JPH0851992A - Ｄ−α−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
Ｄ−α−アミノ酸の製造方法Info
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- JPH0851992A JPH0851992A JP7115213A JP11521395A JPH0851992A JP H0851992 A JPH0851992 A JP H0851992A JP 7115213 A JP7115213 A JP 7115213A JP 11521395 A JP11521395 A JP 11521395A JP H0851992 A JPH0851992 A JP H0851992A
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/009—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving hydantoins or carbamoylamino compounds
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体特
異的転化によるＤ−α−アミノ酸の製造方法であって、
該転化反応を、該ヒダントインを対応するＤ−α−アミ
ノ酸に転化できる酵素系を、高収率で、誘導物質なしに
発現できるプラスミドで形質転換した微生物の存在下で
行なう方法および該酵素系をコード化する遺伝子を含む
プラスミドおよび該プラスミドで形質転換したエセリヒ
ア コリまたはバシルス ズブチルスから選択された微
生物。 【効果】上記により得られたＤ−α−アミノ酸は、薬理
学的に活性な物質、農薬および甘味料の製造に貴重な化
合物である。
異的転化によるＤ−α−アミノ酸の製造方法であって、
該転化反応を、該ヒダントインを対応するＤ−α−アミ
ノ酸に転化できる酵素系を、高収率で、誘導物質なしに
発現できるプラスミドで形質転換した微生物の存在下で
行なう方法および該酵素系をコード化する遺伝子を含む
プラスミドおよび該プラスミドで形質転換したエセリヒ
ア コリまたはバシルス ズブチルスから選択された微
生物。 【効果】上記により得られたＤ−α−アミノ酸は、薬理
学的に活性な物質、農薬および甘味料の製造に貴重な化
合物である。
Description
【０００１】本発明は、５−置換ヒダントインを対応す
るＤ−α−アミノ酸に直接転化できる酵素系を高収率
で、誘導物質なしに発現できるプラスミドで形質転換し
た微生物を使用し、５−置換ヒダントインのラセミ混合
物を立体特異的に転化することによる、Ｄ−α−アミノ
酸の製造方法に関する。用語「酵素系」とは、Ｄ−ヒダ
ントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ酵素からな
る系を意味する。Ｄ−α−アミノ酸は、薬理学的に活性
な物質（例えばＤ−フェニルグリシンおよびＤ−パラヒ
ドロキシフェニルグリシンはペニシリンおよびセファロ
スポリンの合成に使用される）、農薬（殺虫剤フルバニ
レート合成用のＤ−バリン）または甘味料（Ｄ−アラニ
ン）の製造に極めて貴重な化合物である。この分野で
は、対応する５−置換ヒダントインの化学的および／ま
たは酵素加水分解によるＤ−α−アミノ酸の製造は公知
である。例えば、特許ＦＲ２，３１０，９８６は、５−
置換ヒダントインを化学的に加水分解してＤ，Ｌアミノ
酸のラセミ混合物を形成し、続いてこれを分離処理して
目的の異性体を得る方法を記載している。これに対し
て、特許ＦＲ２，３１７，３５７は、５−置換ヒダント
インのラセミ混合物を酵素により加水分解し、続いて、
この変換生成物（Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸）
を対応するＤ−α−アミノ酸に化学的に酸化する方法を
記載している。これらの方法に関連する問題点は、Ｄ−
α−アミノ酸の分離および精製に複雑な操作が必要にな
ることである。その結果、これらの方法は工業的な観点
から経済的に重要ではない。
るＤ−α−アミノ酸に直接転化できる酵素系を高収率
で、誘導物質なしに発現できるプラスミドで形質転換し
た微生物を使用し、５−置換ヒダントインのラセミ混合
物を立体特異的に転化することによる、Ｄ−α−アミノ
酸の製造方法に関する。用語「酵素系」とは、Ｄ−ヒダ
ントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ酵素からな
る系を意味する。Ｄ−α−アミノ酸は、薬理学的に活性
な物質（例えばＤ−フェニルグリシンおよびＤ−パラヒ
ドロキシフェニルグリシンはペニシリンおよびセファロ
スポリンの合成に使用される）、農薬（殺虫剤フルバニ
レート合成用のＤ−バリン）または甘味料（Ｄ−アラニ
ン）の製造に極めて貴重な化合物である。この分野で
は、対応する５−置換ヒダントインの化学的および／ま
たは酵素加水分解によるＤ−α−アミノ酸の製造は公知
である。例えば、特許ＦＲ２，３１０，９８６は、５−
置換ヒダントインを化学的に加水分解してＤ，Ｌアミノ
酸のラセミ混合物を形成し、続いてこれを分離処理して
目的の異性体を得る方法を記載している。これに対し
て、特許ＦＲ２，３１７，３５７は、５−置換ヒダント
インのラセミ混合物を酵素により加水分解し、続いて、
この変換生成物（Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸）
を対応するＤ−α−アミノ酸に化学的に酸化する方法を
記載している。これらの方法に関連する問題点は、Ｄ−
α−アミノ酸の分離および精製に複雑な操作が必要にな
ることである。その結果、これらの方法は工業的な観点
から経済的に重要ではない。
【０００２】この分野では、Pseudomonas 、Moraxella
、Agrobacterium 、Hansenula 、Arthrobacter（ＥＰ
−１９９，９４３、ＥＰ−３０９，３１０、ＵＳ ４３
１２９４８、ＦＲ ２４５６７２８）の様な微生物から
製造した酵素系で５−置換ヒダントインを処理すること
により、これらの物質からＤ−α−アミノ酸を直接得る
方法が開示されている。しかし、これらの酵素系の製造
には、微生物にこれらの酵素の生産を刺激することがで
きる効果的な誘導物質を使用する必要がある。実際、酵
素Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ
の発現水準は実質的に非常に低いことが分かっている
（Syldatk ら、(1990), Advabces in Biochem. Enginee
ring/Biotechnology(Fiechter, A.Ed.), 41, 29-75
頁、Springer-Verlag, Berlin)。一般に使用される誘導
物質は、微生物により容易に代謝されるヒダントインの
誘導体または窒素化された環状化合物であるか、または
代謝されないウラシルまたはチオ−２−ウラシルまたは
チミンの様な化合物である（Meyer ら、(1993),Fems Mi
crobiol. Letters, 109 : 67-74)。誘導物質の使用は
一連の欠点を引き起こすが、とりわけ、製造原価が増加
し、酵素の生産収率が変動し易くなる（Syldatk ら、(1
987), Biotechnol. Lett., 9:25-30; Yokozekiら、(198
7) Agric. Biol. Chem., 51, 715-722)。最近、酵素Ｄ
−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼをコ
ード化する遺伝子が個別に配列され、クローニングされ
ている（ＵＳ ４，９１２，０４４およびＥＰ−５１５
６９８）。より詳しくは、特許ＵＳ４，９１２，０４４
は、発現が温度変化により誘発されるヒダントイナーゼ
遺伝子を含むハイブリッドベクターで形質転換した微生
物の発酵による、Ｄ−ヒダントイナーゼの製造を記載し
ている。こうして得られる酵素は、５−置換ヒダントイ
ンからＤ−Ｎ−カルバミルを製造するのに使用される。
、Agrobacterium 、Hansenula 、Arthrobacter（ＥＰ
−１９９，９４３、ＥＰ−３０９，３１０、ＵＳ ４３
１２９４８、ＦＲ ２４５６７２８）の様な微生物から
製造した酵素系で５−置換ヒダントインを処理すること
により、これらの物質からＤ−α−アミノ酸を直接得る
方法が開示されている。しかし、これらの酵素系の製造
には、微生物にこれらの酵素の生産を刺激することがで
きる効果的な誘導物質を使用する必要がある。実際、酵
素Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ
の発現水準は実質的に非常に低いことが分かっている
（Syldatk ら、(1990), Advabces in Biochem. Enginee
ring/Biotechnology(Fiechter, A.Ed.), 41, 29-75
頁、Springer-Verlag, Berlin)。一般に使用される誘導
物質は、微生物により容易に代謝されるヒダントインの
誘導体または窒素化された環状化合物であるか、または
代謝されないウラシルまたはチオ−２−ウラシルまたは
チミンの様な化合物である（Meyer ら、(1993),Fems Mi
crobiol. Letters, 109 : 67-74)。誘導物質の使用は
一連の欠点を引き起こすが、とりわけ、製造原価が増加
し、酵素の生産収率が変動し易くなる（Syldatk ら、(1
987), Biotechnol. Lett., 9:25-30; Yokozekiら、(198
7) Agric. Biol. Chem., 51, 715-722)。最近、酵素Ｄ
−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼをコ
ード化する遺伝子が個別に配列され、クローニングされ
ている（ＵＳ ４，９１２，０４４およびＥＰ−５１５
６９８）。より詳しくは、特許ＵＳ４，９１２，０４４
は、発現が温度変化により誘発されるヒダントイナーゼ
遺伝子を含むハイブリッドベクターで形質転換した微生
物の発酵による、Ｄ−ヒダントイナーゼの製造を記載し
ている。こうして得られる酵素は、５−置換ヒダントイ
ンからＤ−Ｎ−カルバミルを製造するのに使用される。
【０００３】一方、特許出願ＥＰ−５１５，６９８は、
発現がＩＰＴＧにより化学的に誘発されるカルバミラー
ゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換された微生物の発
酵によるＤ−Ｎ−カルバミラーゼの製造を記載してい
る。こうして得られた酵素は、Ｎ−カルバミルからＤ−
α−アミノ酸を製造するのに使用される。工業的な関心
はラセミ体ヒダントインをＤ−α−アミノ酸に転化する
ことに向けられており、二種類の酵素が異なった品種中
で発現されることは、両者を使用すること、したがって
二種類の異なった発酵工程から出発する製法を開発する
ことになる。これは明らかに製造原価を増加し、転化速
度を下げる。事実、酵素反応を完了させるには、ヒダン
トイナーゼを含む形質転換した微生物により生産された
Ｎ−カルバミル誘導体が、細菌の薄膜を通過し、反応媒
体中に分散し、次いで反対方向に進行し、他の品種中に
存在する第二の酵素（カルバミラーゼ）に到達しなけれ
ばならない。これはすべて、細菌膜のカルバミル誘導体
に対する透過性が低いこと（Olivieriら、(1981), Biot
echnol. Bioeng., 23, 2173-2183)、およびカルバミル
自体が反応媒体中で不可避的に希釈されることを考える
と、特に不利である。最後に、２倍量のバイオマスを使
用することは、最終生成物の収率および純度に好ましく
ない影響を及ぼす。その上、これらの酵素の発現を誘発
する必要性から、さらに別の問題が生じるために、これ
らの方法はほとんど実用性がない。
発現がＩＰＴＧにより化学的に誘発されるカルバミラー
ゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換された微生物の発
酵によるＤ−Ｎ−カルバミラーゼの製造を記載してい
る。こうして得られた酵素は、Ｎ−カルバミルからＤ−
α−アミノ酸を製造するのに使用される。工業的な関心
はラセミ体ヒダントインをＤ−α−アミノ酸に転化する
ことに向けられており、二種類の酵素が異なった品種中
で発現されることは、両者を使用すること、したがって
二種類の異なった発酵工程から出発する製法を開発する
ことになる。これは明らかに製造原価を増加し、転化速
度を下げる。事実、酵素反応を完了させるには、ヒダン
トイナーゼを含む形質転換した微生物により生産された
Ｎ−カルバミル誘導体が、細菌の薄膜を通過し、反応媒
体中に分散し、次いで反対方向に進行し、他の品種中に
存在する第二の酵素（カルバミラーゼ）に到達しなけれ
ばならない。これはすべて、細菌膜のカルバミル誘導体
に対する透過性が低いこと（Olivieriら、(1981), Biot
echnol. Bioeng., 23, 2173-2183)、およびカルバミル
自体が反応媒体中で不可避的に希釈されることを考える
と、特に不利である。最後に、２倍量のバイオマスを使
用することは、最終生成物の収率および純度に好ましく
ない影響を及ぼす。その上、これらの酵素の発現を誘発
する必要性から、さらに別の問題が生じるために、これ
らの方法はほとんど実用性がない。
【０００４】本発明の目的は、上記先行技術の欠点を解
決することである。特にここで、本発明により、適切な
合成プロモーターで制御されるＤ−ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミラーゼの遺伝子を含む特殊なプラスミ
ドを使用することにより、誘導物質なしに、これらの酵
素の効率の高い発現を達成できることが分かった。した
がって、内部に２種類の酵素活性を含む該プラスミドで
形質転換した単一の微生物を製造することができる。こ
の解決法は、基質の濃度が優れた同じ細胞内で２種類の
反応が起きるので、透過性が限られているための速度に
関連する問題だけではなく、誘導物質の必要性、および
生成物および廃棄物の処理に関連する問題も解決する。
そこで、本発明は第一に、５−置換ヒダントインのラセ
ミ混合物の立体特異的転化によるＤ−α−アミノ酸の製
造方法であって、転化反応を、該ヒダントインを対応す
るＤ−α−アミノ酸に転化できる酵素系を高収率で誘導
物質なしに発現できるプラスミドで形質転換した微生物
の存在下で行なうことを特徴とする方法に関する。本発
明の別の目的は、この酵素系をコード化する遺伝子を含
むプラスミドｐＳＭ６５１である。本発明のさらに別の
目的は、５−置換ヒダントインのラセミ混合物を対応す
るＤ−α−アミノ酸に立体特異的に転化できる酵素系
を、高収率で、誘導物質なしに発現することができるプ
ラスミドｐＳＭ６５１で形質転換した微生物である。本
発明の別の目的は、該微生物または該微生物から分離し
た酵素系の、５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立
体特異的転化によるＤ−α−アミノ酸製造における使用
に関する。本発明の他の目的は、下記の説明および実施
例から明らかである。
決することである。特にここで、本発明により、適切な
合成プロモーターで制御されるＤ−ヒダントイナーゼお
よびＮ−カルバミラーゼの遺伝子を含む特殊なプラスミ
ドを使用することにより、誘導物質なしに、これらの酵
素の効率の高い発現を達成できることが分かった。した
がって、内部に２種類の酵素活性を含む該プラスミドで
形質転換した単一の微生物を製造することができる。こ
の解決法は、基質の濃度が優れた同じ細胞内で２種類の
反応が起きるので、透過性が限られているための速度に
関連する問題だけではなく、誘導物質の必要性、および
生成物および廃棄物の処理に関連する問題も解決する。
そこで、本発明は第一に、５−置換ヒダントインのラセ
ミ混合物の立体特異的転化によるＤ−α−アミノ酸の製
造方法であって、転化反応を、該ヒダントインを対応す
るＤ−α−アミノ酸に転化できる酵素系を高収率で誘導
物質なしに発現できるプラスミドで形質転換した微生物
の存在下で行なうことを特徴とする方法に関する。本発
明の別の目的は、この酵素系をコード化する遺伝子を含
むプラスミドｐＳＭ６５１である。本発明のさらに別の
目的は、５−置換ヒダントインのラセミ混合物を対応す
るＤ−α−アミノ酸に立体特異的に転化できる酵素系
を、高収率で、誘導物質なしに発現することができるプ
ラスミドｐＳＭ６５１で形質転換した微生物である。本
発明の別の目的は、該微生物または該微生物から分離し
た酵素系の、５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立
体特異的転化によるＤ−α−アミノ酸製造における使用
に関する。本発明の他の目的は、下記の説明および実施
例から明らかである。
【０００５】Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カル
バミラーゼ酵素をコード化する遺伝子は、Pseudomonas
、Hansenula 、Agrobacterium 、Aerobacter、Aeromon
as 、Bacillus、Molaxella 、Brevibacterium、Flavoba
cterium、Serratia、Micrococcus 、Arthrobacterまた
はParacoccusの様な微生物から分離することができる。
これら微生物の具体例は、Bacillus macroides ATCC 12
905 、Aerobacter cloacae IAM 1221 、Agrobacterium
sp. IP I-671 、Agrobacterium radiobacter NRRLB 1
1291、Pseudomonas sp. FERM BP 1900 である。Ｄ−ヒ
ダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ酵素をコ
ード化する遺伝子の分離は、遺伝子ライブラリーの構
築、微生物のゲノムの表示、該酵素をコード化する遺伝
子を含むクローンの識別、遺伝子配列の解析、該遺伝子
のベクターへの挿入およびそれらの発現のコントロール
により行なうことができる。遺伝子ライブラリーまたは
ゲノムバンクの用語は、バンクを形成すべき供与微生物
に由来する染色体ＤＮＡの断片をそれぞれが有する、特
定の宿主微生物のクローンの組合せを意味する。バンク
は、各クローンに含まれる個別断片の組合せが供与体生
物の染色体ＤＮＡの大部分を形成する場合の代表として
定義される。本発明の方法の好ましい実施態様では、Ｄ
−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼをコ
ード化する遺伝子を分離するための供与体生物として、
A.radiobacter NRRL B-11291 株を使用する。
バミラーゼ酵素をコード化する遺伝子は、Pseudomonas
、Hansenula 、Agrobacterium 、Aerobacter、Aeromon
as 、Bacillus、Molaxella 、Brevibacterium、Flavoba
cterium、Serratia、Micrococcus 、Arthrobacterまた
はParacoccusの様な微生物から分離することができる。
これら微生物の具体例は、Bacillus macroides ATCC 12
905 、Aerobacter cloacae IAM 1221 、Agrobacterium
sp. IP I-671 、Agrobacterium radiobacter NRRLB 1
1291、Pseudomonas sp. FERM BP 1900 である。Ｄ−ヒ
ダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ酵素をコ
ード化する遺伝子の分離は、遺伝子ライブラリーの構
築、微生物のゲノムの表示、該酵素をコード化する遺伝
子を含むクローンの識別、遺伝子配列の解析、該遺伝子
のベクターへの挿入およびそれらの発現のコントロール
により行なうことができる。遺伝子ライブラリーまたは
ゲノムバンクの用語は、バンクを形成すべき供与微生物
に由来する染色体ＤＮＡの断片をそれぞれが有する、特
定の宿主微生物のクローンの組合せを意味する。バンク
は、各クローンに含まれる個別断片の組合せが供与体生
物の染色体ＤＮＡの大部分を形成する場合の代表として
定義される。本発明の方法の好ましい実施態様では、Ｄ
−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼをコ
ード化する遺伝子を分離するための供与体生物として、
A.radiobacter NRRL B-11291 株を使用する。
【０００６】実際には、染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＳａｃＩで別々に消化することにより、該微
生物の２種類のゲノムバンクをE.coli中に構築する。２
種類の消化により得られる断片の中で、一般に３，００
０〜４，５００ bp の寸法を有する断片を精製する。選
別は、Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラ
ーゼ酵素の分子量をそれぞれ５０，０００および３４，
０００ダルトンと推定して行なう。次いで、ＢａｍＨＩ
およびＳａｃＩ断片の２つの集団をE.coliのベクター
に、単一の断片がベクターの各分子に縮合し易い条件下
で連結する。コンピテントにしたE.coliの細胞を形質転
換するのに、例えばDagert, M.およびEhrlich(1979),(G
ene, 6 :23)により示される様に、２種類のリガーゼ混
合物を使用する。こうして得られた、それぞれハイブリ
ッドプラスミドを有する、すなわちベクターの分子およ
びA.radiobacter の染色体ＤＮＡ断片からなる、コロニ
ー（ゲノムバンク）の２集団を選別し、ヒダントイナー
ゼおよびカルバミラーゼ遺伝子を含むクローンを識別す
る。識別は、直接発現により、または特殊なプローブを
使用して行なう。第二の方法を使用するのが好ましい。
プローブの選択には、カルバミラーゼの場合、Comonoma
s sp. 5222c(Ogawa ら、(1993), Eur. J. Biochem., 21
2: 685-691) によるカルバミラーゼのアミノ末端配列の
知識を参考にした。この配列に基づき、小さなオリゴヌ
クレオチドを合成し、これを、標識を付けた後、ハイブ
リダイゼーション技術(Maniatis ら、(1982), "Molecul
ar Cloning: a laboratory manual", Cold Springer Ha
rbor Laboratory)によりgenothecaのスクリーニングに
使用する。これによって、カルバミラーゼ全体に関して
コード化するヌクレオチド配列を含むＢａｍＨＩ断片を
有するハイブリッドプラスミドを有するクローンを識別
することができる。該プラスミドの分析により、さら
に、カルバミラーゼ遺伝子に対して他方の鎖上に配置さ
れた、第二の不完全ＯＲＦの存在が示されたが、これは
様々な微生物から分離されたウレアーゼ部分との同族性
を示している。
ＨＩおよびＳａｃＩで別々に消化することにより、該微
生物の２種類のゲノムバンクをE.coli中に構築する。２
種類の消化により得られる断片の中で、一般に３，００
０〜４，５００ bp の寸法を有する断片を精製する。選
別は、Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラ
ーゼ酵素の分子量をそれぞれ５０，０００および３４，
０００ダルトンと推定して行なう。次いで、ＢａｍＨＩ
およびＳａｃＩ断片の２つの集団をE.coliのベクター
に、単一の断片がベクターの各分子に縮合し易い条件下
で連結する。コンピテントにしたE.coliの細胞を形質転
換するのに、例えばDagert, M.およびEhrlich(1979),(G
ene, 6 :23)により示される様に、２種類のリガーゼ混
合物を使用する。こうして得られた、それぞれハイブリ
ッドプラスミドを有する、すなわちベクターの分子およ
びA.radiobacter の染色体ＤＮＡ断片からなる、コロニ
ー（ゲノムバンク）の２集団を選別し、ヒダントイナー
ゼおよびカルバミラーゼ遺伝子を含むクローンを識別す
る。識別は、直接発現により、または特殊なプローブを
使用して行なう。第二の方法を使用するのが好ましい。
プローブの選択には、カルバミラーゼの場合、Comonoma
s sp. 5222c(Ogawa ら、(1993), Eur. J. Biochem., 21
2: 685-691) によるカルバミラーゼのアミノ末端配列の
知識を参考にした。この配列に基づき、小さなオリゴヌ
クレオチドを合成し、これを、標識を付けた後、ハイブ
リダイゼーション技術(Maniatis ら、(1982), "Molecul
ar Cloning: a laboratory manual", Cold Springer Ha
rbor Laboratory)によりgenothecaのスクリーニングに
使用する。これによって、カルバミラーゼ全体に関して
コード化するヌクレオチド配列を含むＢａｍＨＩ断片を
有するハイブリッドプラスミドを有するクローンを識別
することができる。該プラスミドの分析により、さら
に、カルバミラーゼ遺伝子に対して他方の鎖上に配置さ
れた、第二の不完全ＯＲＦの存在が示されたが、これは
様々な微生物から分離されたウレアーゼ部分との同族性
を示している。
【０００７】ウレアーゼは、ヒダントイナーゼと同様
に、アミド−加水分解酵素の群に属する酵素であるの
で、不完全なＯＲＦはヒダントイナーゼのそれに対応す
ると仮定した。次いで、この仮定は、識別された遺伝子
を有する細胞の細胞抽出物に対して行なった酵素活性試
験により確認された。ヒダントイナーゼをコード化する
ヌクレオチド配列全体を分離するために、ＳａｃＩで消
化したA.radiobacter のＤＮＡの遺伝子ライブラリーの
スクリーニングを、不完全ＯＲＦのヌクレオチド配列を
基に合成したオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼ
ーションにより行なった。このスクリーニングにより、
ヒダントイナーゼ遺伝子全体を含むクローンが分離され
た。こうして得られた遺伝子を、United State Biochem
icalから販売されている配列版キット２．０を使用して
配列した。分離された遺伝子ベクターの両方を含むプラ
スミドを構築するために、この分野で公知のプラスミ
ド、コスミドおよびバクテリオファージから選択された
ベクターを使用することができる。E.coliおよびB.subt
ilisの２官能性プラスミドｐＳＭ６７１ ＣＢＳ ２０
５．９４を使用するのが好ましい。この、カナマイシン
およびクロラムフェニコールに対する耐性をコード化す
る遺伝子を含み、E.coliおよびB.subtilis中で使用でき
る複製起源を有するプラスミドは、高い効率で、誘導物
質なしに、その制御下におかれた遺伝子の発現を導くこ
とができる合成プロモーターを含む。実際には、Ｄ−ヒ
ダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ酵素をコ
ード化する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＳ
Ｍ６７１中に、ユニーク制限箇所ＥｃｏＲＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩでクローニングし、組替えｐＳＭ６５１を得
る。
に、アミド−加水分解酵素の群に属する酵素であるの
で、不完全なＯＲＦはヒダントイナーゼのそれに対応す
ると仮定した。次いで、この仮定は、識別された遺伝子
を有する細胞の細胞抽出物に対して行なった酵素活性試
験により確認された。ヒダントイナーゼをコード化する
ヌクレオチド配列全体を分離するために、ＳａｃＩで消
化したA.radiobacter のＤＮＡの遺伝子ライブラリーの
スクリーニングを、不完全ＯＲＦのヌクレオチド配列を
基に合成したオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼ
ーションにより行なった。このスクリーニングにより、
ヒダントイナーゼ遺伝子全体を含むクローンが分離され
た。こうして得られた遺伝子を、United State Biochem
icalから販売されている配列版キット２．０を使用して
配列した。分離された遺伝子ベクターの両方を含むプラ
スミドを構築するために、この分野で公知のプラスミ
ド、コスミドおよびバクテリオファージから選択された
ベクターを使用することができる。E.coliおよびB.subt
ilisの２官能性プラスミドｐＳＭ６７１ ＣＢＳ ２０
５．９４を使用するのが好ましい。この、カナマイシン
およびクロラムフェニコールに対する耐性をコード化す
る遺伝子を含み、E.coliおよびB.subtilis中で使用でき
る複製起源を有するプラスミドは、高い効率で、誘導物
質なしに、その制御下におかれた遺伝子の発現を導くこ
とができる合成プロモーターを含む。実際には、Ｄ−ヒ
ダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバミラーゼ酵素をコ
ード化する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＳ
Ｍ６７１中に、ユニーク制限箇所ＥｃｏＲＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩでクローニングし、組替えｐＳＭ６５１を得
る。
【０００８】構築は、組換えＤＮＡの分野で公知の一般
的な技術にしたがって操作することより実行できる。こ
れらの酵素がB.subtilisおよびE.coliから発現するか否
かを確認するために、該プラスミドで形質転換した細胞
を好適な培地中で培養する。細胞分解物から抽出し、ポ
リアクリルアミドゲル上で分析したタンパク質全体は、
２種類の酵素の分子量に対応する分子量を有する２種類
のタンパク質の存在を示しており、これらのタンパク質
はタンパク質全体の約１０％を占めていた。これらの結
果は、B.subtilisおよびE.coliの、該酵素を高い効率
で、誘導物質なしに発現する能力を立証している。本発
明の酵素系は、プラスミドpSM651で形質転換したE.coli
またはB.subtilisを、好気性条件下で、炭素および窒素
ならびに様々な陽イオン、陰イオンおよび所望により微
量のビタミン、例えばビオチン、チアミン、またはアミ
ノ酸の吸収可能な供給源を含む水性培地中で培養するこ
とにより得られる。吸収可能な炭素供給源には、グルコ
ースの様な炭水化物、加水分解アミド、糖蜜、スクロー
スまたは他の通常の炭素供給源がある。窒素供給源の例
は、例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムの様な鉱物アン
モニウム塩および尿素または有機または無機窒素を含む
物質、例えばペプトン、酵母抽出物または肉抽出物から
選択することができる。本発明の目的には、カリウム、
ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、リン酸
塩、硫酸塩、塩酸塩、マンガン、および硝酸塩の陽イオ
ンおよび陰イオンも同様に好適である。
的な技術にしたがって操作することより実行できる。こ
れらの酵素がB.subtilisおよびE.coliから発現するか否
かを確認するために、該プラスミドで形質転換した細胞
を好適な培地中で培養する。細胞分解物から抽出し、ポ
リアクリルアミドゲル上で分析したタンパク質全体は、
２種類の酵素の分子量に対応する分子量を有する２種類
のタンパク質の存在を示しており、これらのタンパク質
はタンパク質全体の約１０％を占めていた。これらの結
果は、B.subtilisおよびE.coliの、該酵素を高い効率
で、誘導物質なしに発現する能力を立証している。本発
明の酵素系は、プラスミドpSM651で形質転換したE.coli
またはB.subtilisを、好気性条件下で、炭素および窒素
ならびに様々な陽イオン、陰イオンおよび所望により微
量のビタミン、例えばビオチン、チアミン、またはアミ
ノ酸の吸収可能な供給源を含む水性培地中で培養するこ
とにより得られる。吸収可能な炭素供給源には、グルコ
ースの様な炭水化物、加水分解アミド、糖蜜、スクロー
スまたは他の通常の炭素供給源がある。窒素供給源の例
は、例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムの様な鉱物アン
モニウム塩および尿素または有機または無機窒素を含む
物質、例えばペプトン、酵母抽出物または肉抽出物から
選択することができる。本発明の目的には、カリウム、
ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、リン酸
塩、硫酸塩、塩酸塩、マンガン、および硝酸塩の陽イオ
ンおよび陰イオンも同様に好適である。
【０００９】発酵は、攪拌しながら、２５〜４０℃、好
ましくは３０〜３７℃の温度で、pH６〜７．５、好まし
くは６．５〜７．０で行なう。遠心分離または濾過の様
な通常の技術により培地から回収した細胞（バイオマ
ス）は、５−置換ヒダントインのラセミ混合物の転化工
程に使用する。あるいは、転化反応は、超音波処理また
はフレンチプレスにより細胞を粉砕して得た細胞抽出
物、または通常の方法で精製した、または部分的に精製
した酵素または不溶性の支持体上に固定した酵素を使用
して行なうことができる。本発明の製法には、５位置で
置換された多くのヒダントインを使用することができ
る。５位置の置換基は、１〜６個の炭素原子を含む直鎖
または分枝鎖アルキル基から選択できるが、これらの基
は、ヒドロキシ、カルボキシ、ヒドロスルフィドまたは
アミノ基またはフェニルまたはベンジル基で一または多
置換されていてよく、これらの基はさらにオルト、メタ
およびパラ位置に１個以上の置換基を含むことができ
る。５−置換ヒダントインの例は、Ｄ，Ｌ−５−フェニ
ルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−ヒドロキシフェニ
ルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−メチルヒダントイン、
Ｄ，Ｌ−５−イソプロピルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−
チエニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−メトキシフ
ェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−クロロフェニ
ルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−ベンジルヒダントインで
ある。
ましくは３０〜３７℃の温度で、pH６〜７．５、好まし
くは６．５〜７．０で行なう。遠心分離または濾過の様
な通常の技術により培地から回収した細胞（バイオマ
ス）は、５−置換ヒダントインのラセミ混合物の転化工
程に使用する。あるいは、転化反応は、超音波処理また
はフレンチプレスにより細胞を粉砕して得た細胞抽出
物、または通常の方法で精製した、または部分的に精製
した酵素または不溶性の支持体上に固定した酵素を使用
して行なうことができる。本発明の製法には、５位置で
置換された多くのヒダントインを使用することができ
る。５位置の置換基は、１〜６個の炭素原子を含む直鎖
または分枝鎖アルキル基から選択できるが、これらの基
は、ヒドロキシ、カルボキシ、ヒドロスルフィドまたは
アミノ基またはフェニルまたはベンジル基で一または多
置換されていてよく、これらの基はさらにオルト、メタ
およびパラ位置に１個以上の置換基を含むことができ
る。５−置換ヒダントインの例は、Ｄ，Ｌ−５−フェニ
ルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−ヒドロキシフェニ
ルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−メチルヒダントイン、
Ｄ，Ｌ−５−イソプロピルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−
チエニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−メトキシフ
ェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−クロロフェニ
ルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−ベンジルヒダントインで
ある。
【００１０】ヒダントインの、対応するＤ−α−アミノ
酸への転化は、気密装置を使用し、窒素雰囲気中、２０
〜６０℃、好ましくは３０〜４５℃で行なう。反応媒体
のpHは６〜１０、好ましくは７〜８．５に維持する。こ
のpH調節は、例えばアンモニア、水酸化カリウム、水酸
化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムの水
溶液の様な塩基水溶液を加えることにより実行できる。
ヒダントインの初期濃度は一般に２〜３０重量％であ
る。本発明の菌株から生産される酵素の立体特異性によ
り、ヒダントインのＤ−鏡像体だけが加水分解される。
しかし、ヒダントインは操作条件下で自然に、多かれ少
なかれ急速にラセミ化するので、Ｌ−鏡像体は対応する
Ｄ−α−アミノ酸に完全に転化される。反応媒体に加え
るバイオマスの量は、酵素に対する基質の特定の親和力
により異なる。一般にバイオマス／ヒダントインの重量
比１／１〜１／５０を使用できる。転化反応を最適条件
下で行なう場合、９５〜９８％の収率が得られる。本発
明の方法で製造されるＤ−α−アミノ酸は、通常の方
法、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはその等
電点におけるアミノ酸の沈殿、により反応媒体から回収
することができる。プラスミドｐＳＭ６５１は、Bureau
Voor Schimmelcultures, SK Baarn （オランダ）に、
E.coli ＳＭＣ３０５として寄託してあり、寄託番号CB
S 203.94を受けている。
酸への転化は、気密装置を使用し、窒素雰囲気中、２０
〜６０℃、好ましくは３０〜４５℃で行なう。反応媒体
のpHは６〜１０、好ましくは７〜８．５に維持する。こ
のpH調節は、例えばアンモニア、水酸化カリウム、水酸
化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムの水
溶液の様な塩基水溶液を加えることにより実行できる。
ヒダントインの初期濃度は一般に２〜３０重量％であ
る。本発明の菌株から生産される酵素の立体特異性によ
り、ヒダントインのＤ−鏡像体だけが加水分解される。
しかし、ヒダントインは操作条件下で自然に、多かれ少
なかれ急速にラセミ化するので、Ｌ−鏡像体は対応する
Ｄ−α−アミノ酸に完全に転化される。反応媒体に加え
るバイオマスの量は、酵素に対する基質の特定の親和力
により異なる。一般にバイオマス／ヒダントインの重量
比１／１〜１／５０を使用できる。転化反応を最適条件
下で行なう場合、９５〜９８％の収率が得られる。本発
明の方法で製造されるＤ−α−アミノ酸は、通常の方
法、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはその等
電点におけるアミノ酸の沈殿、により反応媒体から回収
することができる。プラスミドｐＳＭ６５１は、Bureau
Voor Schimmelcultures, SK Baarn （オランダ）に、
E.coli ＳＭＣ３０５として寄託してあり、寄託番号CB
S 203.94を受けている。
【００１１】下記の実施例により本発明を詳細に説明す
るが、本発明を限定するものではない。 実施例１A.radiobacter からの染色体ＤＮＡの抽出 １％グルコース、０．３％酵母抽出物、１．３６％ＫＨ
2 ＰＯ4 および０．０２％ＭｇＳＯ4 ．７Ｈ2 Ｏ（pH
７．０）の組成を有する発酵培地１００mlに菌株A.radi
obacter (NRRLB 11291) を接種し、攪拌（２２０ rpm）
しながら３０℃に２４時間保持した。次いで、培地ブロ
スをSS34ローターモデルSorvall RC-5B 中で遠心分離
（４℃、５０００ rpmで１０分間）して細胞を回収し、
１ mM ＥＤＴＡ、１０ mM Tris−ＨＣｌ、pH７．４を含
む溶液（ＴＥ）で洗浄した（２ｘ１２０ml）。得られた
懸濁液を再度上記の様に遠心分離し、細胞を回収し、Ｔ
Ｅ溶液９．５ml中に再分散させた。１０％ＳＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）０．５mlおよびプロテイナーゼＫ
（２０mg/ml ）の溶液５０μl を加えた後、懸濁液を３
７℃で１時間培養した。続いてＮａＣｌ ５Ｍ １．８
mlおよび０．７Ｍ ＮａＣｌ中１０％ヘキサデシルトリ
メチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）の溶液１．５
mlを加え、得られた溶液を６５℃で２０分間培養した。
次いで、この溶液を等体積のクロロホルム／イソアミル
アルコール（２４／１、v/v ）で脱タンパク質化し、Ｄ
ＮＡを０．６体積のイソプロパノールで沈殿させた。Ｄ
ＮＡをエタノール（７０％）１mlで洗浄し、ガラス棒で
回収した。回収したＤＮＡを最後にＴＥ ４ml中に溶解
させ、その濃度を分光計で２６０nmで測定した。染色体
ＤＮＡを臭化エチジウム０．１mg/ml を含むＣｓＣｌ
（１％）の勾配上で遠心分離（Beckman rotor V65Ti 中
５５，０００ rpmで１６時間）して精製した。ＤＮＡ帯
をＵＶ光で目に見える様にし、Ｈ2 Ｏ中に飽和させたブ
タノールで抽出することにより、臭化エチジウムを除去
した。ＴＥ緩衝液に対して透析した後、ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、所望の体積で再分散させた。
るが、本発明を限定するものではない。 実施例１A.radiobacter からの染色体ＤＮＡの抽出 １％グルコース、０．３％酵母抽出物、１．３６％ＫＨ
2 ＰＯ4 および０．０２％ＭｇＳＯ4 ．７Ｈ2 Ｏ（pH
７．０）の組成を有する発酵培地１００mlに菌株A.radi
obacter (NRRLB 11291) を接種し、攪拌（２２０ rpm）
しながら３０℃に２４時間保持した。次いで、培地ブロ
スをSS34ローターモデルSorvall RC-5B 中で遠心分離
（４℃、５０００ rpmで１０分間）して細胞を回収し、
１ mM ＥＤＴＡ、１０ mM Tris−ＨＣｌ、pH７．４を含
む溶液（ＴＥ）で洗浄した（２ｘ１２０ml）。得られた
懸濁液を再度上記の様に遠心分離し、細胞を回収し、Ｔ
Ｅ溶液９．５ml中に再分散させた。１０％ＳＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）０．５mlおよびプロテイナーゼＫ
（２０mg/ml ）の溶液５０μl を加えた後、懸濁液を３
７℃で１時間培養した。続いてＮａＣｌ ５Ｍ １．８
mlおよび０．７Ｍ ＮａＣｌ中１０％ヘキサデシルトリ
メチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）の溶液１．５
mlを加え、得られた溶液を６５℃で２０分間培養した。
次いで、この溶液を等体積のクロロホルム／イソアミル
アルコール（２４／１、v/v ）で脱タンパク質化し、Ｄ
ＮＡを０．６体積のイソプロパノールで沈殿させた。Ｄ
ＮＡをエタノール（７０％）１mlで洗浄し、ガラス棒で
回収した。回収したＤＮＡを最後にＴＥ ４ml中に溶解
させ、その濃度を分光計で２６０nmで測定した。染色体
ＤＮＡを臭化エチジウム０．１mg/ml を含むＣｓＣｌ
（１％）の勾配上で遠心分離（Beckman rotor V65Ti 中
５５，０００ rpmで１６時間）して精製した。ＤＮＡ帯
をＵＶ光で目に見える様にし、Ｈ2 Ｏ中に飽和させたブ
タノールで抽出することにより、臭化エチジウムを除去
した。ＴＥ緩衝液に対して透析した後、ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、所望の体積で再分散させた。
【００１２】実施例２A.radiobacter のゲノムバンクの構築 こうして得られたＤＮＡのアリコート（１０μg ）を、
各２５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩ(Boehringer)で、製造業者
の指示に従って、個別に消化した。酵素反応を６５℃で
１０分間ブロックした後、反応混合物を寒天ゲル上に
０．８％載せ、次いで、１００ボルトで２時間移動させ
た。ＥｔＢｒ（０．５ gamma/ml ）で着色して目に見え
る様にしたＤＮＡ帯をナイロンフィルター(Boehringer)
上に移し、ＮａＯＨで分解した後、サザーンブロット法
(Maniatis ら、"Molecular Cloning: a practical labo
ratory manual", Cold Spring Harbor, New York, 198
2) により固定した。このフィルターを、４５℃で、Com
amonas sp. E222c(Ogawa ら、(1993), Eur.J. Bioche
m., 212 :685-691) のカルバミラーゼのアミノ末端に基
づいて表現された、配列 を有する退化オリゴヌクレオチドのそれぞれでハイブリ
ッド化した。これらのオリゴヌクレオチドをBeckmannの
自動System OLIGO 1000 システムを使用して合成し、次
いでキットDIG SYSTEM(Boehrunger)を使用して５' 末端
で標識を付けた。プローブ２によるハイブリッド化反応
は陽性信号を与えた。特に、ＢａｍＨＩで消化したＤＮ
Ａは、プローブをハイブリッド化できる約４０００ bp
の断片を生じた。こうして識別されたＢａｍＨＩ断片を
分離するために、１０μg の染色体ＤＮＡを５０μl の
緩衝液１０mM Tris-ＨＣｌ pH８、１００mM ＮａＣ
ｌ、５mMＭｇＣｌ2 、１mM２−メルカプトエタノール中
に懸濁させ、２５Ｕの酵素ＢａｍＨＩの存在下、３７℃
で４〜５時間培養した。次いで消化混合物を寒天ゲル
上、０．８％で電気泳動にかけ、ＥｔＢｒで着色した
後、３，５００〜４，５００ bp のＤＮＡ断片を電気泳
動緩衝液中で電気溶離させた(Maniatis ら、"Molecular
Cloning: a practical laboratory manual", Cold Spr
ing Harbor, New York, 1982) 。次いでプラスミドｐＵ
Ｃ１８（ＢＲＬ）中の染色体ＤＮＡ断片をクローニング
した。実際には、制限酵素ＢａｍＨＩで前もって直線化
したこのプラスミド２０ngを、染色体ＤＮＡ断片１００
ngで、６６mM Tris-ＨＣｌ pH７．６、１mM ＡＴＰ、
１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）を含む混合物２０μl 中で、１ＵのＴ４ ｗ１５
リガーゼの存在下、１６℃で一晩連結した。５０mM Ｃ
ａＣ2 で競合化したE.coli JM101(BRL) の細胞を形質転
換するためにリガーゼ混合物を使用した(Dagert, M. お
よびEhrlich(1979), Gene, 6 :23)。続いて形質転換物
を、４０μg のＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）およ
び１００μg のアンピシリンを加えたＬＢ媒体（８ g/l
Bactotruptone(DIFCO),５ g/l ＮａＣｌ，１５ g/l寒
天(DIFCO),０．５ g/l酵母抽出物）のプレート上で選別
した。上記と同様に操作し、多くの陽性組換え型コロニ
ー（白色）が得られたが、これらは非組換え型（青色）
と容易に見分けられる。陽性クローンをナイロンフィル
ター(Boehringer)上に移し、これらのクローンから抽出
したＤＮＡを、同じ条件下で、染色体ＤＮＡによるハイ
ブリッド化に陽性反応したプローブ２を使用してハイブ
リッド化した。陽性信号を与えたクローンから抽出した
プラスミドを、Sequenase 版２．０キット(United Stat
es Biochemical) を使用して配列させた。これらのプラ
スミドの、完全なカルバミラーゼ遺伝子（９１５ bp ）
を含むものはｐＳＭ６５２と呼ばれている。図４および
５は、カルバミラーゼのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す。
各２５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩ(Boehringer)で、製造業者
の指示に従って、個別に消化した。酵素反応を６５℃で
１０分間ブロックした後、反応混合物を寒天ゲル上に
０．８％載せ、次いで、１００ボルトで２時間移動させ
た。ＥｔＢｒ（０．５ gamma/ml ）で着色して目に見え
る様にしたＤＮＡ帯をナイロンフィルター(Boehringer)
上に移し、ＮａＯＨで分解した後、サザーンブロット法
(Maniatis ら、"Molecular Cloning: a practical labo
ratory manual", Cold Spring Harbor, New York, 198
2) により固定した。このフィルターを、４５℃で、Com
amonas sp. E222c(Ogawa ら、(1993), Eur.J. Bioche
m., 212 :685-691) のカルバミラーゼのアミノ末端に基
づいて表現された、配列 を有する退化オリゴヌクレオチドのそれぞれでハイブリ
ッド化した。これらのオリゴヌクレオチドをBeckmannの
自動System OLIGO 1000 システムを使用して合成し、次
いでキットDIG SYSTEM(Boehrunger)を使用して５' 末端
で標識を付けた。プローブ２によるハイブリッド化反応
は陽性信号を与えた。特に、ＢａｍＨＩで消化したＤＮ
Ａは、プローブをハイブリッド化できる約４０００ bp
の断片を生じた。こうして識別されたＢａｍＨＩ断片を
分離するために、１０μg の染色体ＤＮＡを５０μl の
緩衝液１０mM Tris-ＨＣｌ pH８、１００mM ＮａＣ
ｌ、５mMＭｇＣｌ2 、１mM２−メルカプトエタノール中
に懸濁させ、２５Ｕの酵素ＢａｍＨＩの存在下、３７℃
で４〜５時間培養した。次いで消化混合物を寒天ゲル
上、０．８％で電気泳動にかけ、ＥｔＢｒで着色した
後、３，５００〜４，５００ bp のＤＮＡ断片を電気泳
動緩衝液中で電気溶離させた(Maniatis ら、"Molecular
Cloning: a practical laboratory manual", Cold Spr
ing Harbor, New York, 1982) 。次いでプラスミドｐＵ
Ｃ１８（ＢＲＬ）中の染色体ＤＮＡ断片をクローニング
した。実際には、制限酵素ＢａｍＨＩで前もって直線化
したこのプラスミド２０ngを、染色体ＤＮＡ断片１００
ngで、６６mM Tris-ＨＣｌ pH７．６、１mM ＡＴＰ、
１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）を含む混合物２０μl 中で、１ＵのＴ４ ｗ１５
リガーゼの存在下、１６℃で一晩連結した。５０mM Ｃ
ａＣ2 で競合化したE.coli JM101(BRL) の細胞を形質転
換するためにリガーゼ混合物を使用した(Dagert, M. お
よびEhrlich(1979), Gene, 6 :23)。続いて形質転換物
を、４０μg のＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）およ
び１００μg のアンピシリンを加えたＬＢ媒体（８ g/l
Bactotruptone(DIFCO),５ g/l ＮａＣｌ，１５ g/l寒
天(DIFCO),０．５ g/l酵母抽出物）のプレート上で選別
した。上記と同様に操作し、多くの陽性組換え型コロニ
ー（白色）が得られたが、これらは非組換え型（青色）
と容易に見分けられる。陽性クローンをナイロンフィル
ター(Boehringer)上に移し、これらのクローンから抽出
したＤＮＡを、同じ条件下で、染色体ＤＮＡによるハイ
ブリッド化に陽性反応したプローブ２を使用してハイブ
リッド化した。陽性信号を与えたクローンから抽出した
プラスミドを、Sequenase 版２．０キット(United Stat
es Biochemical) を使用して配列させた。これらのプラ
スミドの、完全なカルバミラーゼ遺伝子（９１５ bp ）
を含むものはｐＳＭ６５２と呼ばれている。図４および
５は、カルバミラーゼのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す。
【００１３】実施例３A.radiobacter のヒダントイナーゼ遺伝子の分離 プラスミドｐＳＭ６５２の分析により、カルバミラーゼ
遺伝子に対して別の鎖上に位置する、様々な微生物から
分離されたウレアーゼとの同族性を示す第二の不完全Ｏ
ＲＦの存在が分かった。ウレアーゼは、ヒダントイナー
ゼと同様に、アミド加水分解酵素の群に属する酵素なの
で、不完全ＯＲＦはヒダントイナーゼのそれに対応する
と仮定した。この仮定は、識別された遺伝子を有する細
胞の細胞抽出物に行なった酵素活性試験により確認され
た。ヒダントイナーゼをコード化するヌクレオチド配列
全体を分離するために、カルバミラーゼを分離するのに
使用した同じサザーンブロットを、プローブとして 配列 5' ATC GTA ACC GCG GAC GGG ATT TCT CCC 3' を有するオリゴヌクレオチドを使用してハイブリダイゼ
ーション化した。識別された部分ＯＲＦのヌクレオチド
配列の５' 末端領域と一致する、このオリゴヌクレオチ
ドを合成し、実施例２に示す様に標識を付けた。このプ
ローブに対する陽性の帯の中で、酵素ＳａｃＩによるＤ
ＮＡの消化から得た、約３５００bp の帯が識別され
た。次いで、実施例２に示す様に操作して、ＳａｃＩで
消化したA.radiobacter の染色体ＤＮＡのゲノムバンク
を構築した。このバンクをスクリーニングすることによ
り、ヒダントイナーゼ用の遺伝子全体を含むプラスミド
ｐＳＭ６５３が分離されたが、そのヌクレオチドおよび
アミノ酸配列を図５に示す。
遺伝子に対して別の鎖上に位置する、様々な微生物から
分離されたウレアーゼとの同族性を示す第二の不完全Ｏ
ＲＦの存在が分かった。ウレアーゼは、ヒダントイナー
ゼと同様に、アミド加水分解酵素の群に属する酵素なの
で、不完全ＯＲＦはヒダントイナーゼのそれに対応する
と仮定した。この仮定は、識別された遺伝子を有する細
胞の細胞抽出物に行なった酵素活性試験により確認され
た。ヒダントイナーゼをコード化するヌクレオチド配列
全体を分離するために、カルバミラーゼを分離するのに
使用した同じサザーンブロットを、プローブとして 配列 5' ATC GTA ACC GCG GAC GGG ATT TCT CCC 3' を有するオリゴヌクレオチドを使用してハイブリダイゼ
ーション化した。識別された部分ＯＲＦのヌクレオチド
配列の５' 末端領域と一致する、このオリゴヌクレオチ
ドを合成し、実施例２に示す様に標識を付けた。このプ
ローブに対する陽性の帯の中で、酵素ＳａｃＩによるＤ
ＮＡの消化から得た、約３５００bp の帯が識別され
た。次いで、実施例２に示す様に操作して、ＳａｃＩで
消化したA.radiobacter の染色体ＤＮＡのゲノムバンク
を構築した。このバンクをスクリーニングすることによ
り、ヒダントイナーゼ用の遺伝子全体を含むプラスミド
ｐＳＭ６５３が分離されたが、そのヌクレオチドおよび
アミノ酸配列を図５に示す。
【００１４】実施例４カルバミラーゼ遺伝子のクローニング １）カルバミラーゼ遺伝子の増幅 プラスミドｐＳＭ６５２を、Leung ら(Leung D.W., Che
n E., Goeddel D.V.,Techniqie -a journal of methods
in cell and molecular biology, 1 , No.1(1989):11
-15)による指示に従って、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により、オリゴヌクレオチドの対 を使用して増幅した。オリゴヌクレオチド（２）は、３
' 末端に近いカルバミラーゼ遺伝子の内部に存在する制
限箇所ＥｃｏＲＩをも除去した。増幅は、DNA Thermal
Cycler 480装置(Perkin-Elmer Cetus)で、１０mM Tris-
ＨＣｌ pH８．３、１．５mMＭｇＣｌ2 、５０mMＫＣ
ｌ、０．０１％（重量／体積）ゼラチン、１ngｐＳＭ６
５２、１ μM の２つのプライマー、２００μＭのｄＮ
ＴＰ、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ(Perkin Elmer)
を含む反応混合物を使用して行なった。鉱油１滴を加
え、この混合物を９４℃で４分間変性させ、 ９４℃で１分間（変性） ５５℃で１分間（アニーリング） ７２℃で１分間（伸長） を合計３０サイクル、続いて７２℃で８分間（最終拡
張）からなるサイクルプログラムを開始した。こうして
得られた増幅生成物をフェノール−クロロホルム（１：
１）で処理し、ＮａＣｌ（１／１０体積／体積）および
エタノール（２体積）で沈殿させ、２０μl のＨ2 Ｏ中
に再分散させた。プラスミドｐＳＭ６７１（ＣＢＳ ２
０５．９４）中にクローニングするのに好適な制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（５Ｕ）で切断した
後、ＤＮＡ断片を低温融解ゲル(SeaPlague, FMC BioPro
ducts)上、１．０％で精製し、ゲルから溶出した帯をGE
lase(Epicentre Technologies)（ゲル３００ μg 毎に
１Ｕ計量）により、４５℃で１．５時間処理した。同時
に、５０ngのプラスミドｐＳＭ６７１を同じ制限酵素で
切断した。プラスミドおよび断片を、１０μl の反応混
合物（ＤＮＡ ２０ ng/ml) 中で連結し、この混合物２
μl を、ＣａＣｌ2 でコンピテントにしたE.coli 71/18
の細胞の形質転換に使用した(Dagert, M. およびEhrlic
h, Gene,6 :23, 1979)形質転換物を、クロラムフェニコ
ール２０μg/mlを含むＬＢ培地のプレート上で選別し
た。陽性クローンから抽出されたプラスミドＤＮＡを分
析してカルバミラーゼが精確に挿入され、増幅により起
こり得る誤りがないことを確認した。これらプラスミド
の一つをｐＳＭ６３７と呼んでいる。ｐＳＭ６３７を含
むE.coliの菌株をＳＭＣ３０７と呼んでいる。"Molecul
ar Biology Methods for Bacillus"(1990)(Harwood and
Cutting(eds) Wiley and Sons) に記載されている様に
コンピテントにしたB.subtilis SMS108 NRRLB-15.898の
細胞を、１００ ng のプラスミドｐＳＭ６３７で、公知
の技術により形質転換し、その形質転換した菌株をＳＭ
Ｓ３７４と呼ぶことにした。
n E., Goeddel D.V.,Techniqie -a journal of methods
in cell and molecular biology, 1 , No.1(1989):11
-15)による指示に従って、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により、オリゴヌクレオチドの対 を使用して増幅した。オリゴヌクレオチド（２）は、３
' 末端に近いカルバミラーゼ遺伝子の内部に存在する制
限箇所ＥｃｏＲＩをも除去した。増幅は、DNA Thermal
Cycler 480装置(Perkin-Elmer Cetus)で、１０mM Tris-
ＨＣｌ pH８．３、１．５mMＭｇＣｌ2 、５０mMＫＣ
ｌ、０．０１％（重量／体積）ゼラチン、１ngｐＳＭ６
５２、１ μM の２つのプライマー、２００μＭのｄＮ
ＴＰ、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ(Perkin Elmer)
を含む反応混合物を使用して行なった。鉱油１滴を加
え、この混合物を９４℃で４分間変性させ、 ９４℃で１分間（変性） ５５℃で１分間（アニーリング） ７２℃で１分間（伸長） を合計３０サイクル、続いて７２℃で８分間（最終拡
張）からなるサイクルプログラムを開始した。こうして
得られた増幅生成物をフェノール−クロロホルム（１：
１）で処理し、ＮａＣｌ（１／１０体積／体積）および
エタノール（２体積）で沈殿させ、２０μl のＨ2 Ｏ中
に再分散させた。プラスミドｐＳＭ６７１（ＣＢＳ ２
０５．９４）中にクローニングするのに好適な制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（５Ｕ）で切断した
後、ＤＮＡ断片を低温融解ゲル(SeaPlague, FMC BioPro
ducts)上、１．０％で精製し、ゲルから溶出した帯をGE
lase(Epicentre Technologies)（ゲル３００ μg 毎に
１Ｕ計量）により、４５℃で１．５時間処理した。同時
に、５０ngのプラスミドｐＳＭ６７１を同じ制限酵素で
切断した。プラスミドおよび断片を、１０μl の反応混
合物（ＤＮＡ ２０ ng/ml) 中で連結し、この混合物２
μl を、ＣａＣｌ2 でコンピテントにしたE.coli 71/18
の細胞の形質転換に使用した(Dagert, M. およびEhrlic
h, Gene,6 :23, 1979)形質転換物を、クロラムフェニコ
ール２０μg/mlを含むＬＢ培地のプレート上で選別し
た。陽性クローンから抽出されたプラスミドＤＮＡを分
析してカルバミラーゼが精確に挿入され、増幅により起
こり得る誤りがないことを確認した。これらプラスミド
の一つをｐＳＭ６３７と呼んでいる。ｐＳＭ６３７を含
むE.coliの菌株をＳＭＣ３０７と呼んでいる。"Molecul
ar Biology Methods for Bacillus"(1990)(Harwood and
Cutting(eds) Wiley and Sons) に記載されている様に
コンピテントにしたB.subtilis SMS108 NRRLB-15.898の
細胞を、１００ ng のプラスミドｐＳＭ６３７で、公知
の技術により形質転換し、その形質転換した菌株をＳＭ
Ｓ３７４と呼ぶことにした。
【００１５】実施例５E.coliおよびB.subtilisにおけるカルバミラーゼ遺伝子
の発現 この実験の目的は、形質転換した菌株（E.coli SMC307
およびB.subtilis SMS374 ）の、誘導物質なしにカルバ
ミラーゼ遺伝子を発現する能力を確認することである。
菌株（E.coli SMC307 およびB.subtilis SMS 374）の斜
面上のプレカルチャーを、それそれクロラムフェニコー
ル２０μg/mlを加えたＬＢ培地１０mlおよびクロラムフ
ェニコール５μg/mlを加えたＶＹ培地１０mlを含む２個
の１００mlフラスコ中に接種した。これらのフラスコ
を、攪拌しながら（２２０ rpm）３７℃で１６時間培養
した。２種類の培地の遠心分離（１２，０００ rpm、４
℃、１分間）により細胞を回収し、３００μl の緩衝液
２０mM Tris-ＨＣｌpH７．５、２０mM ＢＭｅＯＨ、２
０％グリセロールに再分散させ、超音波処理(Soniprep1
50, MSE 平均電圧で１分間インパルス）により分解し
た。２種類の分解物のアリコート（１５μl ）をポリア
クリルアミドゲル上に１０％で載せ、２０ mA で３時間
移動させた。タンパク質の帯をCoomassie R-250(Laemml
i, Nature:227 , 680, 1970)で着色して目に見える様に
した。Coomassie で着色後、分子量３４，０００Ｄで、
形質転換されていない菌株B.subtilis SMS108 およびE.
coli 71/18の抽出物中に存在しないタンパク質帯が目に
見える様になった。さらに、Coomassie で着色した同じ
ゲル上で行なった濃度計分析により、このタンパク質は
形質転換した菌株の両方で、支配的なタンパク質（タン
パク質全体の１０％）として発現したことが分かった。
の発現 この実験の目的は、形質転換した菌株（E.coli SMC307
およびB.subtilis SMS374 ）の、誘導物質なしにカルバ
ミラーゼ遺伝子を発現する能力を確認することである。
菌株（E.coli SMC307 およびB.subtilis SMS 374）の斜
面上のプレカルチャーを、それそれクロラムフェニコー
ル２０μg/mlを加えたＬＢ培地１０mlおよびクロラムフ
ェニコール５μg/mlを加えたＶＹ培地１０mlを含む２個
の１００mlフラスコ中に接種した。これらのフラスコ
を、攪拌しながら（２２０ rpm）３７℃で１６時間培養
した。２種類の培地の遠心分離（１２，０００ rpm、４
℃、１分間）により細胞を回収し、３００μl の緩衝液
２０mM Tris-ＨＣｌpH７．５、２０mM ＢＭｅＯＨ、２
０％グリセロールに再分散させ、超音波処理(Soniprep1
50, MSE 平均電圧で１分間インパルス）により分解し
た。２種類の分解物のアリコート（１５μl ）をポリア
クリルアミドゲル上に１０％で載せ、２０ mA で３時間
移動させた。タンパク質の帯をCoomassie R-250(Laemml
i, Nature:227 , 680, 1970)で着色して目に見える様に
した。Coomassie で着色後、分子量３４，０００Ｄで、
形質転換されていない菌株B.subtilis SMS108 およびE.
coli 71/18の抽出物中に存在しないタンパク質帯が目に
見える様になった。さらに、Coomassie で着色した同じ
ゲル上で行なった濃度計分析により、このタンパク質は
形質転換した菌株の両方で、支配的なタンパク質（タン
パク質全体の１０％）として発現したことが分かった。
【００１６】実施例６ヒダントイナーゼ遺伝子のクローニング プラスミドｐＳＭ６５３（１μg ）を制限酵素ＥｃｏＲ
ＶおよびＳａｌＩ（４Ｕ）(Boehringer)により、３７℃
で１時間消化した。次いで消化混合物を寒天ゲル上０．
８％（低融解）で電気泳動にかけ、ＥｔＢｒで着色した
後、１３００ bp のＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片に対応す
るＤＮＡ帯を再切断し、ＤＮＡをGelase TM 法(EPICENT
RE Technologies)で抽出した。この断片は５' 末端で小
さな区域が、３' 末端で７０ bp の部分が欠落している
ので、配列 を有する２種類のリンカーを使用してヒダントイナーゼ
遺伝子全体を再構築した。次いで、１３００ bp 断片４
０ ng 、リンカー３' ４０ ng 、リンカー５' １０ ng
およびＥｃｏＲＩで予め直線化したプラスミドｐＳＭ６
７１ ＣＢＳ ２０５．９４ ５０ ng を、１ＵのＴ４
ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ混合物中で連結し、１
２℃で１６時間培養した。続いてリガーゼ混合物を使用
してE.coli71/18のコンピテント細胞を形質転換し、そ
の形質転換物を、クロラムフェニコール２０μg/mlを加
えたＬＢ培地のプレート上で選別した。陽性クローンの
中から選別したプラスミドＤＮＡを分析し、ヒダントイ
ナーゼ遺伝子の完全な配列を含むクローンを確認した。
これらのプラスミドの一つをｐＳＭ６５０と呼び、該プ
ラスミドを含むE.coliにＳＭＣ３０８の記号をつけた。
プラスミドｐＳＭ６５０ １００ ng を使用してB.subt
ilis SMS 108のコンピテント細胞を形質転換し、得られ
た菌株をＳＭＳ３７５とした。
ＶおよびＳａｌＩ（４Ｕ）(Boehringer)により、３７℃
で１時間消化した。次いで消化混合物を寒天ゲル上０．
８％（低融解）で電気泳動にかけ、ＥｔＢｒで着色した
後、１３００ bp のＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片に対応す
るＤＮＡ帯を再切断し、ＤＮＡをGelase TM 法(EPICENT
RE Technologies)で抽出した。この断片は５' 末端で小
さな区域が、３' 末端で７０ bp の部分が欠落している
ので、配列 を有する２種類のリンカーを使用してヒダントイナーゼ
遺伝子全体を再構築した。次いで、１３００ bp 断片４
０ ng 、リンカー３' ４０ ng 、リンカー５' １０ ng
およびＥｃｏＲＩで予め直線化したプラスミドｐＳＭ６
７１ ＣＢＳ ２０５．９４ ５０ ng を、１ＵのＴ４
ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ混合物中で連結し、１
２℃で１６時間培養した。続いてリガーゼ混合物を使用
してE.coli71/18のコンピテント細胞を形質転換し、そ
の形質転換物を、クロラムフェニコール２０μg/mlを加
えたＬＢ培地のプレート上で選別した。陽性クローンの
中から選別したプラスミドＤＮＡを分析し、ヒダントイ
ナーゼ遺伝子の完全な配列を含むクローンを確認した。
これらのプラスミドの一つをｐＳＭ６５０と呼び、該プ
ラスミドを含むE.coliにＳＭＣ３０８の記号をつけた。
プラスミドｐＳＭ６５０ １００ ng を使用してB.subt
ilis SMS 108のコンピテント細胞を形質転換し、得られ
た菌株をＳＭＳ３７５とした。
【００１７】実施例７E.coliおよびB.subtilisにおけるヒダントイナーゼ遺伝
子の発現 この実験の目的は、形質転換した菌株（E.coli SMC308
およびB.subtilis SMS375）の、誘導物質なしにカルバ
ミラーゼ遺伝子を発現する能力を確認することである。
菌株（E.coli SMC308 およびB.subtilis SMS 375）の斜
面上のプレカルチャーを、それぞれクロラムフェニコー
ル５μg/mlを加えたＬＢ培地１０mlおよびクロラムフェ
ニコール２０μg/mlを加えたＶＹ培地１０mlを含む２個
の５０mlフラスコ中に接種した。これらのフラスコを、
穏やかに攪拌しながら（２２０ rpm）３７℃で１６時間
培養した。２種類の培地の遠心分離（１２，０００ rpm
、４℃、１分間）により細胞を回収し、３００μl の
緩衝液２０mM Tris-ＨＣｌpH７．５、２０mM ＢＭｅＯ
Ｈ、２０％グリセロールに再分散させ、超音波処理( 平
均電圧で１分間インパルス）により分解した。２種類の
分解物のアリコート（１５μl ）をポリアクリルアミド
ゲル上に１０％で載せ、２０ mA で３時間移動させた。
タンパク質の帯をCoomassie R-250(Laemmli, Nature:22
7 , 680, 1970)で着色して目に見える様にした。Coomas
sie で着色後、分子量５０，０００Ｄで、形質転換され
ていない菌株B.subtilis SMS108 およびE.coli 71/18の
抽出物中に存在しないタンパク質帯が目に見える様にな
った。さらに、Coomassie で着色した同じゲル上で行な
った濃度計分析により、このタンパク質は形質転換した
菌株の両方で、支配的なタンパク質（タンパク質全体の
１０％）として発現したことが分かった。
子の発現 この実験の目的は、形質転換した菌株（E.coli SMC308
およびB.subtilis SMS375）の、誘導物質なしにカルバ
ミラーゼ遺伝子を発現する能力を確認することである。
菌株（E.coli SMC308 およびB.subtilis SMS 375）の斜
面上のプレカルチャーを、それぞれクロラムフェニコー
ル５μg/mlを加えたＬＢ培地１０mlおよびクロラムフェ
ニコール２０μg/mlを加えたＶＹ培地１０mlを含む２個
の５０mlフラスコ中に接種した。これらのフラスコを、
穏やかに攪拌しながら（２２０ rpm）３７℃で１６時間
培養した。２種類の培地の遠心分離（１２，０００ rpm
、４℃、１分間）により細胞を回収し、３００μl の
緩衝液２０mM Tris-ＨＣｌpH７．５、２０mM ＢＭｅＯ
Ｈ、２０％グリセロールに再分散させ、超音波処理( 平
均電圧で１分間インパルス）により分解した。２種類の
分解物のアリコート（１５μl ）をポリアクリルアミド
ゲル上に１０％で載せ、２０ mA で３時間移動させた。
タンパク質の帯をCoomassie R-250(Laemmli, Nature:22
7 , 680, 1970)で着色して目に見える様にした。Coomas
sie で着色後、分子量５０，０００Ｄで、形質転換され
ていない菌株B.subtilis SMS108 およびE.coli 71/18の
抽出物中に存在しないタンパク質帯が目に見える様にな
った。さらに、Coomassie で着色した同じゲル上で行な
った濃度計分析により、このタンパク質は形質転換した
菌株の両方で、支配的なタンパク質（タンパク質全体の
１０％）として発現したことが分かった。
【００１８】実施例８ヒダントイナーゼ−カルバミラーゼオペロンのクローニ
ング プラスミドｐＳＭ６５０（１μg ）を酵素ＥｃｏＲＩ
（５Ｕ）により、３７℃で１時間消化した。ヒダントイ
ナーゼ遺伝子を含む約１３８０ bp のＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を、Gelase TM 法により、寒天ゲルにより
０．８％で精製した。この断片２０ ng を、ＥｃｏＲＩ
で直線化したプラスミドｐＳＭ６３７ ５０ngで連結し
た。反応は、１ＵのT4 DNAリガーゼを含むリガーゼ緩衝
液中、１６℃で１６時間行なった。このリガーゼ混合物
を使用してE.coli 71/18のコンピテント細胞を形質転換
した。続いて形質転換物をクロラムフェニコール２０
μg/mlを加えたＬＢ培地（８g/l Bactotrypton(DIFC
O)、５ g/l寒天(DIFCO) 、０．５ g/l酵母抽出物）のプ
レート上で選別した。陽性クローンを制限分析により分
析し、２つの遺伝子中に正しく挿入されていることを確
認した。ヒダントイナーゼ−カルバミラーゼオペロンを
含むプラスミドをｐＳＭ６５１と呼び、該プラスミドを
含むE.coliの菌にＳＭＣ３０５の略号を付けた。このプ
ラスミド１００ngでB.subtilis SMS108 のコンピテント
細胞を形質転換した。陽性クローンの一つをＳＭＳ３７
３とした。
ング プラスミドｐＳＭ６５０（１μg ）を酵素ＥｃｏＲＩ
（５Ｕ）により、３７℃で１時間消化した。ヒダントイ
ナーゼ遺伝子を含む約１３８０ bp のＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を、Gelase TM 法により、寒天ゲルにより
０．８％で精製した。この断片２０ ng を、ＥｃｏＲＩ
で直線化したプラスミドｐＳＭ６３７ ５０ngで連結し
た。反応は、１ＵのT4 DNAリガーゼを含むリガーゼ緩衝
液中、１６℃で１６時間行なった。このリガーゼ混合物
を使用してE.coli 71/18のコンピテント細胞を形質転換
した。続いて形質転換物をクロラムフェニコール２０
μg/mlを加えたＬＢ培地（８g/l Bactotrypton(DIFC
O)、５ g/l寒天(DIFCO) 、０．５ g/l酵母抽出物）のプ
レート上で選別した。陽性クローンを制限分析により分
析し、２つの遺伝子中に正しく挿入されていることを確
認した。ヒダントイナーゼ−カルバミラーゼオペロンを
含むプラスミドをｐＳＭ６５１と呼び、該プラスミドを
含むE.coliの菌にＳＭＣ３０５の略号を付けた。このプ
ラスミド１００ngでB.subtilis SMS108 のコンピテント
細胞を形質転換した。陽性クローンの一つをＳＭＳ３７
３とした。
【００１９】実施例９ヒダントイナーゼ−カルバミラーゼオペロンの発現 E.coli SMC305 およびB.subtilis SMS373 をそれぞれ、
クロラムフェニコール２０μg を加えたＬＢ培地１００
mlおよび、クロラムフェニコール５μg を加えたＶＹ培
地１００ml中、３７℃で１６時間、攪拌（２００ rpm）
しながら培養した。細胞分解物から得たタンパク質抽出
物を実施例７に記載する様に分析した。これらの結果
は、ヒダントイナーゼおよびカルバミラーゼに対応する
２種類のタンパク質の存在を示している（図９）。これ
らの酵素の活性を評価するために、基質として（Ｄ，
Ｌ）パラヒドロキシフェニル−ヒダントインまたは５−
フェニルヒダントイン２０mM（２００mlのリン酸塩緩衝
液pH８中）を使用し、アンモニアを放出しながら対応す
るＤ−α−アミノ酸に転化する反応を追跡することによ
り、反応速度を求めた。採用した方法は、Weatherburn,
M.W., (1967), (Anal.Chem.,39:971) により開示され
ている。
クロラムフェニコール２０μg を加えたＬＢ培地１００
mlおよび、クロラムフェニコール５μg を加えたＶＹ培
地１００ml中、３７℃で１６時間、攪拌（２００ rpm）
しながら培養した。細胞分解物から得たタンパク質抽出
物を実施例７に記載する様に分析した。これらの結果
は、ヒダントイナーゼおよびカルバミラーゼに対応する
２種類のタンパク質の存在を示している（図９）。これ
らの酵素の活性を評価するために、基質として（Ｄ，
Ｌ）パラヒドロキシフェニル−ヒダントインまたは５−
フェニルヒダントイン２０mM（２００mlのリン酸塩緩衝
液pH８中）を使用し、アンモニアを放出しながら対応す
るＤ−α−アミノ酸に転化する反応を追跡することによ
り、反応速度を求めた。採用した方法は、Weatherburn,
M.W., (1967), (Anal.Chem.,39:971) により開示され
ている。
【００２０】実施例１０Ｄ，Ｌ−フェニルヒダントインの、Ｄ−フェニルグリシ
ンへの転化 ２ｇのＤ，Ｌ−フェニルヒダントインを１００mlのリン
酸ナトリウム０．２Ｍ緩衝液pH８．０に分散させた懸濁
液を、攪拌機を備え、サーモスタットで４０℃に調節し
た装置中に入れた。窒素により４０℃で５分間脱気した
後、実施例９に記載する様にしてE.coli SMC305 の培養
から得たバイオマス５ｇ（湿重量）を導入した。装置を
密封した後、反応混合物を窒素雰囲気中、４０℃に２４
時間保持した。反応混合物のアリコートの、旋光計およ
び薄層クロマトグラフィー分析(J. of Chromatography,
80: 199-204), 1973)により、出発基質が完全にＤ−フ
ェニルグリシンに加水分解されたことが分かった。反応
混合物を６０００ rpmで１０分間遠心分離した後、上澄
み液をＨＣｌ ６ＭでpH１．０に酸性化し、Amberlite
IR 120（ＨＣｌで活性化）のカラム（２．６ｘ２０cm）
上に載せた。次いでこのカラムを水洗し、５％アンモニ
ア水溶液で溶離させた。溶出液を脱色カーボン(C.Erba)
で脱色し、脱色した溶液を真空中で濃縮し、pH５．８に
した。こうして得た結晶を濾過して回収し、水から再結
晶化させた。得られた白色粉末（１．６３ｇ）は比旋光
度［α］D 20＝−１５６°（ｃ＝１、１Ｎ ＨＣｌ）を
示した。ＩＲスペクトルは標準Ｄ−フェニルグリシンの
それと一致していた。
ンへの転化 ２ｇのＤ，Ｌ−フェニルヒダントインを１００mlのリン
酸ナトリウム０．２Ｍ緩衝液pH８．０に分散させた懸濁
液を、攪拌機を備え、サーモスタットで４０℃に調節し
た装置中に入れた。窒素により４０℃で５分間脱気した
後、実施例９に記載する様にしてE.coli SMC305 の培養
から得たバイオマス５ｇ（湿重量）を導入した。装置を
密封した後、反応混合物を窒素雰囲気中、４０℃に２４
時間保持した。反応混合物のアリコートの、旋光計およ
び薄層クロマトグラフィー分析(J. of Chromatography,
80: 199-204), 1973)により、出発基質が完全にＤ−フ
ェニルグリシンに加水分解されたことが分かった。反応
混合物を６０００ rpmで１０分間遠心分離した後、上澄
み液をＨＣｌ ６ＭでpH１．０に酸性化し、Amberlite
IR 120（ＨＣｌで活性化）のカラム（２．６ｘ２０cm）
上に載せた。次いでこのカラムを水洗し、５％アンモニ
ア水溶液で溶離させた。溶出液を脱色カーボン(C.Erba)
で脱色し、脱色した溶液を真空中で濃縮し、pH５．８に
した。こうして得た結晶を濾過して回収し、水から再結
晶化させた。得られた白色粉末（１．６３ｇ）は比旋光
度［α］D 20＝−１５６°（ｃ＝１、１Ｎ ＨＣｌ）を
示した。ＩＲスペクトルは標準Ｄ−フェニルグリシンの
それと一致していた。
【００２１】実施例１１Ｄ，Ｌ−フェニルヒダントインの、Ｄ−フェニルグリシ
ンへの転化 E.coli SMC305 の培養から得たバイオマス５ｇ（湿重
量）および１００mlのリン酸ナトリウム０．２Ｍ緩衝液
pH８．０に入れた１０ｇのＤ，Ｌ−フェニルヒダントイ
ンを使用し、実施例１０と同じ操作を行なった。反応は
窒素雰囲気中、４０℃で９０時間行なった。得られた白
色粉末（８．１ｇ）は比旋光度［α］D 20＝−１５６．
５°（ｃ＝１、１Ｎ ＨＣｌ）を示した。ＩＲスペクト
ルは標準Ｄ−フェニルグリシンのそれと一致していた。
ンへの転化 E.coli SMC305 の培養から得たバイオマス５ｇ（湿重
量）および１００mlのリン酸ナトリウム０．２Ｍ緩衝液
pH８．０に入れた１０ｇのＤ，Ｌ−フェニルヒダントイ
ンを使用し、実施例１０と同じ操作を行なった。反応は
窒素雰囲気中、４０℃で９０時間行なった。得られた白
色粉末（８．１ｇ）は比旋光度［α］D 20＝−１５６．
５°（ｃ＝１、１Ｎ ＨＣｌ）を示した。ＩＲスペクト
ルは標準Ｄ−フェニルグリシンのそれと一致していた。
【００２２】実施例１２Ｄ，Ｌ−５−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントイン
の、Ｄ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転化 バイオマス２．５ｇ（湿重量）およびＤ，Ｌ−５−パラ
−ヒドロキシ−フェニルヒダントイン１ｇを使用し、実
施例１０と同じ操作を行なった。白色粉末として得られ
たＤ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシン（０．８２
ｇ）は比旋光度［α］D 20＝−１５８°（ｃ＝１、１Ｎ
ＨＣｌ）を示した。ＩＲスペクトルは標準Ｄ−フェニ
ルグリシンのそれと一致していた。
の、Ｄ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転化 バイオマス２．５ｇ（湿重量）およびＤ，Ｌ−５−パラ
−ヒドロキシ−フェニルヒダントイン１ｇを使用し、実
施例１０と同じ操作を行なった。白色粉末として得られ
たＤ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシン（０．８２
ｇ）は比旋光度［α］D 20＝−１５８°（ｃ＝１、１Ｎ
ＨＣｌ）を示した。ＩＲスペクトルは標準Ｄ−フェニ
ルグリシンのそれと一致していた。
【００２３】実施例１３Ｄ，Ｌ−５−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントイン
の、Ｄ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転化 E.coli SMC305 の培養から得たバイオマス２．５ｇ（湿
重量）およびＤ，Ｌ−５−パラ−ヒドロキシ−フェニル
ヒダントイン８ｇを使用し、実施例１０と同じ操作を行
なった。反応は窒素雰囲気中、４０℃で１７０時間行な
った。白色粉末として得られたＤ−パラヒドロキシフェ
ニルグリシン（６．６ｇ）は比旋光度［α］D 20＝−１
５７．８°（ｃ＝１、１Ｎ ＨＣｌ）を示した。ＩＲス
ペクトルは標準Ｄ−フェニルグリシンのそれと一致して
いた。
の、Ｄ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転化 E.coli SMC305 の培養から得たバイオマス２．５ｇ（湿
重量）およびＤ，Ｌ−５−パラ−ヒドロキシ−フェニル
ヒダントイン８ｇを使用し、実施例１０と同じ操作を行
なった。反応は窒素雰囲気中、４０℃で１７０時間行な
った。白色粉末として得られたＤ−パラヒドロキシフェ
ニルグリシン（６．６ｇ）は比旋光度［α］D 20＝−１
５７．８°（ｃ＝１、１Ｎ ＨＣｌ）を示した。ＩＲス
ペクトルは標準Ｄ−フェニルグリシンのそれと一致して
いた。
【００２４】実施例１４Ｄ，Ｌ−５−イソプロピルヒダントインの、Ｄ−バリン
への転化 E.coli SMC305 の培養から得たバイオマス５．０ｇ（湿
重量）およびＤ，Ｌ−５−イソプロピルヒダントイン２
ｇを使用し、実施例１０と同じ操作を行なった。反応は
窒素雰囲気中、４０℃で２４０時間行なった。白色粉末
として得られたＤ−バリン（０．８ｇ）は比旋光度
［α］D 20＝−２７．５°（ｃ＝５、６ＮＨＣｌ）を示
した。ＩＲスペクトルは標準Ｄ−バリンのそれと一致し
ていた。
への転化 E.coli SMC305 の培養から得たバイオマス５．０ｇ（湿
重量）およびＤ，Ｌ−５−イソプロピルヒダントイン２
ｇを使用し、実施例１０と同じ操作を行なった。反応は
窒素雰囲気中、４０℃で２４０時間行なった。白色粉末
として得られたＤ−バリン（０．８ｇ）は比旋光度
［α］D 20＝−２７．５°（ｃ＝５、６ＮＨＣｌ）を示
した。ＩＲスペクトルは標準Ｄ−バリンのそれと一致し
ていた。
【００２５】配列リスト 配列の数：１９ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 CGAATTGTAA ATTATGCAGC AGC 23 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 AGGATCGTGA ACTACGCGGC GGC 23 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 CGCATAGTCA ATTATGCCGC CGC 23 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 CGTATTGTTA ATTATGCTGC TGC 23 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 GGACCAATTC AACGAGC 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 GGGCCGATCC AGCGGGC 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 GGCCCCATAC AACGCGC 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 GGTCCTATTC AACGTGC 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 CGAGCAGATG TAATGGA 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 AGGGCGGACG TGATGGA 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 CGCGCCGATG TCATGGA 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 CGTGCTGATG TTATGGA 17 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｘｉ）配列 ATCGTAACCG CGGACGGGAT TTCTCCC 27 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称：プライマー （ｘｉ）配列 GGGAATTCTT ATGACACGTC AG 22 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称：プライマー （ｘｉ）配列 CCCAAGCTTC AAAATTCCGC GAT 23 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称：リンカー （ｘｉ）配列 AATTCTTATG GAT 13 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：７６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称：リンカー （ｘｉ）配列 TCGACGAGGG AACCTACGTG GGGGCGCCGA CGGATGGCCA 40 GTTCCGGAAG CGCCGCAAAT ACAAGCAATA AGGAGG 76
【００２６】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に関する
情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：９１５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｖｉ）起源 （Ａ）生物：Agrobacterium radiobacter （ｘｉ）配列 ATG ACA CGT CAG ATG ATA CTT GCT GTC GGA CAG CAA GGC CCC ATC 45 Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile 5 10 15 GCG CGA GCG GAG ACA CGC GAA CAG GTG GTT GGC CGC CTC CTC GAC 90 Ala Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Gly Arg Leu Leu Asp 20 25 30 ATG TTG ACG AAC GCA GCC AGC CGG GGC GTG AAC TTC ATC GTC TTT 135 Met Leu Thr Asn Ala Ala Ser Arg Gly Val Asn Phe Ile Val Phe 35 40 45 CCC GAG CTT GCG CTC ACG ACC TTC TTC CCG CGC TGG CAT TTC ACC 180 Pro Glu Leu Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr 50 55 60 GAC GAG GCC GAG CTC GAT AGC TTC TAT GAG ACC GAA ATG CCC GGC 225 Asp Glu Ala Glu Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly 65 70 75 CCG GTG GTC CGT CCA CTC TTT GAG ACG GCC GCC GAA CTC GGG ATC 270 Pro Val Val Arg Pro Leu Phe Glu Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile 80 85 90 GGC TTC AAT CTG GGC TAC GCC GAA CTC GTC GTC GAA GGC GGC GTC 315 Gly Phe Asn Leu Gly Tyr Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val 95 100 105 AAG CGT CGC TTC AAC ACG TCC ATT CTG GTG GAT AAG TCA GGC AAG 360 Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys 110 115 120 ATC GTC GGC AAG TAT CGT AAG ATC CAT TTG CCG GGT CAC AAG GAG 415 Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His Leu Pro Gly Hys Lys Glu 125 130 135 TAC GAG GCC TAC CGG CCG TTC CAG CAT CTT GAA AAG CGT TAT TTC 450 Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His Leu Glu Lys Arg Tyr Phe 140 145 150 GAG CCG GGC GAT CTC GGC TTC CCG GTC TAT GAC GTC GAC GCC GCG 495 Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr Asp Val Asp Ala Ala 155 160 165 AAA ATG GGG ATG TTC ATC TGC AAC GAT CGC CGC TGG CCT GAA ACG 540 Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp Pro Glu Thr 170 175 180 TGG CGG GTG ATG GGA CTT AAG GGC GCC GAG ATC ATC TGC GGC GGC 585 Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile Cys Gly Gly 185 190 195 TAC AAC ACG CCG ACC CAC AAT CCC CCC GTT CCC CAG CAC GAC CAT 630 Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His Asp His 200 205 210 CTG ACG TCC TTC CAC CAC CTT CTG TCG ATG CAG GCC GGG TCG TAC 675 Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser Tyr 215 220 225 CAA AAC GGC GCC TGG TCC GCG GCG GCC GGC AAG GTC GGC ATG GAG 720 Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu 230 235 240 GAG GGG TGC ATG CTG CTC GGC CAT TCG TGC ATC GTG GCG CCG ACC 765 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr 245 250 255 GGC GAA ATC GTT GCC CTG ACC ACG ACG TTG GAA GAC GAG GTG ATC 810 Gly Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile 260 265 270 ACC GCC GCC GTC GAT CTC GAC CGC TGC CGG GAA CTG CGC GAA CAC 855 Thr Ala Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His 275 280 285 ATC TTC AAT TTC AAA GCC CAT CGT CAG CCA CAG CAC TAC GGT CTG 900 Ile Phe Asn Phe Lys Ala His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu 290 295 300 ATC GCG GAA TTT TGA 915 Ile Ala Glu Phe 止
情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：９１５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｖｉ）起源 （Ａ）生物：Agrobacterium radiobacter （ｘｉ）配列 ATG ACA CGT CAG ATG ATA CTT GCT GTC GGA CAG CAA GGC CCC ATC 45 Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile 5 10 15 GCG CGA GCG GAG ACA CGC GAA CAG GTG GTT GGC CGC CTC CTC GAC 90 Ala Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Gly Arg Leu Leu Asp 20 25 30 ATG TTG ACG AAC GCA GCC AGC CGG GGC GTG AAC TTC ATC GTC TTT 135 Met Leu Thr Asn Ala Ala Ser Arg Gly Val Asn Phe Ile Val Phe 35 40 45 CCC GAG CTT GCG CTC ACG ACC TTC TTC CCG CGC TGG CAT TTC ACC 180 Pro Glu Leu Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr 50 55 60 GAC GAG GCC GAG CTC GAT AGC TTC TAT GAG ACC GAA ATG CCC GGC 225 Asp Glu Ala Glu Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly 65 70 75 CCG GTG GTC CGT CCA CTC TTT GAG ACG GCC GCC GAA CTC GGG ATC 270 Pro Val Val Arg Pro Leu Phe Glu Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile 80 85 90 GGC TTC AAT CTG GGC TAC GCC GAA CTC GTC GTC GAA GGC GGC GTC 315 Gly Phe Asn Leu Gly Tyr Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val 95 100 105 AAG CGT CGC TTC AAC ACG TCC ATT CTG GTG GAT AAG TCA GGC AAG 360 Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys 110 115 120 ATC GTC GGC AAG TAT CGT AAG ATC CAT TTG CCG GGT CAC AAG GAG 415 Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His Leu Pro Gly Hys Lys Glu 125 130 135 TAC GAG GCC TAC CGG CCG TTC CAG CAT CTT GAA AAG CGT TAT TTC 450 Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His Leu Glu Lys Arg Tyr Phe 140 145 150 GAG CCG GGC GAT CTC GGC TTC CCG GTC TAT GAC GTC GAC GCC GCG 495 Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr Asp Val Asp Ala Ala 155 160 165 AAA ATG GGG ATG TTC ATC TGC AAC GAT CGC CGC TGG CCT GAA ACG 540 Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp Pro Glu Thr 170 175 180 TGG CGG GTG ATG GGA CTT AAG GGC GCC GAG ATC ATC TGC GGC GGC 585 Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile Cys Gly Gly 185 190 195 TAC AAC ACG CCG ACC CAC AAT CCC CCC GTT CCC CAG CAC GAC CAT 630 Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His Asp His 200 205 210 CTG ACG TCC TTC CAC CAC CTT CTG TCG ATG CAG GCC GGG TCG TAC 675 Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser Tyr 215 220 225 CAA AAC GGC GCC TGG TCC GCG GCG GCC GGC AAG GTC GGC ATG GAG 720 Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu 230 235 240 GAG GGG TGC ATG CTG CTC GGC CAT TCG TGC ATC GTG GCG CCG ACC 765 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr 245 250 255 GGC GAA ATC GTT GCC CTG ACC ACG ACG TTG GAA GAC GAG GTG ATC 810 Gly Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile 260 265 270 ACC GCC GCC GTC GAT CTC GAC CGC TGC CGG GAA CTG CGC GAA CAC 855 Thr Ala Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His 275 280 285 ATC TTC AAT TTC AAA GCC CAT CGT CAG CCA CAG CAC TAC GGT CTG 900 Ile Phe Asn Phe Lys Ala His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu 290 295 300 ATC GCG GAA TTT TGA 915 Ile Ala Glu Phe 止
【００２７】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に関する
情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１３７３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｖｉ）起源 （Ａ）生物：Agrobacterium radiobacter （ｘｉ）配列 ATG GAT ATC ATC ATC AAG AAC GGA ACC ATC GTA ACC GCG GAC GGG 45 Met Asp Ile Ile Ile Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Asp Gly 5 10 15 ATT TCT CCC GCC GAT CTC GGA ATC AAG GAT GGC AAG ATC GCC CAG 90 Ile Ser Pro Ala Asp Leu Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gln 20 25 30 ATC GGC GGA ACG TTC GGC CCG GCC GGC CGG ACA ATC GAC GCC TCC 135 Ile Gly Gly Thr Phe Gly Pro Ala Gly Arg Thr Ile Asp Ala Ser 35 40 45 GGC CGC TAC GTT TTT CCG GGC GGC ATC GAC GTT CAT ACG CAT GTC 180 Gly Arg Tyr Val Phe Pro Gly Gly Ile Asp Val His Thr His Val 50 55 60 GAG ACG GTC AGC TTC AAC ACG CAG TCG GCC GAC ACA TTC GCA ACC 225 Glu Thr Val Ser Phe Asn Thr Gln Ser Ala Asp Thr Phe Ala Thr 65 70 75 GCG ACG GTC GCG GCC GCC TGT GGC GGC ACG ACG ACC ATC GTC GAT 270 Ala Thr Val Ala Ala Ala Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp 80 85 90 TTC TGC CAG CAG GAC CGC GGC CAT AGC CTG AGG GAG GCG GTC GCC 315 Phe Cys Gln Gln Asp Arg Gly Hys Ser Leu Arg Glu Ala Val Ala 95 100 105 AAA TGG GAC GGC ATG GCC GGC GGC AAG TCG GCG ATC GAC TAC GGC 360 Lys Trp Asp Gly Met Ala Gly Gly Lys Ser Ala Ile Asp Tyr Gly 110 115 120 TAC CAT ATC ATC GTG CTC GAT CCG ACT GAT AGC GTG ATC GAG GAG 405 Tyr His Ile Ile Val Leu Asp Pro Thr Asp Ser Val Ile Glu Glu 125 130 135 CTA GAG GTA CTG CCA GAT CTC GGC ATC ACC TCC TTC AAG GTC TTC 450 Leu Glu Val Leu Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Phe Lys Val Phe 140 145 150 ATG GCT TAT CGC GGC ATG AAC ATG ATC GAC GAC GTG ACA CTG CTC 495 Met Ala Tyr Arg Gly Met Asn Met Ile Asp Asp Val Thr Leu Leu 155 160 165 AGG ACG CTC GAC AAG GCC GCC AAG ACT GGG TCA CTC GTC ATG GTG 540 Arg Thr Leu Asp Lys Ala Ala Lys Thr Gly Ser Leu Val Met Val 170 175 180 CAC GCG GAG AAC GGC GAC GCC GCC GAC TAT CTT CGC GAC AAG TTC 585 His Ala Glu Asn Gly Asp Ala Ala Asp Tyr Leu Arg Asp Lys Phe 185 190 195 GTC GCC GAT GGC AAA ACG GCG CCG ATC TAC CAC GCG CTC AGC CGT 630 Val Ala Asp Gly Lys Thr Ala Pro Ile Tyr His Ala Leu Ser Arg 200 205 210 CCG CCC CGG GTC GAA GCC GAG GCG ACC GCG AGG GCC CTC GCC CTG 675 Pro Pro Arg Val Glu Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Leu Ala Leu 215 220 225 GCG GAA ATC GTC AAC GCC CCG ATC TAC ATC GTG CAT CTG ACC TGC 720 Ala Glu Ile Val Asn Ala Pro Ile Tyr Ile Val His Leu Thr Cys 230 235 240 GAA GAA TCC TTC GAC GAG TTG ATG CGG GCA AAG GCT CGG GGT GTC 765 Glu Glu Ser Phe Asp Glu Leu Met Arg Ala Lys Ala Arg Gly Val 245 250 255 CAC GCC CTG GCC GAA ACC TGC ACA CAA TAC CTC TAC CTC ACC AAG 810 His Ala Leu Ala Glu Thr Cys Thr Gln Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys 260 265 270 GAC GAC CTG GAG CGG CCG GAT TTC GAG GGC GCG AAG TAT GTT TTC 855 Asp Asp Leu Glu Arg Pro Asp Phe Glu Gly Ala Lys Tyr Val Phe 275 280 285 ACC CCG CCT CCG CGC ACG AAG AAG GAC CAG GAA ATC CTC TGG AAC 900 Thr Pro Pro Pro Arg Thr Lys Lys Asp Gln Glu Ile Leu Trp Asn 290 295 300 GCA CTC CGG AAC GGG GTC CTC GAA ACG GTC TCC TCG GAC CAT TGT 945 Ala Leu Arg Asn Gly Val Leu Glu Thr Val Ser Ser Asp His Cys 305 310 315 TCC TGG CTC TTC GAG GGG CAC AAG GAT CGG GGC AGG AAC GAC TTC 990 Ser Trp Leu Phe Glu Gly His Lys Asp Arg Gly Arg Asn Asp Phe 320 325 330 CGC GCC ATC CCG AAC GGA GCG CCG GGC GTC GAG GAG CGG CTG ATG 1035 Arg Ala Ile Pro Asn Gly Ala Pro Gly Val Glu Glu Arg Leu Met 335 340 345 ATG GTC TAT CAG GGC GTC AAC GAA GGC CGC ATT TCC CTC ACC CAG 1080 Met Val Tyr Gln Gly Val Asn Glu Gly Arg Ile Ser Leu Thr Gln 350 355 360 TTC GTA GAA CTG GTC GCC ACG CGC CCG GCC AAG GTC TTC GGC ATG 1125 Phe Val Glu Leu Val Ala Thr Arg Pro Ala Lys Val Phe Gly Met 365 370 375 TTC CCG GAA AAA GGA ACG GTC GCG GTC GGT TCG GAT GCC GAC ATC 1170 Phe Pro Glu Lys Gly Thr Val Ala Val Gly Ser Asp Ala Asp Ile 380 385 390 GTC CTT TGG GAT CCC GAG GCT GAA ATG GTG ATC GAA CAA AGC GCC 1215 Val Leu Trp Asp Pro Glu Ala Glu Met Val Ile Glu Gln Ser Ala 395 400 405 ATG CAT AAC GCC ATG GAT TAC TCC TCC TAC GAG GGA CAC AAG ATC 1260 Met His Asn Ala Met Asp Tyr Ser Ser Tyr Glu Gly His Lys Ile 410 415 420 AAG GGC GTG CCG AAG ACA GTG CTG CTG CGT GGC AAG GTG ATC GTC 1305 Lys Gly Val Pro Lys Thr Val Leu Leu Arg Gly Lys Val Ile Val 425 430 435 GAC GAG GGA ACC TAC GTG GGG GCG CCG ACG GAT GGC CAG TTC CGG 1350 Asp Glu Gly Thr Tyr Val Gly Ala Pro Thr Asp Gly Gln Phe Arg 440 445 450 AAG CGC CGC AAA TAC AAG CAA TAA 1373 Lys Arg Arg Lys Tyr Lys Gln 止 445
情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１３７３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：単 （Ｄ）幾何学的形状：線状 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム性） （ｖｉ）起源 （Ａ）生物：Agrobacterium radiobacter （ｘｉ）配列 ATG GAT ATC ATC ATC AAG AAC GGA ACC ATC GTA ACC GCG GAC GGG 45 Met Asp Ile Ile Ile Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Asp Gly 5 10 15 ATT TCT CCC GCC GAT CTC GGA ATC AAG GAT GGC AAG ATC GCC CAG 90 Ile Ser Pro Ala Asp Leu Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gln 20 25 30 ATC GGC GGA ACG TTC GGC CCG GCC GGC CGG ACA ATC GAC GCC TCC 135 Ile Gly Gly Thr Phe Gly Pro Ala Gly Arg Thr Ile Asp Ala Ser 35 40 45 GGC CGC TAC GTT TTT CCG GGC GGC ATC GAC GTT CAT ACG CAT GTC 180 Gly Arg Tyr Val Phe Pro Gly Gly Ile Asp Val His Thr His Val 50 55 60 GAG ACG GTC AGC TTC AAC ACG CAG TCG GCC GAC ACA TTC GCA ACC 225 Glu Thr Val Ser Phe Asn Thr Gln Ser Ala Asp Thr Phe Ala Thr 65 70 75 GCG ACG GTC GCG GCC GCC TGT GGC GGC ACG ACG ACC ATC GTC GAT 270 Ala Thr Val Ala Ala Ala Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp 80 85 90 TTC TGC CAG CAG GAC CGC GGC CAT AGC CTG AGG GAG GCG GTC GCC 315 Phe Cys Gln Gln Asp Arg Gly Hys Ser Leu Arg Glu Ala Val Ala 95 100 105 AAA TGG GAC GGC ATG GCC GGC GGC AAG TCG GCG ATC GAC TAC GGC 360 Lys Trp Asp Gly Met Ala Gly Gly Lys Ser Ala Ile Asp Tyr Gly 110 115 120 TAC CAT ATC ATC GTG CTC GAT CCG ACT GAT AGC GTG ATC GAG GAG 405 Tyr His Ile Ile Val Leu Asp Pro Thr Asp Ser Val Ile Glu Glu 125 130 135 CTA GAG GTA CTG CCA GAT CTC GGC ATC ACC TCC TTC AAG GTC TTC 450 Leu Glu Val Leu Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Phe Lys Val Phe 140 145 150 ATG GCT TAT CGC GGC ATG AAC ATG ATC GAC GAC GTG ACA CTG CTC 495 Met Ala Tyr Arg Gly Met Asn Met Ile Asp Asp Val Thr Leu Leu 155 160 165 AGG ACG CTC GAC AAG GCC GCC AAG ACT GGG TCA CTC GTC ATG GTG 540 Arg Thr Leu Asp Lys Ala Ala Lys Thr Gly Ser Leu Val Met Val 170 175 180 CAC GCG GAG AAC GGC GAC GCC GCC GAC TAT CTT CGC GAC AAG TTC 585 His Ala Glu Asn Gly Asp Ala Ala Asp Tyr Leu Arg Asp Lys Phe 185 190 195 GTC GCC GAT GGC AAA ACG GCG CCG ATC TAC CAC GCG CTC AGC CGT 630 Val Ala Asp Gly Lys Thr Ala Pro Ile Tyr His Ala Leu Ser Arg 200 205 210 CCG CCC CGG GTC GAA GCC GAG GCG ACC GCG AGG GCC CTC GCC CTG 675 Pro Pro Arg Val Glu Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Leu Ala Leu 215 220 225 GCG GAA ATC GTC AAC GCC CCG ATC TAC ATC GTG CAT CTG ACC TGC 720 Ala Glu Ile Val Asn Ala Pro Ile Tyr Ile Val His Leu Thr Cys 230 235 240 GAA GAA TCC TTC GAC GAG TTG ATG CGG GCA AAG GCT CGG GGT GTC 765 Glu Glu Ser Phe Asp Glu Leu Met Arg Ala Lys Ala Arg Gly Val 245 250 255 CAC GCC CTG GCC GAA ACC TGC ACA CAA TAC CTC TAC CTC ACC AAG 810 His Ala Leu Ala Glu Thr Cys Thr Gln Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys 260 265 270 GAC GAC CTG GAG CGG CCG GAT TTC GAG GGC GCG AAG TAT GTT TTC 855 Asp Asp Leu Glu Arg Pro Asp Phe Glu Gly Ala Lys Tyr Val Phe 275 280 285 ACC CCG CCT CCG CGC ACG AAG AAG GAC CAG GAA ATC CTC TGG AAC 900 Thr Pro Pro Pro Arg Thr Lys Lys Asp Gln Glu Ile Leu Trp Asn 290 295 300 GCA CTC CGG AAC GGG GTC CTC GAA ACG GTC TCC TCG GAC CAT TGT 945 Ala Leu Arg Asn Gly Val Leu Glu Thr Val Ser Ser Asp His Cys 305 310 315 TCC TGG CTC TTC GAG GGG CAC AAG GAT CGG GGC AGG AAC GAC TTC 990 Ser Trp Leu Phe Glu Gly His Lys Asp Arg Gly Arg Asn Asp Phe 320 325 330 CGC GCC ATC CCG AAC GGA GCG CCG GGC GTC GAG GAG CGG CTG ATG 1035 Arg Ala Ile Pro Asn Gly Ala Pro Gly Val Glu Glu Arg Leu Met 335 340 345 ATG GTC TAT CAG GGC GTC AAC GAA GGC CGC ATT TCC CTC ACC CAG 1080 Met Val Tyr Gln Gly Val Asn Glu Gly Arg Ile Ser Leu Thr Gln 350 355 360 TTC GTA GAA CTG GTC GCC ACG CGC CCG GCC AAG GTC TTC GGC ATG 1125 Phe Val Glu Leu Val Ala Thr Arg Pro Ala Lys Val Phe Gly Met 365 370 375 TTC CCG GAA AAA GGA ACG GTC GCG GTC GGT TCG GAT GCC GAC ATC 1170 Phe Pro Glu Lys Gly Thr Val Ala Val Gly Ser Asp Ala Asp Ile 380 385 390 GTC CTT TGG GAT CCC GAG GCT GAA ATG GTG ATC GAA CAA AGC GCC 1215 Val Leu Trp Asp Pro Glu Ala Glu Met Val Ile Glu Gln Ser Ala 395 400 405 ATG CAT AAC GCC ATG GAT TAC TCC TCC TAC GAG GGA CAC AAG ATC 1260 Met His Asn Ala Met Asp Tyr Ser Ser Tyr Glu Gly His Lys Ile 410 415 420 AAG GGC GTG CCG AAG ACA GTG CTG CTG CGT GGC AAG GTG ATC GTC 1305 Lys Gly Val Pro Lys Thr Val Leu Leu Arg Gly Lys Val Ile Val 425 430 435 GAC GAG GGA ACC TAC GTG GGG GCG CCG ACG GAT GGC CAG TTC CGG 1350 Asp Glu Gly Thr Tyr Val Gly Ala Pro Thr Asp Gly Gln Phe Arg 440 445 450 AAG CGC CGC AAA TAC AAG CAA TAA 1373 Lys Arg Arg Lys Tyr Lys Gln 止 445
【図１】カルバミラ遺伝子を含むプラスミドｐＳＭ６３
７の地図を示す図である。
７の地図を示す図である。
【図２】ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳ
Ｍ６５０の地図を示す図である。
Ｍ６５０の地図を示す図である。
【図３】ヒダントイナーゼ−カルバミラーゼオペロンを
含むプラスミドｐＳＭ６５１の地図を示す図である。
含むプラスミドｐＳＭ６５１の地図を示す図である。
【図４】カルバミラーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示す図である。
配列を示す図である。
【図５】カルバミラーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示す図である。
配列を示す図である。
【図６】ヒダントイナーゼのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す図である。
酸配列を示す図である。
【図７】ヒダントイナーゼのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す図である。
酸配列を示す図である。
【図８】ヒダントイナーゼのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を示す図である。
酸配列を示す図である。
【図９】プラスミドｐＳＭ６５１で形質転換したE.coli
およびB.subtilisの培養物から抽出したタンパク質全体
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびウエスターン−ブロッ
ト（Ｂ）を示す写真である。 線１：標準ヒダントイナーゼ 線２：標準カルバミラーゼ 線３：E.coli（ｐＳＭ６７１）比較用 線４：E.coliＳＭＣ３０５ 線５：B.subtilis（ｐＳＭ６７１）比較用 線６：B.subtilisＳＭＳ３７３
およびB.subtilisの培養物から抽出したタンパク質全体
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびウエスターン−ブロッ
ト（Ｂ）を示す写真である。 線１：標準ヒダントイナーゼ 線２：標準カルバミラーゼ 線３：E.coli（ｐＳＭ６７１）比較用 線４：E.coliＳＭＣ３０５ 線５：B.subtilis（ｐＳＭ６７１）比較用 線６：B.subtilisＳＭＳ３７３
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジュリアーノ、ガルリ イタリー国サン、ドナト、ミラネーゼ、ビ ア、フェルランディーナ、14／ア (72)発明者 グイド、グランディ イタリー国セグラーテ、ノナ、ストラー ダ、４
Claims (15)
- 【請求項１】５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立
体特異的転化によるＤ−α−アミノ酸の製造方法であっ
て、転化反応を、前記ヒダントインを対応するＤ−α−
アミノ酸に転化できる酵素系を高収率で誘導物質なしに
発現できるプラスミドｐＳＭ６５１ ＣＢＳ ２０３．
９４で形質転換した微生物の存在下で行なうことを特徴
とする方法。 - 【請求項２】転化反応が、プラスミドｐＳＭ６５１ Ｃ
ＢＳ ２０３．９４で形質転換した微生物から分離した
酵素系の存在下で行なわれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記酵素系が不溶性支持体上に固定されて
いる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】微生物が、Bacillus subtilis およびEsch
erichia coliの群から選択される、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項５】５−置換ヒダントインが、Ｄ，Ｌ−５−フ
ェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−ヒドロキシフ
ェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−メチルヒダントイ
ン、Ｄ，Ｌ−５−イソプロピルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−
５−チエニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−メトキ
シフェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−パラ−クロロフ
ェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−ベンジルヒダントイ
ンから選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】ヒダントインが、Ｄ，Ｌ−５−パラ−ヒド
ロキシフェニルヒダントインである、請求項５に記載の
方法。 - 【請求項７】ヒダントインが、Ｄ，Ｌ−５−フェニルヒ
ダントインである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】転化反応が、２０〜６０℃の温度で行なわ
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】温度が３０〜４５℃である、請求項８に記
載の方法。 - 【請求項１０】転化反応が、pH６．０〜１０で行なわれ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】pHが７．０〜８．５である、請求項１０
に記載の方法。 - 【請求項１２】転化反応が、バイオマス／ヒダントイン
の重量比１／１〜１／５０で行なわれる、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１３】Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baa
rn（オランダ）に寄託してあり、寄託番号ＣＢＳ ２０
３．９４を受けているプラスミドｐＳＭ６５１。 - 【請求項１４】プラスミドｐＳＭ６５１で形質転換され
たBacillus subtilis およびEscherichia coliから選択
された微生物。 - 【請求項１５】Escherichia coliＳＭＣ３０５ ＣＢＳ
２０３．９４である、請求項１０に記載の微生物。
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|---|---|---|---|
| IT94A000726 | 1994-04-15 | ||
| ITMI940726A IT1274167B (it) | 1994-04-15 | 1994-04-15 | Procedimento per la produzione di d- -amminoacidi |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0677585B1 (ja) |
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| DK (1) | DK0677585T3 (ja) |
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| GR (1) | GR3024727T3 (ja) |
| IT (1) | IT1274167B (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003024074A (ja) * | 2001-07-10 | 2003-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 |
| JP2003024073A (ja) * | 2001-07-10 | 2003-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 |
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1997
- 1997-09-16 GR GR970402370T patent/GR3024727T3/el unknown
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| JP2003024073A (ja) * | 2001-07-10 | 2003-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 |
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