ITMI20131473A1 - Metodo per valutare gli effetti di una composizione comprendente microrganismi sul microbiota intestinale - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo

“Metodo per valutare gli effetti di una composizione comprendente microrganismi sul microbiota intestinale”

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per determinare l’attività probiotica/paraprobiotica di una composizione comprendente microrganismi, in particolare batteri, detto metodo essendo basato sulla valutazione della variazione, qualitativa e/o quantitativa, del microbiota fecale a seguito dell’assunzione della composizione. Inoltre, la presente invenzione riguarda un kit per la realizzazione di detto metodo.

Il tratto gastrointestinale è costituito da numerose popolazioni di microrganismi che si sono sviluppati e moltiplicati durante lo sviluppo di ciascun individuo e che costituiscono il c.d. microbiota intestinale o flora intestinale.

Pertanto, il microbiota intestinale rappresenta un ecosistema molto complesso e la condizione di equilibrio tra le diverse popolazioni di microrganismi che lo costituiscono, cioè la c.d. eubiosi, è fondamentale allo scopo di garantire il benessere e la salute dell'organismo dal momento che il microbiota condiziona notevolmente lo sviluppo e l'omeostasi della mucosa intestinale del soggetto che lo ospita.

In altre parole, il microbiota intestinale rappresenta un vero è proprio organo. Infatti, modificazioni qualitative e/o quantitative a carico del microbiota intestinale di un soggetto, cioè la c.d. disbiosi o dismicrobismo, possono condurre alla perdita deH’omeostasi intestinale, che a sua volta può condizionare la eziopatogenesi di un ampio spettro di patologie.

Allo scopo di trattare una condizione di disbiosi intestinale, o, comunque, allo scopo di mantenere l'equilibrio del microbiota intestinale, è sempre più frequente la pratica di assumere prodotti probiotici/paraprobiotici.

Secondo la definizione della FAO/WHO, un probiotico è l’insieme di “organismi vivi e vitali che, quando somministrati in quantità adeguata, conferiscono benefici alla salute dell’ospite”.

Alla luce di quanto sopra riportato, risultano abbastanza evidenti i vantaggi relativi alla messa a punto di un metodo che consenta di valutare, in maniera veloce ed attendibile, gli effetti di una composizione/formulazione esogena comprendente microrganismi sulla composizione batterica del microbiota intestinale di un individuo.

Infatti, sulla base degli effetti misurati con tale metodo, cioè sulla base di come l’assunzione della composizione comprendente microrganismi modifica quantitativamente e/o qualitativamente il microbiota intestinale, sarà possibile stabilire se detta composizione è in grado di favorire e/o garantire il benessere e la salute dell’organismo umano e, quindi, se risponde ad uno dei prerequisiti fondamentali per essere annoverato come probiotico/paraprobiotico.

La presente invenzione risponde alle esigenze sopra riportate mettendo a disposizione un metodo per determinare, mediante analisi molecolare, la variazione, qualitativa e/o quantitativa, della composizione del microbiota fecale di un soggetto a seguito dell’assunzione, secondo un protocollo randomizzato, controllato verso placebo, cross-over in doppio cieco, di una composizione comprendente microrganismi, preferibilmente batteri. Infatti, la Richiedente ha dimostrato sperimentalmente per la prima volta la necessità di condurre, specie su popolazione sana, dei protocolli di intervento che siano crossover, al fine di evitare che la marcata variabilità inter-soggetto nasconda i possibili effetti del trattamento, in particolare del trattamento con probiotico/paraprobiotico, o conduca a falsi positivi statistici.

Il metodo della presente invenzione, oltre ad essere particolarmente vantaggioso ai fini della determinazione degli effetti sul microbiota fecale da parte di una generica composizione comprendente microrganismi (cioè un presunto probiotico/paraprobiotico), risulta anche utile allo scopo di confermare l’effetto salutistico per l’organismo umano di un probiotico/paraprobiotico noto, oppure allo scopo di determinare eventuali nuovi effetti specifici di un probiotico/paraprobiotico noto, per esempio andando a studiare quali popolazioni di microrganismi vengono stimolate e/o inibite nella crescita a seguito dell’assunzione della composizione. Infatti, sulla base delle attività principali in cui sono coinvolte le popolazioni di microrganismi stimolate e/o inibite nella crescita a seguito dell’assunzione della composizione, sarà possibile definire gli eventuali nuovi effetti della stessa. Per esempio, qualora a seguito dell’assunzione di un probiotico secondo il metodo della presente invenzione, si trovi che una particolare popolazione batterica sia cresciuta in termini quantitativi e che questa popolazione batterica abbia un metabolismo principalmente coinvolto nella produzione, per esempio di acido butirrico, si può dedurre che il probiotico può essere assunto allo scopo di aumentare la quantità di acido butirrico a livello intestinale.

Ulteriori vantaggi del metodo oggetto della presente invenzione saranno evidenti dalla descrizione dettagliata a seguire e dagli esempi che, tuttavia, hanno solo scopo dimostrativo e non limitativo.

Per una migliore comprensione della descrizione dettagliata si allegano le Figure 1-4, di cui:

- La Figura 1 mostra il risultato dell’analisi statistica condotta al fine di valutare l’aumento della popolazione di batteri del genere Coprococcus (Fig.1.1) e la diminuzione della popolazione di batteri del genere Blautia (Fig.1.2) prima e dopo il trattamento con la composizione oggetto della presente invenzione (A) e, al tempo stesso, la diminuzione della popolazione di batteri del genere Coprococcus (Fig.1.1) e l’aumento della popolazione di batteri del genere Blautia (Fig.1.2) prima e dopo il trattamento con il placebo (B);

La Figura 2.1 mostra l’aumento della popolazione di batteri del genere Coprococcus (grigio scuro) e la diminuzione della popolazione di batteri del genere Blautia (grigio chiaro) prima e dopo il trattamento con la composizione oggetto della presente invenzione;

- La Figura 2.2 mostra l’aumento in percentuale della popolazione di batteri del genere Coprococcus (grigio scuro) e la diminuzione in percentuale della popolazione di batteri del genere Blautia (grigio chiaro) prima e dopo il trattamento con la composizione oggetto della presente invenzione (A) e la diminuzione in percentuale della popolazione di batteri del genere Coprococcus (grigio scuro) e l’aumento in percentuale della popolazione di batteri del genere Blautia (grigio chiaro) prima e dopo il trattamento con il placebo (B); - La Figura 3 mostra il risultato dell’analisi statistica condotta per stabilire l’aumento del metabolismo dell’acido nicotinico prima e dopo il trattamento con la composizione oggetto della presente invenzione e la sua diminuzione prima e dopo il trattamento con il placebo; e

- La Figura 4 mostra il risultato dell’analisi statistica condotta per stabilire l’aumento della biosintesi dell’acido folico prima e dopo il trattamento con la composizione oggetto della presente invenzione ed un’assenza di modificazioni, invece, prima e dopo il trattamento con il placebo.

Un primo aspetto della presente invenzione si riferisce ad un metodo per determinare la variazione della composizione del microbiota fecale di un soggetto a seguito dell’assunzione, secondo un protocollo randomizzato, controllato verso placebo, cross-over in doppio cieco, di una composizione/formulazione comprendente microrganismi detto metodo comprendente le fasi di:

a) raccogliere le informazioni riguardanti lo stato di salute e/o le abitudini alimentari di detto soggetto prima e/o durante e/o dopo l’assunzione, secondo un protocollo randomizzato, controllato verso placebo, cross-over in doppio cieco, della composizione o del placebo;

b) ottenere almeno un campione fecale di detto soggetto prima e/o durante e/o dopo l’assunzione, secondo un protocollo randomizzato, controllato verso placebo, cross-over in doppio cieco, della composizione o del placebo;

c) analizzare il microbiota mediante analisi metagenomica condotta sul campione fecale ottenuto secondo la fase (ii);

d) confrontare, preferibilmente qualitativamente e/o quantitativamente, il microbiota fecale del soggetto prima e/o durante e/o dopo l’assunzione, secondo un protocollo randomizzato, controllato verso placebo, cross-over in doppio cieco, della composizione e del placebo.

Nel contesto della presente invenzione col termine microbiota fecale si intende l’insieme delle popolazioni di microrganismi che sono presenti all'interno delle feci di un soggetto e che riflettono l’insieme di popolazioni di microrganismi presenti nell’intestino dello stesso. Pertanto, il termine microbiota fecale è qui inteso come sinonimo di microbiota intestinale.

In particolare, i microrganismi compresi nella composizione della presente invenzione sono batteri e/o lieviti e/o altri microrganismi, presi singolarmente o in combinazione.

Una composizione comprendente batteri è particolarmente preferita ai fini della presente invenzione. In particolare, i batteri appartengono al genere scelto tra: Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Propionibacterium, Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus ed Enterococcus. Più preferibilmente detto batterio è del genere Lactobacillus e/o Bifidobacterium.

In particolare, il Lactobacillus è scelto tra: Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius e Lactobacillus sanfranciscensis.

Ai fini della presente invenzione particolarmente preferiti sono i batteri che appartengono alla specie Lactobacillus paracasei, più preferibilmente il ceppo Lactobacillus paracasei DG.

Il ceppo batterico Lactobacillus paracasei DG è stato depositato da SOFAR S.p.A. presso la Collezione Nazionale di Colture di Microrganismi dell’Istituto Pasteur di Parigi in data 05/05/1995, con il numero di deposito CNCM 1-1572. Inizialmente il ceppo aveva la denominazione di Lactobacillus casei DG sub. casei.

In particolare, i batteri del genere Bifidobacterium sono scelti tra: Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve e Bifidobacterium longum.

I lieviti sono preferibilmente del genere Saccharomices, più preferibilmente della specie Saccharomices cerevisiae.

In generale, i microrganismi compresi nella composizione della presente invenzione sono microrganismi singoli o combinazioni di qualsiasi specie microbica indicata nella lista QPS dell’EFSA (http://www.efsa.europa.eu/it/search/doc/3020.pdf).

I microrganismi della composizione della presente invenzione sono preferibilmente vivi e pertanto la composizione è definibile anche un probiotico. Alternativamente i microrganismi della composizione sono morti e/o in forma di lisato o estratto e pertanto la composizione è definibile anche un paraprobiotico. Quindi la composizione della presente invenzione è anche un probiotico o un paraprobiotico noto o presunto. In una forma di realizzazione dell’invenzione, la composizione comprende circa 1-50 miliardi di unità formanti colonia (UFC) di microrganismi, preferibilmente 15-30, più preferibilmente 20-25 miliardi di UFC di microrganismi.

In una forma di realizzazione della presente invenzione, la composizione è formulata per la somministrazione orale. In particolare, la composizione è formulata in forma solida, preferibilmente come compresse, capsule, tavolette, polvere granulare, opercoli, granuli orosolubili, bustine o confetti. Alternativamente, la composizione dell’invenzione è formulata come liquido, per esempio come sciroppo o come bevanda, oppure è aggiunta ad un alimento, per esempio ad uno yogurt, un formaggio, un succo di frutta.

Alternativamente, la composizione dell’invenzione è formulata in una forma in grado di esercitare un’azione per via topica, per esempio come enema.

In una ulteriore forma di realizzazione dell’invenzione, la composizione comprende anche eccipienti generalmente accettati per la produzione di prodotti probiotici e/o farmaceutici.

In una ulteriore forma di realizzazione dell’invenzione, la composizione dell’invenzione è arricchita con vitamine, oligoelementi quali zinco e selenio, enzimi e/o sostanze prebiotiche come fruttooligosaccaridi (FOS), galattooligosaccaridi (GOS), inulina, gomma guar o loro combinazioni. Per quanto riguarda l'assunzione della composizione, come prima precisato, essa segue un protocollo randomizzato, controllato verso placebo, cross-over in doppio cieco. In altre parole, durante l’assunzione né lo sperimentatore né i soggetti inclusi sono a conoscenza dei trattamenti assegnati (i trattamenti sono indistinguibili, doppio-cieco) e uno stesso soggetto viene esposto in tempi diversi al trattamento sia con la composizione contenente microrganismi sia con il placebo (cross-over), secondo una sequenza casuale (randomizzata o random).

In una forma di realizzazione dell’invenzione, detto protocollo prevede le seguenti fasi: 1) una fase di pre-reclutamento, in cui i soggetti preferibilmente non assumono la composizione comprendente microrganismi o il placebo; e/o 2) una fase di primo trattamento, in cui i soggetti preferibilmente assumono la composizione comprendente microrganismi o il placebo; e/o 3) una fase di wash-out, in cui i soggetti preferibilmente non assumono la composizione comprendente microrganismi o il placebo; e/o 4) una fase di secondo trattamento, in cui i soggetti preferibilmente assumono il placebo o la composizione comprendente microrganismi.

Le assunzioni secondo la fase 2 e la fase 4 sono fatte in maniera random ed in doppio cieco come sopra specificato. È chiaro che il soggetto che nella prima fase assume il placebo nella seconda assumerà la composizione comprendente microrganismi e viceversa.

La durata delle diverse fasi del protocollo è preferibilmente la stessa, in particolare, la durata di almeno una di queste fasi, preferibilmente di tutte le fasi, è di circa quattro settimane.

Nel contesto della presente invenzione con il termine wash-out si intende un periodo posto tra due fasi di assunzione della composizione comprendente microrganismi o placebo in cui il soggetto non assume nulla e quindi dovrebbe “espellere" quello che ha assunto in precedenza, ovvero, un periodo di assenza di trattamento finalizzato ad eliminare ogni effetto residuo.

In una forma di realizzazione dell'invenzione, la composizione della presente invenzione è assunta preferibilmente una volta al giorno, più preferibilmente appena svegli.

Alternativamente è possibile anche l’assunzione serale, preferibilmente almeno 3 ore dopo i pasti.

La fase di raccolta delle informazioni riguardanti lo stato di salute e/o le abitudini alimentari del soggetto è realizzata preferibilmente raccogliendo dette informazioni in un questionario. Detto questionario è predisposto ad hoc per la raccolta di dati riguardanti lo stato di salute e/o le abitudini alimentari di un soggetto che effettua il metodo dell'invenzione.

In particolare, detto questionario è un foglio standard su cui sono formulate delle domande relative allo stato di salute e/o le abitudini alimentari di detto soggetto. In merito allo stato di salute, il soggetto può rispondere utilizzando delle scale di valutazioni associate a ciascuna domanda. La scala di valutazione è preferibilmente una scala numerica verbale (VNS), o una scala analogica visiva (VAS) o scala di valutazione verbale (VRS). In merito alle abitudini alimentari, il soggetto può rispondere indicando gli alimenti che quotidianamente assume, specificando laddove possibile anche le quantità assunte.

La fase di raccolta delle informazioni è preferibilmente realizzata all’inizio della fase di pre-reclutamento e/o prima e/o dopo la fase di primo trattamento e/o prima e/o dopo la fine del secondo trattamento.

L’ottenimento di almeno un campione fecale è preferibilmente realizzato all’inizio e/o alla fine del primo trattamento e/o all’inizio e/o alla fine del secondo trattamento.

Il campione fecale è preferibilmente prelevato non più di 48 ore prima, più preferibilmente non più di 24 ore prima di essere processato o di essere conservato ad una temperatura compresa preferibilmente tra 4°C e -20°C, più preferibilmente a -20°C, per un periodo che preferibilmente non supera i 7-10 giorni. La conservazione del campione fecale prima del processamento o della conservazione a bassa temperatura è realizzata preferibilmente a temperatura ambiente.

La fase di analisi del microbiota mediante analisi metagenomica condotta sul campione fecale è realizzata sugli acidi nucleici, preferibilmente sul DNA estratto dal microbiota fecale.

In particolare, l’analisi del microbiota mediante analisi metagenomica comprende almeno una delle, preferibilmente tutte le seguenti fasi:

• estrazione degli acidi nucleici, preferibilmente del DNA dal campione fecale; e

· tipizzazione molecolare del microbiota fecale.

L’estrazione degli acidi nucleici in generale, e del DNA in particolare, dal campione fecale è realizzata utilizzando le procedure note ad ogni esperto del settore a tale scopo.

In una forma di realizzazione dell’invenzione, la tipizzazione delle popolazioni di microrganismi è realizzata mediante analisi della sequenza nucleotidica di almeno una porzione del gene codificante per una subunità del ribosoma, preferibilmente per la subunità 16S del ribosoma, cioè il gene codificante per la molecola rRNA 16S.

A tale scopo il DNA estratto dai campioni fecali è amplificato mediante tecniche note nell’arte, per esempio mediante PCR. Preferibilmente l’amplificazione è realizzata utilizzando una coppia di oligonucleotidi (primer); preferibilmente mediante l’uso di SEQ ID NO: 1 (Probio_Uni 5’-CCTACGGGRSGCAGCAG-3’) e SEQ ID NO: 2 (Probio_Rev 5’-ATTACCGCGGCTGCT-3’) (Milani C, Hevia A, Foroni E, Duranti S, Turroni F, et al. (2013) Assessing thè Fecal Microbiota: An Optimized lon Torrent 16S rRNA Gene-Based Analysis Protocol. PLoS ONE 8(7): e68739).

Le condizioni di realizzazione della PCR possono variare in dipendenza dalla qualità e dalla quantità dell’acido nucleico che si vuole amplificare e/o dei primer utilizzati. In ogni caso, il setting delle condizioni di PCR sono attività di routine per ogni esperto del settore.

Preferibilmente le porzioni di acido nucleico amplificate sono successivamente sequenziate.

L’esperto del settore può utilizzare qualsiasi metodica nota a tale scopo. Preferibilmente le metodiche utilizzate sono scelte tra: metodiche di sequenziamento basate sul metodo dì Sanger, metodiche di pirosequenziamento e la metodica di sequenziamento lon Torrent.

Nel caso della lon Torrent è preferibile utilizzare dei primer che preferibilmente hanno all’estremità 5’ delle sequenze adattatrici. Nella forma di realizzazione particolarmente preferita della presente invenzione le sequenze adattatrici sono SEQ ID NO: 1 e 2.

Una volta ottenute le sequenze e, quindi, una volta tipizzate le popolazioni di microrganismi del microbiota fecale, si esegue la caratterizzazione della comunità di microrganismi preferibilmente mediante programmi di hierarchical clustering, analisi tassonomica e/o costruzione di dendrogrammi filogenetici, preferibilmente con heatmap. A tale scopo risulta particolarmente preferito ai fini della presente invenzione il software QIIME.

Infine, i dati ottenuti dalle analisi di caratterizzazione sono preferibilmente analizzati mediante metodi statistici di tipo parametrico e/o non parametrico.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un kit per la realizzazione del metodo secondo la presente invenzione, detto kit comprendente:

- un codice identificativo del kit;

- almeno una formulazione orale di una composizione comprendente microrganismi, preferibilmente appartenente alla specie Lactobacillus paracasei, più preferibilmente il ceppo Lactobacillus paracasei DG, in una quantità compresa tra 1-50 miliardi di unità formanti colonia (UFC) di microrganismi, preferibilmente 15-30, più preferibilmente 20-25 miliardi di UFC di microrganismi.

- almeno una formulazione orale di placebo che non contiene microrganismi;

detta composizione di microrganismi essendo assunta secondo un protocollo randomizzato, controllato verso detto placebo, cross-over in doppio cieco, e detta composizione comprendente microrganismi e detto placebo essendo identificati da un codice.

Il placebo è preferibilmente identico nell’aspetto estetico, cioè nella forma, ma diversa nella sostanza, alla detta formulazione orale di una composizione comprendente microrganismi, preferibilmente appartenente alla specie Lactobacillus paracasei, più preferibilmente il ceppo Lactobacillus paracasei DG. Tale formulazione orale di placebo non contiene microrganismi.

In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il kit comprende almeno 28 capsule o compresse o pasticche o pillole o tavolette o opercoli o bustine o confetti contenenti la formulazione orale della composizione comprendente microrganismi, e, preferibilmente, altrettante compresse o pasticche o pillole o tavolette o opercoli o bustine o confetti contenenti la formulazione orale di placebo.

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, detta almeno una formulazione orale è almeno una capsula, almeno una compressa, almeno una pasticca, almeno una pillola, almeno una tavoletta, almeno un opercolo, almeno una bustina o almeno un confetto.

Dette formulazioni orali sono contrassegnate da un codice, per esempio un codice colore, un codice numerico, un codice alfabetico, o un codice alfa numerico. Detto codice servirà alla fine del metodo allo scopo di capire quando è stato assunta la composizione comprendente microrganismi e quando è stato assunto il placebo come prima descritto.

Le formulazioni orali sono identiche nell’aspetto estetico, cioè nella forma, ma diversi nella sostanza perché una contiene la composizione comprendente microrganismi e l’altra contiene placebo. Inoltre, le due formulazioni sono identificate ciascuna da un codice.

In questo modo la composizione comprendente microrganismi e il placebo contenute all’interno di un kit sono tali per cui risultano indistinguibili da parte di un qualsiasi soggetto. Inoltre, la composizione comprendente microrganismi e il placebo contenute nel kit sono univocamente identificate da un qualsiasi codice, per esempio un codice colore, un codice numerico, un alfabetico o un codice alfa numerico.

La corrispondenza di questo codice con la natura della sostanza, cioè se si tratta la composizione comprendente microrganismi o il placebo, è nota solo al produttore del kit.

Secondo una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, il kit comprende ulteriormente questionari predisposti ad hoc per la raccolta di dati riguardanti lo stato di salute del soggetto che effettua il metodo dell’invenzione.

In particolare, i questionari sono fogli standard su cui sono formulate domande relative allo stato di salute e alle abitudini alimentari del soggetto. In merito allo stato di salute, il soggetto può rispondere utilizzando delle scale di valutazioni associate a ciascuna domanda. La scala di valutazione è preferibilmente una scala numerica verbale (VNS), o una scala analogica visiva (VAS) o scala di valutazione verbale (VRS). In merito alle abitudini alimentari, il soggetto può rispondere indicando gli alimenti che quotidianamente assume, specificando laddove possibile anche le quantità assunte.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda l’uso di detto kit per scopi diagnostici e/o terapeutici.

ESEMPIO

T rattamente.

È stato condotto uno studio di intervento alimentare randomizzato, controllato verso placebo, crossover in doppio cieco in soggetti sani.

I volontari sono stati reclutati in accordo con i seguenti criteri:

- criteri di inclusione: uomini e donne sane, di età compresa tra i 18 e i 55 anni; firma del consenso informato;

- criteri di esclusione: assunzione di antibiotici nel mese precedente la prima visita; episodi di enteriti virali o batteriche nei 2 mesi precedenti la prima visita; ulcere gastriche o duodenali nei 5 anni precedenti la prima visita; gravidanza o allattamento; recenti o presunti casi di alcolismo e assunzione di droghe; altre condizioni di non conformità al protocollo di studio.

L’intervento alimentare probiotico è stato realizzato in accordo con un design crossover, come schematizzato nella Tabella I a seguire.

Tabella I

pre-reclutamento trattamento 1 wash-out trattamento 2 4 settimane 4 settimane 4 settimane 4 settimane

Colloquio 1 (V0) 2 (V1) 3 (V2) 4 (V3) 5 (V 4 ) Prelievo del campione fecale 1 2 3

Analisi metagenomica del microbiota fecale Nella fase di pre-arruolamento (4 settimane) i volontari hanno seguito la loro dieta convenzionale con il divieto di assunzione di: latti fermentati probiotici (lo yogurt tradizionale era, quindi, consentito), integratori alimentari probiotici, integratori alimentari prebiotici.

Alla fine del periodo di pre-arruolamento, i volontari sono stati randomizzati a ricevere una capsula al giorno di probiotico o di placebo per 4 settimane.

A titolo di esempio è stato utilizzato come probiotico da somministrare Enterolactis Plus che consiste in capsule da 420 mg contenenti 24 miliardi di UFC (unità formanti colonia) di Lactobacillus paracasei ceppo DG.

Il placebo è costituito da capsule di aspetto identico a quelle del probiotico ovviamente prive dell’agente probiotico.

Il gusto e il colore della sostanza attiva (cioè del probiotico) e del placebo sono identici.

Il prodotto è stato assunto a digiuno al mattino, almeno dieci minuti prima di colazione o, in caso di dimenticanza, alla sera, prima di coricarsi e comunque almeno due ore dopo l’ultimo pasto.

In seguito alle prime quattro settimane di trattamento, i volontari sono stati sottoposti a quattro settimane di wash-out identiche al periodo di prearruolamento.

Al termine del periodo di wash-out, i volontari hanno assunto una capsula al giorno di Enterolactis Plus o di placebo per quattro settimane in accordo con il disegno cross-over di cui sopra.

In sintesi lo studio ha previsto 4 fasi, ciascuna delle quali della durata di 4 settimane:

• Fase di pre-reclutamento : i soggetti non hanno assunto né il trattamento con Enterolactis Plus, né il trattamento con il placebo. • Trattamento T. i soggetti hanno assunto il trattamento con Enterolactis Plus o il trattamento con il placebo.

· Wash-out : i soggetti non hanno assunto né il trattamento con Enterolactis Plus né il trattamento con il placebo.

• Trattamento 2: i soggetti hanno assunto il trattamento con il placebo o il trattamento con Enterolactis Plus rispettivamente.

Visite e raccolta campioni.

Ogni volontario è stato inizialmente istruito sull’intera procedura da seguire, la quale ha previsto un totale di 5 incontri per ciascun volontario. Durante il primo incontro, è stato raccolto il consenso informato e i dati personali del volontario. Il volontario, inoltre, ha ricevuto informazioni generali sulla realizzazione dello studio ed è stato istruito sulle modifiche della dieta, che sono state seguite nelle successive 4 settimane di prearruolamento (divieto di assunzione dei prodotti precedentemente indicati).

Dopo 4 settimane, il volontario si è recato al secondo incontro con un proprio campione fecale (campione T0), raccolto durante le 24 ore precedenti in un contenitore apposito che è stato consegnato durante il primo incontro.

Per un’ottimale preservazione, i campioni fecali sono stati conservati a temperatura ambiente e consegnati in laboratorio entro 24 ore.

Durante il secondo incontro, inoltre, è stato dato al volontario il prodotto probiotico (o il placebo) da assumere durante le 4 settimane successive. Inoltre, il volontario è stato istruito sulle modalità di assunzione del prodotto.

Al termine delle 4 settimane di assunzione del prodotto (o del placebo), il volontario si è recato al terzo incontro con un altro campione fecale (campione T1) raccolto durante le precedenti 24 ore.

Durante il terzo incontro, il volontario ha compilato un questionario inerente possibili effetti, sia positivi sia indesiderati, derivanti dal consumo del prodotto.

Il volontario è stato, quindi, istruito circa le successive 4 settimane, durante le quali, nuovamente, non ha assunto i prodotti precedentemente citati.

Al termine di queste 4 settimane, il volontario si è recato al quarto incontro con un proprio campione fecale (campione T2) e ha ricevuto il prodotto probiotico (o il placebo) da assumere durante le 4 settimane successive. Infine, dopo le 4 settimane di assunzione del prodotto (o del placebo), il volontario si è recato al quinto incontro per la consegna dell’ultimo campione fecale (campione T3).

Durante quest’ultimo incontro, il volontario ha compilato un questionario analogo a quello ricevuto durante il terzo incontro.

Tutti i campioni fecali raccolti sono stati conservati a -20°C per non più di 7 giorni prima di essere sottoposti all’analisi del microbiota.

Analisi del microbiota fecale

Il microbiota fecale è stato analizzato mediante l’analisi della sequenza nucleotidica di porzioni del gene codificante per la subunità ribosomiale batterica 16S rRNA. Più specificatamente, è stata adottata una strategia metagenomica, che consiste in sintesi nei seguenti passaggi:

1. estrazione, quantificazione e normalizzazione del DNA metagenomico dai campioni fecali;

2. amplificazione via PCR della regione ipervariabile V3 del gene batterico codificante per il 16S rRNA;

3. quantificazione dei prodotti di PCR;

4. sequenziamento dei prodotti dell'amplificazione;

5. analisi bioinformatica delle sequenze.

Le procedure secondo la fase 1 e 3 sono tecniche ben note nel settore e, pertanto, esse sono realizzate con i protocolli comunemente utilizzati in questo ambito. Per esempio i metodi descritti nei manuali di laboratorio come Sambrook et al. 2001 , oppure Ausubel et al. 1994.

La fase 2 di amplificazione della regione V3 dei geni 16S dell'RNA ribosomale è stata realizzata mediante la tecnica di amplificazione del DNA nota come PCR utilizzando come oligonucleotidi (primer) Probio_Uni 5’-CCTACGGGRSGCAGCAG-3’ (SEQ ID NO: 1) e Probio_Rev 5’-ATTACCGCGGCTGCT-3’ (SEQ ID NO: 2)

In particolare, la coppia di primer SEQ ID NO: 1 e 2 amplifica le regioni V3 del gene 16S rRNA.

La fase 4 può essere realizzata con le tecniche note nel settore a tale scopo, per esempio tecniche basate sul metodo di Sanger, mediante pirosequenziamento oppure la metodica di sequenziamento lon Torrent Fusion Primers utilizzata nell’esempio specifico della presente invenzione secondo il protocollo descritto nei materiali e metodi deH’articolo scientifico Milani et al. (2013).

Nel caso della tecnica lon Torrent i primer sono disegnati e sintetizzati in modo da includere all'estremità 5' una delle due sequenze adattattrici tilizzate in questa specifica tecnica di sequenziamento del DNA. In questo caso le sequenze adattatrici sono SEQ ID NO: 1 e 2.

Le condizioni in cui è realizzata la PCR sono le seguenti:

• 5 minuti a 95°C;

· 30 secondi a 94°C, 30 secondi a 55°C, e 90 secondi a 72°C per 35 cicli;

• 10 minuti a 72°C.

Al termine della PCR l'integrità dell'amplificato è stata verificata mediante elettroforesi.

La fase 5 del metodo, necessaria per la caratterizzazione delle comunità microbiche, può essere realizzata con numerose tecniche attualmente note per questo scopo. Nello specifico sono state utilizzate: hierarchical clustering, analisi tassonomica e costruzione di dendrogrammi filogenetici con heatmap secondo il protocollo descritto nei materiali e metodi dell'articolo scientifico Milani et al. (2013); nello specifico l’analisi dei dati di sequenza è stata condotta attraverso i software QIIME.

Analisi statistica dei dati

L’analisi statistica è stata condotta attraverso il software STATISTICA (StatSoft Ine., Tulsa, OK, USA).

Allo scopo di evidenziare differenze significative, i dati sono stati analizzati attraverso metodi statistici sia parametrici (ANOVA multivariata e univariata per misure ripetute), sia non parametrici (Wald-Wolfowitz e Mann-Whitney).

La normalità delle serie di dati (assunzione importante per la ANOVA) è stata valutata attraverso i test di Shapiro - Wilk e di Kolmogorov-Smirnov.

Risultati del trattamento

Hanno portato a termine lo studio 22 soggetti in tutto (11 femmine e 11 maschi).

Inizialmente erano stati arruolati 33 soggetti, ma di questi 11 sono usciti anticipatamente per diversi motivi: assunzione di antibiotici (4), rifiuto a proseguire lo studio (1), frequenti episodi diarroici (1), assunzione di altri probiotici durante il periodo di studio (3), drastico cambiamento delle abitudini alimentari (1), influenza stagionale con episodi di diarrea (1). Concluso lo studio e terminata l’analisi dei risultati dei due bracci di trattamento, si è aperto il cieco e si è visto che: il trattamento A è il trattamento attivo, contenente Lactobacillus paracasei DG; il trattamento B è il placebo, identico esteriormente al trattamento attivo, ma privo dei lattobacilli.

Analizzando i dati ottenuti dallo studio, è stata osservata, dal punto di vista tassonomico, una elevata stabilità del microbiota intestinale dei soggetti in studio.

Infatti è stato ritrovato che:

a) due divisioni batteriche, cioè i Bacteroidetes e i Firmicutes delle 15 identificate costituiscono più del 90% delle sequenze;

b) 11 famiglie delle 131 identificate costituiscono più del 90% delle sequenze; e

c) 20 generi dei 262 identificati costituiscono più del 90% delle sequenze.

Inoltre, questo studio ha confermato come il microbiota intestinale umano a livelli tassonomici inferiori (cioè a livello di famiglia e di genere) sia notevolmente variabile da soggetto a soggetto.

Dunque, le evidenze sperimentali hanno dimostrato la necessità di condurre su popolazione sana trial di intervento che siano crossover , al fine di evitare che la marcata variabilità inter-soggetto nasconda i possibili effetti del trattamento probiotico, o conduca a falsi positivi statistici.

Andando a valutare le modificazioni indotte nel microbiota intestinale da parte dei due trattamenti, è emersa una differenza statisticamente significativa a livello dei generi solo nel gruppo trattato con il trattamento con il Lactobacillus paracasei DG (trattamento attivo). Nello specifico, si è osservato un aumento del genere Coprococcus. Infatti, come si nota in Figura 1.1, 2.1 e 2.2, prima e dopo il trattamento con il Lactobacillus paracasei DG si è osservato un aumento statisticamente significativo dei coprococchi. Al contrario, nel gruppo trattato con il trattamento con il placebo, si è vista una loro blanda riduzione.

Inoltre, dopo il trattamento con il Lactobacillus paracasei DG si è osservata una riduzione statisticamente significativa dei batteri del genere Blautia. Al contrario, nel gruppo trattato con il trattamento con il placebo, si è osservato un loro lieve aumento (Figura 1.2, 2.1 e 2.2).

I coprococchi sono tra i principali produttori di butirrato a livello intestinale. II butirrato è un composto fondamentale a livello intestinale, in quanto da un lato contribuisce a ripristinare e a mantenere nel tempo l'integrità funzionale della mucosa intestinale, dall’altro ha importanti effetti antinfiammatori, tanto da venire impiegato come coadiuvante dei trattamenti dietetici delle colopatie intestinali (es. malattie infiammatorie croniche intestinali).

Inoltre, l’analisi del loro genoma, evidenzia che questi batteri possono utilizzare il succinato come substrato fermentativo.

Questa informazione è fondamentale, in considerazione del fatto che i membri del genere Blautia generano acetato e succinato come prodotti finali principali della fermentazione del glucosio.

Il succinato è considerato un fattore ulcerogeno, in grado, quindi, di aggravare la condizione dei soggetti con colite ulcerosa, in quanto è il probabile responsabile del danno mucosale presente soprattutto nelle fasi attive della malattia.

In conclusione, a seguito del trattamento con il probiotico, in questo caso a seguito della somministrazione di Lactobacillus paracasei DG, si osserva un aumento dei batteri appartenenti al genere Coprococcus e quindi si osserva un aumento della concentrazione intestinale di butirrato.

Allo stesso tempo, si osserva una riduzione della concentrazione di succinato, possibile responsabile del danno mucosale nei soggetti con colite ulcerosa, in maniera diretta, perché a seguito del trattamento con il probiotico, in questo caso a seguito della somministrazione di Lactobacillus paracasei DG, si ha una riduzione dei batteri appartenenti al genere Blautia, e, in maniera indiretta, perché, l’aumentata popolazione di coprococchi è ulteriormente in grado di diminuire la quota di succinato, impiegandola come substrato del loro processo fermentativo.

In conclusione, a seguito del trattamento con il probiotico, nell’esempio specifico a seguito della somministrazione di Lactobacillus paracasei DG, si verifica un aumento della concentrazione di acido butirrico nelle feci dei soggetti, con contemporanea riduzione di altri acidi organici, quali l’acido succinico.

I dati relativi alla composizione del microbiota fecale sono stati infine utilizzati in un’analisi bioinformatica finalizzata alla ricostruzione virtuale del metagenoma basata sulla conoscenza dei genomi batterici (Okuda S, Tsuchiya Y, Kiriyama C, Itoh M, Morisaki H. Virtual metagenome

reconstruction from 16S rRNA gene sequences. Nat Commun.

2012;3: 1203); in altre parole, si è stabilito in silico quali potenziali geni sono presenti e in quale abbondanza in un determinato microbiota. Questa analisi ha consentito di verificare un putativo aumento dei geni codificanti per la sintesi dell’acido folico e per il metabolismo dell’acido nicotinico (Figure 3 e 4). Queste due molecole rappresentano importanti vitamine per l’ospite umano (rispettivamente denominate vitamina B9 e B3). La vitamina B9, in particolare, rappresenta un fattore nutrizionale di primaria importanza, la cui carenza, soprattutto in specifiche condizioni fisiologiche quali la gravidanza, può condurre a gravi conseguenze per la salute. L’intervento con il prodotto probiotico impiegato in questo studio potrebbe, quindi, favorire la capacità del microbiota intestinale di produrre acido folico (vitamina B9), con conseguente beneficio nutrizionale per l’ospite umano.

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo in vitro per determinare la variazione della composizione del microbiota fecale di un soggetto a seguito dell’assunzione, secondo un protocollo randomizzato, controllato verso placebo, cross-over in doppio cieco, di una composizione comprendente microrganismi e di un placebo detto metodo comprendente le fasi di: (i) raccogliere le informazioni riguardanti lo stato di salute e/o le abitudini alimentari di detto soggetto prima e/o durante e/o dopo l’assunzione della composizione o del placebo secondo detto protocollo; (ii) ottenere almeno un campione fecale di detto soggetto prima e/o durante e/o dopo assunzione della composizione o del placebo secondo detto protocollo; (iii) analizzare il microbiota mediante analisi metagenomica condotta sul campione fecale ottenuto secondo la fase (ii); (iv) confrontare, preferibilmente qualitativamente e/o quantitativamente, il microbiota fecale del soggetto prima e/o durante e/o dopo l’assunzione della composizione o del placebo secondo detto protocollo.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui, detti microrganismi sono batteri e/o lieviti presi singolarmente o in combinazione.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detti microrganismi appartengono al genere scelto tra: Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Propionibacterium, Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus ed Enterococcus, preferibilmente detto microrganismo è un batterio del genere Lactobacillus e/o Bifidobacterium.
4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detti microrganismi sono batteri del genere Lactobacillus scelto tra le specie: Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobaci/lus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus , Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum , Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius e Lactobacillus sanfranciscensis.
5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detti microrganismi sono batteri di specie Lactobacillus paracasei, più preferibilmente è il ceppo Lactobacillus paracasei DG.
6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detti microrganismi sono presenti nella composizione in una quantità compresa tra 1-50 miliardi di unità formanti colonia (UFC) di microrganismi, preferibilmente 15-30, più preferibilmente 20-25 miliardi di UFC di microrganismi.
7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui detti microrganismi è sono presenti nella composizione in forma viva o morta, oppure in forma di lisato o di estratto.
8. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui la composizione comprendente microrganismi è formulata per la somministrazione orale, preferibilmente in forma solida, preferibilmente come compresse, capsule, tavolette, polvere granulare, opercoli, granuli orosolubili, bustine o confetti.
9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui l’analisi metagenomica comprende almeno una delle, preferibilmente tutte, le seguenti fasi: - estrazione degli acidi nucleici, preferibilmente del DNA dal campione fecale; e - tipizzazione molecolare dei microrganismi presenti nel microbiota fecale.
10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui la tipizzazione del microbiota fecale è realizzata mediante analisi della sequenza nucleotidica di almeno una porzione del gene codificante per la subunità 16S del ribosoma.
11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui la tipizzazione del microbiota fecale è realizzata mediante amplificazione della sequenza nucleotidica di almeno una porzione del gene codificante per la subunità 16S del ribosoma mediante PCR.
12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui la PCR è realizzata utilizzando SEQ ID NO: 1 e 2.
13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 11 o 12, in cui la sequenza nucleotidica amplificata è sequenziata, preferibilmente mediante la metodica di sequenziamento lon Torrent.
14. 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9-13, in cui i microrganismi tipizzati sono sottoposti ad una fase di caratterizzazione mediante programmi di hierarchical clustering , e/o analisi tassonomica, e/o costruzione di dendrogrammi filogenetici, preferibilmente con heatmap.
15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 14, in cui i risultati della caratterizzazione sono analizzati mediante metodi statistici di tipo parametrico e/o non parametrico.
16. 16. Kit per la realizzazione del metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15 comprendente: - un codice identificativo del kit; - almeno una formulazione orale di una composizione comprendente microrganismi, preferibilmente appartenente alla specie Lactobacillus paracasei, più preferibilmente il ceppo Lactobacillus paracasei DG, in una quantità compresa tra 1-50 miliardi di unità formanti colonia (UFC) di microrganismi, preferibilmente 15-30, più preferibilmente 20-25 miliardi di UFC di microrganismi. - almeno una formulazione orale di placebo che non contiene microrganismi; detta composizione di microrganismi essendo assunta secondo un protocollo randomizzato, controllato verso detto placebo, cross-over in doppio cieco, e detta composizione comprendente microrganismi e detto placebo essendo identificati da un codice.