ITMI20120896A1 - Condroitina per uso in medicina - Google Patents

Description

“CONDROITINA PER USO IN MEDICINAâ€

La presente invenzione ha per oggetto composizioni farmaceutiche, nutraceutiche, cosmeceutiche o dispositivi medici contenenti come ingrediente attivo condroitina non solfatata.

Stato della tecnica

La condroitina, precursore metabolico della condroitina solfato, à ̈ un polisaccaride naturale lineare formato dall’alternanza di residui di N-acetil-D-galattosammina β 1:4 e D-glucuronato β 1:3. Nei vertebrati la condroitina à ̈ solfatata in maniera regio-selettiva a livello degli ossidrili 4 o 6 della N-acetil-D-galattosammina e in alcuni casi quelli 2 o 3 dell’acido glucuronico (Sugahara et al., J. Biol. Chem., 1996, 271:26745-54). Il peso molecolare della condroitina e l’entità e i siti della solfatazione dipendono dalla specie, dall’età e dalla tipologia del tessuto (Kuettner et al., Eds., in Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992; Volpi Ed., in Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California Academic Press - Elsevier Inc, 2006).

La condroitina solfato, che rappresenta la parte polisaccaridica di varie famiglie di proteoglicani in acronimo GAGs, à ̈ legata a un residuo di serina del core proteico mediante il tetrasaccaride GlcA-Gal-Gal-Xyl. Come per la maggior parte delle proteine di membrana la biosintesi del core proteico dei GAGs ha inizio nel citosol e successivamente il polipeptide à ̈ traslocato nel reticolo endoplasmatico. La sintesi del tetrasaccaride ha inizio nel lume del reticolo endoplasmatico e viene completata nel golgi, dove ha inizio la polimerizzazione/solfatazione della condroitina solfato. La polimerizzazione avviene grazie all’azione concertata e altamente organizzata di un sistema multienzimatico associato alla membrana, in cui la GalNAc transferasi e la GlcA transferasi aggiungono in modo alternato i due zuccheri all’estremità non riducente del proteoglicano nascente, determinando la formazione di catene di condroitina di circa 70kDa. La solfatazione del polimero avviene nel golgi, in particolare la solfatazione in posizione 6 avviene nella regione medial/trans del golgi, mentre la solfatazione in posizione 4 avviene nella regione trans. Studi con preparazioni microsomali (Sugumaran e Silbert, J. Biol. Chem. 1990, Oct 25, 265(30):18284-8) hanno dimostrato che appena 30 secondi dopo l’inizio del processo di polimerizzazione della condroitina inizia quello di solfatazione, in cui il substrato donatore del gruppo solfato à ̈ il PAPS (3’-fosfoadenosina 5’-fosfosolfato), la cui formazione à ̈ catalizzata da ATP sulfurilasi e APS kinasi.

La reazione di attivazione degli zuccheri e del solfato avviene nel citosol, le forme attivate sono successivamente trasportate nel reticolo endoplasmatico e nel golgi, dove vengono utilizzate per la sintesi della condroitina solfato.

I GAGs nella matrice extracellulare assumono conformazioni molto estese, formando gel porosi in cui vengono attratti cationi e acqua. In questo modo i GAGs idratano ed espandono i tessuti, rendendo la matrice idonea a resistere a forze compressive anche di forte entità.

La condroitina solfato non à ̈ presente solo nei vertebrati, ma anche in zebra fish, nei nematodi e negli insetti. Anche alcuni batteri producono come componenti della loro capsula polimeri correlati alla condroitina. A differenza dei vertebrati, questi polisaccaridi non sono presenti come proteoglicani e non sono solfatati, ma sono associati alle componenti lipidiche della superficie batterica o vengono rilasciati nel mezzo di coltura (Whitfield, Ann. Rev. Biochem. 2006, 75:39-68; De Angelis, Glycobiol, 12:9R-16R).

La condroitina solfato, ottenuta per estrazione da varie fonti animali, come cartilagini di maiale, pinne di pescecane e cartilagini di teleostei, à ̈ utilizzata come nutraceutico e come farmaco condroprotettivo e antireumatico, nella terapia di osteoartriti tibiofibulari del ginocchio e nelle osteoartriti della cartilagine articolare (Kuettner KE et al., Eds., in Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992; Simànek V et al., 2005, 149:51-56; Goerres GW et al., J. Clinical Densitometry 2005, 8:484-487; Altman RD et al., OsteoArthritis and Cartilage 2005, 13:13-19; Chan PS, et al., OsteoArthritis and Cartilage 2005, 13:387-394; Chou MM, et al., Exp. Biol. Med. 2005, 230:255-262; Clegg DO, et al., New England J. of Medicine, 2006, 23:795-808; Roman-Blas et al., OsteoArthritis and Cartilage, 2006, 14:839-848; Maheu E et al., OsteoArthritis and Cartilage, 2006, 14:303-322; Fotinì N et al., Biomed. Chromatogr. 2006, 20:539-550; Lagnaoui R et al., Thérapie 2006, 61: 341-346; Volpi N Ed. in Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California Academic Press -Elsevier Inc, 2006; Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 2007, 66:377-38. Altri settori terapeutici in cui trova impiego la condroitina solfato sono quelli delle cistiti interstiziali (Nickel et al., BJU Int. 2009, 103:56-60; Cervigni et al., Int Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunction. 2008, 19:943-947) e delle sinoviti (Hochberg and Clegg, Osteoarthritis and Cartilage 2008, 16 supp. 3:S22-S24; Moller, Osteoarthritis and Cartilage 2009, 17 supp. 1:S32-S33).

La condroitina, intermedio metabolico, non à ̈ invece isolabile in quantità significative da fonti animali. Solo recentemente sono stati messi a punto processi per la produzione di condroitina da microrganismi o mediante sintesi enzimatica.

Di particolare interesse à ̈ la produzione di condroitina descritta in WO 2010136435, per mezzo di un ceppo ingegnerizzato di E. coli K4, che produce il polisaccaride K4, una condroitina che a livello del C3 dell’acido glucuronico presenta residui di β-fruttofuranosio. Questi residui possono essere facilmente rimossi mediante idrolisi acida controllata, per la bassa stabilità del legame glicosidico con cui il fruttosio à ̈ legato alla catena della condroitina. L’ingegnerizzazione del ceppo à ̈ stata finalizzata a migliorare la processività dell’intero complesso enzimatico responsabile della sintesi del polisaccaride K4 mediante inserimento di più copie del gene autologo RfaH, che funziona da regolatore positivo delle trascrizione del cluster di geni responsabili della sintesi del materiale capsulare. Utilizzando questo microrganismo e una strategia integrata basata sull’ottimizzazione di un processo fermentativo trifasico (batch - fed batch - in regime di microfiltrazione) si ottengono rese in condroitina anche > 8 g/L. Le alte rese produttive, la semplicità del downstream di purificazione, i bassi costi complessivi del processo, il suo ridotto impatto ambientale rendono il processo di WO 2010136435 superiore rispetto a tutte le strategie fermentative in precedenza descritte (Rodriguez et al., Eur. J. Biochem., 1988, 177:117-124; Manzoni et al., Biotechnology Letters, 1996, 18:383-386; WO 01/02597 A1; US 6,288,044; US 6,777,398; US 2005266460; WO 0180810; EP 1282684; EP 1832662; US 20030104601; US 20050164984; US 20070015249; US 20030109693; EP 1950308; WO 2007145197; WO 2007069693; WO 2007058252; WO 2007058252; WO 2007023867; US 7,273,729; JP 2004024208; US 20060052335; US 20060057697; US 7,232,676; US 20070059805). Più recentemente, US 2011244520A1 descrive una serie di microrganismi ingegnerizzati che producono condroitina in concentrazioni confrontabili con quelle di WO 2010136435.

Per quanto concerne la sintesi enzimatica della condroitina, US 2005266460, WO 0180810, EP 1282684, EP 1832662, US 20030104601 e US 20050164984 descrivono l’uso della condroitina sintetasi da Pasteurella multocida, un enzima che catalizza la sintesi di condroitina a partire dai corrispondenti UDP zuccheri. In particolare questi documenti descrivono la sequenza del segmento nucleotidico che codifica per l’enzima, la costruzione e l’uso di ricombinanti (in sistemi di espressione sia procarioti che eucarioti) che lo esprimono e la produzione con questi ricombinanti di condroitina modificata e di varie dimensioni. In tutti questi documenti mancano evidenze sperimentali sui processi produttivi rivendicati, in particolare non sono mai riportati dati dettagliati sulle modalità fermentative per produrre gli enzimi e sulle rese in condroitina. US 20070015249 e US 20030109693 descrivono la produzione di una condroitina sintetasi da E. coli K4 e il suo impiego per la produzione in vitro di condroitina. La produzione dell’enzima, codificata dal gene kfoC della regione II del cluster di E. coli K4 responsabile della biosintesi dell’antigene capsulare, à ̈ caratterizzata dalle seguenti fasi: amplificazione di kfoC, clonaggio del gene nel vettore pTrcHis e sua espressione nel ceppo commerciale di E. coli TOP. I due documenti rivendicano anche proteine con mutazioni, naturali o artificiali, che possono indurre leggere modifiche strutturali della condroitina sintetasi, senza alterarne la funzione catalitica. Anche in questi documenti mancano dati sulle rese dei processi produttivi, sia quello della produzione della condroitina sintetasi che quello della produzione enzimatica in vitro della condroitina a partire dai corrispondenti UDP-zuccheri.

EP 1950308, WO 2007145197, WO 2007069693, WO 2007058252, WO 2007058252 e WO 2007023867 descrivono metodi di sintesi in vitro di condroitina e derivati che utilizzano la condroitina sintetasi da E. coli K4 e suoi mutanti, che presentano una sola delle due attività trasferasiche.

US 7,273,729, JP 2004024208, US 20060052335, US 20060057697 e US 7,232,676 descrivono l’uso della condroitina sintetasi umana, un enzima che catalizza la sintesi di condroitina a partire dai corrispondenti UDP zuccheri. I documenti rivendicano la struttura della condroitina sintetasi umana, un vettore di espressione che comprende la sequenza dell’enzima, l’espressione di tale vettore in cellule eucariotiche e un metodo per sintetizzare la catena polisaccaridica della condroitina.

US 20070059805 rivendica la struttura della condroitina sintetasi umana, un vettore di espressione che comprende la sequenza dell’enzima, l’espressione di tale vettore in cellule eucariote e un metodo per sintetizzare la catena polisaccaridica della condroitina.

Tutti i documenti in precedenza citati considerano la condroitina un intermedio per la sintesi di condroitina solfato, senza evidenziarne proprietà biologiche intrinseche. Solo genericamente in alcuni di essi si cita la possibilità di un utilizzo della condroitina in composizioni non meglio definite come nel caso di US 20110244520 (claim 63) e di WO 0180810 (claim 73); in quest’ultimo documento va sottolineato che a pag 4-5, la condroitina à ̈ definita come un “polymer more inert, loosely speaking, than analogous HA molecule†.

WO 2012/032151 descrive inoltre complessi cooperativi ibridi fra acido ialuronico e condroitina. Quest’ultima à ̈ proposta solo come eccipiente reologico, per ridurre la viscosità, senza che ne sia descritto alcun effetto farmacologico.

Definizioni

Spesso con il termine condroitina si indica impropriamente anche la condroitina solfatata; pertanto, per chiarezza, i due termini condroitina e condroitina solfato sono mantenuti di seguito distinti. Con il termine condroitina si intende il polisaccaride non solfatato, indicato con l’acronimo C, mentre con il termine condroitina solfato si intende il polisaccaride differentemente solfatato, indicato con l’acronimo CS.

Descrizione dell’invenzione

Mentre à ̈ ampiamente documentato l’uso della condroitina solfato in campo medico, nessun dato era a oggi disponibile per applicazioni della condroitina. Si à ̈ ora trovato che la condroitina à ̈ dotata di una serie di importanti attività biologiche, che la rendono utile per diverse applicazioni non solo nel campo terapeutico, ma anche in quelli della medicina estetica, della nutraceutica e della cosmeceutica.

Modelli sperimentali e studi clinici hanno dimostrato che la condroitina interagisce con i sistemi biologici in maniera multifattoriale, originando a livello di cellule, tessuti e intero organismo risposte biologiche superiori o nuove rispetto a quelle della condroitina solfato.

Anche se la condroitina à ̈ di fatto un intermedio metabolico per la biosintesi della condroitina solfato, questa molecola non à ̈ presente come tale nei tessuti, perché già nella fase di biosintesi à ̈ ancorata a un residuo di serina del core proteico mediante il tetrasaccaride GlcA-Gal-Gal-Xyl su cui si ha la crescita della catena formata dalla ripetizione delle unità disaccaridiche di N-acetil-D-galattosammina β 1:4 e D-glucuronato β 1:3. Il processo di allungamento della catena e la sua successiva solfatazione avvengono in maniera quasi contestuale.

La presenza di condroitina libera nell’organismo a seguito di una sua somministrazione esogena rappresenta pertanto una condizione metabolica nuova, responsabile di una serie di risposte biologiche di natura multifattoriale.

Si à ̈ infatti trovato che la condroitina stimola la crescita cellulare, in particolare la crescita dei condrociti favorendone il mantenimento del tipo cellulare, possiede attività antiinfiammatoria e antibatterica ed à ̈ in grado di stimolare il wound repair. La condroitina può inoltre vantaggiosamente sostituire la condroitina solfato o altri glicosamminoglicani nelle applicazioni tipiche di questi ultimi, ad esempio nella viscosupplementazione, nel riparo cartilagineo, in campo oftalmico, nel trattamento delle artropatie e nei trattamenti di biorivitalizzazione della pelle mediante microiniezioni intradermiche. Si à ̈ inoltre trovato che la condroitina potenzia l’attività di principi attivi antitumorali e trova impiego nel trattamento di diverse patologie quali osteoartrite, cistite interstiziale, patologie dell’apparato respiratorio. La condroitina trova inoltre utile impiego in soluzioni per dialisi peritoneale e come componente strutturale di scaffold per crescite tissutali.

L’invenzione riguarda pertanto composizioni farmaceutiche, nutraceutiche, cosmeceutiche o dispositivi medici contenenti come ingrediente attivo condroitina non solfatata.

La condroitina può essere eventualmente associata ad altri ingredienti attivi, ad esempio acido ialuronico, anti-infiammatori, farmaci antitumorali, mucolitici, antibatterici.

Le vie di somministrazione e i dosaggi dipenderanno dal tipo di condizione da trattare e potranno essere determinati dagli esperti in base a studi pre-clinici e clinici, con metodologie note. In linea di massima, i dosaggi non saranno comunque sostanzialmente simili a quelli attualmente usati per la condroitina solfato, quando impiegata nelle stesse applicazioni. Tali dosaggi potranno essere ad esempio compresi tra 0,1 e 200 mg/Kg per via orale, tra 0,01 e 20 mg/Kg per via iniettiva mentre le formulazioni topiche potranno contenere concentrazioni di condroitina variabili da 0,01 a 80% in peso. La condroitina potrà essere formulata in composizioni adatte alla somministrazione orale, iniettabile o topica. Esempi di tali forme di somministrazione comprendono capsule, compresse, colliri, gel, creme, soluzioni o sospensioni, polveri orosolubili, spray, sciroppi.

La somministrazione di condroitina per via iniettiva, orale o topica, anche a dosaggi molto elevati, non provoca reazioni avverse che possano pregiudicare il suo impiego. Le caratteristiche tossicologiche della condroitina, riportate in tabella 1, ne dimostrano la sicurezza di impiego.

Test Modello sperimentale Valor Tossicità

Acuta Topo/ratto LD50 >2000 mg/Kg p.o. e 160 mg/K Subacuta 30 giorni Ratto Assenza di tossicità >200 mg/Kg/die Cronica 26 settimane Ratto Assenza di tossicità >200 mg/Kg/die Mutagenicità/ genotossicità

In vitro test, Ames’ test 5 ceppi di Salmonella Fino a 2.0 mg/piastra assenza di poin typhimurium

In vitro, test, chromosomal aberration Linfociti umani Fino a 5 pg/mL non si osservano sig test delle cellule portatrici di aberrazioni In vitro test, DNA-repair test Ceppo di Escherichia coli Anche ai dosaggi più elevati non inte sensibile all’azione di

sostanze mutagene

Test in vivo, micronucleous test Topo Anche al dosaggio di 80 mg/K considerata non mutagenica nel early Studio di carcinogenicità Ratto L’esame istopatologico della sperim effettuata sul ratto dimostra la to degenerativo di tipo neoplastico a live Studi di tossicità sul sistema riproduttivo

Studio sulla fertilità e la capacità Ratto La somministrazione giornaliera per riproduttiva via orale, anche alla dose di 200 m fertilità dei ratti maschi. Analo giornaliera fino a 200 mg/Kg accoppiamento e fino al giorno 21° sulla capacità riproduttiva delle fem Descrizione dettagliata dell’invenzione

Si riassumono di seguito le evidenze sperimentali alla base degli usi oggetto dell’invenzione. Ulteriori dettagli sono riportati negli esempi.

Stimolazione della crescita cellulare

La presenza di condroitina stimola fortemente la crescita di numerosi tipi cellulari, come cheratinociti, fibroblasti e, in particolare, condrociti. Si tratta di una fenomenologia complessa, messa bene in evidenza da esperimenti di wound healing, che in vitro simulano il processo di guarigione di una ferita. Le sperimentazioni di wound healing sono realizzate utilizzando la microscopia ottica time lapse, una tecnica che permette di monitorare per tempi prolungati (2-4 giorni) il comportamento cellulare in termini di adesione, proliferazione e motilità, in un ambiente che riproduce le condizioni ottimali di crescita cellulare (atmosfera al 5% v/v di CO2in aria umida e temperatura a 37±0.1°C). La coltura à ̈ portata a confluenza e su di essa si pratica un taglio (wound) valutandone nel tempo la velocità di riparo calcolando la variazione dell’area della ferita. L’analisi quali-quantitativa mostra una riparazione della ferita in presenza di condroitina in meno di 20 h mentre nel caso della condroitina solfato anche dopo 70 h la ferita non rimargina completamente; nelle stesse condizioni il controllo (terreno senza aggiunta di polisaccaride) si chiude dopo 40 h. In ognuna delle condizioni sperimentate, C mostra capacità di ridurre il tempo di rimarginazione, approssimativamente dimezzandolo. Questo risultato rappresenta un importante indicatore della risoluzione di ferite aperte, con conseguente riduzione delle tipiche complicanze relative ad infezioni, sepsi ecc..

Stimolazione della crescita dei condrociti e mantenimento del tipo cellulare

La sperimentazione su colture primarie di condrociti umani, isolati da prelievi di cartilagine umana sana ottenuti durante interventi di rinoplastica, dimostra che la presenza di condroitina nel terreno di coltura non solo ha un’azione di stimolo per la crescita cellulare, ma anche una specifica azione nel mantenimento del tipo cellulare condrocitico. Nel caso dei condrociti si osserva, infatti, un processo di differenziazione delle cellule che, con il procedere dei passaggi di crescita, presentano sempre più un aspetto morfologicamente simile a fibroblasti. Questo tipo di comportamento à ̈ contrastato dalla presenza di condroitina nel terreno di coltura. Uno studio dell’effetto della condroitina sulla proliferazione di condrociti, effettuato utilizzando la videomicroscopia time-lapse, mostra che la crescita delle cellule trattate con la condroitina à ̈ migliore rispetto a quella di cellule non trattate o trattate con condroitina solfato.

L’analisi fenotipica mediante immunoistochimica di condrociti umani cresciuti in presenza di condroitina o condroitina solfato mostra che dopo 4 giorni di trattamento le diverse colture (cellule non trattate, cellule trattate con condroitina e con condroitina solfato) presentano tutte una forte positività al collagene di tipo II, un marcatore specifico del tipo cellulare condrocitico, ma questa condizione à ̈ mantenuta a tempi più lunghi (7 e 10 giorni) solo nelle cellule trattate con condroitina.

L’analisi mediante real time PCR dell’espressione genica dei principali marcatori specifici di differenzazione (β-actina, aggrecano, collagene tipo II, collagene tipo I, sox9) in condrociti umani cresciuti in presenza di condroitina o condroitina solfato mostra che: a) il trattamento con condroitina determina una variazione dell’espressione dei geni di differenziazione e di matrice analizzati (aggrecano, collagene di tipo I, collagene di tipo II, sox9) ai diversi tempi di analisi considerati (4, 7 e 10 gg); b) i condrociti al secondo passaggio di crescita, se trattati con condroitina, presentano elevati livelli di espressione del collagene di tipo II mentre, se trattati con condroitina solfato, presentano elevati livelli di espressione del collagene di tipo I, che si accompagnano a un evidente cambiamento morfologico in tipologia fibroblastica; c) le cellule al terzo passaggio di crescita presentano una minore risposta al trattamento con condroitina o condroitina solfato, anche se si riscontra un’evidente persistenza di espressione del collagene di tipo II in presenza della condroitina, dimostrando il mantenimento del fenotipo condrocitico anche ad avanzati passaggi di crescita.

Questi risultati hanno un rilevante interesse applicativo nell’ingegneria tissutale, dimostrando che la crescita di condrociti ottenibili da un espianto in presenza di condroitina permette di amplificare nel tempo le cellule, mantenendo il fenotipo condrocitico e quindi le caratteristiche del tessuto che si viene formando. Questo risultato à ̈ importante anche sotto il profilo farmacologico per l’utilizzazione della condroitina in tutte quelle patologie in cui il fenotipo condrocitico e il suo ottimale metabolismo rivestono un ruolo strategico nella risoluzione della patologia.

Attività antiinfiammatoria

L’uso della condroitina solfato nel trattamento dell’osteoartrite (OA) à ̈ stato basato per decenni sull’ipotesi che il contenuto di questa diminuisse con l’invecchiamento nei pazienti affetti da OA e che il prodotto somministrato avesse quindi una funzione suppletiva alla ridotta capacità biosintetica di proteoglicani e fluido sinoviale. Studi recenti sul meccanismi di azione della condroitina solfato nel trattamento dell’OA hanno modificato questa ipotesi di meccanismo d’azione, dimostrando un attivo coinvolgimento della condroitina solfato nella riduzione dello stato infiammatorio alla base della progressione dell’OA e anche dell’artrite reumatoide. In particolare à ̈ stato dimostrato che in conseguenza di traumi ripetuti delle articolazioni (tessuto cartilagineo, liquido sinoviale, osso subcondrale) sono rilasciati a livello della matrice extracellulare mediatori pro-infiammatori, che svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi. Tra questi ci sono l’interleuchina 1b (IL-1β) e il fattore di necrosi tumorale a (TNF-α). In particolare, nei condrociti l’IL-1β si lega a recettori di membrana e attiva vie di signaling mediante chinasi, quali ERK-1/2 e p38MAPK, che a loro volta attivano pathways infiammatori nella cellula. In particolare, studi in vitro hanno dimostrato che la condroitina solfato inibisce la fosforilazione e l’attivazione sia di ERK-1/2 che di p38MAPK, riducendo di conseguenza la traslocazione di NF-kB, supportando di fatto un effetto antiinfiammatorio della condroitina solfato (Du Souich, P., et al., J. Cellular and Molecular Medicine, 2009, 13:1451-1463). In uno studio più recente effettuato su condrociti umani estratti da cartilagine del ginocchio e amplificati in laboratorio, Calamia e collaboratori (Calamia V, et al., Arthritis Res. Ther., 2010, 12(4):R138) hanno studiato l’effetto dell’addizione di IL-1b, una citochina pro-infiammatoria (Fernandes JC, et al., Biorheology, 2002, 39:237-246) ed à ̈ stata valutata la modulazione di due marcatori coinvolti nella manifestazione dello stato infiammatorio: la chaperonina GRP78 e l’enzima superossido dismutasi (SOD-2).

Uno studio comparativo tra condroitina e condroitina solfato ha dimostrato che la condroitina, nonostante sia una molecola naturalmente non presente nell’organismo, à ̈ in grado di attivare in vitro su sistemi cellulari come i condrociti azioni di signaling della stessa tipologia di quelle proposte per la condroitina solfato, ma significativamente più potenti. I risultati sperimentali, infatti, dimostrano che: a) l’espressione di GRP78 à ̈ positivamente modulata dal trattamento con condroitina, in maniera significativamente migliore della condroitina solfato; b) il processo di up-regolazione di SOD-2 indotto da IL-1β (sintomo di forte stress ossidativo) à ̈ efficacemente ridotto dal pretrattamento con condroitina, mentre inefficace risulta il pretrattamento con condroitina solfato.

La condroitina à ̈ pertanto un farmaco utile nel trattamento di patologie in cui la componente infiammatoria à ̈ conseguenza o fattore causale della malattia, come nel caso dell’OA e dell’artrite reumatoide.

Attività antibatterica

Recentemente à ̈ stato dimostrato che in soggetti affetti da OA la somministrazione dell’antibiotico trimoxazolo, per il trattamento di una concomitante infezioni urinaria, ha anche un effetto di sensibile alleviamento dei sintomi dell’OA. Questo dato ha portato a ipotizzare che, almeno in parte, l’azione della condroitina solfato nel trattamento dell’OA potesse essere connessa anche con una sua possibile attività antimicrobica. Questa ipotesi ha trovato riscontri in due studi (Rozin AP, Clin. Rheumatol., 2009, Oct 28(10):1221-3; Sprecher H. et al., Clin. Exp. Rheumatol., 2008, 26(3):509-510) che dimostrano un’attività antibatterica contro Escherichia coli di prodotti contenenti condroitina solfato.

Uno studio comparativo tra condroitina e condroitina solfato ha dimostrato che la condroitina, nonostante sia presente nella capsula di alcuni microrganismi in forma variamente modificata (es. fruttosilata), à ̈ in grado di inibire la crescita di enterobatteri patogeni. In particolare à ̈ stata dimostrata una azione marcata su Escherichia coli ed Enterococcus faecalis.

Tale attività concorre all’efficacia di uso di condroitina in diverse indicazioni, quali: a) il wound healing perché, oltre alla promozione del riparo, la presenza della condroitina previene i rischi di infezione sui tessuti esposti; b) l’OA, perché un’alterata flora intestinale/fecale, come riportato in letteratura, ha effetti negativi sulla progressione della patologia e pertanto l’effetto antibatterico si configura come un fattore adiuvante per contrastare l’aggravarsi della malattia; c) la cistite interstiziale, perché zone di ristagno di liquidi possono costituire aree preferenziali di infiltrazioni batteriche e infezioni.

Stimolazione di wound repair

Per le sue molteplici interazioni con i sistemi cellulari, la condroitina presenta una notevole capacità di accelerare i processi di riparazione tissutale. Impiegando come modello sperimentale il mini-pig, un modello la cui validità à ̈ ampiamente riconosciuta, sul cui dorso sono praticate chirurgicamente delle ferite, à ̈ stata valutata la capacità di accelerare il processo di guarigione con applicazioni topiche di condroitina o condroitina solfato. Il trattamento à ̈ effettuato facendo gocciolare lentamente la soluzione acquosa dei composti nella ferita due volte al giorno e tamponando con una garza con cui viene poi coperta la ferita. La sperimentazione si protrae per 6 settimane.

La valutazione dermatologica della guarigione della ferita dimostra una migliore qualità del processo di guarigione in presenza di condroitina rispetto a quello con condroitina solfato, perché il primo à ̈ più rapido e caratterizzato da un aspetto qualitativamente migliore dei bordi della ferita e del tessuto circostante.

La valutazione istopatologica mostra nel caso del trattamento con condroitina un minore contenuto di tessuto di granulazione e un quadro infiammatorio notevolmente più contenuto rispetto al trattamento con condroitina solfato.

La valutazione istologica mostra che nel caso del trattamento con condroitina si ha una organizzazione delle fibre di collagene simile a quella di un tessuto normale, indicando un processo avanzato di guarigione delle ferita.

Trattamento delle artropatie

Le capacità rigenerative della condroitina a livello cellulare, le proprietà reologiche di questo polisaccaride e la sua specifica azione sul tipo cellulare condrocitico sono alla base dell’impiego di questo composto nel trattamento delle artropatie. Una valutazione delle potenzialità terapeutiche della condroitina nel trattamento delle artropatie effettuata sul cane, un modello sperimentale in cui sono particolarmente ricorrenti sia in età giovane che geriatrica problemi ortopedici di tipo degenerativo o infiammatorio riconducibili ad artropatie (DJD, degenerative joint diseases), dimostra che la somministrazione per 6 mesi per via orale al dosaggio di 15 mg/Kg/gg di condroitina risulta più efficace della condroitina solfato e migliora significativamente il quadro clinico con una buona regressione della patologia.

Biorivitalizzazione della pelle

La biorivitalizzazione della pelle mediante microiniezioni intradermiche di soluzioni di acido ialuronico à ̈ uno dei trattamenti estetici più praticati. Il razionale à ̈ che l’introduzione nel derma di questo polisaccaride elicita complesse risposte biologiche, mediate da attività multiple di signalling cellulare, che si traducono in una riattivazione metabolica tissutale. Si à ̈ trovato che microiniezioni intradermiche di condroitina hanno effetti biorivitalizzanti superiori a quelle dell’ acido ialuronico. 2 mL di condroitina in concentrazioni di 20 o 60 mg/mL sono state microiniettate con cadenza bimestrale nell’arco di 6 mesi. Un altro gruppo di soggetti era trattato analogamente con 2 mL di acido ialuronico 20 mg/mL. All’inizio e al termine della sperimentazione si sono effettuate misure strumentali della TEWL (Trans Epidermal Water Loss), della consistenza del tessuto e della rugosità cutanea. Inoltre il medico e la paziente indipendentemente valutano nel tempo il quadro estetico complessivo. Lo studio dimostra che la condroitina, a parità di concentrazione con l’acido ialuronico (20 mg/mL), ha un effetto biorivitalizzante più precoce e duraturo nel tempo mentre, a concentrazioni maggiori (60 mg/mL), l’effetto biorivitalizzante della condroitina à ̈ nettamente superiore, raggiungendo risultati ottimali già dal secondo trattamento.

Potenziamento dell’attività di farmaci antitumorali

La condroitina potenzia fortemente l’azione apoptotica di gemcitabina (GEM) o mitomicina-C (MMC), due antitumorali utili nel trattamento intravescicale dei tumori non muscolari della vescica. In uno studio in vitro su linee cellulari umane di cancro della vescica HT-1376, à ̈ stata valutata la capacità di inibizione della crescita e l’azione apoptotica/necrotica a opera di differenti combinazioni di GEM o MCC con condroitina o condroitina solfato. Questa sperimentazione dimostra che: a) l’associazione tra antitumorale e condroitina o condroitina solfato ha un forte effetto sulla inibizione della crescita delle cellule tumorali; b) le condizioni sinergistiche sono differenti in funzione dell’antitumorale associato; c) il sinergismo polisaccaride-GEM porta prevalentemente a cellule che vanno in apoptosi, mentre il sinergismo polisaccaride MMC porta a cellule che vanno in necrosi; d) gli effetti sinergistici della condroitina sono significativamente più importanti di quelli della condroitina solfato; e) le associazioni sinergistiche della condroitina con GEM o MMC possono rappresentare un promettente approccio terapeutico nel campo dei tumori superficiali della vescica.

Viscosupplementazione e nel riparo cartilagineo

La condroitina, grazie alla specificità d’azione nella stimolazione dei condrociti e nel mantenimento del loro tipo cellulare nel tempo, risulta un efficace agente di viscosupplementazione e riparo del tessuto cartilagineo danneggiato. La validità di questo impiego terapeutico della condroitina à ̈ stata verificata paragonando l’efficacia nel trattamento di patologie articolari connesse con danni della componente cartilaginea dell’articolazione dell’associazione acido ialuronico-condroitina a quella di un trattamento convenzionale a base di solo acido ialuronico. La sperimentazione, effettuata su volontari affetti da una severa compromissione dell’articolazione del ginocchio con danni della componente cartilaginea, evidente sintomatologia infiammatoria in atto, gonfiore e dolore, ha dimostrato che la presenza della condroitina consente un ottimo livello di recupero dell’articolazione con riparazione della componente cartilaginea e un generalizzato miglioramento nel tempo del quadro patologico della sintomatologia dolorosa. Risultati così risolutivi non si osservano invece nel trattamento convenzionale di viscosupplementazione con solo acido ialuronico.

Trattamento della cistite interstiziale

E’ noto l’impiego dell’acido ialuronico e della condroitina solfato nel trattamento della cistite interstiziale (D. Porru et al., Urol. Int. 1997, 59:26-29; Curtis et al., BUJI, 2008, 103:56-60; M. Cervigni, Int. Urogynecol., 2008, 19:943-947; D. Porru et al., Rewievs on Recent Clinical Trials, 2008, 3:00-00; DE 102006060953). In considerazione delle analogie strutturali con questi polisaccaridi e delle azioni di stimolazione cellulare e tissutale della condroitina, à ̈ stato condotto uno studio comparativo di efficacia nel trattamento della cistite interstiziale di associazioni di acido ialuronico e condroitina o condroitina solfato.

I soggetti volontari, con diagnosi certa di cistite interstiziale, sono trattati con istillazioni in vescica mediante catetere di una soluzione di acido ialuronico-condroitina o acido ialuronico condroitina solfato, ripetendo il trattamento con cadenza settimanale per 6 settimane e successivamente con cadenza mensile ancora per 5 mesi. All’inizio del trattamento e alla conclusione dello studio viene effettuata una cistoscopia con dilatazione vescicale per verificare lo stato del tessuto epiteliale e una biopsia della parete vescicale per definire lo stato infiammatorio. Durante la sperimentazione si valuta l’urodinamica (urgenza, frequenza e nocturia) e la presenza di bruciore e dolore vescicale. Il confronto della cistoscopia effettuata prima e dopo il trattamento dimostra una generalizzata e migliore risoluzione del quadro patologico dei soggetti trattati con l’associazione acido ialuronicocondroitina, dato questo che trova riscontro anche nella valutazione istologica delle biopsie della parete vescicale, che dimostrano una migliore risoluzione del processo infiammatorio, e nei dati clinici, che dimostrano una più completa e veloce risoluzione del quadro patologico, sia sotto il profilo urodinamico che del dolore residuale.

Impiego in formulazioni oftalmiche

La condroitina, per le caratteristiche di biocompatibilità, l’azione cicatrizzante, la capacità di idratare, la blanda azione antimicrobica, l’ottimale viscosità delle soluzioni acquose che la compongono e la possibilità di sterilizzazione a caldo senza che si abbiano modifiche reologiche, à ̈ utilizzabile nella fabbricazione di preparati oftalmici come colliri e pomate, in associazione con altri principi attivi. Le caratteristiche migliorative dei colliri fabbricati utilizzando la condroitina come componente reologico-terapeutico sono: a) una viscosità ottimale con assenza di appiccicosità del preparato; b) un’uniforme e più omogenea distribuzione del collirio in ogni parte della cornea; c) una migliore stabilità del film lacrimale; d) una migliore adesione alle cellule corneocongiuntivali; e) un’azione riepitelizzante, anti-infiammatoria e disinfettante sulla superficie corneale; f) la normalizzazione della tensione superficiale; g) una maggiore permanenza a livello corneale; h) la possibilità, nel corso della giornata, di ripetute applicazioni per ripristinare l’adeguata condizione lacrimale.

Una sperimentazione su soggetti affetti dalla patologia detta dell’occhio secco, che ha messo a confronto due preparati oftalmici, uno convenzionale a base di acido ialuronico e uno a base di condroitina, entrambe al 3% p/v in soluzione salina fisiologica, con un ciclo terapeutico che prevede applicazioni 4 volte die per 30 gg, ha mostrato che il collirio a base di condroitina, sia nella valutazione clinica che in quella soggettiva del soggetto trattato, presenta migliori indici di valutazione.

Impiego nella dialisi peritoneale

Le proprietà chimico-fisiche e la capacità rigenerativa a livello tissutale sono alla base di un innovativo impiego della condroitina nel campo della dialisi peritoneale. La soluzione di dialisi à ̈ costituita principalmente da zuccheri (soluzione glucosata) addizionata con altri sali. Esiste in tre differenti concentrazioni (1.36%, 2.27% and 3.86%): più à ̈ alta la concentrazione, maggiore la quantità di liquidi che sarà rimossa. Quindi in caso di maggiore ritenzione di liquidi sarà indicato l’uso di soluzioni ad elevata concentrazione, viceversa in caso di disidratazione le soluzioni a più bassa concentrazione saranno più indicate.

Nel caso in cui non si riesca ad ottimizzare il trattamento deve essere valutato attentamente il passaggio alla emodialisi.

La dialisi peritoneale ha molti vantaggi rispetto all’emodialisi, perché comporta minori restrizioni dietetiche e di attività, ha meno effetti negativi sull’emodinamica, à ̈ migliore la conservazione della funzione renale residua ed à ̈ più facile la riabilitazione. Tuttavia, negli ultimi anni, sono emersi una serie di inconvenienti nei casi di dialisi peritoneale prolungata, legati a un deterioramento della funzione peritoneale, con insufficiente allontanamento di acqua e scorie metaboliche durante il trattamento dialitico. Si ritiene che questo deterioramento della funzione peritoneale sia da associare alle alte concentrazioni di glucosio, presente come agente osmotico nei liquidi di dialisi peritoneale, che determinano un processo di glicosilazione di proteine e la formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Nonostante l’attualità della problematica e le numerose innovazioni formulative proposte (US 2010286085, WO 9801141, US 5955450, US 5597805l, WO 9314796, JP 1151462) non sono state ad oggi sviluppate strategie in grado di minimizzare in maniera soddisfacente il danno funzionale della membrana peritoneale associato al ricorso prolungato alla dialisi peritoneale.

È stato trovato che l’impiego in formulazioni per dialisi peritoneale di condroitina, come agente osmotico ad effetto protettivo, rappresenta una valida soluzione per minimizzare le problematiche in precedenza menzionate, grazie alla capacità di questo polisaccaride di promuovere la rigenerazione del mesotelio peritoneale, evitando processi fibrotici.

Trattamento delle patologie dell’apparato respiratorio

La condroitina può essere impiegata nella risoluzione di patologie dell’apparato oro-faringeo e polmonare di differente eziologia come stomatiti, tonsilliti, laringiti, faringiti, tosse, bronchiti grazie alle sue proprietà reologiche e biologiche, quali la capacità di ritenere acqua promuovendo l’idratazione tissutale, l’azione filmogena e la capacità di aderire alle mucose, la capacità di biostimolare cellule e tessuti, l’azione antiinfiammatoria e antibatterica. La condroitina per questi impieghi può essere formulata in associazione con agenti lenitivi e mucolitici in differenti forme farmaceutiche come sciroppi, tablets, polveri orosolubili, spray.

La condroitina come nutraceutico e cosmeceutico

Alla luce delle attività biologiche sopra riportate (in particolare l’attività antiinfiammatoria e antibatterica) e grazie alla completa assenza di tossicità, la condroitina à ̈ utile nella formulazione, eventualmente insieme ad altri composti, di nutraceutici e cosmeceutici, utili in particolare per la biorivitalizzazione di cellule e tessuti.

Scaffold per crescite tissutali

La condroitina può essere impiegata come elemento strutturale per la costruzione di scaffold per la crescita 3D di sistemi cellulari da utilizzare nel campo della medicina rigenerativa.

Di seguito si riportano esempi che meglio descrivono l’invenzione. ESEMPIO 1 - Attivazione della crescita dei cheratinociti

Come sistema modello sono utilizzate le HaCat, una linea cellulare immortalizzata di cheratinociti umani. Le HaCat sono cresciute e amplificate in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) al 10% di siero fetale bovino (FBS) 1% Pen-Strep solution (10.000 unità di pennicillina-G/mL e 10 mg di streptomicina/mL in soluzione salina) in un incubatore per colture cellulari (37°C, 5% CO2in aria umida). Le sperimentazioni di wound healing sono realizzate utilizzando la microscopia ottica time lapse, una tecnica che permette di monitorare per tempi prolungati (2-4 giorni) il comportamento cellulare in termini di adesione, proliferazione e motilità. Il sistema consta di un microscopio ottico invertito (Zeiss Axiovert 200), di un bagno termostatico (LAUDA Ecoline), di un microincubatore a CO2con una geometria tale da alloggiare piastre di dimensioni variabili (da 6 a 96 well) e di un’unità di controllo dei gas in uscita (aria e CO2); lo strumento à ̈ anche dotato di una telecamera digitale e di un motore di controllo, che consente all’incubatore di eseguire spostamenti lungo le direzioni x, y e z in modo da registrare e acquisire a intervalli predefiniti le immagini scelte dall’operatore.

Il sistema così assemblato consente di mantenere le cellule in un ambiente che riproduce le condizioni ottimali di crescita cellulare (atmosfera al 5% v/v di CO2in aria umida e temperatura a 37±0.1°C) e di monitorarle durante tutta la durata dell’esperimento. Inoltre il sistema à ̈ dotato di un software che permette di eseguire un’accurata analisi delle immagini. In particolare la strumentazione à ̈ dotata di un software automatizzato che permette di calcolare la riparazione di una ferita in saggi di wound healing e ottenere dati sulla velocità di riparazione e di migrazione cellulare, parametri importanti per valutare l’effetto biorivitalizzante di sostanze che possono accelerare o inibire la riparazione di una ferita in vitro.

La procedura standard per un saggio di wound healing à ̈ così articolata: a) si aggiungono 100 µL di una soluzione di collagene 0.1 mg/mL in CH3COOH in ogni pozzetto di una multiwell da 12 pozzetti, per incrementare l’adesione cellula-substrato e migliorare la direzionalità della migrazione cellulare, lasciando la piastra aperta sotto cappa a flusso laminare fino alla completa evaporazione dell’acido; b) si utilizza DMEM 2% FBS come terreno di coltura e si aggiungono nei pozzetti condroitina o condroitina solfato o acido ialuronico, questi ultimi utilizzati come sistemi di confronto, per concentrazioni finali tra 0.1 e 1% p/v, in due dei 12 pozzetti, che fungono da controllo, non si aggiunge niente al terreno di coltura; c) in ciascun pozzetto si piastra un’aliquota della sospensione cellulare di HaCat (1.8*10<5>) per ottenere dopo 2 giorni di incubazione (37°C, 5% CO2in aria umida) la completa confluenza; d) nel layer a confluenza presente in ogni pozzetto si effettua con una tip sterile un taglio (wound) di circa 1mm; e) la multiwell da 12 à ̈ alloggiata nello stage incubator della stazione di video microscopia time-lapse; f) l’esperimento inizia solo quando le condizioni ambientali sono quelle ottimali per il mantenimento delle cellule in vitro e per una buona visualizzazione delle immagini (37°C±0.1, 5% CO2e assenza di condensa); g) si selezionano 4-5 campi di vista del taglio per ogni pozzetto e si avvia l’esperimento che in media dura 72-96 h; h) durante questo periodo lo strumento segue nel tempo la chiusura dei differenti tagli rappresentati da tutti i campi di vista selezionati con un intervallo di tempo di 1h; i) al saggio di wound healing segue l’analisi quali-quantitativa del wound repair mediante un software che permette di misurare automaticamente l’area del taglio nel tempo per ciascun campo selezionato; l) i risultati in funzione del tempo sono riportati sotto forma di immagini, che permettono di osservare in maniera qualitativa la riparazione della ferita, e in termini numerici come percentuale di riparazione [(area tempo zero-area tempo t/area tempo zero)*100].

I risultati dimostrano che già alla concentrazione 0.1 p/v la condroitina accelera il processo di riparazione, mentre la condroitina solfato lo rallenta. Il dato à ̈ confermato in maniera più netta a 1% p/v. L’analisi quali-quantitativa del wound repair mostra una riparazione della ferita in presenza di condroitina in meno di 20 h, mentre il controllo si chiude solo dopo 40 h, nel caso della condroitina solfato, invece, anche dopo 70 h la ferita non rimargina completamente.

ESEMPIO 2 - Saggio di proliferazione di condrociti

Come sistema modello si utilizzano culture primarie di condrociti umani isolati da prelievi di cartilagine umana sana ottenuti durante interventi di rinoplastica. I frammenti di tessuto appena prelevati in camera operatoria sono immersi in una soluzione fisiologica di NaCl 0,9% p/p, e rapidamente trasferiti in laboratorio per l’estrazione dei condrociti. Operando in condizioni sterili sotto cappa a flusso laminare il tessuto prelevato à ̈ trasferito su una piastra petri dove à ̈ ridotto in piccoli pezzi utilizzando pinzette e bisturi sterili. I pezzi di cartilagine sono successivamente immersi in tampone fosfato pH 7,4 0,01M (PBS) contenente collagenasi di tipo 1 (3 mg/mL), dispasi (4 mg/mL) e gentamicina (5 µL/mL di una soluzione 80 mg/mL) per garantire la sterilità durante la digestione enzimatica. I pezzi sono lasciati in incubazione overnight in una falcon a 37°C, sotto agitazione. Dopo 16-18 h la soluzione à ̈ filtrata su un filtrino da 70 µm, trasferendo sul filtro le parti adese alla falcon con un lavaggio con 7-8 mL di DMEM al 10% FBS. Il filtrato à ̈ centrifugato a 1.500rpm per 7’, il surnatante à ̈ allontanato e il pellet à ̈ sospeso in 10 mL di DMEM al 10% FBS contenente fungizone (5 µL/mL di una soluzione 80 mg/mL) e gentamicina (5 µL/mL di una soluzione 80 mg/mL). La sospensione cellulare così ottenuta à ̈ piastrata in una flask da 25 cm<2>e incubata a 37°C in atmosfera al 5% CO2, con cambi del mezzo ogni 2 o 3 giorni, fino a completa confluenza della coltura cellulare. Successivamente le cellule, che presentano l’aspetto caratteristico dei condrociti, piccole cellule rigonfie di forma un poco allungata, sono staccate dal fondo della flask, contate e nuovamente incubate in terreno fresco. In genere al secondo passaggio di crescita si ottengono circa 2*10<6>cellule partendo da 0,4 g di cartilagine. La conoscenza del numero di cicli di crescita a cui la cultura à ̈ stata in precedenza sottoposta à ̈ di fondamentale importanza per cellule primarie, in particolare nel caso dei condrociti si osserva un processo di differenziazione delle cellule che, con il procedere dei passaggi di crescita, presentano sempre più un aspetto morfologicamente simile a fibroblasti. Per questa ragione tutta la sperimentazione à ̈ effettuata impiegando colture di condrociti primari al II-IV passaggio di crescita.

La valutazione dell’effetto della condroitina sulla proliferazione di condrociti à ̈ effettuata utilizzando la videomicroscopia time-lapse, come

descritto nell’esempio 1. La sperimentazione à ̈ effettuata comparativamente a

condrociti stimolati con condroitina solfato, utilizzando come sistema

controllo condrociti non stimolati. Si seminano 20*10<3>cellule per pozzetto di

una multiwell da 24 pozzetti. Le cellule sono trattate con condroitina o

condroitina solfato con un contenuto di endotossine ≤0.1 EU/mg all’1% p/v in

DMEM al 10% di FBS, nel controllo le cellule sono seminate in DMEM al

10% di FBS. Gli esperimenti sono realizzati in triplicato e analizzati per un

tempo totale che varia da 96 a 120 h. L’analisi delle immagini, eseguita

utilizzando il software di analisi Image Pro-plus 5.1, permette, mediante una

conta manuale, di ottenere un numero preciso di cellule a tempi prestabiliti

dall’operatore, per costruire una curva di crescita nel tempo. L’analisi dei dati

evidenzia (tabella 2) che la crescita delle cellule trattate con la condroitina à ̈

migliore rispetto quella delle cellule non trattate e delle cellule trattate con

condroitina solfato.

Tempo Cellule x 10<4>

<(h)>controllo condroitina solfato condroitina

0 7,0±0,8 7,0±0,5 7,0±0,7

20 10,0±1,1 10,0±1,2 10,2±0,9

40 15,1±1,6 14,0±1,8 15,3±1,3

60 18,8±1,4 18,0±1,6 22,0±1,8

80 22,5±1,9 21,8±1,7 27,0±2,0

100 27,0±2,3 25,0±2,5 32,0±2,1

Tabella 2 - Numero di condrociti in funzione del tempo, incubando in

presenza di condroitina o condroitina solfato 1% p/v.

ESEMPIO 3 - Analisi fenotipica mediante immunoistochimica

di condrociti umani cresciuti in presenza di condroitina o condroitina solfatato

La valutazione del fenotipo condrocitico delle cellule di fresco estratte da prelievi di tessuto cartilagineo umano e dopo 4, 7 e 10 giorni di crescita in terreno contenente condroitina o condroitina solfato à ̈ stata ottenuta mediante analisi di immunoistochimica, utilizzando il kit Envision (DaKo) che impiega un anticorpo per il Collagene di Tipo II, considerato un marcatore di differenzazione specifico dei condrociti (Stokes et al., Biochem. J., 2001, 360:461-470). Dopo 4 giorni di trattamento, le diverse colture (cellule non trattate, trattate con condroitina e trattate con condroitina solfato) presentano tutte una forte positività al collagene di tipo II, ma questa condizione à ̈ mantenuta a tempi più lunghi (7 e 10 giorni) solo nelle cellule trattate con condroitina.

ESEMPIO 4 - Analisi mediante real time PCR dell’espressione genica dei principali marcatori specifici di differenzazione in condrociti umani cresciuti in presenza di condroitina o condroitina solfato

Al fine di valutare gli effetti biologici della condroitina su colture di condrociti umani à ̈ stata effettuata la determinazione dell’espressione di un set di geni, considerati chiave nella definizione del fenotipo e marker idonei alla valutazione della qualità del tessuto generato. La sperimentazione à ̈ condotta su condrociti preparati da cartilagine umana, come riportato nell’esempio 2, crescendo le cellule in presenza di condroitina o condroitina solfato. In una procedura tipo 5*10<4>cellule sono seminate per pozzetto in una multiwell da 24 posti. I condrociti sono cresciuti in DMEM contenente 1% p/v di condroitina o condroitina solfato (contenuto di endotossine ≤ 0.1 EU/mg). Le cellule sono stimolate per 4, 7 e 10 giorni, (Ishak et al., International J. of Pediatric Otorhinolaryngology, 2011, 75: 835-840) dopo i quali si procede all’estrazione dell’RNA utilizzando il Trizol Reagent, come descritto dal manuale del kit (Life Technologies Ltd, Milano, Italy). Ai vari tempi, parallelamente all’estrazione dell’RNA, si effettua anche un’analisi morfologica qualitativa della coltura cellulare, mediante osservazione al microscopio ottico dei campioni corrispondenti a 4, 7 e 10 gg. Le cellule seminate ai tre tempi diversi sono osservate al microscopio e, utilizzando una stazione di video microscopia time-lapse, si procede all’acquisizione delle immagini che meglio rappresentano le condizioni di crescita delle cellule. Dopo l’estrazione dell’RNA si procede con la retro trascrizione utilizzando 1 µg totale di RNA e quindi con l’amplificazione mediante Real Time PCR di geni che risultano essere marcatori specifici dei condrociti (tabella 3).

Temperatura Gene Oligo-sequenze di annealing (°C) β-Actina<Forward: 5’gCgAgAAgATgA CCC AgA TC 3’>55Reverse: 5’ggATAgCACAgCCTggATAg 3’

Aggrecano<Forward: 5’ TCgAggACAgCgAggCC 3’>

Reverse: 5’ TCgAgggTgTAgCgTgTAgAg 3’56 Collagene Forward: 5’CAgCCgCTTCACCTACAgC 3’

tipo I Reverse: 56

5’TTTgTATTCAATCACTgTCTTgCC 3’

Collagene Forward: 5’CAACACTgCCAACgTCCAgAT

3’

tipo II 57

Reverse: 5’CTgCTTCgTCCAgATAggCAA 3’

Sox9<Forward: 5’AgACCTTTgggATgCCTTAT 3’>

Reverse: 5’ TAgCCTCCCTCACTCCAAgA 3’55

Tabella 3 - Oligo-sequenze utilizzate per lo studio mediante Real Time PCR dell’espressione dei principali marcatori specifici di differenzazione in condrociti umani stimolati con condroitina solfatata e non solfatata.

Come marcatori specifici di differenziazione e caratterizzazione dei condrociti sono analizzati geni collegati alla produzione di matrice, quali aggrecano, collagene di tipo I, collagene di tipo II e il gene Sox9, la cui espressione à ̈ strettamente correlata all’espressione del collagene di tipo II (Akiyama H., Mod Rheumatol., 2008, 18(3): 213-9; Yang et al., J. of Orthopaedic Res. 2011).

L’analisi dell’espressione genica dei suddetti marcatori su condrociti umani coltivati in terreno base (controllo) e con il trattamento con condroitina (C) o condroitina solfato (CS) à ̈ stata effettuata su colture cellulari al secondo e terzo passaggio di crescita.

In tabella 4 sono riportati i valori dei livelli di espressione genica a 4, 7 e 10 giorni rispetto al controllo e rispetto a geni housekeeping, che consentono la normalizzazione dell’espressione (metodo del ∆∆ct) (Pfaffl MW., Nucleic Acids Res., 2001, May 1; 29(9): e45). I risultati dell’analisi dell’espressione genica sono riportati come medie di almeno 3 esperimenti indipendenti per prove condotte in presenza di C o CS, su cellule dei passaggi 2 e 3.

Al passaggio 2 di crescita l’espressione dell’aggrecano à ̈ inferiore al controllo a 4gg dal piastramento per le cellule trattate con C, mentre, allo stesso tempo, in media l’espressione del gene per le cellule trattate con CS risulta lievemente superiore. La differenza osservata tra i campioni trattati con CS e il controllo non à ̈ significativa, mentre lo à ̈ quella che si ha tra campioni trattati con CS e campioni trattati con C. Il dato di espressione a tempi brevi concorda con l’evidenza di un’aumentata proliferazione dei condrociti in presenza di C, che può spiegare il ritardo nell’espressione e quindi nella sintesi dell’aggrecano. A 7gg, infatti, si riscontra un aumento significativo dell’espressione dell’aggrecano per i campioni trattati con C (1.66±0.22) rispetto al controllo e una lieve down regolazione per i campioni trattati con CS. Quest’ultima persiste, divenendo significativa a 10 gg di incubazione, mentre per le cellule trattate con C si riscontra parallelamente l’assestamento dei valori di espressione dell’aggrecano sui valori simili al controllo.

L’osservazione in esperimenti time-lapse sui campioni trattati e non, evidenzia all’avanzare della coltura (e poi nei passaggi successivi) il cambiamento del fenotipo in tipologia fibroblastica; l’evidente modifica morfologica, trova riscontro nel marcatore specifico: il collagene di tipo I. In tabella 4 si evidenzia come a 4gg di incubazione entrambi i trattamenti (C e CS) portano a un incremento non significativo dell’espressione del collagene di tipo I, a 7gg però l’incremento per le cellule trattate con CS diviene significativo, diversamente da quello per le cellule trattate con C, che addirittura a tempi lunghi di incubazione presentano una riduzione statisticamente significativa del 30%. Sia l’analisi morfologica che la valutazione dell’espressione del collagene di tipo I confermano che il fenotipo condrocitico à ̈ conservato meglio in presenza di C rispetto al trattamento con CS (Chiu L.H. et al., J. Cell. Physiol., 2011, 226: 1981-1988).

Sono stati analizzati anche Sox9 e collagene di tipo II, quest’ultimo considerato uno dei più significativi marcatori specifico del tipo cellulare condrocitico, in particolare nella tipizzazione immunoistochimica. L’espressione del gene Sox-9 à ̈ analizzata perché recentemente Sox-9 à ̈ stato classificato come un fattore di trascrizione che controlla positivamente la sintesi del collagene di tipo II e che à ̈ essenziale per la condrogenesi (Yang et al., Journal of Orthopaedic Research August 2011).

Un comportamento sovrapponibile per i 2 trattamenti (C e CS) à ̈ stato riscontrato in relazione ad una up-regolazione di Sox9, rispetto al controllo, a 4gg di incubazione. Nel tempo (7 e 10 gg) la condroitina aiuta a mantenere alti i livelli di espressione rispetto al controllo anche se con minore significatività rispetto ai tempi brevi, mentre la CS a 10gg dimostra una down-regolazione.

Il marker principale del tipo condrocitico, il collagene di tipo II, risulta, infine, fortemente up-regolato a tutti i tempi di coltura analizzati per i trattamenti con C e presenta, invece, un aumento significativo a tempi brevi per le cellule trattate con CS, che si va riducendo con l’allungarsi dei tempi di incubazione, sostanzialmente tornando ai valori del controllo.

Il panel di geni analizzati comparativamente consente di affermare che il trattamento con C permette un mantenimento del fenotipo più a lungo, modulando la produzione di aggrecano, verosimilmente in maniera collegata alla fase di proliferazione che prelude a quella di sintesi della matrice extracellulare (Ishak M.F. et al, Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 2011, 75: 835-840). L’analisi al microscopio ottico dei condrociti al terzo passaggio di crescita a pochi giorni (4 gg) dal piastramento evidenzia che si ha proliferazione e produzione di matrice. A questi tempi l’espressione genica dell’aggrecano in presenza della C risulta ancora bassa per poi aumentare rispetto al controllo a 7 gg in maniera sequenziale all’aumento della densità cellulare (Roughley et al., European Cells and Materials, 2006, 11: 1-7). Il comportamento in presenza di CS à ̈ simile fino a 7 gg di incubazione, ma a 10 gg si ha un’evidente down regolazione, significativa rispetto ai valori di espressione dei campioni trattati con C. Quando i condrociti sono in presenza di C, l’espressione del collagene di tipo I risulta inferiore al controllo a tutti i tempi di incubazione. Diversi sono i risultati per il terreno contenente CS che presenta, invece, un aumento dell’espressione di collagene di tipo I a 7 gg. Parallelamente si osserva per i campioni trattati con CS una down regolazione del collagene di tipo II nei primi 4 gg di crescita, che poi si trasforma in un over-espressione rispetto al controllo (circa 2 volte) a 7 gg, e poi, con un andamento altalenante, di nuovo una down regolazione a 10 gg. I campioni trattati con C presentano già a 4gg dal piastramento un’elevata espressione del collagene di tipo II rispetto al controllo, tale modulazione viene mantenuta in maniera persistente a 7 e 10 gg, confermando il ruolo di questa molecola nel mantenimento del fenotipo condrocitico più a lungo, anche in piastramenti sequenziali.

In sintesi lo studio, nel suo complesso, dimostra che:

a) il trattamento con C determina una variazione dell’espressione dei geni di differenziamento e di matrice analizzati (aggrecano, collagene di tipo I, collagene di tipo II, Sox9) ai diversi tempi di analisi considerati (4, 7 e 10 gg); b) i condrociti al secondo passaggio di crescita, se trattati con C, presentano elevati livelli di espressione del collagene di tipo II, invece, se trattati con CS, presentano elevati livelli di espressione del collagene di tipo I, che si accompagnano a un evidente cambiamento morfologico in fenotipo fibroblastico.

4g 0.08±0.02 0.16±0.08 1.28±0.75 0. 17±0. 10 1.23±0.29 0.24±0.01 1.20±0.56 0.34±0.01 2.70±0.32 1.69±0.20 2.8±0.75 0.50±0.01 Il gene SOX9 codifica per una proteina che

svolge un ruolo importante durante le prime II 1.87±0.85 fasi dello sviluppo. Il ruolo chiave à ̈ C

soprattutto nello sviluppo scheletrico e

cartilagineo. Nei condrociti, SOX9 III 3.68±0.44 Sox9 interagisce con un sito specifico sull’introne

6 del COL2A1, regolandone attività.

II 2.2±1.20 CS III 2.6±1.21

* Livello di espressione genica normalizzata rispetto al controllo (condrociti non trattati) Tabella 4 - Valutazione dell’espressione di aggrecano, collagene di tipo I, Sox 9 e colla condrociti umani al secondo e terzo passaggio di crescita. I dati sono riportati come rapporto de geni in colture di condrociti dopo 4, 7 e 10 giorni di trattamento con 1% p/v di condroitina (C) o al livello di espressione degli stessi geni nel controllo costituito da cellule non trattate.

c) le cellule al terzo passaggio di crescita presentano una minore risposta al trattamento con C o CS, anche se si riscontra un’evidente persistenza di espressione del collagene di tipo II in presenza della C, dimostrando il mantenimento del fenotipo condrocitico anche ad avanzati passaggi di crescita.

ESEMPIO 5 - Razionali molecolari dell’azione antiinfiammatoria della condroitina

Lo studio ha come obiettivo la valutazione degli effetti della condroitina o della condroitina solfato sull’espressione genica di GRP78 e SOD-2 in condrociti umani, dopo trattamento con la citochina pro-infiammatoria IL-1β.

Nello studio si sono utilizzati condrociti umani estratti da cartilagine nasale trattati con l’IL-1β, una citochina pro-infiammatoria che agisce come mediatore nell’attivazione dei meccanismi biologici alla base dell’insorgenza dell’OA. In particolare si à ̈ valutata la modulazione di due marcatori coinvolti nella manifestazione dello stato infiammatorio: la chaperonina GRP78 e l’enzima superossido dismutasi (SOD-2).

In un esperimento tipo 10<4>cellule sono seminate per pozzetto di una multiwell da 24 pozzetti, dopo 5 gg, raggiunta la confluenza, le cellule sono starvate per 24 ore (incubazione in DMEM con FBS allo 0.5%). Successivamente le cellule sono trattate per 2h con 1% p/v di condroitina (C) o condroitina solfato (CS) (contenuto di endotossine ≤ 0.1 EU/mg), in DMEM senza FBS, mantenendo nelle stesse condizioni, ma senza aggiunta di C o CS il controllo. Successivamente alle colture si aggiunge IL-1β alla concentrazione di 10 ng/mL, Dopo 24h ore di incubazione si recuperano le cellule e da esse si estrae l’RNA, utilizzando il Trizol Reagent, come descritto dal manuale del kit (Life Technologies, Ltd, Milan Italy).

Con 1 µg totale di RNA si effettua, quindi, la retrotrascrizione, amplificando mediante Real Time PCR i geni di riferimento (GRP78 e SOD-2), in accordo con quanto riportato in Calamia V, et. al., (Calamia V, et. al., Arthritis Res. Ther. 2010, 12(4):R138).

In tabella 5 sono riportati i risultati delle analisi in RT-PCR, relativi all’espressione dei due geni marker selezionati, rispetto a un controllo negativo costituito da condrociti non trattati con C, CS e l’IL-1β e un controllo positivo costituito da condrociti trattati solo con IL-1β.  L’espressione di GRP78 nel trattamento con solo IL-1β (controllo positivo) aumenta di 2 volte rispetto al controllo negativo, nel trattamento con CS IL-1β aumenta di circa 3 volte, mentre nel trattamento con C IL-1β aumenta di circa 10 volte. Sebbene questo gene sia sintomo di un meccanismo infiammatorio attivo, à ̈ stato dimostrato che la proteina per cui codifica, sita nel reticolo endoplasmatico, si configura come un auto-antigene dell’artrite reumatoide (malattia a connotazione autoimmune) ed à ̈, infatti, responsabile della stimolazione monocitaria alla sintesi di citochine, modulando così la risposta antiinfiammatoria dell’organismo.

Per quanto riguarda l’espressione di SOD-2 (Tabella 5), i risultati ottenuti, mostrano una sostanziale equivalenza nell’espressione genica nel caso di IL-1β CS e IL-1β mentre si osserva una riduzione notevole nel caso di IL-1β C.

I valori di espressione genica sono confermati dai dati di espressione proteica ottenuti in western-blot mediante analisi densitometrica delle bande proteiche GRP78 e di SOD2 confrontate con il gene costitutivo della tubulina

(Tabella 6)

<Gene Controllo>IL-1β IL-1β+CS IL-1β+C

GRP78 1 2.0±0.5 2.8±0.2* 10±2,1<§>

SOD-2 1 22±4 24±3 8±1.1<§>

Tabella 5. Variazioni dell’espressione genica di GRP78 e SOD 2, in

condrociti umani in seguito a trattamento con IL-1β, IL-1β condroitina

solfato (IL-1β CS) e IL-1β condroitina (IL-1β C), rispetto alle cellule

non trattate date come 1 (controllo negativo). L’espressione genica à ̈

determinata mediante analisi di Real Time PCR (ï€ ̈n=3, *p<0.05 IL-1β+CS vs

controllo positivo, §p <0.01 IL-1β+C vs IL-1β+CS e controllo positivo) 

<Proteina Controllo>IL-1β IL-1β+CS IL-1β+C

GRP78 1 1.15±0.15 1.18±0.10 1.71±0.31*

SOD-2 1 1.96±0.20 1.94±0.30 1.42±0.22*

Tabella 6. Valori di espressione proteica di GRP78 e SOD 2, in

condrociti umani in seguito a trattamento con IL-1β, IL-1, β+condroitina

solfato (IL-1 β+CS) e IL-1β+condroitina (IL-1 β+C), ottenuti dall’analisi

densitometrica di western, analisi effettuata su n=3 esperimenti indipendenti,

*p (blots rispetto alla tubulina espressa costitutivamente, (*p<0.05 IL-1β+C

vs IL-1β+CS e controllo positivo).

In sintesi i risultati sperimentali dimostrano che: a) l’espressione di

GRP78 indotta da IL-1β à ̈ positivamente modulata dal pretrattamento con C,

in maniera significativamente migliore che nel caso del pretrattamento con

CS; b) il processo di up-regolazione di SOD-2 indotto da IL-1β (sintomo di

forte stress ossidativo) Ã ̈ efficacemente ridotto dal pretrattamento con condroitina, mentre inefficace risulta il pretrattamento con condroitina solfato.

ESEMPIO 6 - La condroitina come antibatterico

È stata esaminata l’attività antibatterica della condroitina (C) e della condroitina solfato (CS) sulla crescita di Escherichia. coli ATCC 25922 ed Enterococcus faecalis ATCC 19433 su terreno solido in vitro. Il range di concentrazioni esplorato va da 40 µg/mL a 40 mg/mL di C o CS come concentrazioni finali in terreno. Come terreno di coltura si utilizza brain-Heart infusion (Oxoid) per E. coli ATCC 25922 e M17 (Oxoid) per E. faecalis ATCC 19433, entrambi i terreni sono portati allo stesso pH e alla stessa osmolarità prima di essere solidificati per addizione di agar e raffreddamento. Sono piastrati come inoculo 100µL di una sospensione batterica contenente 10<2>,10<3>o 10<4>batteri/mL. Le piastre inoculate sono incubate in shaker ad aria a 37°C per 16h. Il numero di colonie à ̈ stato quindi contato su piastre di controllo in assenza delle sostanze in studio e sulle piastre alle varie concentrazioni di C e CS. I dati degli esperimenti per i due microrganismi, condotti in triplicato per ognuna delle condizioni, sono riportati nelle tabelle 7 e 8.

Dai risultati si evince che a tutte le concentrazioni c’à ̈ un effetto superiore della C rispetto alla CS, ma in particolare emerge una forte efficacia della prima, fino all’inibizione totale della crescita di E. coli quando si addizionano 40 mg/mL di C e una soglia di sensibilità superiore, che fa riscontrare una inibizione elevata già a concentrazioni 10 volte superiori Concentrazione N° batteri UFC dopo 16h Fattore di Inibizione inoculati inibizione valutazione qualitativa Controllo 10 100 1000 8±2 90±8 870±100 -40 µg/mL CS 10 100 1000 7±2 85±7 860±70 1 non significativa 400 µg/mL CS 10 100 1000 5±1 50±5 400±70 2 landa 4 mg/mL CS 10 100 1000 0 9±2 100±10 10 significativa 40 mg/mL CS 10 100 1000 0 0 3±1 330 elevata 40 µg/mL C 10 100 1000 7±2 80±5 800±70 1.3 blanda 400 µg/mL C 10 100 1000 2±1 10±2 120±30 9 significativa 4 mg/mL C 10 100 1000 0 1±1 20±4 66 elevata 40 mg/mL C 10 100 1000 0 0 0 1000 totale

Tabella 7 - Inibizione della crescita cellulare del ceppo di Escherichia. coli ATCC 25922 su piastra in presenza di CS e C

Concentrazione N° batteri inoculati UFC dopo 36h Fattore di Inibizione inibizione valutazione qualitativa Controllo 10 100 1000 9±2 95±8 950±100 -40 µg/mL CS 10 100 1000 8±2 90±7 960±70 - non significativa 400 µg/mL CS 10 100 1000 7±1 80±5 780±70 1.3 blanda 4 mg/mL CS 10 100 1000 5±1 48±4 520±30 2 significativa 40 mg/mL CS 10 100 1000 0 15±2 120±10 7.4 elevata 40 µg/mL C 10 100 1000 8±2 82±5 870±70 1.2 blanda 400 µg/mL C 10 100 1000 5±1 55±6 480±30 2 significativa 4 mg/mL C 10 100 1000 0 18±4 150±4 6.1 significativa 40 mg/mL C 10 100 1000 0 0 20±2 50 elevata

Tabella 8 - Inibizione della crescita cellulare del ceppo di Enterococcus faecalis ATCC 19433 su piastra in presenza di CS e C.

Si dimostra in generale meno sensibile il ceppo di Enterococcus, che

comunque in presenza della concentrazione massima di sostanze testate mostra un fattore di inibizione pari a 7.4 con CS mentre arriva a un fattore 50 con C. Questi risultati dimostrano l’efficacia della C come antibatterico.

ESEMPIO 7 - Studi di tossicità della condroitina

Studio di tossicità acuta - Lo studio à ̈ eseguito su due modelli animali,

topo e ratto, a cui si somministra la condroitina per via orale (p.o.) e per via

endovena (i.v.). Per ciascuna sperimentazione gli animali (topi o ratti Sprague

Dawley) sono divisi in 5 gruppi di 20 (10 maschi e 10 femmine) che ricevono

p.o. o i.v. la condroitina a dosaggi che variano da 250 a 2.000 mg/Kg per la

somministrazione orale e da 20 a 160 mg/Kg per la somministra endovena, il

volume di somministrazione à ̈ di 10 mL/Kg per la somministrazione p.o. e

5 mL/Kg per la somministrazione i.v. Nella tabella 9 Ã ̈ riportato il disegno

sperimentale

Numero di Dose Dose Totale condroitina animali (mg/Kg) (mg/animale) per 20 animali (mg)

topo ratto Topo Ratto

20 0 0,0 0 0 0

20 20 0,6 4 12 80

20 40 1,2 8 24 160

20 80 2,4 16 48 320

20 160 4,8 32 96 640

Totale 180 1.200

Tabella 9 - Disegno sperimentale per la valutazione della tossicità acuta

della condroitina somministrata in topo e ratto in dose singola per via orale o

endovena.

Durante il trattamento gli animali sono visitati ogni 24h per 40 gg senza

osservare segni di tossicità o mortalità negli animali. Sugli animali al termine

del trattamento, dopo il sacrificio, si effettua una autopsia completa. I valori

di LD50per entrambe le tipologie di animali risultano rispettivamente superiori a 2.000 mg/Kg per la somministrazione p.o. e a 160 mg/Kg per la somministrazione i.v. Complessivamente lo studio dimostra l’assenza di tossicità della condroitina ai dosaggi utilizzati in condizioni di somministrazione acuta.

Studio di tossicità subacuta - Lo studio à ̈ eseguito su ratto somministrando la condroitina per via orale (p.o.) e per via intramuscolo (i.m.). Per ciascuna delle due sperimentazione gli animali (ratti Sprague Dawley) sono divisi in 4 gruppi formati da 15 maschi e 15 femmine, ai primi 3 si somministra la condroitina rispettivamente a 50, 100 e 200 mg/Kg mentre al quarto gruppo si somministra solo il veicolo; il volume di somministrazione à ̈ di 10 mL/Kg per la somministrazione p.o. e 5 mL/Kg per la somministrazione i.m. La somministrazione giornaliera si protrae per 30 gg. Le dosi utilizzate rappresentano fino a 20 volte la dose terapeutica sull’uomo. Giornalmente si monitorano le condizioni generali di salute degli animali trattati e il loro comportamento, mentre ogni 5 gg si valutano le variazioni di peso, il quadro ematologico e le urine. Durante l’intero trattamento non si riscontrano decessi e gli animali non presentano alterazioni comportamentali di rilievo e variazioni ponderali anomale. Analogamente i parametri chimico-clinici non presentano variazioni statisticamente significative rispetto agli animali controllo. Al termine dello studio tutti gli animali sono sacrificati e si effettua una autopsia e un’analisi istopatologica degli principali organi (polmoni, cuore, fegato, ovaio, utero, testicoli, reni e ipofisi). Tutte queste valutazioni non mostrano significative differenze tra gli animali trattati con condroitina e gli animali controllo che hanno ricevuto il solo veicolo. Complessivamente lo studio dimostra l’assenza di tossicità della condroitina ai dosaggi utilizzati in condizioni di somministrazione subacuta.

Studio di tossicità cronica - Lo studio à ̈ eseguito su ratto (Sprague Dawley) trattato tutti i giorni per 26 settimane con condroitina somministrata p.o. (mediante gavage) a dosi da 50 a 200 mg/Kg. Giornalmente si monitorano le condizioni generali di salute degli animali trattati e il loro comportamento, mentre ogni 7 gg si valutano le variazioni di peso, il quadro ematologico e le urine. Durante l’intero trattamento non si riscontrano decessi e gli animali non presentano alterazioni comportamentali di rilievo e variazioni ponderali anomale. Analogamente i parametri chimico-clinici non presentano variazioni statisticamente significative rispetto agli animali controllo. Al termine dello studio tutti gli animali sono sacrificati e si effettua una autopsia e un’analisi istopatologica degli principali organi (polmoni, cuore, fegato, ovaio, utero, testicoli, reni, ipofisi, nodi linfatici e tratto gastrointestinale). Tutte queste valutazioni non mostrano significative differenze tra gli animali trattati con condroitina e gli animali controllo che hanno ricevuto il solo veicolo. Complessivamente lo studio dimostra l’assenza di una tossicità della condroitina ai dosaggi utilizzati in condizioni di somministrazione cronica.

ESEMPIO 8 - Studi di mutagenicità e genotossicità

Gli studi di mutagenicità della condroitina sono condotti su differenti modelli di mutagenicità e genotossicità sia in vitro che in vivo (Sirtori C., File CONDRAL®, Vol. IV - Reproductive Toxicity and Mutagenesis; Slater E. et al., Rapid detection of mutagens and carcinogens, Cancer Res. 1971, 31: 970-973).

In vitro test, Ames’ test - Il test à ̈ effettuato con e senza attivazione metabolica su 5 ceppi di Salmonella typhimurium. La condroitina à ̈ testata a concentrazioni tra 2.0 µg/piastra e 2.0 mg/piastra. L’analisi della

retromutazione ottenuta ai differenti dosaggi e nel controllo non mostra

significative differenze nel numero di istidine revertanti in ogni gruppo. La

sperimentazione dimostra che la condroitina e i metaboliti che da essa

possono generarsi non inducono una specifica point-reverse mutation sui

ceppi di Salmonella typhimurium testati.

In vitro, test chromosomal aberration test - Il chromosomal aberration

test à ̈ realizzato su linfociti umani in due differenti esperimenti con e senza

attivazione metabolica, il disegno sperimentale à ̈ riportato nella tabella 10.

Senza S9 mix Con S9 mix esperimento I esperimento esperimento I esperimento II II

Periodo di

esposizione4h 22h 46h 4h 4h Recovery 18h - - 18h 42h Preparation

interval22h 22h 46h 22h 46h

Tabella 10 - Disegno sperimentale del chromosomal aberration test per

la valutazione della mutagenicità della condroitina.

In ciascuno dei due esperimenti si analizzano due culture in parallelo. I

dosaggi di condroitina testati tra 1,6 e 5,0 µg/mL sono scelti in accordo con

quanto previsto nel documento Organization for Economic Cooperation and

Development Guideline # 473 of 21 July 1997. Nella doppia e indipendente

sperimentazione non si osservano significativi incrementi del numero delle

cellule portatrici di aberrazioni cromosomiche, anche alle concentrazioni più

alte di condroitina testate.

In vitro test, DNA-repair test - Il DNA alteration test, realizzato

utilizzando un ceppo di Escherichia coli sensibile all’azione di sostanze mutagene. Nella sperimentazione la mitomicina C à ̈ utilizzata come controllo positivo e la penicillina G come controllo negativo. La condroitina à ̈ testata con e senza attivazione metabolica a concentrazioni secondo quanto descritto da Slater et. al (Slater E. et al., Rapid detection of mutagens and carcinogens, Cancer Res. 1971, 31:970-973, 1971. I risultati ottenuti dimostrano che la condroitina, anche ai dosaggi più elevati non interagisce e non altera il DNA.

Test in vivo, micronucleous test - Utilizzando come modello sperimentale il topo, la condroitina à ̈ somministrata in un “early micronucleous test†a dosi da 20 a 80 mg/Kg, somministrate per via intraperitoneale (i.p.) in 5 gruppi di Swiss mice (5 per gruppo). La somministrazione à ̈ effettuata per due volte a 24 h di distanza, utilizzando la trietanolammina come controllo positivo. Dopo 6 h dalla seconda somministrazione gli animali sono sacrificati e il midollo osseo à ̈ preparato come descritto nel RCC-CCR Study 105303, 2007. La frequenza di cellule micronucleate à ̈ determinata su un totale di 2.000 eritrociti per animale. Nella sperimentazione non si riscontrano significative differenze tra i gruppi trattati e quello controllo che riceve il solo veicolo. Complessivamente i dati dimostrano che la condroitina può essere considerata non mutagenica nel early micronucleous test.

ESEMPIO 9 - Studi di carcinogenicità

L’esame istopatologico della sperimentazione subcronica e cronica effettuata sul ratto (esempio 6) ha dimostrato la totale assenza di un potenziale degenerativo di tipo neoplastico a livello di tutti gli organi principali. In particolare la sperimentazione cronica, anche ai dosaggi più elevati, mostra la totale assenza di sintomi di irritazione del tratto gastro-intestinale, che nel lungo tempo rappresenta in genere la premessa per lo sviluppo di possibili neoplasie come il carcinoma gastro-intestinale. Analogamente à ̈ importante considerare che il catabolismo idrolitico della condroitina non à ̈ diverso da quello della condroitina solfato e che gli oligosaccaridi e gli zuccheri ottenuti rappresentano specie chimiche naturalmente presenti nell’organismo.

ESEMPIO 10 - Studi di tossicità sul sistema riproduttivo

Studio sulla fertilità e la capacità riproduttiva - Lo studio tossicologico su possibili effetti della condroitina sulla fertilità dei maschi e sulla capacità riproduttiva delle femmine à ̈ eseguito su 200 ratti Wistar, 160 femmine e 40 maschi, divisi casualmente in quattro gruppi, ciascuno formato da 40 femmine e 10 maschi, trattati rispettivamente con 0, 50, 100 e 200 mg/Kg di condroitina. Ogni gruppo di ratti di sesso femminile à ̈ stato a sua volta diviso in due sottogruppi di 20 animali, il primo che riceve il prodotto quotidianamente dal giorno 14° prima dell’inizio del periodo di accoppiamento fino al giorno 19° di gravidanza, il secondo che riceve la condroitina fino 21° giorno dopo il parto. Tutti i maschi sono trattati con condroitina per 60 giorni prima dell’accoppiamento e per tutto il periodo di gravidanza delle femmine. Il protocollo adottato segue le linee guida della direttiva CEE 85/571. I risultati non mostrano differenze statisticamente significative tra il controllo e i tre gruppi trattati e nel ambito dei ogni gruppo tra i due subgruppi di femmine e il controllo. L’analisi istopatologica della progenie sacrificata dopo il parto al giorno 21° non mostra differenze tra animali controllo e trattati, evidenziando la totale assenza di anomalie. Sulla base di questi risultati si può concludere che la somministrazione giornaliera per 60 giorni della condroitina per via orale, anche alla dose di 200 mg/Kg, non ha alcun effetto sulla fertilità dei ratti maschi, analogamente non ha effetto sulla capacità riproduttiva delle femmine il trattamento con condroitina somministrata giornaliermente fino a 200 mg/Kg per 15 giorni prima dell’accoppiamento e fino al giorno 21° della lattazione

Sviluppo embrio-fetale - Lo studio di tossicità fetale à ̈ condotto su 50 ratte gravide New Zealand di 5 mesi, divise in maniera casuale in 4 gruppi di 12 individui, trattati con condroitina per i.m. rispettivamente alle dosi di 0, 25, 50 e 100 mg/Kg una volta al giorno dal 6° al 27° giorno di gravidanza. Al giorno 28 i feti sono prelevati con taglio cesareo e su di essi si effettua una completa analisi istopatologia. I seguenti parametri sono valutati durante il periodo di trattamento: l’incremento del peso corporeo delle gravide, il numero di corpi lutei e impianti, così come i feti nati vivi, il peso medio, il sesso dei feti nati vivi, il numero dei riassorbimenti e dei feti nati morti. I risultati non mostrano differenze statisticamente significative tra i gruppi trattati e il gruppo controllo a cui si pratica il trattamento i.m. con il solo veicolo. Nei feti dei 4 gruppi, infatti, non si osservano alterazioni esterne e a livello dell’apparato scheletrico e dei visceri. La valutazione complessiva dei dati permette di concludere che la condroitina, anche al dosaggio massimo testato di 100 mg/Kg, non presenta attività teratogena.

Sviluppo post-natale - Lo studio sulla tossicità post-natale à ̈ eseguito su 48 ratti Wistar femmine, trattate per via orale dal giorno 15° di gravidanza fino al termine del periodo di allattamento, cioà ̈ 21 giorni post-partum. Gli animali sono divisi in quattro gruppi che ricevono p.o. ogni giorno 0, 50, 100, 200 mg/Kg di condroitina. Al termine del periodo di lattazione tutte le femmine sono sacrificate e vengono valutate la morfologia e le malformazioni scheletriche e viscerali della prole. I parametri osservati nel tempo sono: il peso corporeo delle femmine che allattano e il numero, il sesso e il peso dei ratti nati. I risultati non mostrano differenze tra i gruppi trattati e rispetto al controllo. Durante l’allattamento non si osservano anomalie nello sviluppo della prole. Si può concludere che la condroitina non ha effetti teratogeni nei ratti dopo la somministrazione delle dosi orali di 50, 100, 200 mg/Kg /die se somministrata dal 15° giorno di gravidanza alla fine del periodo di lattazione.

ESEMPIO 11 - Sensibilizzazione

La valutazione dell’attività sensibilizzante sistemica e cutanea della condroitina à ̈ effettuata su Guinea pig.

Sensibilizzazione sistemica e anafilassi - Il test di ipersensibilizzazione indotta da condroitina à ̈ effettuata su 6 Guinea pig come di seguito riportato. 6 animali sono sensibilizzati con una iniezione intramuscolo di 100 µg di ovalbumina 5 mg di condroitina in 100 µL di soluzione fisiologica tamponata a pH 6,8. 10gg dopo la sensibilizzazione dagli animali si ottiene il siero. Ulteriori 24 cavie sono trattate per via intradermica con il siero iperimmune degli animali sensibilizzati in precedenza e divise in 4 gruppi di 6 (gruppo A: controllo negativo; gruppo B: test con 0,5 mg/mL di condroitina; gruppo C: test con 50 mg/mL di condroitina; gruppo D: controllo positivo). 3h dopo l’iniezione intradermica con il siero ipersensibilizzato, i quattro gruppi di animali sono trattati per i.v. come segue: gruppo A: 1 mL di NaCl 0,9% 0,2% di soluzione di blu di Evans; gruppo B: 1 mL di 0,5 mg/mL di condroitina 0,2% soluzione di blu Evans; gruppo C: 1 mL di 50 mg/mL di condroitina 0,2% soluzione di blu Evans; gruppo D: 1 mL di 0,1 mg/mL di ovoalbumina 0,2% soluzione di blu Evans. 24h dopo l’iniezione i.v. dell’antigene ovoalbumina e blu di Evans tutti gli animali del gruppo D mostrano una trasudazione del marcatore blu di Evans nell’area dermica dove à ̈ stato iniettato il siero iperimmune. La condroitina invece non induce reazioni di tipo anafilattico e ipersensibilità in nessuno degli animali trattati.

Sensibilizzazione cutanea - Il test di sensibilizzazione cutanea indotta da condroitina à ̈ effettuato su Guinea pig come di seguito riportato. 20 animali sono sensibilizzati con una iniezione intradermica di 5,0 mg di condroitina in 0,1 mL di NaCl allo 0,9% con e senza adiuvante di Freund. 10 animali del gruppo di controllo ha ricevono 0,1 mL di 0,9% di NaCl iniezioni con e senza adiuvante di Freund. L’induzione della sensibilizzazione à ̈ completata dopo 7 gg con l’applicazione di 0,5 mL di una soluzione di condroitina 50 mg/mL sulla zona di pelle precedentemente iniettata degli animali sensibilizzati. Sul gruppo controllo, invece si applicano 0,5 mL di una soluzione di NaCl allo 0,9%. 21 gg dopo tutti gli animali sono trattati con 0,5 mL di una soluzione di condroitina al 50% sul lato addominale sinistro e con 0,5 mL di una soluzione al 50% NaCl sul lato addominale destro. Nessun segno di sensibilizzazione cutanea à ̈ osservabile negli animali tratti.

ESEMPIO 12 - Wound repair

Come modello sperimentale per la valutazione della capacità di accelerare il processo riparativo di un danno tissutale cutaneo da parte della condroitina si à ̈ utilizzato il mini-pig (animale del peso di 25-28 Kg), un modello la cui validità per studi di wound repair à ̈ ampiamente riconosciuta. Operando sotto anestesia generale dal dorso degli animali si rimuove il pelo con un rasoio e la zona depilata à ̈ abbondantemente lavata con una soluzione di complesso iodio-polivinilpirrolidone al 10% e poi con alcol isopropilico. Sul dorso depilato e disinfettato degli animali si praticano 12 ferite ellittiche, sei per lato, 20 mm lunghe e 6 mm larghe. Le ferite sono praticate fino al grasso sottocutaneo, a circa 4 cm dalla linea mediana del dorso con la dimensione lunga della ferita parallela alla linea spinale. Successivamente le incisioni sono suturate nella metà del derma con due punti di sutura nel tessuto sottocutaneo. Le suture superficiali sono rimosse dopo approssimativamente 7 gg. Le ferite sono coperte con una medicazione non aderente, fissata con un cerotto e il corpo degli animali à ̈ protetto con una fascia elastica. Si selezionano 8 animali divisi in due gruppi di 4, trattati per via topica con condroitina (primo gruppo) o condroitina solfato (secondo gruppo), come descritto nel protocollo di tabella 11. Partendo dal capo dell’animale le prime due ferite su entrambe i lati sono trattate con il solo veicolo costituito da 2,5 mL di fisiologica, le seconde due su entrambe i lati sono trattate con 2,5 mL di una soluzione di condroitina 30 mg/mL in fisiologica (primo gruppo) o con 2,5 mL di una soluzione di condroitina solfato 30 mg/mL in fisiologica (secondo gruppo), le terze due su entrambe i lati sono trattate con 2,5 mL di una soluzione di condroitina 60 mg/mL in fisiologica (primo gruppo) o con 2,5 mL di una soluzione di condroitina solfato 60 mg/mL in fisiologica (secondo gruppo). Il trattamento à ̈ effettuato facendo gocciolare lentamente la soluzione nella ferita due volte al giorno e tamponando con una garza con cui viene poi coperta la ferita consentendo una più prolungata presenza sulla ferita del principio attivo. La sperimentazione si protrae per 6 settimane e alla fine gli animali sono sacrificati. A 4 settimane si effettua un biopsia di circa 4 mm, mentre dagli animali sacrificati si asportano le intere aree delle 12 ferite dorsali per gli accertamenti istologici. Sugli animali trattati si effettuano le seguenti valutazioni:

a) a 4 e 6 settimane una valutazione da parte di 4 dermatologi che valutano indipendentemente la qualità della ferita (colore, texture, contorni, distorsione) e l’aspetto del tessuto circostante su una scala di 5 punti;

b) una valutazione patologica su una scala da 1 a 3 effettuata da due veterinari sul tessuto prelevato dopo il sacrificio, per valutare la presenza di situazioni istopatologiche anormali (quantità di tessuto di granulazione e risposta infiammatoria, 3 per guarigione ottimale - 1 per fenomeni infiammatori in atto e tessuto di granulazione abbondante);

c) un’analisi istologica delle biopsie a 4 settimane e dei tessuti prelevati dopo il sacrificio, effettuata da due istologi che operano in maniera indipendente, valutando l’organizzazione del collageno su una scala di 3 punti. Viene valutata con 3 punti un’organizzazione delle fibre collageno simile al modello normale, ma di dimensioni più piccole rispetto al derma normale (la guarigione migliore), 2 punti una sistemazione intermedia della tessitura delle fibre e 1 punto per più fibre disposte in fasci paralleli o in un piano.

Gruppo Prime due ferite su Seconde due ferite su Terze due ferite su entrambe gli emilati entrambe gli emilati entrambe gli emilati irrigate con 2,5 mL di: irrigate con 2,5 mL di: irrigate con 2,5 mL di:

1 Salina 30 mg/mL di C 60 mg/mL di C 2 Salina 30 mg/mL di CS 60 mg/mL di CS Tabella 11 - Disegno sperimentale per la valutazione di efficacia nel wound repair di condroitina versus condroitina solfato. Ogni gruppo à ̈ formato da 4 animali. Il primo gruppo à ̈ trattato con condroitina (C) il secondo con condroitina solfato (CS).

Nella tabella 12 à ̈ riportata la valutazioni della qualità delle ferite

30 mg/mL 60 mg/mL Valutazione Salina

<C>CS C CS a) Valutazione della qualità

della ferita 4 settimane2,3±0,1 3,8±0,4 2,6±0,2 4,1±0,3 2,9±0,2 b) Valutazione della qualità

della ferita 6 settimane3,5±0.3 4,5±0,3 3,4±0,3 4,9±0,1 3,7±0,3 c) Valutazione istopatologica a

6 settimane1,7±0,2 2,3±0,1 1,7±0,2 3,0±0,2 2,3±0,2 d) Valutazione istologica sulle

biopsie a 4 settimane1,3±0,1 2,3±0,2 1,3±0,1 2,7±0,1 1,3±0,1 e) Valutazione istologica sulle

biopsie a 6 settimane1,7±0,2 2,7±0,1 1,7±0,2 3,0±0,2 1,7±0,1

Tabella 12 - Valutazione, dermatologica, istopatologica e istologica

delle ferite dopo trattamento con condroitina (C) e condroitina solfato (CS);

a-b) a 4 e 6 settimane 4 dermatologi valutano indipendentemente la qualità

della ferita (colore, texture, contorni, distorsione) e l’aspetto del tessuto

circostante su una scala di 5 punti, dove 5 rappresenta una qualità ottimale;

c) valutazione istopatologica su una scala da 1 a 3 effettuata da due veterinari

sul tessuto prelevato dopo il sacrificio per valutare la presenza di situazioni

istopatologiche anomale (quantità di tessuto di granulazione e risposta

infiammatoria, dove 3 Ã ̈ guarigione ottimale e 1 indica fenomeni infiammatori

in atto e tessuto di granulazione abbondante; d-e) analisi istologica delle

biopsie a 4 settimane e dei tessuti prelevati dopo il sacrificio effettuata da due

istologi che operano in maniera indipendente valutando l’organizzazione del

collageno su una scala di 3 punti dove 3 rappresenta un’organizzazione delle

fibre collageno simile al modello normale, ma di dimensioni più piccole

rispetto al derma normale (la guarigione migliore), 2 una sistemazione

intermedia della tessitura delle fibre e 1 punto per più fibre disposte in fasci paralleli o in un piano.

La valutazione dermatologica della guarigione della ferita dimostra una qualità nettamente migliore del processo di guarigione in presenza di condroitina che à ̈ più veloce nel tempo e caratterizzato da un aspetto qualitativamente migliore dei bordi della ferita e del tessuto circostante.

La valutazione istopatologica mostra, nel caso del trattamento con condroitina, un minore contenuto di tessuto di granulazione e un quadro infiammatorio notevolmente contenuto.

La valutazione istologica mostra che, nel caso del trattamento con condroitina, si ha una organizzazione delle fibre di collageno molto simile a quella di un tessuto normale, indicando un processo di guarigione delle ferita molto avanzato.

ESEMPIO 13 - Potenzialità terapeutiche della condroitina nel trattamento delle artropatie

La valutazione delle potenzialità terapeutiche della condroitina nel trattamento delle artropatie à ̈ stata effettuata sul cane, un modello sperimentale in cui sono particolarmente ricorrenti sia in età giovane che geriatrica problemi ortopedici di tipo degenerativo o infiammatorio riconducibili ad artropatie dette in acronimo DJD (Degenerative Joint Diseases).

La sperimentazione à ̈ stata condotta su 90 animali con un peso medio di 30 ± 10 Kg, un’età media di circa 8 anni, di razze differenti, sia maschi che femmine, tutti affetti da DJD della spalla, dell’anca e/o del ginocchio, divisi in maniera casuale in tre gruppi di 30, trattati rispettivamente con 15 mg/Kg/gg di condroitina (gruppo C), 15 mg/Kg/gg di condroitina solfato (gruppo CS) e con 15 mg/Kg/gg di amido (gruppo placebo). Gli animali assumono la dose giornaliera con il cibo. A tutti gli animali inseriti nello studio si effettua preliminarmente una radiografia e un set di analisi diagnostico per la DJD. Gli animali non ricevono nelle tre settimane precedenti la sperimentazione trattamenti farmacologici e durante la sperimentazione non ricevono trattamenti addizionali a quelli previsti dallo studio. La sperimentazione si protrae per 6 mesi e durante il trattamento gli animali, affidati ai loro padroni, sono seguiti da tre veterinari, che indipendentemente valutano lo stato degli animali. Mensilmente sia i proprietari degli animali che i tre veterinari riempiono un questionario, assegnando un punteggio sulla scala 1-5 a una serie di parametri. I proprietari mensilmente valutano su una scala da 1 a 5 la zoppia dell’animale, la sua disponibilità a giocare, la tolleranza al carico, la presenza di comportamenti indicativi di sintomatologie dolorose. I veterinari mensilmente valutano su una scala da 1 a 5 la regressione della patologia, la caratterizzazione del tipo e del grado di artropatia, nonché la valutazione del dolore e la capacità dell’animale di compensare. Al termine della sperimentazione lo stato della patologia à ̈ controllato con una analisi radiografica e un set di analisi diagnostico per la DJD. Sulla base dei questionari e delle valutazioni cliniche finali, i tre veterinari esprimono per i tre gruppi di animali una valutazione media complessiva della regressione della patologia su una scala da 1 a 10, dove valori da 3 a 1 indicano un crescente peggioramento del quadro clinico rispetto all’inizio della sperimentazione mentre valori crescenti da 3 a 10 indicano un’evoluzione verso la completa guarigione. Il gruppo controllo ha un punteggio medio di 2,5 ± 1,3, il gruppo CS di 5,3 ± 2,3 e il gruppo C di 8,5 ± 2,1. Complessivamente la sperimentazione sul cane affetto da DJD indica che il trattamento orale con condroitina al dosaggio giornaliero di 15 mg/Kg per un periodo di 6 mesi contribuisce significativamente a migliorare il quadro clinico, con una buona regressione della patologia.

ESEMPIO 14 - Trattamenti di biorivitalizzazione della pelle mediante microiniezioni intradermiche di condroitina

L’attività di biorivitalizzazione della pelle mediante microiniezioni di condroitina à ̈ valutata in confronto con trattamenti analoghi a base di acido ialuronico. Nell’esperimento sono reclutate 60 volontarie con età tra 50 e 70 anni, sottoposte a un trattamento estetico di biorivitalizzazione della pelle che prevede nell’arco di 6 mesi, con cadenza bimestrale, la microiniezione per tre cicli di 2 mL di una soluzione apirogena e sterile di condroitina (MW 35KDa) 20 mg/mL (C-20) o 60 mg/mL (C-60), avendo come riferimento positivo un analogo ciclo di trattamento di tipo convenzionale con 2 mL di acido ialuronico 1.200 KDa 20 mg/mL (HA-20). I soggetti non hanno subito nei 5 mesi precedenti la sperimentazione trattamenti analoghi o di peeling chimico. Nei 6 mesi di trattamento tutti i soggetti reclutati utilizzano una stessa crema idratante applicata la mattina e la sera. All’inizio della sperimentazione e a 6 mesi si effettuano in uno stesso laboratorio misure strumentali della TEWL (Trans Epidermal Water Loss), della consistenza del tessuto e una replica siliconica della superficie cutanea per documentarne la rugosità. Il medico estetico che pratica il trattamento e la paziente, indipendentemente, riempiono a 0, 2, 4 e 6 mesi un questionario in cui si valuta il quadro estetico complessivo su una scala da 1 a 5 dove 1 indica mancanza di risultato nel trattamento e 5 il pieno successo. Queste valutazioni integrate dai dati strumentali portano a una valutazione complessiva del risultato raggiunto. In tabella 13 sono riportate le medie dei risultati conseguiti.

Valutazione

del paziente del medico strumentale

mesi

0 2 4 6 0 2 4 6 0 2 4 6

HA- 1,4±0,1 2,8±0,2 3,5±0,3 4,1±0,3 1,3±0,1 3,0±0,2 4,1±0,1 4,3±0,2 1,6±0,1 3,0±0,2 4,0±0,2 4,1±0,1 20

C-20 1,2±0,1 3,1±0,1 4,5±0,2 4,5±0,3 1,5±0,2 3,8±0,4 4,5±0,2 4,7±0,1 1,5±0,2 4,1±0,3 4,6±0,4 4,7±0,1 C-60 1,3±0,2 4,0±0,5 4,9±0,1 5,0±0,0 1,2±0,1 4,0±0,2 5,0±0,0 5,0±0,0 1,1±0,1 4,5±0,1 5,0±0,0 5,0±0,0 Tabella 13 - Nell’esperimento sono reclutate 60 volontarie con età tra 50 e 70 anni, sottoposte a un trattamento estetico di biorivitalizzazione della pelle che prevede nell’arco di 6 mesi, con cadenza bimestrale, la microiniezione per tre cicli di 2 mL di una soluzione apirogena e sterile di condroitina (MW 35KDa) 20 mg/mL (C-20) o 60 mg/mL (C-60), avendo come riferimento positivo un analogo ciclo di trattamento di tipo convenzionale con 2 mL di acido ialuronico 1.200KDa 20 mg/mL (HA-20). Il medico estetico che pratica il trattamento e la paziente, indipendentemente, riempiono a 0, 2, 4 e 6 mesi un questionario in cui si valuta il quadro estetico complessivo su una scala da 1 a 5, dove 1 indica mancanza di risultato nel trattamento e 5 il pieno successo. All’inizio della sperimentazione e a 6 mesi si effettuano in uno stesso laboratorio misure strumentali della TEWL (Trans Epidermal Water Loss), della consistenza del tessuto e una replica siliconica della superficie cutanea per documentarne la rugosità. Anche in questo caso la valutazione à ̈ espressa con un giudizio del dermatologo che valuta comparativamente i dati e ne esprime il risultato complessivo su una scala da 1 a 5. Ogni dato rappresenta la media dei 10 casi esaminati.

Come si può osservare, l’effetto biorivitalizzante della condroitina, a parità di concentrazione con l’acido ialuronico, à ̈ più precoce e duraturo nel tempo (HA-20 in confronto con C-20), a concentrazioni maggiori (C-60) l’effetto biorivitalizzante à ̈ nettamente superiore, sia sul piano delle valutazioni di medico e paziente che su quello strumentale, raggiungendo risultati ottimali già dal secondo trattamento.

ESEMPIO 15 - La condroitina come agente potenziante l’attività di principi attivi antitumorali

È stata studiata la capacità della condroitina (C) e della condroitina solfato (CS) di potenziare l’azione apoptotica della gemcitabina (GEM) e della mitomicina-C (MMC), due antitumorali che trovano impiego nel trattamento intravescicale dei tumori non muscolari della vescica. Come sistema modello si sono utilizzate linee cellulari umane di cancro della vescica HT-1376, valutando la capacità di inibizione della crescita a opera di differenti combinazioni di GEM o MCC e C o CS.

La linea cellulare di carcinoma della vescica umana HT-1376 (American Type Tissue Culture Collection Rockville, MD) à ̈ coltivata in DMEM supplementato con 10% foetal bovine serum (FBS) inattivato termicamente, acido 4,2-idrossietil-1-piperazinil-etansolfonico (HEPES) 20 mM, 100 U/mL penicillina, 100 pg/mL streptomicina, 1% p/v di sodio L-glutammina e 1% p/v piruvato. Le cellule sono coltivate in atmosfera umidificata 95% di aria/5% CO2a 37ËšC. Per lo studio del sinergismo tra C o CS e MMC o GEM nella inibizione della crescita delle HT-1376, le cellule sono seminate in piastre da 96 pozzetti alla densità di 6*10<3>cellule/pozzetto. Dopo 24 h di incubazione a 37°C le cellule sono trattate con differenti concentrazioni di C o CS o GEM o MMC e loro combinazioni polisaccarideantitumorale. La valutazione del sinergismo polisaccaride-antitumorale si basa sull’analisi dopo 72 h di trattamento delle curve frazione di cellule sopravvissute versus concentrazione dell’antitumorale, effettuata con il programma per computer Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO). Valori del combination index (CI) di <1, 1, e> 1 indicano rispettivamente sinergia, additività e antagonismo nell’interazione polisaccaride-antitumorale. Il contributo specifico dei vari componenti C, CS, GEM e MMC sulla citotossica delle varie associazioni si determina calcolando il fattore di potenziamento (PF), definito come il rapporto tra l’IC50(inibizione della crescita del 50%) di C, CS, GEM o MMC presi singolarmente e l’IC50delle associazioni C/GEM, C/MMC, CS/GEM o CS/MMC; un valore di PF più elevato à ̈ indice di maggiore citotossicità.

La citometria a flusso à ̈ utilizzata per valutare la quantità di cellule in apoptosi o necrotiche. Come marcatori si utilizzano isotiocianato di fluoresceina (Annessina V-FITC) in combinazione con ioduro di propidio (PI); le cellule apoptotiche sono quelle Annessina V-FITC positive e PI negative, quelle necrotiche sono Annessina V-FITC positive e PI positive. La marcatura delle cellule à ̈ effettuata incubandole con annessina V-FITC (Diagnostics MedSystems) e PI (Sigma) in un tampone di legame (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2) per 10’ a temperatura ambiente e successivamente lavando e risospendendo il materiale cellulare nello stesso tampone. L’analisi delle cellule apoptotiche e necrotiche à ̈ eseguita mediante citometria a flusso (FACScan, Becton-Dickinson), acquisendo mediamente per ciascun campione 2x10<4>eventi, con determinazioni in triplicato su tre distinti esperimenti.

Gli effetti sulla crescita delle HT-1376 di C, CS, GEM e MMC prese singolarmente à ̈ valutato a 48 e 72h dall’inizio del trattamento. Tutti i prodotti causano inibizione della crescita tempo- e dose-dipendente. A 72 h, alla concentrazione di 12 mg/mL, l’IC50à ̈ di 2 mg/mL per C, 12 mg/mL per CS, 18 µ/mL per MMC e 0,5 µ/mL per GEM. A queste concentrazioni l’effetto citotossico à ̈ modesto e la crescita cellulare riprende se si allontana dal terreno il prodotto testato.

Sulla base di questi risultati si à ̈ valutato l’effetto sinergico dell’associazione polisaccaride-antitumorale sulla inibizione della crescita delle HT-1376. In particolare, si à ̈ studiata l’inibizione della crescita indotta da differenti concentrazioni di C o CS in combinazione con MMC o GEM a 72 h utilizzando Calcusyn come software per l’analisi dei dati. L’associazione di C o CS con MMC à ̈ fortemente sinergistica quando si utilizza un eccesso di polisaccaride rispetto all’MMC, con valori di IC50di 0,1 e 0,4 rispettivamente per C e CS, che indicano un migliore effetto sinergistico di C rispetto a CS. Diverso comportamento si osserva quando si associano C o CS con GEM, in questo caso, infatti, si ha un’interazione sinergistica quando si utilizza un eccesso di GEM rispetto al polisaccaride. Operando in rapporti che danno interazione sinergistica (polisaccaride in difetto rispetto all’antitumorale) si ottengono per C e CS valori di IC50di 0,2 e 0,7 rispettivamente, che confermano anche in questo caso un migliore effetto sinergistico di C rispetto a CS.

La combinazione sinergistica C o CS e GEM Ã ̈ caratterizzata da un importante effetto apoptotico che non si osserva quando i principi attivi sono utilizzati singolarmente, come riportato in tabella 14.

Stato cellulare

Trattamentoapoptotico

vitale necrotico

precoce avanzato Non trattate 91±3 5±1 1±1 3±1

C 59±2 28±3 6±1 7±2

CS 68±4 23±2 4±1 5±1

GEM 81±3 16±3 1±1 2±1

C+GEM 16±2 30±2 9±2 45±6

CS+GEM 29±2 27±4 8±1 36±5

Tabella 14 - Stato cellulare valutato al cell sorter di cellule HT-1376

trattate per 48 h con 0,04 µg/mL di C o CS e 0,15 µg/mL di GEM da soli o in

combinazione polisaccaride-GEM.

Differente comportamento si osserva nel caso di combinazioni di tipo

sinergistico di C o CS con MMC (polisaccaride in eccesso rispetto

all’antitumorale). In questo caso, come riportato in tabella 15, la combinazione

polisaccaride-antitumorale determina un’ampia necrosi cellulare, che si presenta

più importante nel caso dell’associazione sinergica C-MMC.

Stato cellulare

Trattamentoapoptoticovitale necrotico

precoce avanzato Non trattate 90±4 7±1 1±1 2±1

C 56±3 41±2 1±1 2±1

CS 62±4 36±2 1±1 1±1

MMC 64±5 33±1 1±1 2±1

C+MMC 36±2 62±3 1±1 1±1

CS+MMC 46±1 51±2 1±1 2±1

Tabella 15 - Stato cellulare valutato al cell sorter di cellule HT-1376

trattate per 48 h con 5,7 µg/mL di C o CS e 1,7 µg/mL di MMC da soli o in

combinazione polisaccaride-MMC.

La sperimentazione complessivamente dimostra che: a) l’associazione tra antitumorale e C o CS ha un forte effetto sull’inibizione della crescita delle cellule tumorali; b) le condizioni sinergistiche sono differenti in funzione dell’antitumorale associato; c) il sinergismo polisaccaride-GEM porta prevalentemente a cellule che vanno in apoptosi, mentre il sinergismo polisaccaride MMC porta a cellule che vanno in necrosi; d) gli effetti sinergistici di C sono significativamente più importanti di quelli di CS; e) le associazioni sinergistiche di C con GEM o MMC possono rappresentare un promettente approccio terapeutico nel campo dei tumori superficiali della vescica.

ESEMPIO 16 - Viscosupplementazione e riparo cartilagineo

La sperimentazione ha come oggetto la valutazione delle potenzialità terapeutiche dell’associazione acido ialuronico-condroitina (HA-C) nei casi di patologie articolari connesse con danni della componente cartilaginea dell’articolazione. La sperimentazione à ̈ effettuata su 30 volontari affetti da una severa compromissione dell’articolazione del ginocchio, con danni della componente cartilaginea, evidente sintomatologia infiammatoria in atto, gonfiore e dolore. I volontari con età variabile da 25 a 45 anni, di entrambi i sessi, sono divisi in maniera casuale in tre gruppi di 10, il gruppo controllo e trattato con fisiologica, il gruppo HA à ̈ trattato con acido ialuronico e il gruppo HA-C à ̈ trattato con una miscela di acido ialuronico e condroitina. Il trattamento di viscosupplementazione à ̈ effettuato 3 volte a distanza di 2 mesi, iniettando nell’articolazione 2 mL di una soluzione sterile e apirogena formata da una soluzione salina fisiologica (0,9% NaCl) per il gruppo controllo, da una soluzione di 20 mg/mL di acido ialuronico 1.200KDa per il gruppo HA e da una soluzione contenente 20 mg/mL di acido ialuronico 1.200KDa 20 mg/mL di condroitina per il gruppo HA-C. Prima della sperimentazione e al suo termine dopo 6 mesi ai volontari viene eseguito controllo radiografico e NMR dell’articolazione. Tre ortopedici, indipendentemente, valutano nel tempo (prima del trattamento, a 3 e 6 mesi) su una scala da 1 a 5 (1 rappresenta assenza di guarigione, 5 totale remissione del quadro patologico e completa riparazione del danno a livello del tessuto cartilagineo) l’evoluzione del quadro patologico (dolore, stato infiammatorio, gonfiore) e la riparazione del danno cartilagineo. In tabella 16 sono riportati i dati conclusivi della sperimentazione. Questi dimostrano che, nei trattamenti di viscosupplementazione con compromissione della cartilagine, la presenza della condroitina consente una ottimo livello di riparazione della componente cartilaginea dell’articolazione e un generalizzato miglioramento nel tempo del quadro patologico

Dolore Infiammazione Gonfiore Riparo cartilagineo GruppoMesi

0 3 6 0 3 6 0 3 6 0 3 6 Controllo 1,0±0,1 1,3±0,2 1,3±0,1 1,5±0,2 1,0±0,2 1,4±0,1 1,5±0,2 1,0±0,1 1,8±0,2 1,0±0,1 1,5±0,2 1,6±0,1

HA 1,6±0,2 3,1±0,4 4,0±0,3 1,3±0,2 3,1±0,2 4,1±0,5 1,2±0,1 3,1±0,3 4,20,5 1,0±0,1 1,5±0,2 1,4±0,3

HA-C 1,5±0,1 3,5±0,4 5,0±0,0 1,6±0,2 4,1±0,4 5,0±0,0 1,4±0,2 4,2±0,2 5,0±0,0 1,1±0,1 3,2±0,5 5,0±0,0 Tabella 16 - Il trattamento di viscosupplementazione à ̈ effettuato tre volte a distanza di 2 mesi, iniettando nell’articolazione 2mL di una soluzione sterile e apirogena formata da una soluzione salina fisiologica (0,9%NaCl) per il gruppo controllo, da una soluzione di 20 mg/mL di acido ialuronico 1.200KDa per il gruppo HA e da una soluzione contenente 20 mg/mL di acido ialuronico 1.200KDa 20 mg/mL di condroitina per il gruppo HA-C. Tre ortopedici, indipendentemente, valutano nel tempo (prima del trattamento, a 3 e 6 mesi) su una scala da 1 a 5 l’evoluzione del quadro patologico (dolore, stato infiammatorio, gonfiore) e la riparazione del danno cartilagineo. 1 rappresenta assenza di guarigione 5 totale remissione del quadro patologico e completa riparazione del danno a livello del tessuto cartilagineo. I valori riportati sono la media delle 3 valutazioni indipendenti.

ESEMPIO 17 - La condroitina nel trattamento della cistite interstiziale

Nello studio sono reclutate 10 donne di età variabile tra 35 e 60 anni, con diagnosi certa di cistite interstiziale non ulcerativa, basata su parametri urodinamici, clinici ed endoscopici, questi ultimi che evidenziano la presenza di petecchie emorragiche nella cistoscopia con distensione vescicale. I soggetti sono divisi in maniera casuale in 2 gruppi di 5 individui, il primo gruppo à ̈ trattato con istillazione in vescica mediante catetere di una soluzione (40 mL) contenente 40 mg di acido ialuronico MW 1,800KDa (HA) e 40 mg di condroitina solfato (CS), il secondo con una soluzione (40 mL) contenente 40 mg di acido ialuronico MW 1,800KDa (HA) e 40 mg di condroitina (C). Questo trattamento à ̈ ripetuto con cadenza settimanale per 6 settimane e successivamente con cadenza mensile ancora per 5 mesi. All’inizio del trattamento e alla conclusione dello studio alle pazienti viene effettuata una cistoscopia con dilatazione vescicale, per verificare lo stato del tessuto epiteliale, e una biopsia della parete vescicale, per definire lo stato infiammatorio. Prima del trattamento e a 2, 5 e 7 mesi l’urologo compila di concerto con la paziente una scheda clinica per quantificare l’urodinamica (urgenza, frequenza e nocturia) e la presenza di bruciore e dolore vescicale. Tutti i parametri sono valutati su una scala da 0 a 6, in cui 0 indica l’assenza di una sintomatologia patologica. In tabella 17 sono riportati i dati ottenuti. Il confronto della cistoscopia con dilatazione vescicale effettuata prima e dopo il trattamento dimostra una generalizzata e migliore risoluzione del quadro patologico del gruppo HA-C rispetto al gruppo HA-CS, dato che trova riscontro nella valutazione istologica delle biopsie della parete vescicale, che dimostrano una migliore risoluzione del processo infiammatorio del gruppo HA-C rispetto al gruppo HA-CS. E’ congruente con questa valutazione anche il dato clinico di tabella 11, che dimostra una più completa e veloce risoluzione del quadro patologico per il gruppo HA-C sia sotto il profilo urodinamico che del dolore residuale.

urgenza frequenza nocturia bruciore dolore Tempo

minzione vescicale

(mesi)

HA-C HA-CS HA-C HA-CS HA-C HA-CS HA-C HA-CS HA-C HA-CS

0 5,7±0,2 5,8±0,3 5,7±0,2 5,9±0,1 5,8±0,2 5,7±0,1 5,9± 5,8±0,2 5,7±0,3 5,7±0,2

2 2,4±0,4 4,4±0,2 2,1±0,3 3,2±0,3 2,0±0,6 3,5±0,3 2,4±0,1 4,3±0,3 1,8±0,2 3,7±0,3

5 1,3±0,1 3,2±0,3 0,9±0,2 2,4±0,4 1,3±0,2 3,1±0,1 0,9±0,1 3,0±0,3 0,7±0,1 2,6±0,1

7 1,1±0,1 2,6±0,3 0,9±0,1 1,9±0,2 1,0±0,1 2,8±0,2 0,5±0,1 2,6±0,2 0,6±0,3 2,1±0,1

Tabella 17 - 10 donne volontarie affette da cistite interstiziale non ulcerativa sono divise in maniera casuale in due gruppi di 5 individui, il primo gruppo (HA-C) à ̈ trattato con istillazione in vescica mediante catetere di una soluzione (40 mL) contenente 40 mg di acido ialuronico MW 1,800KDa (HA) e 40 mg di condroitina solfato (CS), il secondo gruppo (HA-CS) con una soluzione (40 mL) contenente 40 mg di acido ialuronico MW 1,800KDa (HA) e 40 mg di condroitina (C). Questo trattamento à ̈ ripetuto con cadenza settimanale per 6 settimane e successivamente con cadenza mensile per 5 mesi. Prima del trattamento e a 2, 5 e 7 mesi l’urologo compila di concerto con la paziente una scheda clinica per quantificare l’urodinamica (urgenza, frequenza e nocturia) e la presenza di bruciore e dolore vescicale. Tutti i parametri sono valutati su una scala da 0 a 6, in cui 0 indica l’assenza di una sintomatologia patologica.

ESEMPIO 18 - Formulazioni oftalmiche

Sono confrontati due preparati oftalmici uno convenzionale a base di acido ialuronico e uno a base di condroitina entrambe al 3% p/v in soluzione salina fisiologica di NaCl a pH 7,4. I colliri sono preparati in confezioni monodose sterilizzate in autoclave.

La sperimentazione à ̈ effettuata su 30 volontari affetti da patologia detta dell’occhio secco, a cui si applica il collirio 4 volte al giorno per un periodo di 30 giorni. I soggetti, di entrambe i sessi e di età variabile da 45 a 60 anni sono divisi in maniera casuale in due gruppi di 15, che vengono trattati con i due colliri. Sotto controllo medico si valuta lo stato infiammatorio della superficie corneale all’inizio e alla fine del trattamento e sono registrate le valutazioni dei pazienti trattati rispetto a: tollerabilità, durata dell’effetto umettante, alterazione della visione dopo l’applicazione. Sia per le valutazioni cliniche che per quelle del paziente si utilizza una scala da 1 a 5 in cui 5 rappresenta un’ottimale risoluzione della condizione patologica e delle sue sequele.

Come si rileva dalla risultanze sperimentali riportate in tabella 18 il collirio a base di condroitina (C) sia alla valutazione clinica che a quella soggettiva del paziente trattato presenta indici di valutazione migliori.

Medico Paziente

Tempo infiammazione tollerabilità effetto umettante assenza di (gg) corneale alterazione visiva HA C HA C HA C HA C

0 1,0±0,1 1,1±0,2 - - - - - -

10 - - 3,8±0,2 4,7±0,2 4,0±0,2 4,8±0,3 3,5±0,2 4,6±0,2

20 - - 3,7±0,3 4,5±0,5 4,1±0,3 4,6±0,2 3,2±0,1 4,7±0,1

30 3,5±0,2 4,2±0,3 3,9±0,3 4,8±0,1 4,4±0,3 4,9±0,1 3,6±0,2 4,8±0,1

Tabella 18 - La sperimentazione à ̈ effettuata su 30 volontari di entrambe i sessi e di età variabile da 45 a 60, affetti da patologia detta dell’occhio secco. I soggetti sono divisi in maniera casuale in due gruppi di 15 a cui si applica 4 volte al giorno per un periodo di 30 giorni un collirio. Il primo gruppo (HA) à ̈ trattato con un collirio a base di acido ialuronico al 3% p/v in soluzione salina fisiologica di NaCl a pH 7,4. Il secondo gruppo (C) à ̈ trattato con un collirio a base di condroitina al 3% p/v in soluzione salina fisiologica di NaCl a pH 7,4. I colliri sono preparati in confezioni monodose sterilizzate in autoclave.

Sotto controllo medico si valuta lo stato infiammatorio della superficie corneale all’inizio e alla fine del trattamento e sono registrate le valutazioni dei pazienti trattati rispetto a: tollerabilità, durata dell’effetto umettante, alterazione della visione dopo l’applicazione. Sia per le valutazioni cliniche che per quelle del paziente si utilizza una scala da 1 a 5, in cui 5 rappresenta un’ottimale risoluzione della condizione patologica e delle sue sequele.

ESEMPIO 19 - Effetto protettivo della condroitina in soluzioni per dialisi intraperitoneale

Lo studio ha come obiettivo la valutazione del danno perossidativo a livello della membrana peritoneale connesso con la presenza di glucosio, condroitina o condroitina solfato in liquidi per dialisi peritoneale. L’effetto perossidativo dei lipidi a livello del tessuto peritoneale a seguito di ripetuti trattamenti di dialisi peritoneale, à ̈ valutato utilizzando come modello sperimentale ratti Wistar maschi di 8 settimane di età trattati con 4 tipi di formulati: a) glucosio 2.5% p/v, condroitina solfato MW 20-40KDa 0.1% p/v, sodio 135.0 mEq/L, magnesio 1,5 mEq/L, calcio 4.0 mEq/L, cloro 105.5 mEq/L, acido lattico 35.0 mEq/L, pH 7,0-7.3, Ï€ soluzione/Ï€fisiologica 1.4-1.6.; b) glucosio 2.5% p/v, condroitina MW 20-40KDa 0.1% p/v, sodio 135.0 mEq/L, magnesio 1,5 mEq/L, calcio 4.0 mEq/L, cloro 105.5 mEq/L, acido lattico 35.0 mEq/L, pH 7,0-7.3, Ï€ soluzione/Ï€fisiologica 1.4-1.6; c) condroitina solfato MW 20-40 KDa 2,5% p/v, sodio 135.0 mEq/L, magnesio 1,5 mEq/L, calcio 4.0 mEq/L, cloro 105.5 mEq/L, acido lattico 35.0 mEq/L, pH 7,0-7.3, con aggiunta di NaCl fino ad avere un valore del rapporto Ï€ soluzione/Ï€fisiologica nell’intervallo 1.4-1.6; d) condroitina solfato MW 20-40 KDa 2,5% p/v, sodio 135.0 mEq/L, magnesio 1,5 mEq/L, calcio 4.0 mEq/L, cloro 105.5 mEq/L, acido lattico 35.0 mEq/L, pH 7,0-7.3, con aggiunta di NaCl fino ad avere un valore del rapporto Ï€ soluzione/Ï€fisiologica nell’intervallo 1.4-1.6. 40 animali sono divisi in maniera casuale in 4 gruppi di 10 e sotto anestesia da etere a ciascun animale per 10 giorni consecutivi si iniettano nella cavità peritoneale 15 mL di soluzione. Al termine della sperimentazione dagli animali sacrificati si asporta il peritoneo e sul tessuto si valuta la perossidazione lipidica in maniera quantitativa con il metodo dell’acido tiobarbiturico (TBA), utilizzando il kit OxiSelect TBARS Assay Kit (Cell Biolabs Inc.). La perossidazione dei lipidi à ̈ un meccanismo ben conosciuto del danno cellulare. I perossidi dei lipidi sono indicatori instabili dello stress ossidativo cellulare che, decomponendosi, formano composti reattivi come la malonildialdeide (MDA), marker principale di lipoperossidazione. Il kit utilizzato offre un sistema semplice e riproducibile per il dosaggio del MDA e quindi dell’ossidazione lipidica in campioni di omogenati di tessuto, basato sulla capacità dell’MDA di formare un complesso 1:2 con l’acido tiobarbiturico (TBARS Thiobarbituric Acid Reactive Substances) che può essere determinato spettrofotometricamente. Il kit comprende uno standard di MDA da usare come controllo positivo e per le curve di calibrazione. L’MDA contenuto nei campioni e l’MDA standard à ̈ fatto reagire con il TBA con una breve incubazione 95°C, che porta alla formazione del complesso TBARS, determinato in maniera quantitativa spettrofotometricamente per confronto con la curva standard. I campioni di tessuto peritoneale appena prelevati sono ripetutamente lavati con una soluzione di eparina contenente PBS per allontanare l’emoglobina, sospesi (100 mg/mL) in PBS contenente una soluzione 1x di BHT (fornita dal Kit per prevenire l’ulteriore ossidazione dei lipidi durante l’elaborazione dei campioni) e poi omogeneizzati in ghiaccio e centrifugati a 10.000 g per 5’, raccogliendo il surnatante su cui si saggia il livello di TBARS. Dato uguale a 1 il valore dei lipoperossidi/g di tessuto nel trattamento con la soluzione a) contenente 2,5% p/v glucosio e 0,1% p/v condroitina solfato, il valore relativo ottenuto con la soluzione b) contenente 2,5% p/v glucosio e 0,1% p/v condroitina à ̈ 0,7, quello ottenuto con la soluzione c) contenente 2,5% p/v condroitina solfato à ̈ 0,5 e quello ottenuto con la soluzione d) contenente 2,5% p/v condroitina à ̈ 0,1. Questi dati dimostrano che nella dialisi intraperitoneale à ̈ possibile utilizzare la condroitina come agente osmotico sostitutivo del glucosio, con eccellenti risultati in termini di protezione del tessuto peritoneale sotto il profilo dello stress da perossidazione lipidica nella dialisi intraperitoneale sistematica, un risultato altrettanto soddisfacente non à ̈ ottenibile invece utilizzando condroitina solfato con analoghe caratteristiche di peso molecolare.

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizioni farmaceutiche, nutraceutiche, cosmeceutiche o dispositivi medici contenenti come ingrediente attivo condroitina non solfatata.
2. 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1 in forma di capsule, compresse, colliri, gel, creme, soluzioni o sospensioni, polveri orosolubili, spray, sciroppi.
3. 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 comprendenti inoltre altri ingredienti attivi.
4. 4. Composizioni secondo la rivendicazione 3 in cui la condroitina non solfatata à ̈ associata ad acido ialuronico.
5. 5. Condroitina non solfatata per l’uso come ingrediente attivo in composizioni farmaceutiche, nutraceutiche, cosmeceutiche o dispositivi medici.
6. 6. Condroitina non solfatata secondo la rivendicazione 5 per l’uso come ingrediente attivo per la riparazione di ferite, per il trattamento di patologie articolari, oculari, oncologiche, dell’apparato respiratorio, di osteoartrite, di cistite interstiziale, della senescenza cutanea, come agente osmotico e protettivo in soluzioni per dialisi peritoneale e come scaffold per la crescita 3D di colture cellulari.
7. 7. Condroitina non solfatata secondo la rivendicazione 6 per la viscosupplementazione articolare e il repair del tessuto cartilagineo, per la biorivitalizzazione cutanea mediante microiniezioni intradermiche, per l’uso nel trattamento della patologia dell’occhio secco e per l’applicazione di lenti a contatto.