche come supporto per la crescita cellulare in vitro in applicazioni di screening farmacologico, di saggio per farmaco-sviluppo, di efficacia farmacologica o di tossicità o per altre caratterizzazioni di tipo elettrofisiologico o biomeccanico. Alcuni di questi saggi sono condotti attraverso dispositivi noti anche come bioreattori.
STATO DELLA TECNICA
La letteratura tecnico-scientifica disponibile per quanto concerne i materiali, ivi compresi gli idrogeli, e la loro utilizzazione in ambito rigenerativo è molto vasta ed in questo ampio panorama, gli idrogeli sono di per sé noti e spesso sono descritti quali mezzi per il rilascio controllato di farmaci (drug-delivery) e come supporti per l’ingegneria dei tessuti [come può essere evinto dalle rassegne monografiche qui di seguito riportate a titolo esemplificativo: J.D. Kretlow et al., Advanced Drug Delivery Reviews 59 pgg.
263–273, 2007. L. Yu et al., Tutorial Review on Chemical Society Reviews, 2008].
La preparazione di vari gel anionici per il rilascio controllato di farmaci è stata descritta nel 1986 da Hsu et al. in Pharmaceutical Research (1996) vol. 13 pp. 1865-1870. In particolare è descritta la preparazione di un gel idrofilo a due componenti costituito da una formulazione di agarosio e carbomer. Questo particolare gel viene preparato miscelando una dispersione di carbomer acquoso con una dispersione di agarosio preriscaldato ad una determinata temperatura. In particolare, però, non sono menzionati né l’aggiunta di composti reticolanti, in grado di modificare le proprietà meccaniche del polimero alla base dell’idrogelo, né l’aggiunta di sostanze tamponanti in grado di neutralizzare l’acidità che si libera durante il processo di formazione del gel a causa delle reazioni di reticolazione, né l’aggiunta di composti elasticizzanti. Inoltre, non si fa alcuna menzione alla possibilità di applicare tale gel all’ingegneria dei tessuti viventi, né prevede altre applicazioni specifiche che non siano il rilascio di farmaci. Peraltro nella formulazione descritta non sono contenuti riferimenti all’aggiunta di mezzi di coltura e/o fattori o principi attivi adatti a fornire alle cellule il necessario nutrimento e modularne l’azione e l’attività.
Il brevetto europeo EP929323 descrive un idrogel polimerico biostabile (e quindi non biodegradabile) per uso terapeutico, costituito da un copolimero di (a) una acrilammide o metacrilammide N-sostituita, (b) un agente di reticolazione e (c) materiale copolimerizzabile, utilizzabile per ricostruire tessuto cerebrale o spinale danneggiato.
Il brevetto europeo EP1206254 descrive una matrice tridimensionale basata su fibre riassorbibili caricate con specifici farmaci, nella quale vengono fatte crescere cellule in vitro per poi essere impiantate in vivo.
Si cita inoltre il brevetto US6171610, dove sono descritte formulazioni ottenute dalla miscelazione di sostanze biocompatibili e loro applicazioni estese a tutte le possibili popolazioni cellulari e in particolare al tessuto nervoso centrale. Non sono menzionati né l’aggiunta di composti reticolanti, in grado di modificare le proprietà meccaniche dei polimeri alla base dell’idrogelo, né l’aggiunta di sostanze tamponanti in grado di neutralizzare l’acidità che si libera durante il processo di formazione del gel e durante il successivo degrado, né l’aggiunta di composti elasticizzanti. Nel caso di miscele tra agarosio e carbomer, ad esempio, l’uso di agenti reticolanti e di tamponi di acidità risulta essere non solo fondamentale per il controllo della gelazione ma anche per l’ottenimento di una matrice adeguata ad ospitare le specifiche cellule prescelte ed a veicolarle mantenendole vitali e garantendone così la sopravvivenza e l’efficacia terapeutica una volta impiantate in situ. Occorre ancora precisare che la matrice polimerica, ottenuta in forma gelulare, sarà tanto più efficace nel consentire il supporto, la vitalità e la proliferazione cellulare al suo interno, tanto più la conformazione della matrice di struttura del gel stesso si adatta a quella della matrice extracellulare che le cellule si aspettano.
In sintesi, l’analisi precedente mostra che non sono descritti idrogeli principalmente a base di carbomer e agarosio, le cui proprietà meccaniche, e conseguentemente anche la loro biodegradabilità, siano modulate dall’aggiunta di composti reticolanti quali glicol propilenico, glicerolo e trietil ammina, contenenti nutrienti cellulari, specifici fattori, principi attivi e/o farmaci ed impiegati quali mezzi di sostegno e di veicolazione di cellule per applicazioni di rigenerazione e ricostruzione tessutale.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
Scopo della presente invenzione è fornire una matrice polimerica a base di composti biodegradabili che possa essere utilizzata nel suo stato rigonfiato come dispositivo per l’alloggiamento di cellule di diversi tipi per la rigenerazione e/o ricostruzione e/o sostituzione di vari tessuti viventi danneggiati, morti o non più funzionali.
Tale scopo è raggiunto attraverso un idrogelo a doppia matrice polimerica interpenetrante formata da un polimero di acido acrilico o da un carbomero, un polimero naturale scelto tra agarosio, chitosano, destrano o un glicosaminoglicano, un agente di reticolazione scelto tra glicerolo, glicol propilenico, etilenico, trietilammina o una loro miscela ed eventualmente un agente elasticizzante scelto tra acido alginico e suoi sali, un qualsiasi tipo di collagene, fibrina, fibrinogeno e acido ialuronico o un loro derivato, quale ad esempio la gelatina, laminina, o un miscela di detti agenti, detto idrogelo contenendo cellule appoggiate sulla sua superficie esterna o alloggiate all’interno della matrice polimerica tridimensionale.
Un altro aspetto della presente invenzione riguarda l’uso di detto idrogelo per la preparazione di un impianto cellulare per la rigenerazione o la ricostituzione o la sostituzione di tessuti danneggiati o morti o rimossi o non funzionanti, anche solo parzialmente. È infatti possibile attraverso la presente invenzione migliorare e curare il tessuto nella zona di detto impianto attraverso l’approvvigionamento di cellule ed il controllo della loro proliferazione, infiltrazione ed integrazione con i tessuti circostanti la zona di impianto stessa.
Un altro scopo della presente invenzione è fornire un mezzo per la rigenerazione tessutale in differenti distretti corporei attraverso l’uso di una matrice polimerica biodegradabile particolarmente vantaggiosa sia dal punto di vista clinico che economico per i pazienti che soffrono di patologie degenerative, di esiti traumatici, di resezioni o di altre patologie.
Un altro scopo della presente invenzione è fornire un mezzo per la rigenerazione di vari tessuti viventi con caratteristiche tali per cui possa essere facilmente posizionato nella zona bersaglio attraverso tecniche chirurgiche tradizionali o mini-invasive e che possa essere facilmente adattato alle dimensioni del sito di impianto.
Un altro aspetto della presente invenzione è un metodo per preparare il detto idrogelo, che comprende la preparazione di una dispersione acquosa contenente (% in peso) da 0,01% a 5% di polimero acrilico o di un carbomero, da 0,01% a 5% di polimero naturale, da 0,1% a 40% di agente reticolante ed eventualmente da 0,01% a 5% di agente elasticizzante, a una temperatura di 20-90°C e per un tempo variabile da 10 minuti secondi a 240 minuti primi, in funzione del grado di reticolazione che si vuole ottenere e dei polimeri utilizzati, e l’eventuale successivo raffreddamento a una temperatura compresa tra 37°C e temperatura ambiente. A detta miscela di polimeri può essere aggiunta una base in grado di neutralizzare l’acido che si sviluppa durante la reazione, preferibilmente scelta tra trietilammina e ammoniaca. I rapporti ponderali tra i diversi componenti possono essere variati negli intervalli sopra definiti, potendo in questo modo modulare le dimensioni delle maglie del reticolo polimerico in funzione del tipo cellulare da veicolare per rendere così la matrice più adatta a ciascuna specifica popolazione. Preferibilmente i polimeri e tutti i reagenti utilizzati soddisfano i criteri di purezza e sterilità richiesti per applicazioni mediche, biologiche, biomediche e farmaceutiche.
E’ un altro scopo della presente invenzione fornire una nuova miscela polimerica con le opportune caratteristiche chimico-fisiche affinché al suo interno possano essere mescolate delle cellule viventi garantendo alle stesse la possibilità di sopravvivere e proliferare.
Un altro aspetto dell’invenzione è pertanto un metodo per realizzare un dispositivo bio-ibrido bidimensionale o tridimensionale che possa essere utilizzato per l’alloggiamento e la veicolazione di cellule per la rigenerazione di tessuti viventi all’interno del corpo umano. Un’ulteriore caratteristica fondamentale è che tale dispositivo si degradi con una cinetica predeterminata e compatibile con l’integrazione tra le cellule veicolate e il tessuto bersaglio.
Un altro aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per la preparazione di un dispositivo a base di detto idrogelo contenente cellule. Dette cellule possono essere prelevate da tessuto fresco o mantenute in coltura staccate dal supporto (ad esempio capsula Petri o altro), eventualmente lavate e successivamente aggiunte alla miscela di polimeri, agente reticolante ed eventuale agente elasticizzante durante il processo di gelificazione, preferibilmente nella fase di raffreddamento. Per mantenere il maggior numero di cellule intrappolate nella matrice dell’idrogelo in uno stato vitale e in condizioni di crescita è preferibile aggiungere un idoneo terreno di coltura alla dispersione acquosa dei polimeri prima della gelificazione. In alternativa, le cellule intrappolate nella matrice polimerica possono essere rifornite di sostanze nutrienti e fattori necessari alla loro crescita mettendo in contatto o immergendo l’idrogelo in un opportuno terreno di coltura. Inoltre, durante la preparazione del gel possono essere aggiunti farmaci e/o principi attivi e/o fattori specifici e/o altre sostanze che sono in grado di modulare l’azione specifica delle cellule, anche in base al tessuto bersaglio da rigenerare, e che vengono rilasciati gradualmente dalla matrice polimerica una volta che l’impianto è stato introdotto nel tessuto bersaglio.
Un altro aspetto della presente invenzione è l’uso di un idrogelo che possegga una elevata capacità di rigonfiarsi, per incorporare una miscela principalmente a base di acqua e di un mezzo di coltura eventualmente addizionato con fattori e/o altri principi attivi, detta miscela essendo adatta a fornire alle cellule ospitate il necessario nutrimento affinché possano sopravvivere e proliferare all’interno dell’idrogelo stesso.
Un altro aspetto della presente invenzione è l’uso di un idoneo terreno di coltura finalizzato al miglioramento delle condizioni vitali delle cellule una volta incapsulate nel gel. Tale terreno può essere utilizzato direttamente per la realizzazione del gel con o senza l’aggiunta di soluzione tampone salina.
Diversi tipi di cellule possono essere utilizzati per la preparazione di detto dispositivo bio-ibrido secondo l’invenzione, quali cellule adulte, embrionali, staminali, wild-type, ingegnerizzate, primarie o immortalizzate (di linea).
In una forma di realizzazione della presente invenzione, l’idrogelo possiede adeguate caratteristiche chimico-fisiche per essere prodotto sottoforma di film sottile attraverso una delle metodiche note allo stato dell’arte della tecnica quali, a titolo esemplificativo e non esaustivo, lo spincoating da fuso con successivo raffreddamento, il dip-coating da fuso con successivo raffreddamento oppure il sol-gel. L’idrogelo così ottenuto ha uno spessore nell’ordine delle dimensioni delle cellule da ospitare (da pochi micrometri a qualche decimo di millimetro).
Un altro aspetto della presente invenzione riguarda l’uso di detto idrogelo prodotto sottoforma di film sottile come supporto per la crescita cellulare in vitro in applicazioni di screening farmacologico, di saggio per farmaco-sviluppo, di efficacia farmacologica o di tossicità. Tale supporto è realizzato come film sottile sul quale o all’interno del quale vengono depositate e fatte crescere singole cellule o popolazioni di cellule, anche differenti tra loro. Tale supporto è realizzato anche come substrato di collegamento tra cellule e dispositivi di misura appositamente realizzati per monitorare l’attività cellulare di singole cellule o popolazioni cellulari durante differenti tipologie di test che vanno dal monitoraggio della conducibilità dei segnali (ad esempio per le cellule eccitabili quali le cardiache o quelle nervose), a test di efficacia farmacologica. Tale film sottile di idrogelo polimerico deve essere appositamente disegnato e realizzato al fine di permettere il passaggio dei segnali elettrici e chimici. L’alta porosità della struttura dell’idrogelo unita alla presenza di elettroliti nella soluzione acquosa permette di ottenere alti valori di conducibilità elettrica (comparabili a quelli misurati nella soluzione stessa) e di diffusione degli ioni.
In una realizzazione preferita dell’invenzione, l’idrogelo è ottenuto a partire da una miscela contenente carbopol, agarosio, glicerolo e glicol propilenico, in presenza di trietilammina, dispersi in un opportuno mezzo acquoso addizionato di una miscela di nutrienti quali ad esempio glucosio, amminoacidi essenziali, proteine, oligoelementi, sali minerali, vitamine ed antibiotici battericidi. Tale idrogelo contenente le cellule può essere posizionato per comodità all’interno di pozzetti adatti alle colture cellulari. Le cellule incapsulate nella matrice tridimensionale rimangono vitali e continuano a crescere e ad aggregarsi, come si è potuto osservare nel corso di esperimenti in cui è stata valutata la morfologia, la vitalità e la proliferazione cellulare all’interno di un idrogelo ottenuto come sopra descritto.
In un’altra realizzazione preferita dell’invenzione, l’idrogelo è ottenuto a partire da una miscela contenente carbopol, agarosio, glicerolo e glicol propilenico, in presenza di trietilammina, dispersi in un opportuno mezzo acquoso. Tale idrogelo è all’interno di un sostegno circolare cavo e sottoposto a rotazione a velocità tale da permettere l’ottenimento di un film sottile e regolare dello stesso una volta raffreddato. Successivamente su tale film di idrogelo, una volta rimosso dal supporto e posizionato in un dispositivo microelettronico, è depositata una dispersione liquida contenente cellule. Analogamente, all’interno della miscela si possono posizionare direttamente le cellule e quindi produrre con il metodo descritto un film sottile contenente le cellule stesse.
Un'ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda l’uso di un idrogelo come sopra descritto, in una qualsiasi sua forma di realizzazione, per la preparazione di un impianto di cellule per la rigenerazione o ricostituzione, integrali o parziali, di tessuti danneggiati o malati o rimossi, in particolare tessuto muscolare, miocardico, connettivo, osseo, tendineo o ligamentoso, epatico, renale, corneale, dermico o epidermico, cartilagineo articolare.
ESEMPI
Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione in maggior dettaglio. ESEMPIO 1 - Preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili e con cellule di tipo mioblasti (linea C2C12) da inserire al suo interno
La procedura sotto riportata porta alla formazione di un idrogel con percentuale di carbomer dello 0,5% e di agarosio dello 0,5% oppure dello 0,25% e con mioblasti al suo interno.
Reagenti necessari per la preparazione di 100 mL di gel con cellule neuronali:
- Carbomer 974 P (CAS 151687-96-6, Fagron, Bufa, Paesi Bassi):
0,5 g
- Agarosio (CAS 9012-36-6, Invitrogen Corp., Carlsbad, USA): (0,5 g oppure 0,25 g)
- Glicol propilenico (CAS 504-63-2, Sigma-Aldrich, Germania):
30 mL
- Glicerolo (CAS 56-81-5, Merck Chemicals, Germania): 1 mL
- Trietilammina (CAS 121-44-8, preparazione ad alta purezza, Sigma-Aldrich, Germania): 0,5 mL
- PBS: quanto basta
- Cellule: C2C12 (mioblasti)
- Terreno di coltura: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Sigma-Aldrich Germania)
Procedura operativa per la preparazione delle cellule. Tale procedura inizia con le seguenti operazioni di scongelamento delle cellule dalla soluzione criopreservante, da svolgersi interamente sotto cappa sterile di classe II:
1. prelevare l’aliquota necessarie di cellule criopreservate nella loro criovial;
2. prelevare 10 mL di terreno di coltura e trasferirlo in un tubo da 50 mL mantenendolo a T=37°C;
3. prelevare 1 mL di terreno dal tubo e trasferirlo alla criovial contenente le cellule criopreservate e mescolare con la pipetta dolcemente per diluire il criopreservante a contatto con le cellule al fine di ottenerne il completo scongelamento;
4. ottenuto lo scongelamento totale, trasferire l’intera soluzione con la sospensione cellulare dalla criovial al tubo contenente il terreno e proseguire a sospendere nuovamente le cellule nel tubo con il terreno di coltura;
5. trasferire il tubo con le cellule nella centrifuga e centrifugare a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;
6. rimuovere il mezzo di coltura dal tubo, lasciando le cellule sul fondo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo di coltura fresco e sospendere nuovamente le cellule;
7. eseguire la conta cellulare (ad esempio con camera di Neubauer) e quindi prelevare un volume di sospensione che contenga il numero di cellule che si intende seminare nella fiasca e trasferirvelo; in questo caso per una concentrazione di 100.000 unità/mL;
8. lasciare la fiasca all’interno di un apposito incubatore cellulare per il tempo necessario affinché le cellule raggiungano una sufficiente confluenza.
Procedura operativa per la preparazione del gel, sotto cappa sterile di classe II:
1. in un Becker pirex pesare il carbomer ed aggiungere la rispettiva quantità di PBS mettendo sotto agitazione spinta (1400 giri/minuto, con ancoretta) per 30 minuti primi a temperatura ambiente (T=25°C); 2. aggiungere glicerolo e glicol propilenico, mantenendo sotto agitazione alla medesima velocità per ulteriori 20 minuti primi, sempre a temperatura ambiente;
asciare la sospensione senza agitazione per 60 minuti primi a temperatura ambiente;
er neutralizzare il pH della soluzione (se necessario) aggiungere q.b. di una soluzione di trietilammina al 98% in acqua, mescolando lentamente per 10 minuti primi sotto agitazione lenta (250 giri/minuto, con ancoretta);
esare ed aggiungere l’agarosio in polvere in base alla concentrazione prefissata in precedenza e lasciare sotto agitazione (250 giri/minuto, con ancoretta) per 5 minuti primi a temperatura ambiente;
iscaldare la soluzione con radiazione elettromagnetica (500W) per circa 2 minuti primi fino al raggiungimento di una temperatura di circa 80°C;
stratta la soluzione, in fase di raffreddamento, a circa 40°C, aggiungere la soluzione precedentemente preparata contenente le cellule, in rapporto volumetrico di 1:1, mantenendo la nuova soluzione così ottenuta in lieve rotazione;
relevare dalla soluzione finale di gel e cellule la quantità necessaria al riempimento dei pozzetti da colture cellulari utilizzati che andranno riempiti per il 50% del loro volume complessivo dalla soluzione finale di gel e cellule (pozzetti standard applicabili sono quelli delle piastre tipo “multiwell” da 48 pozzetti l’una), riempire il restante volume con il mezzo di coltura adatto per la tipologia di cellule in uso (mezzo surnatante);
9. per il mantenimento del gel con le cellule all’interno è necessario posizionare i campioni in un apposito incubatore da colture cellulari e sostituire il mezzo surnatante ogni 24 ore con del nuovo. Procedura operativa per i saggi di attività cellulare il cui scopo consiste nel valutare la morfologia, la vitalità e la proliferazione cellulare delle cellule che sono state incapsulate all’interno di un idrogelo costituito come descritto nelle procedure precedenti.
Al fine di valutare la vitalità cellulare, a cadenza giornaliera eseguire sui campioni preparati come dalle procedure sopra descritte i saggi MTT (Sigma-Aldrich, Germania) ed Alamar Blue ™ (AbD Serotec, Gran Bretagna). Un raffronto visibile relativo invece alla morfologia cellulare può essere ottenuto tramite microscopia ottica e/o elettronica a scansione.
Una conferma dello stato di vitalità e proliferazione cellulare può essere ottenuto andando ad eseguire i menzionati saggi sulle cellule una volta estratte dal gel. Tale operazione si configura come distruttiva per il gel ma non significativamente per le cellule e avendo cura di disegnare un set sperimentale sufficientemente ampio essa può essere eseguita a diversi tempi. Tale estrazione può essere ottenuta con la seguente procedura operativa, da eseguirsi sotto cappa sterile di classe II:
1. recuperare il surnatante dei pozzetti contenenti i campioni e trasferirlo in un tubo da 50 ml e portarlo a 30 mL di volume aggiungendo q.b. di soluzione di PBS e SSPE 1X (Sigma-Aldrich, Germania) ed effettuare una prima centrifugazione a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;
2. al termine della centrifugazione, eliminare il surnatante e sospendere nuovamente con 30 mL della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X cui vanno aggiunti 0,5 mL di soluzione tripsina-EDTA 1X (Sigma-Aldrich, Germania; EDTA= Ethylene Diamine Triacetic Acid, acido etilen-diammino-triacetico);
nei pozzetti dove sono situati i campioni aggiungere 0,5 ml della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X cui vanno aggiunti 0,5 mL della soluzione precedentemente descritta di tripsina-EDTA 1X e riporre in apposito incubatore per almeno 5 minuti primi;
dopo l’incubazione, recuperare l’intero contenuto dei pozzetti e trasferirlo nel medesimo tubo da 50 mL precedentemente utilizzato, quindi effettuare una seconda centrifugazione a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;
al termine della centrifugazione, recuperare il surnatante in un secondo tubo da 50 mL e sospendere nuovamente quanto rimasto nel primo tubo con 20 mL della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X cui vanno aggiunti 1 mL della soluzione precedentemente descritta di tripsina-EDTA 1X;
effettuare una terza centrifugazione di entrambi i tubi da 50 mL, a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;
al termine della centrifugazione, eliminare il surnatante da entrambi i tubi, sospendere quanto in entrambi i tubi con 20 mL della soluzione precedentemente descritta di PBS/SSPE 1X;
unire il contenuto dei due tubi in unico tubo e sottoporlo ad una quarta centrifugazione a 2000 giri/minuto per 5 minuti primi;
9. dal termine della centrifugazione, eliminare il surnatante e sospendere in adeguato terreno;
10. rimuovere la sospensione dal tubo e trasferirla nell’apposita fiasca per la conservazione in adeguato incubatore.
ESEMPIO 2 - preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili e con cellule della linea P19, fenotipo CL6 (ossia cardiomiociti contrattili di derivazione staminale embrionale) da inserire al suo interno e con un mezzo di coltura specifico per questa popolazione Si procede come nelle procedure descritte nel precedente esempio dove invece del mezzo di coltura DMEM si usa Alpha-MEM (Invitrogen, USA).
ESEMPIO 3 - preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili e con cellule della linea N9 (microglia) da inserire al suo interno e con un mezzo di coltura specifico per questa popolazione Si procede come nelle procedure descritte nel precedente esempio nr 1, dove invece del mezzo di coltura DMEM, si usa il seguente mezzo, ottenuto come soluzione specificamente realizzata per favorire queste cellule all’interno del gel; quantità di reagenti proporzionati per 20 mL di soluzione:
- PBS (Sigma, Germania) 18,790 mL - B27 (GIBCO, Invitrogen, USA) 400 µL - Insulin-Transferrin-Selenium-G Supplement, 100X
(GIBCO, Invitrogen, USA) [diluizione 1:100] 10 µL - D–(+)Glucose @ 45% (Sigma G8769, Germania) 80 µL - L–Glutamine (Sigma G7513, Germania) 200 µL - Penicillin-Streptomycin (Sigma P0781, Germania) 60 µL - Sodium pyruvate (Sigma S8636, Germania) 200 µL - MEM Vitamins 100X (Sigma M6895, Germania) 20 µL - MEM Aminoacids 50X (Sigma M5550, Germania) 20 µL - MEM Non-Aminoacids 100X NEAA (Sigma M7145, Germania)20 µL - HEPES Buffer (Sigma H0887, Germania) 200 µL I reagenti sono quindi addizionati in bicarbonato di sodio e la soluzione è diluita in ragione di 1:100 e prelevata in aliquote di quanto necessario.
ESEMPIO 4 - preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili, con un agente elasticizzante e cellule di tipo L929 (fibroblasti) da inserire al suo interno
Si procede come nelle procedure descritte nel precedente esempio nr. 1 dove però il PBS utilizzato per la preparazione del gel viene addizionato con 0,5% in peso di gelatina (Sigma-Aldrich, Germania).
ESEMPIO 5 - preparazione dell’idrogelo con due diverse concentrazioni possibili, con aggiunta di fattori specifici per le popolazioni cellulari del sistema nervoso centrale o per le cellule miocardiche
Si procede come nelle procedure descritte nel precedente esempio nr. 1 dove però il mezzo di coltura è quello descritto nell’esempio nr. 3 e viene addizionato con carnitina (alcar) in un range di concentrazione compreso tra 30 e 100 millimolare per meglio favorire le popolazioni cellulari di derivazione dal sistema nervoso centrale, oppure in alternativa il detto mezzo di coltura viene addizionato con vitamina D in una delle sue varianti (quale il colecalciferolo a titolo esemplificativo non esaustivo) in ragione di una concentrazione di circa 0,0004 g/ml per meglio favorire le popolazioni cellulari cardiomiocitiche.
Claims (25)
- RIVENDICAZIONI 1. Idrogelo a doppia matrice polimerica interpenetrante formata da un polimero di acido acrilico o carbomerico, un polimero naturale scelto tra agarosio, chitosano, destrano, un polisaccaride o un glicosaminoglicano, un agente di reticolazione scelto tra glicerolo, glicol propilenico, etilenico, trietilammina o una loro miscela, detto idrogelo contenendo cellule appoggiate sulla sua superficie esterna o alloggiate all’interno del reticolo tridimensionale formato da detta matrice polimerica.
- 2. Idrogelo secondo la rivendicazione 1, in cui detta matrice polimerica contiene inoltre un agente elasticizzante scelto tra acido alginico e suoi sali, collagene o suoi derivati, gelatina, fibrina, fibrinogeno, acido ialuronico e suoi derivati, laminina o una miscela dei suddetti agenti.
- 3. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detta matrice polimerica comprende da 0,01% a 5% di polimero di acido acrilico o carbomerico, da 0,01% a 5% di polimero naturale, da 0,1% a 40% di agente di reticolazione, ed eventualmente da 0,01% a 5% di agente elasticizzante, dove le predette % sono in peso.
- 4. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1 e 2, in cui detto polimero acrilico è carbopol, detto polimero naturale è agarosio, detto agente di reticolazione è una miscela di glicerolo, glicol propilenico e trietilammina e detto agente elasticizzante è gelatina.
- 5. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1-4, in cui dette cellule sono cellule adulte, staminali, embrionali, wild-type, ingegnerizzate, primarie o immortalizzate (di linea).
- 6. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1-5, comprendente inoltre sostanze nutritive e/o fattori di crescita per cellule, preferibilmente scelti nella seguente lista: tampone salino, B27 (GIBCO, Invitrogen, USA), Insulin-Transferrin-Selenium-G Supplement, D–(+)Glucose, L–Glutamine, Penicillin-Streptomycin, Sodium pyruvate, MEM Vitamins 100X, MEM Aminoacids 50X, MEM Non-Aminoacids 100X NEAA, HEPES Buffer, bicarbonato, carnitina (Alcar), vitamina D, l-arginina.
- 7. Idrogelo secondo la rivendicazione 1-6, comprendente inoltre uno o più farmaci e/o fattori e/o principi attivi in grado di modulare l’azione delle cellule e/o di mantenerle vitali e/o di stimolarne il metabolismo e/o di stimolarne la crescita e lo sviluppo e/o di stimolarne il differenziamento e/o di stimolarne l’interazione e l’interconnettività mutua.
- 8. Idrogelo secondo le rivendicazioni precedenti, in forma di film sottile idoneo a supportare le cellule per uso in dispositivi di misura appositamente realizzati per monitorare diversi parametri di attività cellulare.
- 9. Idrogelo secondo le rivendicazioni precedenti, in forma di insieme di film sottili disposti su più strati sovrapposti ed idonei a supportare ed ospitare differenti popolazioni di cellule al fine di ottenere una struttura avanzata polifunzionale (Multi Layer Systems).
- 10. Metodo per la preparazione di un idrogelo secondo le rivendicazioni precedenti, che comprende la preparazione di una miscela contenente (% in peso) da 0,01% a 5% di polimero acrilico, da 0,01% a 5% di polimero naturale, da 0,1% a 40% di agente reticolante in un mezzo acquoso, a una temperatura compresa tra 20°C e 90°C, per un tempo variabile da 10 minuti secondi a 240 minuti primi, e l’eventuale successivo raffreddamento fino a raggiungere una temperatura compresa tra temperatura ambiente e 37°C.
- 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, che comprende inoltre l’aggiunta di una base in grado di neutralizzare l’acido che si sviluppa durante la reazione e l’aggiunta di opportuni sali o di soluzioni saline o di soluzioni tampone finalizzate al controllo del pH.
- 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detta base è trietilammina e la soluzione tampone è PBS.
- 13. Metodo secondo le rivendicazioni 10-12, in cui la miscela acquosa viene addizionata o sostituita con un terreno di coltura idoneo al mantenimento delle cellule in condizioni vitali e di crescita contenente le sostanze nutritive o i fattori di crescita secondo la rivendicazione 6.
- 14. Metodo secondo la rivendicazione 8 o 13, in cui alla miscela acquosa o al terreno di coltura vengono aggiunti uno o più farmaci e/o fattori e/o principi attivi in grado di modulare l’azione delle cellule e/o di mantenerle vitali e/o di stimolarne il metabolismo e/o di stimolarne la crescita e lo sviluppo e/o di stimolarne il differenziamento e/o di stimolarne l’interazione e l’interconnettività mutua.
- 15. Uso di un idrogelo secondo le rivendicazioni 1-9 per la preparazione di un impianto di cellule per la rigenerazione o ricostituzione, integrali o parziali, di tessuti danneggiati o malati o rimossi.
- 16. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è muscolare o miocardico.
- 17. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è connettivo.
- 18. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è una cartilagine articolare.
- 19. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è osseo.
- 20. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è tendineo o ligamentoso.
- 21. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è corneale.
- 22. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è derma o epidermide.
- 23. Uso secondo la rivendicazione 15, dove detto tessuto è epatico o renale.
- 24. Uso di un idrogelo secondo le rivendicazioni 1-9 come interfaccia tra cellule e dispositivi elettronici.
- 25. Uso di un idrogelo secondo la rivendicazione 8, dove vengono monitorati diversi parametri di attività cellulare durante test per screening farmacologico o durante test di sviluppo di farmaci o durante test di efficacia farmacologica o durante test di tossicità. Milano, 17 novembre 2008
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