ITMI940726A1 - Procedimento per la produzione di d- -amminoacidi - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un procedimento per la produzione di D-a-amminoacidi mediante conversione stereospecifica di miscele raceme di idantoine 5-sostituite con un microorganismo trasformato con un plasmide capace di esprimere in rese elevate ed in assenza di induttori un sistema enzimatico in grado di convertire direttamente dette idantoine nei corrispondenti D-a-amminoacidi .
Con il termine sistema enzimatico si fa riferimento ad un sistema costituito dagli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbamilasi.
I D-a-amminoacidi sono composti di notevole valore utili per la preparazione di sostanze farmacologicamente attive (ad esempio, la D-fenilglicina e la D-para-idrossifenilglicina sono utilizzate nella sintesi di penicilline e cefalosporine), pesticidi (la D-valina per la sintesi dell'insetticida fluvanilato) o dolcificanti (D-alanina) .
E' noto nella tecnica preparare D-α-amminoacidi mediante idrolisi chimica e/o enzimatica delle corrispondenti idantoine 5- sostituite.
Ad esempio nel brevetto FR 2.310.986 si descrive un procedimento in cui idantoine 5-sostituite vengono idrolizzate chimicamente in miscele raceme di D,L amminoacidi che sono successivamente sottoposte ad un trattamento di separazione dell'isomero di interesse.
Il brevetto FR 2.317.357 descrive, invece, un procedimento in cui miscele raceme di idantoine 5-sostituite vengono sottoposte ad idrolisi enzimatica e, successivamente, i prodotti di tale trasformazione (N-carbamil-D-a-amminoacidi ) sono ossidati per via chimica nei corrispondenti D-a-amminoacidi .
I problemi connessi con tali procedimenti consistono, generalmente, nel fatto che essi richiedono complesse procedure per la risoluzione e purificazione dei D-a-amminoacidi. Ne consegue che tali procedimenti sono economicamente poco interessanti da un punto di vista industriale. Sono stati descritti nella tecnica procedimenti in cui D-a-amminoacidi vengono ottenuti direttamente dalle idantoine 5-sostituite mediante trattamento di queste con sistemi enzimatici preparati da microorganismi quali Pseudomonas, Moraxella, Agrobacterium, Hansenula, Arthrobacter (EP-199,943, EP-309,310, US 4312948, FR 2456728).
La preparazione di detti sistemi enzimatici richiede, tuttavia, l'utilizzazione di induttori efficienti in grado di stimolare la produzione di tali enzimi da parte dei microorganismi. E' noto, infatti, che il livello di espressione degli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbamilasi è costitutivamente molto basso (Syldatk et al. (1990), "Advances in Biochem. Engineering/
Biotechnology (Fiechter, A. Ed.), 41,, pp.29-75, Springer-Verlag, Berlino).
Quali induttori, usualmente, vengono impiegati derivati delle idantoine o composti ciclici azotati che, tuttavia, vengono facilmente metabolizzati dai microorganismi, oppure composti quali 1' uracile o tio-2-uracile o timina che non vengono metabolizzati (Meyer et al., (1993), Fems Microbiol. Letters, 109: 67-74).
L'impiego di induttori comporta una serie di inconvenienti tra cui l'incremento dei costi di produzione ed una certa variabilità nelle rese di produzione degli enzimi. In aggiunta, il livello di espressione ottenibile nella maggior parte dei microorganismi in seguito ad induzione risulta inadeguato per un loro impiego economico in processi industriali (Syldatk et al. (1987), Biotechnol. lett., 9^ 25-30; Yokozeki et al. (1987) Agric. Biol. Chem., 51, 715-722).
Di recente sono stati sequenziati e clonati singolarmente i geni che codificano gli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbami lasi (US 4,912,044 ed EP-515 .698).
Più in particolare, il brevetto US 4,912,044 descrive la preparazione di D-idantoinasi mediante fermentazione di un microorganismo trasformato con un vettore ibrido contenente il gene idantoinasi la cui espressione è indotta attraverso variazione della temperatura. L'enzima così ottenuto viene impiegato per la produzione di D-N-carbami 1 derivati da idantoine 5-sostituite.
La domanda di brevetto EP-515.698 descrive, invece, la preparazione di D-N-carbami lasi mediante fermentazione di un microorganismo trasformato con un plasmide comprendente il gene carbamilasi la cui espressione è indotta chimicamente con IPTG. L'enzima così ottenuto viene impiegato per la produzione di D-o-amminoacidi da N-carbamil derivati.
Poiché l'interesse industriale è nella conversione delle idantoine raceme a D-a-amminoacidi, il fatto che i due enzimi siano espressi in ceppi diversi comporta l'impiego di entrambi e quindi lo sviluppo di una procedura a partire da due distinti processi fermentativi.
Questo aumenta necessariamente i costi di produzione e riduce le cinetiche di conversione. Infatti, affinchè sia portata a termine la reazione enzimatica, l'N-carbamil derivato prodotto dal microorganismo trasformato contenente 1'idantoinasi deve attraversare la membrana batterica, diffondere nel mezzo di reazione e quindi compiere il cammino inverso per raggiungere il secondo enzima (carbami lasi) presente nell'altro ceppo. Questi eventi sono particolarmente penalizzanti in termini cinetici se si tiene conto della ridotta permeabilità delle membrane batteriche ai carbami1 derivati (Olivieri et al. (1981), Biotechnol. Bioeng. , 2^3, 2173-2183) e della inevitabile diluizione del carbamile stesso nella miscela di reazione .
Infine, l’utilizzo di un volume doppio di biomassa influisce negativamente sulle rese e sul grado di purezza del prodotto finale.
Inoltre, la necessità di dover indurre l'espressione di detti enzimi comporta un maggior onere e rende quindi questi processi scarsamente interessanti per una utilizzazione pratica.
Costituisce lo scopo della presente invenzione il superamento degli inconvenienti della tecnica nota sopra riportati.
In particolare è stato ora trovato, secondo la presente invenzione, che l'adozione di un particolare plasmide che contiene i geni della D-idantoinasi e della N-carbamilasi posti sotto il controllo di un promotore sintetico opportunamente disegnato, consente di ottenere 1' espressione elevata di detti enzimi in assenza di induttori.
Risulta così possibile la preparazione di un singolo microorganismo trasformato con detto plasmide contenente al suo interno le due attività enzimatiche. Questa soluzione consente di risolvere sia i problemi cinetici conseguenti la scarsa permeabilità, in quanto le due reazioni avvengono all'interno della stessa cellula dove la concentrazione dei substrati è ottimale, sia quelli relativi alla richiesta di induttori ed al trattamento degli scarti e del prodotto.
In accordo con ciò, in un suo primo aspetto la presente invenzione riguarda un procedimento per la produzione di D-o-amminoacidi mediante conversione stereospecifica di miscele raceme di idantoine 5-sostituite caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta in presenza di un microorganismo trasformato con un plasmide capace di esprimere ad alti livelli ed in assenza di induttori un sistema enzimatico in grado di convertire dette idantoine nei corrispondenti D-α-amminoacidi.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione il plasmide pSM651 comprendente i geni che codificano il sistema enzimatico.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un microorganismo trasformato con il plasmide pSM651 capace di esprimere con elevata efficienza ed in assenza di induttori un sistema enzimatico in grado di convertire in modo stereospecifico miscele raceme di idantoine 5-sostituite nei corripondenti D-o-amminoacidi.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione l'impiego di detti microorganismi o del sistema enzimatico isolato da detti microorganismi per la produzione di D-a-amminoacidi mediante conversione stereospecifica di miscele raceme di idantoine 5-sostituite.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno chiari dalla descrizione e dagli esempi che seguono.
Breve descrizione delle figure
Figura 1: Mappa del plasmide pSM637 contenente il gene carbamilasi
Figura 2: Mappa del plasmide pSM650 contenente il gene idantoinasi
Figura 3: Mappa del plasmide pSM651 contenente 1 'operone idantoinasi-carbamilasi.
Figura 4 A-B : Sequenza nucleotidica ed amminoacidica della carbamilasi.
Figura 5 A-C: Sequenza nucleotidica ed amminoacidica dell'idantoinasi.
Figura 6: SDS-PAGE (A) e Western-Blot (B) delle proteine totali estratte da colture di E.coli e B.subtllis trasformate con il plasmide pSM651 dove:
linea 1: standard idantoinasi
linea 2: standard carbamilasi
linea 3: E.coli (pSM671) controllo
linea 4: E.coli SMC305
linea 5: B.subtilis (pSM671) controllo
linea 6: B.subtilis SMS373
I geni che codificano gli enzimi Didantoinasi e D-N-carbamilasi possono essere isolati da microorganismi quali Pseudomonas, Hansenula, Agrobacterium, Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Moraxella, Brevibacterium, Flavobacterium, Serratia, Micrococcus, Arthrobacter o Paracoccus. Specifici esempi di tali microorganismi sono Bacillus macroides ATCC 12905, Aerobacter cloacae IAM 1221, Agrobacterium sp.IP 1-671, Agrobacterium radiobacter NRRLB 11291, Pseudomonas sp. FERM BP 1900.
L'isolamento dei geni che codificano gli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbamilasi può essere effettuato mediante costruzione di una genoteca rappresentativa del genoma del microorganismo, identificazione dei cloni contenenti i geni che codificano per detti enzimi, analisi della sequenza dei geni, inserimento di detti geni in un vettore e verifica della loro espressione.
Per genoteca o banca genomica si intende l'insieme di cloni di un dato microorganismo ospite ognuno dei quali portante un frammento del DNA cromosomale derivante dall'organismo donatore di cui si vuole ottenere la banca. Una banca viene definita rappresentativa quando l'insieme dei singoli frammenti contenuti in ciascun clone ricostituisce gran parte del DNA cromosomale dell'organismo donatore.
Secondo una forma di attuazione del procedimento della presente invenzione, quale organismo donatore per l'isolamento dei geni che codificano la D-idantoinasi e la D-N-carbamilasi viene impiegato il ceppo A.radiobacter NRRL B-11291.
In pratica, si costruiscono due genoteche di detto microorganismo in E.coli digerendo il DNA cromosomale separatamente con gli enzimi di restrizione BamHI e Sacl. Tra i frammenti ottenuti con le due digestioni, vengono purificati quelli aventi dimensioni comprese mediamente tra 3000 e 4500 coppie di basi. La scelta è stata effettuata stimando il peso molecolare degli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbamilasi rispettivamente di 50.000 e 34.000 Daltons.
Le due popolazioni di frammenti BamHI e Sacl sono quindi ligate ad un vettore di E.coli in condizioni tali da facilitare la condensazione di un singolo frammento a ciascuna molecola del vettore. Le due miscele di ligasi vengono utilizzate per trasformare cellule di E.coli rese competenti come riportato ad esempio da Dagert, M. e Ehrlich (1979), (Gene, 6:23).
Le due popolazioni di colonie (genoteche) così ottenute, ciascuna delle quali portante un plasmide ibrido costituito cioè dalla molecola del vettore e da un frammento di DNA cromosomale di A.radiobacter, sono poi selezionate per identificare quei cloni contenenti i geni dell'idantoinasi e della carbamilasi.
L'identificazione può essere effettuata mediante espressione diretta o utilizzando delle sonde specifiche. Preferibilmente è stato impiegato questo secondo metodo. Per la scelta delle sonde, nel caso della carbamilasi, ci si è avvalsi della conoscenza della sequenza amminoterminale della carbamilasi da Comomonas sp. 5222c (Ogawa et al. (1993), Eur. J. Biochem., 212: 685-691).
Sulla base di tale sequenza si sintetizzano dei piccoli oligonucleotidi che, una volta marcati, vengono impiegati per lo screening delle genoteche mediante tecniche di ibridazione (Maniatis et al., (1982), "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory) .
Ciò ha permesso l'identificazione di un clone portante un plasmide ibrido portante un frammento BamHI contenente la sequenza nucleotidica che codifica per l'intera carbamilasi. L'analisi di detto plasmide ha rivelato, inoltre, la presenza di una seconda ORF incompleta, posta sull'altro filamento rispetto al gene della carbamilasi, che mostrava una omologia con porzioni ureasi isolate da vari microorganismi.
Poiché le ureasi, come le idantoinasi, sono enzimi appartenenti alla famiglia delle amidoidrolasi è stato ipotizzato che la ORF incompleta corrispondesse a quella dell'idantoinasi. L'ipotesi è stata poi confermata dai saggi di attività enzimatica condotti su estratti cellulari di cellule portanti il gene identificato.
Allo scopo di isolare l'intera sequenza nucleotidica codificante 1'idantoinasi, è stato effettuato uno screening della genoteca del DNA di A.radiobacter digerito con Sacl mediante ibridazione con un oligonucleotide sintetizzato sulla base della sequenza nucleotidica della ORF incompleta .
Lo screening ha portato all'isolamento di un clone contenente l'intero gene dell'idantoinasi. I geni così isolati sono stati sequenziati utilizzando il Kit sequenase version 2.0 commercializzato dalla United State Biochemical.
Per la costruzione di un plasmide comprendente entrambi i geni isolati possono essere utilizzati vettori scelti fra plasmidi, cosmidi e batteriofagi noti nella tecnica.
Preferibilmente è stato impiegato il plasmide bifunzionale di E.coli e B.subtilis, pSM671 CBS 205.94.
Detto plasmide, che comprende i geni che codificano per la resistenza alla kanamicina ed al cloramfenicolo e presenta le origini di replicazione funzionali in E.coli e B.subtilis, è caratterizzato dal fatto di contenere un promotore sintetico capace di dirigere con elevata efficienza ed in assenza di induttori l’espressione dei geni posti sotto il suo controllo.
In pratica, i frammenti di DNA contenenti i geni che codificano gli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbami lasi sono clonati nel plasmide pSM671 nei siti unici di restrizione EcoRI e HindlII ottenendo il plasmide ricombinante pSM651.
La costruzione può essere condotta operando secondo tecniche generali note nel campo del DNA ricombinante. Allo scopo di verificare se questi enzimi sono espressi da B.subtilis ed E .coli, cellule trasformate con detto plasmide vengono coltivate in terreno di coltura adatto. Le proteine totali, estratte dal U sato cellulare, analizzate su gel di poliacrilammide hanno mostrato la presenza di due proteine aventi un peso molecolare corrispondente a quello dei due enzimi; dette proteine rappresentano circa il 10% delle proteine totali. Tali risulati confermano la capacità di B.subtilis e di E.coli di esprimere detti enzimi con elevata efficienza ed in assenza di induttori.
Il sistema enzimatico secondo la presente invenzione può essere ottenuto coltivando i ceppi E.coli o B.subtilis trasformati con il plasmide pSM651, in condizioni aerobiche, in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni ed, eventualmente, tracce di vitamine, quali biotina o tiamina, o di amminoacidi.
Sorgenti di carbonio assimilabili includono carboidrati come glucosio, amidi idrolizzati, melassa, saccarosio od altre sorgenti di carbonio convenzionali .
Esempi di sorgenti di azoto possono essere scelti, ad esempio, tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne .
I seguenti cationi ed anioni sono ugualmente adatti per gli scopi della presente invenzione: potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese, e nitrati.
La fermentazione è condotta, sotto agitazione, ad una temperatura compresa tra 25°e 40°C, preferibilmente tra 30° e 37°C e ad un pH compreso tra 6 e 7,5, preferibilmente tra 6,5 e 7,0.
Le cellule (biomassa) recuperate dal mezzo di coltura mediante tecniche convenzionali come centrifugazione o filtrazione vengono impiegate nella fase di conversione di miscele raceme di idantoine 5-sostituite.
Alternativamente, la reazione di conversione può essere condotta sia utilizzando l'estratto cellulare ottenuto dalla disintegrazione delle cellule mediante sonicazione o French-Press, sia gli enzimi purificati o parzialmente purificati utilizzando tecniche convenzionali, sia gli enzimi immobilizzati su supporti insolubili.
Numerose idantoine sostituite in posizione 5 possono essere utilizzate nel procedimento della presente invenzione. Possibili sostituenti in posizione 5 sono scelti tra un gruppo alchilico lineare o ramificato con un numero di atomi di carbonio compreso tra 1 e 6, che possono essere mono o poli sostituiti con gruppi idrossilici, carbossilici , sulfidrilici o amminici oppure un gruppo fenilico o benzilico che, a loro volta, possono contenere uno o più sostituenti in posizione orto, meta e para. Esempi di idantoine 5-sostituite sono: D,L-5-fenilidantoina, D,L-5-para-idrossifenilidantoina, D,L-5-metilidantoina, D,L-5-isopropilidantoina, D,L-5-tienilidantoina,
D,L-5-para-metossifeni lidantoina,
D,L-5-para-clorofenilidantoina, D,L-5-benzilidantoina .
La conversione delle idantoine nei corripondenti D-o-amminoacidi è condotta in atmosfera di azoto in una apparecchiatura ermeticamente chiusa, ad una temperatura compresa tra 20 e 60<D>C, preferibilmente tra 30 e 45°.
Il pH del mezzo di reazione è mantenuto entro valori compresi tra 6 e 10 e di preferenza tra 7 e 8,5. Questa regolazione del pH potrà essere effettuata, ad esempio, mediante aggiunta di una soluzione acquosa basica quale una soluzione acquosa di ammoniaca, di idrossido di potassio, di idrossido di sodio, carbonato di sodio oppure di potassio .
La concentrazione iniziale delle idantoine è generalmente compresa tra il 2% e il 30% in peso. Come conseguenza della stereospecificità degli enzimi prodotti dai ceppi secondo la presente invenzione, solo i D-enantiomeri delle idantoine vengono idrolizzati. Comunque, poiché le idantoine racemizzano spontaneamente più o meno velocemente nelle condizioni operative, gli L-enantiomeri vengono convertiti completamente nei corrispondenti D-a-amminoacidi.
La quantità di biomassa che viene addizionata alla miscela di reazione dipenderà dalla particolare affinità del substrato verso gli enzimi. In generale, può essere utilizzato un rapporto in peso biomassa/idantoine compreso tra 1/1 e 1/50.
Quando la reazione di conversione è condotta nelle condizioni ottimali si ottiene una resa del 95-98%.
I D-a-amminoacidi preparati mediante il processo della presente invenzione possono essere recuperati dall'ambiente di reazione mediante metodiche classiche come cromatografia a scambio ionico o precipitazione dell'amminoacido al suo punto isoelettrico.
Il plasmide pSM651 è stato depositato presso Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn (Olanda) come E.coli SMC305 dove ha ricevuto il numero di deposito CBS 203.94.
Gli esempi sperimentali che seguono hanno lo scopo di illustrare meglio la presente invenzione senza volerla limitare.
Esempio 1
Estrazione del DNA cromosomale da A.radlobacter. 100 mi di terreno di fermentazione avente la seguente composizione:
1% glucosio, 0,3% yeast extract, 1,36% KH2PO4, 0,02% MgSO4.VH2O (pH 7,0) sono stati inoculati con il ceppo A.radiobacter (NRRLB 11291) e mantenuti sotto agitazione (220 rpm) a 30°C per 24 ore.
Quindi, le cellule sono state recuperate mediante centrifugazione della brodocoltura in un rotore SS34 modello Sorvall RC-5B (a 4°C e 5000 rpm per 10 minuti) e poi lavate (2x120 mi) con una soluzione (TE) contenente 1 mM EDTA, 10 mM TrisHC1, pH 7,4. La sospensione risultante è stata nuovamente centrifugata come sopra riportato e le cellule sono state recuperate e risospese in 9,5 mi di soluzione TE. Dopo aggiunta di 0,5 mi di 10% SDS (sodio dodecilsolfato) e 50 μΐ di una soluzione di Proteinasi K (20 mg/ml), la sospensione è stata incubata a 37° C per 1 ora.
Successivamente sono stati addizionati 1,8 mi di NaCl 5 M e 1,5 mi di una soluzione costituita da 10% esadeciltrìmetil ammonio bromuro (CTAB) in 0,7 M NaCl e la soluzione risultante è stata incubata a 65°C per 20 minuti. Quindi la soluzione è stata deproteinizzata con ugual volume di cloroformio :isoamil alcol (24:1, v/v) ed il DNA è stato precipitato con 0,6 volumi di isopropanolo. Il DNA è stato lavato con 1 mi di etanolo (70%) e recuperato con una bacchetta di vetro. Infine il DNA raccolto è stato disciolto in 4 mi di TE e la sua concentrazione è stata determinata mediante lettura spettrofotometrica a 260 nm.
Il DNA cromosomale è stato ulteriormente purificato mediante centrifugazione su gradiente di CsCl (1%) contenente 0,1 mg/ml di bromuro di etidio (55.000 rpm per 16 ore in rotore Beckman V65TÌ).
La banda di DNA è stata visualizzata sotto luce UV ed il bromuro di etidio è stato allontanato mediante estrazione con butanolo saturo in H2O . Dopo dialisi contro tampone TE, il DNA è stato precipitato con etanolo e risospeso nel volume desiderato.
Esempio 2
Costruzione di_ una banca_ genomica_ di A .radiobacter.
Aliquote (10 jig) del DNA così ottenuto sono state digerite, separatamente, con 25 unità di ciascuno degli enzimi di restrizione EcoRI, PstI, BamHI, Sacl, Sali e Sphl (Boehringer) operando secondo le istruzioni della casa produttrice.
Dopo aver bloccato le reazioni enzimatiche a 65°C per 10 minuti, le miscele di reazione sono state caricate su gel di agarosio allo 0,8% e corse a 100 volts per 2 ore. Quindi le bande di DNA, visualizzate mediante colorazione con EtBr (0,5 gamma/ml), sono state trasferite su filtro di nylon (Boehringer) e dopo lisi con NaOH, il DNA delle stesse è stato immobilizzato secondo la tecnica Southern blot (Maniatis et al·., "Molecular Cloning: a practical laboratory manual", Cold Spring Harbor, New York, 1982).
Il filtro è stato ibridizzato a 45°C con ciascuno degli oligonucleotidi degenerati, disegnati sulla base della sequenza amminoterminale della carbamilasi di Comamonas sp. E222c (Ogawa et al., (1993), Eur. J. Biochem., 212: 685-691), aventi la sequenza:
Detti oligonucleotidi sono stati sintetizzati utilizzando il sistema automatico System OLIGO 1000 della Beckmann e poi marcati all'estremità 5 'utilizzando il kit DIG SYSTEM (Boehringer). La reazione di ibridazione con la sonda 2 ha dato segnali positivi. In particolare, il DNA digerito con BamHI generava un frammento di circa 4000 bp in grado di ibridizzare le sonde.
Per isolare il frammento BamHI così identificato, 10 pg di DNA cromosomale sono stati sospesi in 50 Vii di tampone 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoetanolo ed incubati a 37°C per 4-5 ore in presenza di 25 U dell'enzima BamHI .
La miscela di digestione è stata quindi sottoposta ad elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8% e, dopo colorazione con EtBr, frammenti di DNA di 3.500 - 4.500 bp sono stati elettroeluiti nel tampone di elettroforesi (Maniatis et al. "Molecular Cloning: a practical laboratory manual", Cold Spring Harbor, New York, 1982) .
Quindi si è proceduto al clonaggio dei frammenti di DNA cromosomale nel plasmide pUC18 (BRL). In pratica 20 ng di detto plasmide, previamente linearizzato con l'enzima di restrizione BamHI, sono stati ligati con 100 ng dei frammenti di DNA cromosomale in 20 μΐ di miscela contenente 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgC^ , 10 mM Ditiotreitolo (DTT), in presenza di 1 11 di T4 DNA ligasi, a 16°C per una notte.
La miscela di ligasi è stata impiegata per trasformare cellule di E.coli JM101 (BRL) rese competenti con 50 mM CaCL2 (Dagert, M. e Ehrlich (1979), Gene, 6:23).
Successivamente i trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar (DIECO), 0,5 g/1 estratto di lievito) addizionato con 40 yg/ml di X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-tiogalactopiranoside ), 125 yg/ml di IPTG (isopropilbeta-D-tiogalactopiranoside) e 100 yg/ml di ampicillina .
Operando come sopra riportato si sono ottenute numerose colonie ricombinanti positive (bianche) facilmente distinguibili da quelle non ricombinanti (blù).
I cloni positivi sono stati trasferiti su filtri di nylon (Boehringer) ed il DNA estratto da detti cloni è stato ibridizzato nelle medesime condizioni impiegando la sonda 2 che aveva risposto positivamente all'ibridazione con il DNA cromosomale .
I plasmidi estratti dai cloni che davano un segnale positivo sono stati sequenziati utilizzando il Kit Sequenase version 2.0 (United State Biochemical ). Uno di detti plasmidi, contenente il gene completo della carbamilasi (915 bp) è stato denominato pSM652.
In figura 4 è riportata la sequenza nucleotidica ed amminoacidica della carbamilasi.
Esempio 3
Isolamento del gene idantoinasi di A.radiobacter.
L'analisi del plasmide pSM652 ha rivelato la presenza di una seconda ORE incompleta, posta sull'altro filamento rispetto al gene della carbamilasi, che mostrava una omologia con porzioni ureasi isolate da vari microorganismi.
Poiché le ureasi, come le idantoinasi, sono enzimi appartenenti alla famiglia delle amidoidrolasi è stato ipotizzato che la ORF incompleta corrispondesse a quella dell'idantoinasi. L'ipotesi è stata poi confermata dai saggi di attività enzimatica condotti su estratti cellulari di cellule portanti il gene identificato.
Allo scopo di isolare l'intera sequenza nucleotidica codificante 1'idantoinasi, lo stesso Southern Blot utilizzato per l'isolamento della carbamilasi è stato ibridizzato impiegando come sonda 1'oligonucleotide avente la sequenza:
5'ATC GTA ACC GCG GAC GGG ATT TCT CCC 3'
Detto oligonucleotide, omologo alla regione 5'terminale della sequenza nucleotidica della ORF parziale identificata, è stato sintetizzato e marcato come riportato nell'esempio 2. Tra le bande positive per tale probe è stata individuata una banda di circa 3500 bp ottenuta dalla digestione del DNÀ con l'enzima Sacl.
Operando come riportato nell'esempio 2 è stata quindi costruita una banca genomica di DNA cromosomale di A.radiobacter digerito con Sacl. Lo screening di tale banca ha portato all'isolamento del plasmide pSM653 contenente l'intero gene per 1 'idantoinasi la cui sequenza nucleotidica ed amminoacidica sono riportate in figura 5.
Esempio 4
Clonaqgio del gene della carbamilasi.
1) Amplificazione del gene della carbamilasi.
Il plasmide pSM652 è stato amplificato mediante la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR), secondo le indicazioni riportate da Leung et al. (Leung D.W., Chen E., Goeddel D.V., Technique - a journal of methods in celi and molecular biology, 1, n° 1 (1989): pp. 11-15), utilizzando la coppia di oligonucleotidi:
(1) 5'GGG AAT TCT TAT GAG ACG TCA G 3'(FORWARD)
EcoRI
(2) 5'CCC AAG CTT CAA AAT TCC GCG AT 3'(REVERSE) Hindi II
L 'oligonucleotide (2) consentiva anche di eliminare il sito di restrizione EcoRI presente all'interno del gene carbamilasi in prossimità del terminale 3'.
L'amplificazione è stata condotta in una apparecchiatura DNA Thermal Cycler 480 (Perkin -Elmer Cetus) utilizzando una miscela di reazione (100 μΐ) contenente 10 mM Tris HC1 pH 8,3, 1,5 mM
<M>^<C1>2, 50 mM KC1, 0,01% (peso/volume) di gelatina, 1 ng di pSM652, 1 μΜ dei due primers, 200 μΜ di dNTP, 0,5 Unità di Taq polimerasi (Perkin Elmer).
Si aggiunge una goccia di olio minerale e si denatura per 4 minuti a 94 °C e si fa partire il programma ciclico, che comprende :
1 minuto a 94°C (denaturazione)
1 minuto a 55°C (annealing)
2 minuti a 72°C (allungamento)
per 30 cicli complessivi, seguita da 8 minuti a 72°C (estensione finale).
Il prodotto di amplificazione così ottenuto è stato trattato con fenolo - cloroformio (1:1), precipitato con NaCl (1/10 vol/vol) ed EtOH (2 voi) e risospeso in 20 μΐ di I^O. Dopo taglio con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindlII (5 U) adatti al clonaggio nel plasmide pSM671 (CBS 205.94) ed i frammenti di DNA sono stati purificati su gel low - melting (SeaPlaque, FMC BioProducts) all' 1,0% e le bande eluite dal gel sono state trattate con GELase (Epicentre Technologies) (1 U ogni 300 yg di gel pesato) per 1,5 ore a 45°C.
Parallelamente, 50 ng del plasmide pSM671 sono stati tagliati con gli stessi enzimi di restrizione .
Il plasmide ed i frammenti sono stati ligati in 10 yl di miscela di reazione (DNA 20 ng/ml) e 2 Vii di detta miscela sono stati utilizzati per trasformare cellule di E.coli 71/18 rese competenti con CaCl2 (Dagert e Ehrlich, Gene, 6^ 23, 1979). I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB contenente 20 vg/ml di cloramfenicolo .
Il DNA plasmidico estratto dai cloni positivi è stato analizzato per verificare l'esatto inserimento del gene carbamilasi e l'assenza di eventuali errori dovuti all'amplificazione.
Uno di detti plasmidi è stato denominato pSM637.
Il ceppo di E.coli contenente il plasmide pSM637 è stato denominato SMC307.
Cellule di B.subtilis SMS108 NRRLB-15.898 rese competenti come descritto in "Molecular Biology Methods for Bacillus", (1990) (Harwood e Cutting (eds) Wiley and Sons) sono state trasformate con 100 ng del plasmide pSM637 operando secondo tecniche note, ed il ceppo trasformato è stato denominato SMS374.
Esempio 5
Espressione del gene carbamilasi in E.coli e B.subtilis .
Scopo della sperimentazione era quello di verificare la capacità dei ceppi trasformati (E.coli SMC307 e B.subtilis SMS 374) di esprimere il gene carbamilasi in assenza di induttori.
In due beute da 100 mi contenenti, rispettivamente, 10 mi di terreno LB addizionato con 20 yg/ml di cloramfenicolo e 10 mi di terreno VY addizionato con 5 yg/ml di cloramfenicolo, si inocula una precoltura su slant del ceppo E.coli SMS307 e B.subtilis SMS 374. Le beute sono state incubate, sotto agitazione (220 rpm), a 37° per 16 ore.
Le cellule sono state recuperate mediante centrifugazione (12.000 rpm, 4°C, per 1 minuto) delle due brodocolture, risospese in 300 pi di tampone 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM BMeOH, 20% glicerolo e lisate per sonicazione (Soniprepl50, MSE impulsi di 1 minuto, a voltaggio medio). Aliquote (15 pi) dei due U sati sono state caricate su gel di poliacrialammide al 10% e corse a 20 mA per tre ore. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante colorazione con Coomassie R-250 (Laemmli, Nature: 227 , 680, 1970). Dopo colorazione con Coomassie si evidenziava una banda proteica con un peso molecolare di 34.000 D assente negli estratti dei ceppi B.subtilis SMS108 ed E.coli 71/18 non trasformati. Inoltre, l'analisi densitometrica effettuata sullo stesso gel colorato con Coomassie indicava che questa proteina era espressa in entrambi i ceppi trasformati come una delle proteine prevalenti (10% rispetto alle proteine totali).
Esempio 6
Clonaggio del gene deLL'idantoinasi
Il plasmide pSM653 (1 pg) è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRV e Sali (4 U) (Boehringer) a 37°C per 1 ora.
La miscela di digestione è stata quindi sottoposta ad elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8% (low melting) e, dopo colorazione con EtBr, la banda di DNA corrispondente ad un frammento EcoRV-SalI di 1300 bp è stata ritagliata ed il DNA è stato estratto con il metodo Gelase TM (EPICENTRE Technologies). Poiché detto frammento manca di una piccola regione all'estremità 5' e di una porzione di 70 bp all'estremità 3', l'intero gene idantoinasi è stato ricostruito utilizzando due linkers aventi la sequenza:
Quindi 40 ng del frammento di 1300 bp, 40 ng del linker 3', 10 ng del linker 5' e 50 ng del plasmide pSM671 CBS 205.94, previamente linearizzato con EcoRI, sono stati ligati in miscela di ligasi contenente 1 U di T4 DNA ligasi, incubando a 12°C per 16 ore. Successivamente la miscela di ligasi è stata utilzzata per trasformare cellule competenti di E.coli 71/18 ed i trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB addizionato con 20 yg/ml di cloramfenicolo.
I DNA plasmidici isolati da alcuni dei cloni positivi sono stati analizzati per individuare i cloni contenenti la sequenza completa del gene idantoinasi .
Uno di detti plasmidi è stato denominato pSM650 ed il ceppo di E.coli contenente detto plasmide è stato contrassegnato con la sigla SMC308 .
100 ng del plasmide pSM650 sono stati utilizzati per trasformare cellule competenti di B.subtilis SMS108. Il ceppo risultante è stato designato SMS375.
Esempio 7
Espressione del gene idantoinasi in E .coli e B.subtilis .
Scopo della sperimentazione era quello di verificare la capacità dei ceppi trasformati (E.coli SMS308 e B.subtilis SMS375) di esprimere il gene idantoinasi in assenza di induttori.
In due beute da 50 mi contenenti, rispettivamente, 10 mi di terreno LB addizionato con 5 yg/ml di cloramfenicolo e 10 mi di terreno VY addizionato con 20 yg/ml di cloramfenicolo, si inocula una precoltura su slant del ceppo E.coli SMS308 e B.subtilis SMS375. Le beute sono state incubate, sotto blanda agitazione (220 rpm), a 37° per 16 ore.
Le cellule sono state recuperate mediante centrifugazione (12.000 rpm, 4°C, per 1 minuto) delle due brodocolture, risospese in 300 yl di tampone 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM BMeOH, 20% glicerolo e lisate per sonicazione (impulsi da 1 minuto, a voltaggio medio). Aliquote (15 yl) dei due U sati sono state caricate su gel di poliacrilammide al 10% e corse a 20 mA per tre ore. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante colorazione con Coomassie R-250 (Laemmli, Nature: 227, 680, 1970). Dopo colorazione con Coomassie si evidenziava una banda proteica con un peso molecolare di 50.000 Daltons assente negli estratti dei ceppi B.subtilis SMS108 ed E.coli 71/18 non trasformati. L'analisi densitometrica effettuata sullo stesso gel colorato con Coomassie indicava che questa proteina era espressa nei due ceppi trasformati come una delle proteine prevalenti (10% rispetto alle proteine totali).
Esempio 8
Clonacrcfio dell'operone idantoinasi-carbamilasi Il plasmide pSM650 (1 yg) è stato digerito con l'enzima EcoRI (5 U) a 37°C per 1 ora. Il frammento EcoRI-EcoRI di circa 1380 bp contenente il gene idantoinasi è stato purificato da gel di agarosio 0,8% con il metodo Gelase TM. 20 ng di tale frammento sono stati ligati con 50 ng del plasmide pSM637 linearizzato con EcoRI. La reazione è stata condotta in tampone di ligasi contenente 1 U di T4 DNA ligasi, a 16°C per 16 ore.
La miscela di ligasi è stata impiegata per trasformare cellule competenti di E.coli 71/18.
Successivamente i trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar (DIFCO), 0,5 g/1 estratto di lievito) addizionato con 20 yg/ml di Cloramfenicolo.
I cloni positivi sono stati analizzati mediante analisi di restrizione per verificare il corretto inserimento dei due geni. Il plasmide contenente 1'operone idantoinasi-carbamilasi è stato denominato pSM651 ed il ceppo di E.coli contenente detto plasmide è stato contrassegnato con la sigla SMC305.
Con 100 ng di tale plasmide sono state trasformate cellule competenti di B .subtilis SMS108. Uno dei cloni positivi è stato denominato SMS373 .
Esempio 9
Espressione dell'operone idantoinasi-carbamilasi.
E .coli SMC305 e B.subtilis SMS373 sono stati coltivati, rispettivamente, in 100 mi di terreno LB addizionato con 20 yg di cloramfenicolo e in 100 mi di terreno VY addizionato con 5 yg di cloramfenicolo, a 37°C per 16 ore, sotto agitazione (200 rpm). Quindi, gli estratti proteici ottenuti dai U sati cellulari sono stati analizzati come descritto nell'esempio 7. I risulati hanno evidenziato la presenza di due proteine corrispondenti all'idantoinasi ed alla carbamilasi (figura 6). Per valutare l'attività di detti enzimi, è stata effettuata una cinetica della reazione utilizzando quale substrato 20 mM (D,L) paraidrossifenil-idantoina o alternativamente 5-fenil-idantoina (in 200 mM tampone fosfato pH 8) e seguendo la conversione nel corrispondente D-a-amminoacido con evoluzione di ammoniaca. La procedura seguita è quella descritta da Weatherburn, M. W.,(1967), (Anal. Chem., ^9: 971).
Esempio 10
Conversione di D,L-5-fenilidantoina a D-fenilglicina .
In una apparecchiatura, munita di agitatore e termostatata a 40°C, è stata caricata una sospensione di 2 g di D,L-5-fenil-idantoina in 100 mi di tampone Na-fosfato 0,2 M pH 8,0. Dopo aver degassato con azoto a 40° C per 5 minuti, sono stati introdotti 5 g (peso umido) di biomassa proveniente da una coltura di E.coli SMS305, effettuata come riportato nell'esempio 9.
Dopo aver chiuso ermeticamente l'apparecchiatura, la miscela di reazione è stata mantenuta in atmosfera di azoto, a 40°C per 24 ore. L'analisi polarimetrica e cromatografica su strato sottile (J.. of Chromatography, 80:199-204, 1973) di una aliquota della miscela di reazione evidenziava la completa idrolisi del substrato di partenza a D-fenilglicina.
Dopo separazione della biomassa mediante centrifugazione della miscela di reazione a 6000 rpm per 10 minuti, il supernatante è stato acidificato a pH 1,0 con HC1 6 M e caricato su una colonna (2,6 x 20 cm) di Amberlite IR 120 (attivata con HCl). La colonna è stata successivamente lavata con acqua ed eluita con una soluzione ammoniacale al 5% in acqua. L'eluato è stato decolorato con carbone decolorante (C. Erba), e la soluzione decolorata è stata concentrata sotto vuoto e portata a pH 5,8. I cristalli così ottenuti sono stati recuperati per filtrazione e ricristallizzati da acqua. La polvere bianca ottenuta (1,63 g) mostrava un potere rotatorio specifico [O]D20 = -156° (c = 1, I N HC1). Lo spettro IR era in accordo con quello della D-fenilglicina standard.
Esempio 11
Conversione di D,L-5-fenilidantoina a D-fenildlicina.
Si è operato come riportato nell’esempio 10, utilizzando 5 g (peso umido) di biomassa proveniente dalla coltura di E.coli SMS305 e 10 g di D,L-5-fenil-idantoina in 100 mi di tampone Na-fosfato 0,2 M pH 8,0. La reazione è stata effettuata in atmosfera di azoto, a 40°C per 90 ore. La polvere bianca ottenuta (8,1 g) mostrava un potere rotatorio specifico [ot]^20 = -156,5° (c = 1, I N HC1). Lo spettro IR era in accordo con quello della D-fenilglicina standard.
Esempio 12
Conversione di D,L-5-para-idrossi-fenilidantolna a D-para-idrossi-fenilglicina .
Si è operato come nell'esempio 10 che precede utilizzando 2,5 g di biomassa (peso umido) ed 1 g di D,L-5-para-idrossi-f enilidantoina. La D-paraidrossi-feni lglina ottenuta come polvere bianca (0,82 g) mostrava un potere rotatorio specifico [a]Q20 = -158° (c = 1, I N HC1). Lo spettro IR era in accordo con quello della D-fenilglicina standard.
Esempio 13
Conversione di D,L-5-para-idrossi-fenilidantoina a D-para-idrossi-fenilglicina.
Si è operato come nell'esempio 10 che precede utilizzando 2,5 g di biomassa (peso umido) ottenuta dalla coltura di E.coli SMC305 e 8 g di D,L-5-para-idrossi-fenilidantoina .
La reazione è stata effettuata in atmosfera di azoto, a 40°C per 170 ore. La D-paraidrossifenilglina ottenuta come polvere bianca (6,6 g) mostrava un potere rotatorio specifico [α]^20 = -157,8° (c = 1, I N HC1). Lo spettro IR era in accordo con quello della D-fenilglicina standard. Esempio 14
Conversione di D,L-5-isopropilidantoina a Dvaiina .
Si è operato come nell'esempio 10 che precede utilizzando 5,0 g di biomassa (peso umido) ottenuta dalla coltura di E.coli SMC305 e 2 g di D,L-5-isopropilidantoina .
La reazione è stata effettuata in atmosfera di azoto, a 40°C per 240 ore. La D-valina ottenuta come polvere bianca (0,8 g) mostrava un potere rotatorio specifico [a]D20 = -27,5° (c = 5, 6 N HC1). Lo spettro IR era in accordo con quello della D-valina standard.
Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per la produzione di D-α-amminocidi mediante conversione stereospecif ica di miscele raceme di idantoine 5-sostituite caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta in presenza di un microorganismo trasformato con il plasmide pSM651 CBS 203.94 capace di esprimere ad alti livelli ed in assenza di induttori un sistema enzimatico in grado di convertire dette idantoine nei corrispondenti D-o-amminoacidi .
- 2. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta in presenza del sistema enzimatico isolato da un microorganismo trasformato con il plasmide pSM651 CBS 203.94.
- 3. Il procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che, detto sistema enzimatico è immobilizzato su un supporto insolubile.
- 4. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, i microorganismi sono scelti dal gruppo di Bacillus subtilis ed Escherlchia coli.
- 5. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, l'idantoina 5-sostituita è scelta tra D,L-5-fenilidantoina, D,L-5-para-idrossifenilidantoina, D,L-5-metilidantoina, D,L-5-isopropilidantoina, D,L-5-tienilidantoina, D,L-5-parametossifenilidantoina, D,L-5-para-clorofeni 1-idantoina, D,L-5-benzilidantoina.
- 6. Il procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che, l'idantoina è D,L-5-para- idrossifenilidantoina.
- 7. Il procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che, l'idantoina è D,L-5-feni lidantoina
- 8. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta ad una temperatura compresa tra 20°e 60°C.
- 9. Il procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che, la temperatura è compresa tra 30°e 45°C.
- 10. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta ad un pH compreso tra 6,0 e 10.
- 11. Il procedimento secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che il pH è compreso tra 7,0 e 8,5.
- 12. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta impiegando un rapporto ponderale biomassa/idantoine compreso tra 1/1 e 1/50.
- 13. Plasmide pSM651 depositato presso il Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn (Olanda) dove ha ricevuto il numero di deposito CBS 203.94.
- 14. Un microorganismo scelto tra Bacillus subtilis ed Escherichia coli trasformato con il plasmide pSM651.
- 15. Il microorganismo secondo la rivendicazione 10, che è Escherichia coli SMC305 CBS 203.94.
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Effective date: 19970415 |