ITMI980146A1 - Sali dell'acido (r) 2-(3-benzoilfenil) propionico e loro composizioni farmaceutiche - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione avente per titolo:

"Sali dell'acido (R)2-(3-benzoilfenil)propionico e loro composizioni farmaceutiche"

L'oggetto della presente invenzione riguarda sali enantiomericamente puri dell'acido (R)2-(3-benzoilfenil) propionico con basi organiche achirali e chirali, nonché le composizioni farmaceutiche che li contengono, nella cura di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, 1'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite. Già dalla fine degli anni'80, era noto che 1'interleuchina-8 (IL-8) rappresentava un potente agonista dei neutrofili. Tra le funzioni che essa svolge vi è quella di indurre il flusso di ioni Ca<2+ >nei neutrofili, l'aumento della concentrazione intracellulare di ioni Ca<2+ >essendo l'evento iniziale che innesca il processo di attivazione del neutrofilo e di altre cellule leucocitarie, il rilascio di L-selectina, la chemiotassi leucocitaria e la conseguente degranulazione in presenza di citocalasina B.

Vi sono ricorrenti informazioni del coinvolgimento della chemiochina IL-8 nel sostegno, nell'esacerbazione e nell'amplificazione di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti che caratterizzano un ampio spettro di patologie quali la psoriasi (B.J. Nicholoff et al., Am. J. Pathol . , 138, 129, 1991 ) , l'artrite reumatoide (M.Seitz et al, J. din . Inv. , 8J, 463, 1991 ) , la colite ulcerativa (Y. R. Mahida, Clin . Sci . , 62,273 , 1992) , la fibrosi polmonare idiopatica e l' insufficienza respiratoria acuta [Adulty Respiratory Distress Syndrome, ARDS] {P. C. Carré et al., J. Clin. Invest. , 88, 1802, 1991 e E. J. Miller et al. , Am. Rev. Respir. Dis. , 146, 427, 1992) ed, infine, svolge un ruolo determinante nell'amplificazione dei danni da riperfusione (N. Sekido et al Nature , 385 , 654 , 1993) .

Elevate quantità di IL-8 sono presenti nello sputo e nei fluidi edematosi di pazienti affetti da infiammazioni croniche delle vie aeree, dalla fibrosi cistica alle malattie ostruttive polmonari, quali bronchite cronica, bronchiettasie, atelectasia, caratterizzate dall'accumulo intrapolmonare di leucociti polimorfonucleati (PMN) (J.B.Y. Richman-Eisenstat et al Eur. Respir. J. , 6^, 1429, 1993; e H. Nakamura et al., Am.J.Respir. Crit.Care Med. , 149, 1037, 1994) .

Caratteristiche più salienti di queste patologie sono l'infezione batterica cronica delle vie aeree e l'accumulo nelle stesse di grandi quantità di neutrofili PMN che sono responsabili dei danni tissutali e delle ipersecrezioni che accompagnano le varie malattie polmonari. Le ricorrenti infezioni batteriche che ne contraddistinguono il decorso, spesso infausto, concorrono all'esacerbazione di queste manifestazioni. La Pseudomonas aeruginosa, uno dei microorganismi infestanti più diffusi in queste patologie, si contraddistingue per la proprietà di indurre e stimolare la produzione di IL-8 da parte delle cellule epiteliali delle vie aeree, così da favorire, come concausa dell'attivazione di neutrofili, l'amplificazione del danno tissutale, sia indirettamente, attraverso il rilascio di enzimi dei neutrofili, quali elastasi e catepsine, sia direttamente, promuovendo la formazione di radicali dell'02 e di acido ipocloroso, cioè di specie citotossiche (P.P. Massion et al J. Clin . Inv . , 93, 26 , 1994 e P.J. Jorens et al., 263, 1708 , 1993) .

In modelli sperimentali di glomerulonefrite nel coniglio, da endotossina o da albumina bovina, la somministrazione endovenosa di anticorpi verso l'IL-8, ha effetti imponenti per la consistente riduzione dell'escrezione urinaria di proteine, da 3,2 mg/h a 0,9 mg/h, e per la prevenzione dei processi di fusione del podocita glomerulare (T. Wada et al., J. Exp.Med. , 180, 135, 1994) .

Come per altre citochine, l'inibizione selettiva della sintesi o dell'azione dell' IL-8 può risultare in un beneficio terapeutico; uno dei modi possibili per realizzare questo obiettivo potrebbe essere la neutralizzazione dell'attività della citochina nei fluidi extracellulari e nella circolazione ematica ricorrendo all'uso di anticorpi o di recettori solubili o di proteine che leghino 1'IL-8 in alternativa all'impiego di antagonisti recettoriali.

L'acido 4-[3-(4-fluorofenil)]-2- [[4-(N-3-{2-chinolinmetossi)fenil) ]amino]fenilpropilbenzoico (ETH-615), un noto inbitore della sintesi dei leucotrieni, inibisce la chemiotassi dei leucociti PMN indotta dalla citochina IL-8 e dal leucotriene LTB4 e solo debolmente da N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (FLMP o fLMP). Benché privo di effetti sulla migrazione delle cellule T stimolata da questi agonisti, esso è stato recentemente proposto per studi clinici nella terapia di malattie infiammatorie della pelle, caratterizzate da alti livelli di IL-8 e di leucotriene LTB4 (M.Kristensen et al., Exper. Dermatol .,2, 165, 1993).

L'aumento del [Ca<2 >]i nei neutrofili PMN è l'evento che segna e determina la loro attivazione in seguito alla stimolazione da parte di diversi agonisti, per comprendere fra gli stimolanti endogeni il leucotriene LTB4, il PAF ed il fattore C5a del complemento, oltre all'IL-8 ed al tripeptide di sintesi N-formil-metionilleucil-fenilalanina (FLMP). La trasduzione del segnale, a livello recettoriale e post-recettoriale, che determina 1'aumento della concentrazione intracellulare di ioni Ca<2+ >[Ca<2+>]] in queste cellule infiammatorie è stimolo-dipendente e la produzione di anione superossido può essere presa a misura di questa attivazione.

La leumedina o N-Fmoc-L-Leucina (NPC-15669), appartenente ad una serie di Fmoc-amminoacidi, inibisce nei neutrofili PMN l'aumento del [Ca<2+>]i stimolato dal FLMP, ma non quello dovuto ad altri agonisti (R. J. Smilth et al., Bri t. J. Pharmacol., 114, 1694, 1995) . Altre leumedine sono state descritte inibire il reclutamento di neutrofili mediato da IL-8 nelle vie aeree del cane (P. G. Jorensen et al., Europ. Respir. J. , 7, 1935, 1994) .

E' per altro noto che i farmaci antiinfiammatori non sferoidali (FANS), se inibiscono la sintesi di prostaglandine (PG), non influenzano la produzione ed il rilascio delle chemiochine chemiotattiche MCP-1 ed IL-8. All'opposto, in uno studio comparativo, il desametazone, in maniera ottimale, e, in misura sub-ottimale, alcuni farmaci antireumatici, quali il sodio tiomalato ed il metotrexate, inibiscono il rilascio di queste citochine suggerendo che parte dell'azione antireumatica dei glucocorticoidi sia dovuta alla prevenzione dell'accumulo di citochine chemiotattiche che agiscono sui neutrofili e sui monociti (P.Loetscher et al., Cytokine, 6, 162 , 1994 ) .

Così, ad esempio, nei sinoviociti umani, la produzione di IL—8 stimolata da interleukina-1 e TNF-α non è inibita da tipici antiinfiammatori non steroidali, come l'acido tioprofenico, l'indometacina, il naproxene ed il piroxicam (P.Loetscher et al Cytokìne, 6, 162 f 1994) .

Dopo somministrazione per via intradermale, lo sviluppo dell'edema nel sito infiammato richiederebbe la presenza contemporanea di IL-8 e PGE2 mentre i singoli co-fattori non sarebbero, a loro volta, capaci di indurre la formazione di edema (M. Rampart et al .,Am.J.Path., 135,21,1989) anche se un effetto pro-edematoso è stato descritto per la sola citochina IL-8 (I. Colditz, ibidem, 134 , 755, 1989) .

L'uso di (±) ibuprofene, o acido p-isobutilidratropico, e di (±) flurbiprofene, o acido 3-fluoro-4-fenilidratropico, come quello dei loro C1-8-alchilesteri e di loro sali farmaceuticamente accettabili, è stato rivendicato nel trattamento di malattie respiratorie e, più particolarmente, dell'insufficienza respiratoria acuta in EP 70714 (07.05.1986).

(±)Ketoprofene, (±)ibuprofene e {±)flurbiprofene sono esempi di antiinfiammatori non steroidali di largo impiego in terapia come racemati, a differenza del naproxene, di cui è utilizzato il solo enantiomero (S) per il trattamento di una varietà di sintomatologie. Queste includono, accanto al dolore dentale e ad altre sintomatologie dolorose, l'infiammazione acuta, le malattie reumatiche e degenerative delle giunture, l'adesività delle piastrine e l'infarto coronarico, nel caso dell'ibuprofene.

Si ritiene che, analogamente a quanto avviene per l'acido acetilsalicilico, la potenza e l'efficacia terapeutica di questi acidi 2-arilpropionici dipenda dalla comune proprietà di inibire l'enzima cicloossigenasi (CO) che converte l'acido arachidonico in prostaglandine (PG) algogene, pro-infiammatorie, delle quali la PGE2 è l'esemplare più tipico.

Le PG svolgono un ruolo importante nella produzione del dolore, dell'infiammazione e della febbre per cui i succitati composti sono utilizzati come farmaci analgesici, antiinfiammatori ed antipiretici.

Quando sono somministrati in singola dose od in una terapia intermittente e di breve termine, essi forniscono un'adeguata analgesia per risolvere il dolore, da mite a moderato, mentre una loro somministrazione per parecchi giorni, ed anche per settimane, è, il più delle volte, richiesta perchè divengano evidenti i loro effetti antiinfiammatori.

Sebbene vi siano molti studi comparativi fra singoli antiinf iammatori non steroidali od di uno verso più di essi, non vi è un confronto generalizzato che permetta di definire un ordine di efficacia. Si ritiene, per lo più, che vi siano piccole differenze di attività antiinf iammatoria tra di essi e la scelta del farmaco da parte del medico è piuttosto empirica. Per contro, le risposte individuali del paziente possono variare fortemente fra loro; così, se un paziente non risponde ad un farmaco, un altro può avere successo. Tuttavia, viene raccomandato di preferire l'uso di FANS con il più basso rischio di tossicità gastro-intestinali ed alle più basse dosi efficaci.

Più recentemente è stato proposto che i farmaci antiinfiammatori non steroidali (FANS) agiscano attraverso l'inibizione di due isoforme della cicloossigenasi (COX-1 e COX-2); la inibizione della COX-1 sarebbe associata con gli effetti collaterali a livello gastro-intestinale che talvolta si osservano con gli acidi arilacetici e 2-arilpropionici, mentre quei FANS che sono inibitori altamente selettivi della COX-2 avrebbero minori tossicità gastro-intestinali (Martindale, The Extra Pharmacopoeia , 31st Ed. , 72, 1996) . In realtà, il processo di inibizione enzimatica delle due isoforme della CO, COX-1 e COX-2, e quindi il blocco delle PG pro-infiammatorie, pro-algogene e propiretiche, è un processo stereospecifico.

I soli enantiomeri (S) degli acidi 2-arilpropionici, che inibiscono la produzione di PGE2, sono unanimemente considerati i principali effettori dell' attività antiinfiammatoria degli acidi 2-arilpropionici (D. Mauleon et al., Drugs, 52_,24 (1996) . Gli enantiomeri <R) sono sostanzialmente privi di ogni effetto sull'enzima e sulla sintesi delle PG; una qualche attività è osservata a dosaggi molto elevati, da 100 a 1000 volte superiori a quelli dell'altro enantiomero, che eccedono i livelli plasmatici ottenibili con queste sostanze (10<-9>-10<-6 >M/L); ne segue come essi siano stati ritenuti, per lungo tempo, di irrilevante utilità terapeutica.

In realtà, gli enantiomeri (R) degli acidi 2-arilpropionici subiscono in vivo, prevalentemente a livello epatico ed in maniera del tutto trascurabile in altri tessuti, ad esempio, nei macrofagi peritoneali di topo, bìoconversione nell'enantiomero (S) per attivazione stereoselettiva dei loro tioesteri con il CoA (S.Menzel-Soglowek et al . , Bìochem. Pharmacol . , 4_3, 1487, 1992) , e possono così concorrere all'attività globale del racemato.

La misura in cui avviene, in vivo, la bioconversione degli acidi (R)2-arilpropionici negli enantiomeri (S)2-arilpropionici dipende dalla specie animale considerata e dalla particolare struttura chimica del composto. La bio-conversione (R)->(S), che è pressoché totale nel ratto e nell'uomo per l'ibuprofene, è praticamente assente (<5%) nell'uomo e nella cavia per gli enantiomeri (R) del flurbiprofene e del ketoprofene, questi pur essendo bioconvertiti nel ratto in eguale misura dell' ibuprofene (K.Brune et al., Experientia, 47 , 257, 1991 ; K.Brune et al. ,J. Clln. Pharmacol. , 32, 944, 1992) . Da sempre il ratto è stata la specie animale di scelta nei modelli sperimentali di infiammazione, algesia ed iperalgesia più usuali e consolidati in questi studi. Tuttavia, alla luce delle recenti conoscenze sulla bioattivazione metabolica in questa specie degli acidi (R)2-arilpropionici inerentemente inattivi, essa è la meno idonea proprio perchè non consente di determinare le proprietà potenziali di queste sostanze in quelle specie animali, uomo compreso, in cui la conversione metabolica di un enantiomero, l'enantiomero (R), nell'altro, l'enantiomero (S), non ha luogo od avviene in maniera estremamente limitata.

Tanto è che solo recentemente (K. Brune et al ., Experientia (1991) ) è stata dimostrata nell'uomo per gli enantiomeri (R) degli acidi 2-arilpropionici, che nell'uomo, come il flurbiprofene ed il ketoprofene, non subiscono attivazione metabolica, la proprietà di bloccare la percezione del dolore con una potenza almeno simile a quella dell'enantiomero (S).

D'altro lato, la conoscenza del contributo dei singoli enantiomeri all'attività globale di un racemato in modelli sperimentali che escludano fenomeni di bioconversione metabolica è indispensabile per avere una previsione predittiva dell'effetto terapeutico che è da attendersi nell'uomo dopo somministrazione del racemato. Ciò è stato reso possibile utilizzando la cavia come animale da esperimento, in luogo del ratto (P.Ghezzi et al., J. Pharmacol . Exp. Ther. 1997) in un classico modello sperimentale quale 1'iniezione sub-plantare di carrageenina nella zampa destra, il quale consente la valutazione contemporanea dell'inibizione della formazione dell'edema e dello sviluppo dell'iperalgesia da parte dei sali di L-lisina dell'(S)- e dell'(R)-ketoprofene in confronto al sale di L-lisina del ketoprofene racemo, utilizzando 1'indometacina, un acido arilacetico achirale, come standard interno positivo. Nell'intervallo di dosi da 25 a 750 μmoli/kg, il sale dell'enantiomero (S) inibisce la formazione dell'edema in modo dose-dipendente, per raggiungere la significatività statistica a 75 μmoli/kg ed il suo valore massimo di attività a 250 μmoli/kg, per declinare successivamente. Un'inibizione significativa dello sviluppo dell'edema è osservata anche per il sale dell'enantiomero (R), ma solo a partire dalla dose di 250 μmoli/kg, in modo dose-dipendente sino alla dose di 750 μmoli/kg, anche se con una diversa pendenza delle curve dose-effetto, lasciando così supporre un diverso meccanismo d'azione.

Per contro, nell'intero intervallo di dosi da 75 μmoli/kg sino a 250 μmoli/kg si osserva una pronunciata inibizione, dose-dipendente, dell'iperalgesia per il sale di L-lisina dell'(R)ketoprofene . Questo effetto diviene massimo al più alto dosaggio; all'opposto nello stesso intervallo di dosi si osserva un debole effetto inibitorio dell' iperalgesia da parte del sale di L-lisina dell'enantiomero (S) che raggiunge la significatività statistica solo al dosaggio maggiore di 750 μmoli/kg.

Costantemente 1'effetto anti-edematoso ed antiiperalgesico del sale di L-lisina del racemato si attesta su valori intermedi rispetto a quelli valutati per i singoli enantiomeri per concludere che, in assenza di bioconversioni a carico dell'enantiomero (R), l'attività globale del racemato è da attribuirsi all' enantiomero (S) per gli effetti anti-edematosi ed all' enantiomero (R) per il controllo dell'iperalgesia, una conclusione che è sostanzialmente in accordo con quanto 'proposto nel succitato articolo di K. Brune.

La cavia è una specie inerentemente resistente all'azione gastrolesiva dei farmaci antiinflaminatori non steroidali da non consentire la comparazione degli effetti dei due enantiomeri per questo specifico parametro, a meno di fare ricorso a dosi di farmaco così elevate da non avere alcun significato predittivo. Per questo aspetto, il ratto è necessariamente, ancora una volta, la specie di riferimento anche se la meno adatta. I risultati dello studio comparativo in questo modello indicano, senza ombra di dubbio, la minore propensione dell'enantiomero (R) alla formazione di ulcere. Le differenze fra enantiomeri e racemato divengono statisticamente significative alla dose di 40 μmoli/kg, essendo possibile valutare per 1'enantiomero R uno "score ulcer" pari a 2 a fronte di uno "score ulcer" di 3 e 4 per il racemato e per 1'enantiomero (S).

Uno studio parallelo sugli effetti dei sali di L-lisina di (R)- ed (S)-ketoprofene e del sale di L-lisina del ketoprofene racemo sull'inibizione del rilascio di PGE2, TNF-α ed IL-Ιβ da parte dei macrofagi peritoneali di topo stimolati da lipopolisaccaridi (LPS), ha consentito un'interessante interpretazione di quanto prima esposto. Il sale di L-lisina di (S)-ketoprofene inibisce la produzione di PGE2 lungo tutto l'intervallo di dosi da 10<-6 >sino a 10<-9 >M, mentre lo stesso effetto è osservabile per il sale dell'(R)ketoprofene solo nell'intervallo compreso fra 10<-6 >e 10<-5 >M. Per contro, e sorprendentemente, il sale di L-lisina di (S)-ketoprofene e il sale di L-lisina del racemato stimolano la produzione di TNF-α, in maniera dose-dipendente raggiungendo la significatività statistica nell'intervallo da 10<-8 >a 10<-6>M, e quella di IL-Ιβ. In quest'ultimo caso la significatività statistica è raggiunta solo alla concentrazione 10<_5>M.

All'opposto il sale di L-lisina di (R)-ketoprofene è completamente inerte e non stimola il rilascio di queste citochine entro tutto 1'intervallo di concentrazioni da 10<-9 >a 10<-5>M.

Speculativamente, la bassa tollerabilità gastrica dei sali di lisina dell'(S)-ketoprofene e del ketoprofene racemo potrebbe essere la conseguenza diretta della stimolazione del rilascio ("up regulation) di TNF-α (C.B. Appleyard et al. , Am. J. Physiol ■ , 270, G-42, 1996) piuttosto che del blocco della sintesi di PGE2, come si è sino ad ora ritenuto.

La stessa "up-regulation" del TNF-α fornisce inoltre una chiave di lettura della minore efficacia dei sali del racemato e dei sali dell'(S)ketoprofene nel controllo dell'iperalgesia rispetto ai sali dell'enantiomero (R) proprio per il fatto che detto enantiomero, a differenza dei precedenti sali, non amplifica la produzione di citochine infiammatorie.

Questi risultati sono sostanzialmente in accordo con quelli desumibili da uno studio comparativo dell'attività topica antiinfiammatoria del ketoprofene e dei singoli enantiomeri nell'eritema dell'epidermide di cavia da radiazioni ultraviolette. Per quanto ne risultasse per 1'enantiomero (R) un'efficacia pari a 53,1±4,6% di protezione, del tutto simile e statisticamente significativa (p<0.05) verso il ketoprofene racemo 56.1±3,1, ed entrambi inferiori a quella pari a 73,414,0% ottenuta con l'enantiomero (S), il complesso dei risultati ottenuti in altri modelli sperimentali di infiammazione, quali nel ratto su edema da carrageenina e nel topo su edema dell'orecchio da croton oil, lasciavano concludere che l'efficacia antiinfiammatoria "in vivo" dell'enantiomero (R) era significativamente inferiore a quella del racemo e dell'enantiomero (S). Simili conclusioni sono tratte da Suesc et al., Chirality,5, 589 , 1993 sulla base dell'inibizione della sintesi di TXB2 nei leucociti PMN umani e nelle piastrine di ratto che nel caso dell' (R)ketoprofene si manifesta solo per dosaggi da 2 a 3 ordini di grandezza superiori a quelli dell'enantiomero S e del racemato.

Per contro, in un modello di infiammazione indotta nel ratto con acido acetico, è stata trovata una significativa riduzione (p<0,l) della produzione della interleuchina IL-8 da 53,8 pg/ml a 22,4 e 16,9 pg/ml dopo somministrazione di 200 e 100 mg/kg di (±) ketoprofene (l.M.Wang et al., Drugs Exper. Clin. Res. ,23, 1 , 1997) .

In uno studio su pazienti affetti da artrite reumatoide, nella fase iniziale della malattia, la somministrazione di 200 mg di ketoprofene per 10 giorni determina un ritorno alla norma dell' indice chemiotattico e dell'aderenza dei leucociti PMN, che era aumentato, una riduzione della fagocitosi mentre la funzione battericida non risulta significativamente influenzata. Inoltre, 1'attività chemiotattica, indotta da zimosan, un attivatore della via del complemento, era inibita sia nei volontari sani che nei pazienti oggetto dello studio (E.Bacino et al Clin. Exper. Reumatol . , 5 ,50, 1987) .

Successivamente, lo studio degli effetti "antiinfiammatori '' indipendenti dal blocco della sintesi delle prostaglandine dei farmaci antiinfiammatori non steroidali è stata oggetto di grande dibattito e di indagine in particolare per quanto riguarda 1'inibizione della funzionalità dei neutrofili PMN umani ed il meccanismo, ancora sostanzialmente ignoto, che ne regola 1'intervento.

Così, ad esempio, se da una parte si riteneva che farmaci come il ketoprofene, il flurbiprofene, il sudoxicam, il fenofrene e 1'indometacina, dopo somministrazione orale, inibissero la formazione di un essudato pleurico da carrageenina nel ratto per la loro capacità di inibire la migrazione nella cavità pleurica delle cellule polimorfonucleate, ma non quella dei monociti (A.Blackam e R.T.Owen, J. Pharm. Pharmacol ,27, 201, 1915) , veniva successivamente, per alcuni di essi tra i quali lo stesso ketoprofene, dimostrato esattamente l'opposto (S.C.R. Meacock e E.Ann Kitchen, Future Trands Inflammation, Proc. Int.Meet . ,2nd (1975) 320, J.P. Giroud et al, Eds, Birkhaeuser, Basel).

Più recentemente, è stato dimostrato che, nel caso dei fenamati, un particolare sottogruppo di FANS, specificamente acido flufenamico ed acido tolfenamico, l'inibizione dell'attivazione neutrofilica, indotta dall'ionoforo del Ca<2+ >e dal peptide chemiotattico FMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina) è supposta essere dovuta al blocco dell'entrata di ioni Ca<2+ >come sarebbe dimostrato da studi che valutano l'influsso di ioni Mn<2+ >e di ioni <45>Ca<2+>.

La peculiarità di questi fenamati rispetto ad altri farmaci antiinflaminatori non steroidali sta proprio nel fatto che il ketoprofene, assunto come tipico inibitore della sintesi dei prostanoidi, è risultato del tutto inattivo parimenti alla nifedipina, un inibitore dei canali del Ca<2+ >voltaggio indipendenti, a differenza del lH-imidazolo 1-[2-{4-metossifenil-2- [3-(4-metossifenil) propossi]etil] monocloridrato (SK&F 96365), un bloccante non selettivo dei canali del Ca<2+ >(H.Kankaanranta e E. Moilanen, Molec. Pharmacol . ,47_,1006,1995).

Abbiamo ora trovato, e ciò è oggetto della presente invenzione, che i sali di (R)- ed (S)-ketoprofene con basi organiche chirali e non chirali inibiscono in maniera dose-dipendente l'aumento della concentrazione intracellulare di ioni Ca<2+ >([Ca<2+>]i) indotta da IL-8 nei leucociti PMN umani, quando siano somministrati all'uomo in intervalli terapeutici, cioè per concentrazioni da 10<-9 >a I1<06 >molare.

In Tabella 1 sono illustrati i risultati ottenuti utilizzando, nel modello sperimentale descritto da C.Bizzarri et al., (Blood, 86, 2388, 1995) , i sali diastereoisomerici di L-lisina di (R) ed (S)ketoprofene, preparati secondo quanto descritto da E.Bosone et al., nella domanda di brevetto WO 94/20449 (15.09.94).

Tabella 1. Effetto dose-dipendente dei sali di L-Lisina di (R)- ed (S)-ketoprofene sull'aumento della concentrazione di [Ca<++ >] i indotta da IL-8.

I risultati, descritti in Tabella 1, si riferiscono cumulativamente ad 8 esperimenti (8 donatori, di cui si è avuto esplicito consenso, da 3 a 7 cellule per vetrino). I leucociti PMN erano considerati responsivi all'IL-8 quando la [Ca<++>]i rispondeva allo stimolo di IL-8 con un aumento superiore al 34% del valore di base (normalizzato a 100%). Le risposte, che sono state espresse come percentuale rispetto ai valori basali di [Ca<++>]i e rappresentano la media dei valori delle cellule responsive, includono, in parentesi, le deviazioni standard (± SEM). Per ciascun gruppo, la percentuale di cellule non responsive era del 30% eccetto nel caso del pretrattamento con concentrazioni 10<_6>M dei farmaci. IL-8: 50 ng/mL.

Gli effetti inibitori sulla risposta all'IL-8 indotta dai farmaci in oggetto sono da ritenersi essere la conseguenza diretta di un blocco selettivo dell'influsso del catione Ca<2+ >nel leucocita PMN (vedi Tabella 2) come è evidenziato da uno studio comparativo di competizione con ioni di lantanio in presenza di IL-8 piuttosto che di un'interazione recettoriale o con l'espressione, cioè il numero, di recettori per l'IL-8.

Tabella 2 . Ruolo dei canali del Ca2+ sugli effetti inibitori dei sali di L-lisina di <R)- ed (S)-ketoprofene .

I risultati descritti in Tabella 2 sono cumulativi di tre esperimenti (tre donatori, da tre a sette cellule per vetrino). I neutrofili (PMN) umani erano considerati responsivi all'IL-8 quando la [Ca<++>]i era alimentata in misura maggiore del 34% sul valore basale (normalizzato al 100%). Le risposte sono espresse come percentuali del valore basale [Ca<+>]i e rappresentano la media di valori delle cellule responsive (sono riportati l'errore standard ±SEM ed entro le parentesi il numero delle replicazioni) . Le percentuali di cellule non responsive cadono per ciascun gruppo entro il 30% circa. Le concentrazioni dei sali di L-lisina di (R)- ed (S)-ketoprofene utilizzate nell'esperimento sono state 10-8M, quella del La<+++ >è stata ΙΟμΜ e per 1'IL-8 la dose impiegata è stata 50 ng/mL.

Questi risultati mettono in luce per i composti in oggetto una proprietà nuova e finora ignota, quale quella di agire a livello post-recettoriale come antagonisti dell'aumento del Ca<2+ >intracellulare dipendente dall'apertura dei canali di membrana (azione prevenuta dai sali di lantanio) , così da impedire 1'insorgere nei neutrofili della sequenza di eventi indotta da IL-8 attraverso l'effetto primario di aumento delle concentrazioni intracellulari di ioni Ca<2+>. Questa sequenza di eventi, anche definibile come attivazione neutrofilica, sono la degranulazione dei neutrofili con il rilascio di elastasi e catepsine ed altri enzimi e la chemiotassi .

Nella successiva Figura 2, sono riportati (nella forma di istogrammi) i risultati di esperimenti volti a dimostrare gli specifici effetti dei sali di L-lisina di (R)- and (S)-ketoprofene e dei sali di lantanio sull' inibizione della degranulazione di PMN neutrofili umani .

Figura 2. Inibizione della degranulazione di neutrofili PMN umani indotta da IL-8 da parte dei sali di Lantanio e dei sali di L-lisina di (R)- e (S)-ketoprofene.

I neutrofili PMN umani (lOVmL) erano stati stimolati in presenza di citoclasina B (10<-5>M) con IL-8 (50ng/ml) a 37°C per 30 minuti. Il La<3+ >era aggiunto 5 minuti prima dell'IL- 8 ed i sali di lisina di (R)- ed {S)-ketoprofene erano aggiunti 15 minuti prima dell' IL-8. L'avvenuta degranulazione del neutrofilo viene valutata determinando la quantità di elastasi che viene rilasciata nel surnatante deprivato di cellule ed è espresso come Δ0Dxl0<3>/minuto.

I risultati, rappresentati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti (**P<0,05 verso IL-8), dimostrano un pieno parallelismo di effetti delle sostanze saggiate e sono pienamente congruenti con il supposto meccanismo d'azione.

Nella successiva Figura 3 sono riportati, in forma di istogrammi, i risultati di esperimenti volti a dimostare gli specifici effetti dei sali di L-lisina di (R)- e di (S)-ketoprofene sull'inibizione della migrazione chemiotattica stimolata da IL-8.

E' stato inoltre trovato che l'effetto inibitorio operato dai sali di L-lisina di (R)- and (S)-ketoprofene non si limita alla stimolazione della chemiotassi indotta dall'IL-8, ma si estende, sorprendentemente, agli effetti indotti da altri stimolanti fisiologici (C5a) e non fisiologici (FMLP) i cui stimoli sono regolati, anche se in maniera diversa, dalla concentrazione intracellulare di ioni Ca<2+>.

I neutrofili erano stati preincubati a 37°C in assenza, colonna bianca, od in presenza dei sali di L-lisina di (R)- e (S)-ketoprofene (10<_6>Μ) per 10 minuti e quindi era stata valutata la loro capacità di migrare in risposta agli stimoli con C5a, FLMP (N-formil-metionilleucilfenilalanina) ed IL-8. I risultati sono espressi come la media ± SD di tre esperimenti separati (**P<0,01% verso ciascun gruppo).

Figura 3. Effetti dei sali di L-lisina di (R)- ed (S)ketoprofene sulla migrazione chemiotattica di neutrofli PMN umani indotta da IL-8, C5a, e da FMLP.

Nella successiva Tabella 3, sono esemplificati i risultati di singoli esperimenti volti a valutare analiticamente l'attività Ca-antagonista (intesa come inibizione dell'aumento della [Ca<2+>]i) dei sali di Lilisina di (R)- e (S)-ketoprofene (10<_6>M) verso gli altri stimolanti non-fisiologici e fisiologici FLMP (10<-7>M) e C5a (10<-8>M).

I risultati esposti nella Tabella 3 sono cumulativi di sei esperimenti (sei donatori, da tre a sette cellule per vetrino). I neutrofili PMN umani erano considerati rispondere allo stimolo di FMLP e C5a, uno dei costituenti del complemento, quando il conseguente aumento della [Ca<++>]i era maggiore del 34% sopra il valore basale (normalizzato come 100%). Le risposte sono espresse come percentuali rispetto al valore basale della [Ca<++>]i e rappresentano la media dei valori ottenuti per le cellule responsive allo stimolo; n indica il numero delle replicazioni e la deviazione standard è espressa come ±SEM. Le percentuali di cellule non responsive erano 0 nel caso dei neutrofili PMN umani trattati con FMLP e solo il 50% per quelle trattate con i sali di L-lisina di (R)- ed (S)-ketoprofene e stimolate con il complemento C5a.

Tabella 3. Effetto dei sali di L-lisina di (R)- e (S)-ketoprof ene sull'aumento di [Ca<+*>]i indotto da FMLP e C5a.

Da quanto sopra appare chiaro che i sali di L-lisina dei due enantiomeri (R)- ed (S)-ketoprofene esercitano i loro effetti di inibizione della chemiotassi, verso il sito di infiammazione, e della degranulazione dei neutrofili umani indotta da IL-8, interagendo con l'aumento della concentrazione intracellulare di ioni Ca<2+ >nei neutrofili stessi da essa indotto. L'inibizione di questa specifica azione dell'IL-8, come dell'aumento della [Ca<2+>]i indotta dal complemento (C5a) e da FMLP, sono specifici indicatori che l'aumento del [Ca<2+>]i è il segnale che avvia l'attivazione del neutrofilo stesso per indurne il processo atto ad amplificare e sostenere il processo infiammatorio, indipendentemente dalla causa stimolante sia essa di origine batterica od altro. L'inibizione da parte dei sali di lisina di ketoprofene è condiviso in eguale maniera dai due enantiomeri ed è quindi del tutto indipendente dalla configurazione sferica del sostituente metilico di questo particolare acido 2-arilpropionico.

Questi stessi effetti sono del tutto indipendenti dalla controbase organica utilizzata nella formazione del sale; se desiderato, la controbase può essere scelta nel gruppo di D-lisina, arginina, Levodropropizina e Destrodropropizina e/o di basi organiche non-chirali farmaceuticamente accettabili, ad esempio, quelle notoriamente utilizzate nella comune tecnologia farmaceutica come glucamina, trometamina, dietilammina, imidazolo e glicina.

L'enantiomero (R)-ketoprofene ed i suoi sali si distinguono dal ketoprofene racemo e dall'enantiomero (S) e dai sali di questi ultimi per non partecipare all'inibizione degli enzimi della CO (COX-1 e COX-2) e per essere sostanzialmente privi degli effetti biologici che accompagnano l'inibizione di queste isoforme dell'enzima, quali la gastrolesività e l'inibizione dell'aggregazione piastrinica. A questo riguardo, assumendo 1'inibizione della sintesi del TXB2 nel sangue umano in toto come un'indice dell'attività antiaggregante piastrinica di queste sostanze, le concentrazioni micromolari inibenti per il 50% detta sintesi (IC50 in μΜ) sono state calcolate essere rispettivamente 0,42±0,04; 0,16±0,04 e 9,75±0,75 per il ketoprofene racemo, 1'(S)-ketoprofene e 1'(R)-ketoprofene, riflettendo la diversa potenza di questi composti nell'inibizione dell'isoforma COX-1 della cicloossigenasi .

Ne segue che meglio del ketoprofene racemo e dell'(S) ketoprofene, 1' (R)-ketoprofene ed i suoi sali si prestano per la preparazione di formulazioni farmaceutiche utili per il trattamento di patologie e manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, 1'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite; il loro uso per i predetti scopi è del tutto nuovo ed inaspettato.

La sintesi del ketoprofene racemo può essere eseguita a partire dal 4-benzoil-2-(l-metilprop-2-en-l-il )fenolo secondo il procedimento descritto nella domanda di brevetto Italiana n°MI96A 001683 depositata il 02.08.1996 a nome della Richiedente. La separazione ottica del ketoprofene nei suoi enantìomeri (S) ed (R)-ketoprofene e la successiva preparazione dei sali enantiomericamente puri di (R)ketoprofene con basi organiche chirali ed achirali può essere eseguita secondo il procedimento descritto nella domanda di brevetto WO 94/20499 depositata il 15.09.1994 a nome della Richiedente, che include anche composizioni farmaceutiche che contengono questi sali.

Per gli scopi della presente invenzione, composti particolarmente preferiti sono 1' (R)ketoprofene nella forma di acido libero ed i sali di detto (R)ketoprofene con basi inorganiche ed organiche farmaceuticamente accettabili. Più particolarmente preferiti sono i sali dell 'enantiomero (R)ketoprofene con basi organiche achirali quali la trometamina e con basi organiche chirali scelte nel gruppo di L-lisina, D-lisina, L-arginina, (R) ed (S) 3-(4-fenilpiperazin-l-il)-propan-2,3-diolo, dei quali è stata precedentemente descritta la preparazione come singoli individui chimici e l'uso nella formulazione di composizioni farmaceutiche che li contengono nella forma di compresse, tavolette, capsule, granulati, polveri, emulsioni, soluzioni, creme pomate, supposte, schiume e spray, liquidi, gocce e soluzioni sterili ad uso iniettabile.

Rientrano nello scopo della presente invenzione anche preparazioni estemporanee di questi sali che derivano dalla salificazione di quantità equimolecolari di (R)ketoprofene con quantità equimolecolari di un amminoalcool di comune uso farmaceutico. Gli aminoalcooli utili per una salificazione estemporanea sono scelti nel gruppo costituito da etanolammina, 3-ammino-l-propanolo, (R)-l-amino-2-propanolo, (S)-lamino-2-propanolo, 2-amino-l,3-propandiolo, N-{2-idrossietil)pirrolidina, D-glucamina e L-prolinolo, D-glucosamina ed N-metilglucosamina . La reazione di salificazione estemporanea può essere eseguita in acqua, in solventi idroalcoolici, preferibilmente etanolo acquoso, od in un alcool a basso peso molecolare come metanolo ed etanolo.

La quantità di principio attivo, valutata come acido, che viene somministrata giornalmente dipende dal tipo di somministrazione scelta, dall'età e dallo stato di salute del paziente.

Nel caso di somministrazioni per via orale la dose varia da 15 a 200 mg e può essere suddivisa in parecchie dosi o come singola dose, se a rilascio controllato, e nel caso di una somministrazione per via iniettabile essa varia da 5 a 100 mg eventualmente, se desiderato, suddivisibile. Per una somministrazione topica sono convenienti concentrazioni dallo 0,5% al 10%. Nel caso di una somministrazione sub-linguale possono essere somministrate singole dosi da 5 a 50 mg fino ad una dose totale giornaliera che non ecceda i 200 mg; singole dosi da 5 μg a 100 μg possono essere somministrate per aerosol fino a raggiungere la dose di 800 μg come somministrazione totale per questa via. Concentrazioni dallo 0,1% al 2% sono previste per la somministrazione per spray nasale mentre concentrazioni dal 5 al 10% sono utilizzate per la preparazione di colluttori.

Nel caso di formulazioni a lento rilascio di (R)— ketoprofene e dei suoi sali, sono possibili formulazioni in cui il principio attivo è presente come una forma a lento rilascio combinata con una forma a rilascio rapido. Entrambi i tipi di formulazioni sono ben noti nell'arte e preparati utilizzando metodi convenzionali. In queste formulazioni la massa supportante, in una quantità compresa fra il 10 e l'80%, può essere costituita da eccipienti come lattosio, cellulosa microcristallina, cellulosa polverizzata, amido e varie maltodestrine, calcioidrogenofosfato, silici e loro miscele in presenza di leganti (in una concentrazione fra il 2 ed il 10%) quali polivinilpirrolidone, alginati, sodiocarbossimetilcellulosa, amidocarbossimetilcellulosa, in presenza o meno di lubrificanti in una concentrazione da circa 1'1% al 5%.

Esempio 1

Una compressa di (R)-ketoprofene sale di L-lisina contiene in mg:

(R)-ketoprofene sale di L-lisina* 100 polivinilpirrolidone insolubile 10

cellulosa microcristallina 125

magnesio stearato 10

*il contenuto in principio attivo può essere variato nell'intervallo da 23 a 315 mg per compressa.

Esempio 2

Una soluzione iniettabile di (R)-ketoprofene sale di L-lisina ripartita, in ambiente di azoto, entro ampolle sigillate contiene in mg per mi di soluzione acquosa: (R)-ketoprofene sale di L-lisina 80

acido citrico 2,5

sodio idrato 1,5

essendo il pH di detta soluzione compreso entro un valore da 7,0 a 7,5.

Esempio 3

Sotto agitazione ed in atmosfera di azoto e sotto gorgogliamento d'azoto, ad una sospensione di 762,8 g (3 M) di (R)-ketoprofene finemente suddiviso in 3 1 di acqua sterile, previamente disaerata, è aggiunta una soluzione di 543,57 g di D-glucamina (3 M) in 1 1 di acqua sterile previamente disaerata e si agita fino a completa soluzione.

La massa viene allora diluita con una soluzione di 37,5 g di acido citrico (c.a. 0,195 M) e 22,5 g di idrato di sodio (0,5625 M) in 8 1 di acqua sterile previamente disaerata. La soluzione così ottenuta, se necessario, viene addizionata di idrossido di sodio quanto basta per ottenere un valore di pH compreso fra 7,0 e 7,5. Si porta il volume della soluzione ad un volume finale di 15 1 e si agita per assicurare la totale omogeneità della soluzione.

Detta soluzione viene allora filtrata, sotto pressione ed in atmosfera di azoto attraverso cartucce da 0,22 μ, per essere raccolta in adatti contenitori schermati e protetti dalla luce e da radiazioni luminose dell'UV e quindi immessa nella macchina infialatrice per la ripartizione in ampolle di vetro, del volume desiderato, che vengono quindi sigillate in ambiente di azoto.

La composizione della soluzione iniettabile, così ottenuta, contiene per mi di soluzione mg:

(R)-ketoprofene sale di D-glucamina 80,42

acido citrico 2,5

sodio idrato 1,5

Esempio 4

Utilizzando nel processo di salificazione estemporanea dell'Esempio 3, in luogo della D-glucamina, quantità equimolecolari di un'ammina farmaceuticamente accettabile scelta nel gruppo formato da etanolammina, 3-ammino-l-propanolo, (R)-l-amino-2-propanolo, (S)-lamino-2-propanolo , 2-amino-l,3-propandiolo, N-(2-idrossietil )pirrolidina, D-glucosamina e L-prolinolo ed N-metilglucosamina sono ottenute soluzioni iniettabili contenenti i corrispondenti sali di (R) ketoprofene.

Esempio 5

In 100 mi di acqua demineralizzata vengono disciolti 3 g di polivinilpirrolidone, 3 g di sodio saccarinato e 11,75 g di D-glucosammina. A solubilizzazione avvenuta si aggiungono 16,67 g di (R)-ketoprofene e si agita fino a completa dissoluzione.

Questa soluzione, se desiderato, può essere utilizzata come fase legante in processi di granulazione che prevedano 1'impiego di granulatori a letto fluido o del tipo "higher shear mixer" come per granulatori ad impasto .

In un processo di granulazione a letto fluido, la predetta soluzione legante viene spruzzata su una miscela di eccipienti della seguente composizione in g: mannitolo 335

saccarosio 600

ammonioglicirrizzinato 13

sodio cloruro 7

aroma 10

Il granulato risultante viene essiccato fino ad un contenuto di umidità inferiore all'1% per essere poi calibrato tramite vibrovaglio con rete da 1 mm.

Se desiderato, il granulato viene allora ripartito in bustine da 3 g.

Esempio 6

Utilizzando nel processo di salificazione estemporanea dell'Esempio 5, in luogo della D-glucosamina, quantità equimolecolari di un'ammina farmaceuticamente accettabile scelta nel gruppo formato da etanolammina, 3-ammino-l-propanolo, (R)-l-amino-2-propanolo , (S)-1-amino-2-propanolo, 2-amino-l,3-propandiolo, N-(2-idrossietil)pirrolidina, D-glucamina e L-prolinolo ed N-metilglucosamina sono preparati dei granulati contenenti, come principio attivo, i corrispondenti sali di (R) ketoprofene.

Claims (13)

1. Rivendicazioni 1. Composizione farmaceutica adatta alla somministrazione orale, parenterale e topica utile nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, l'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite, caratterizzata dal fatto che essa contiene una quantità terapeuticamente attiva di un sale di (R)-ketoprofene con un'adatta base organica od inorganica opportunamente miscelata con adatti eccipienti farmaceuticamente accettabili .
2. 2. Composizione farmaceutica adatta alla somministrazione orale, parenterale e topica, utile nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrof ilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, l'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite, caratterizzata dal fatto che essa contiene una quantità terapeuticamente attiva di un sale di (R)-ketoprofene con un'adatta base organica chirale od achirale opportunamente miscelata con eccipienti farmaceuticamente accettabili.
3. 3. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto che l'adatta base organica chirale od achirale è scelta nel gruppo formato da L-lisina, D-lisina, arginina, levodropropizina, destrodropropizina, D-glucamina, trometamina, dietilanimina, imidazolo, glicina, etanolammina, 3-ammino-l-propanolo, {R)-l-amino-2-propanolo, (S)-lamino-2-propanolo, 2-amino-l,3-propandiolo, N-(2-idrossietil)pirrolidina, L-prolinolo, D-glucosamina ed N-metilglucosamina .
4. 4. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2 e 3, caratterizzata dal fatto che essa contiene il sale di L-lisina di (R)-ketoprofene.
5. 5. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2 e 3, caratterizzata dal fatto che essa contiene il sale di destrodropropizina di (R)-ketoprofene .
6. 6. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2 e 3, caratterizzata dal fatto che essa contiene il sale di levodropropizina di (R)-ketoprofene. 1.
7. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, caratterizzata dal fatto che essa è in forma di compresse, tavolette, capsule, granulati, polveri, emulsioni, soluzioni, creme, pomate, supposte, schiume e spray.
8. 8. L'uso dell'enantiomero (R)-ketoprofene eventualmente opportunamente salificato con un'adatta base scelta nel gruppo formato da basi organiche, chirali ed achirali, e da basi inorganiche nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, l'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite.
9. 9. L'uso dei sali di (R)-ketoprofene con un'adatta base organica chirale od achirale nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, l'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite.
10. 10. L'uso del sale di L-lisina di (R)-ketoprofene nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, l'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite.
11. 11. L'uso del sale di destrodropropizina di (R)-ketoprofene nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, 1'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite .
12. 12. L'uso del sale di levodropropizina di (R)-ketoprofene nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, 1'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite.
13. 13. L'uso del sale di D-glucamina di (R)-ketoprofene nella cura di patologie e di manifestazioni infiammatorie neutrofilo-dipendenti quali la psoriasi, la fibrosi polmonare idiopatica, l'insufficienza respiratoria acuta, i danni da riperfusione e la glomerulonefrite.