ITRM20080690A1 - Procedimento di biotecnologia microbica per la completa degradazione di glutine nelle farine. - Google Patents

Procedimento di biotecnologia microbica per la completa degradazione di glutine nelle farine. Download PDF

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Giammaria Giuliani
Marco Gobbetti
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Description

Procedimento di biotecnologia microbica per la completa degradazione di glutine nelle farine
La presente invenzione concerne una biotecnologia microbica per la completa degradazione di glutine nelle farine. In particolare, il procedimento secondo l’invenzione prevede l’uso di batteri lattici selezionati e di enzimi proteolitici fungini, usualmente impiegati nella produzione di lievitati da forno, in condizioni di fermentazione liquida per la completa degradazione del glutine (glutine residuo inferiore a 20 ppm). Le farine di cereali ottenute in seguito al processo di fermentazione possono essere impiegate come materie prime per la produzione di alimenti senza glutine destinati all’alimentazione di pazienti celiaci. La biotecnologia proposta consente una serie di vantaggi di natura economica, sociale, nutrizionale e sensoriale rispetto alle attuali produzioni di alimenti gluten-free che fanno uso di ingredienti naturalmente senza glutine o resi senza glutine in seguito a processi di estrazione.
L’epidemiologia della intolleranza al glutine o celiachia à ̈ in continua espansione. Le ultime indagini a livello della popolazione europea e degli Stati Uniti descrivono un’incidenza di 1 individuo ogni 100 (Rewers, 2005. Epidemioloogy of celiac disease; what are the prevalence, incidence, and progression of celiac disease. Gastroenterology 128: 47-51). Allo stato attuale delle conoscenze, l’unico rimedio terapeutico effettivo nei confronti di tale intolleranza alimentare à ̈ una dieta completamente priva di glutine (gluten-free) da osservare rigorosamente per tutta la vita (Hamer, 2005. Coeliac Disease: Background and biochemical aspects. Biotechnol Advanc 23: 401-408). Tuttavia, la dieta gluten-free presenta anche palesi svantaggi. E’ molto costosa, i prodotti gluten-free se comparati con gli alimenti a base di cereali hanno una qualità sensoriale e conservabilità inferiore, la dieta à ̈ difficile da seguire rigorosamente e necessita di un continuo monitoraggio ad opera di specialisti in dietologia, anche in considerazione di squilibri nutrizionali (es. fibre, minerali e vitamine) legati alla completa assenza di cereali nell’alimentazione (Grehn et al., 2001. Dietary habits of Swedish adult coeliac patients treated by a gluten-free diet for 10 years. Scand J Nutr 45: 178-182; Mariani et al., 1998. The gluten-free diet: a nutritional risk factor for adolescents with celiac disease. J Pediart Gastroenterol Nut 27: 519-523; Thompson et al., 2005. Gluten-free diet survey: are Americans with celiac disease consuming recommended amounts of fibre, iron, calcium and grain foods? J. Human. Nutr. Diet.
18:163-169). Inoltre, in alcuni casi (es. “refractory sprue†) anche la completa osservanza della dieta gluten-free non consente un recupero totale della funzionalità intestinale (Sollid and Khosla, 2004. Future therapeutic options for celiac disease. Gastroenterol. Hepatol. 2:140-147). Nell’ambito dei trattamenti terapeutici alternativi alla dieta gluten-free, diversi studi hanno sfruttato le attuali conoscenze sulle sequenze degli epitopi tossici e considerato l’uso di enzimi microbici, in particolare (prolil-endopeptidasi – PEPs), per l’idrolisi di tali derivati proteici. Gli enzimi microbici sono stati proposti come integratori della dieta (Shan et al., 2004. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl endopeptidases: implications for celiac sprue. Biochem. J. 383:311-318) e/o per la detossificazione in vitro del glutine (Chen et al., 2003. Identification and characterization of Lactobacillus helveticus PePO2, an endopeptidase with post-proline specificity. Appl. Environ. Microbiol.
69:1276-1282; Stepniak et al., 2005. highly effiecient gluten degradation with a newly identified prolyl endoprotease: implications for celiac disease. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.
291:G621-G629).
Negli ultimi decenni anche la biotecnologia dei prodotti lievitati da forno à ̈ considerevolmente mutata, influenzando le abitudini nutrizionali di intere popolazioni precedentemente esposte ad una dieta a base di glutine. Attualmente, i prodotti lievitati da forno sono ottenuti mediante processi tecnologici estremamente rapidi (es. lievitazione chimica o mediante lievito di birra), che sostituiscono completamente i lunghi processi di fermentazione mediante impiego di batteri lattici e lieviti autoctoni originati dalla materia prima, ed impiegati in forma di “lievito naturale†. Mediante gli attuali processi i componenti dei cereali (es. proteine) non subiscono alcuna attività idrolitica durante la trasformazione alimentare, mantenendo le caratteristiche presenti nella materia prima (Gobbetti, 1998. The sourdough microflora: interactions between lactic acid bacteria and yeasts. Trends Food Sci. Technol. 9:267-274). Sulla base di queste considerazioni e sfruttando le potenzialità enzimatiche di una miscela di batteri lattici selezionati, alcuni studi (Di Cagno et al., 2002. proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance. Appl. Environ. Microbiol. 68:623-633; Di Cagno et al., 2004. Sourdough bread made from wheat and notori flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Appl. Environ. Microbiol. 70:1088-1096; Di Cagno et al., 2005. Pasta made from durum wheat semolina fermented with selected lactobacilli as a tool for a potential decrease of the gluten intolerance. J. Agr. Food Chem. 53:4393-4402; De Angelis et al., 2005. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochim. Biophys. Acta. 1762:80-93) hanno dimostrato che mediante il ricorso ad una biotecnologia tradizionale, basata sull’impiego di batteri lattici selezionati e lunghi tempi di fermentazione, à ̈ possibile ridurre considerevolmente la concentrazione iniziale di glutine dei cereali.
Il Codex Alimentarius, adottato da WHO (World Health Organization) e FAO (Food and Agricultural Organization), distingue “prodotti gluten-free†, contenenti ingredienti con una concentrazione di glutine inferiore a 20 ppm, e “prodotti resi glutenfree†, aventi una concentrazione di glutine residuo inferiore a 200 ppm. Tuttavia, diversi studi, culminati con le linee guida diramate dal “Prolamins Working Group†, suggeriscono di mantenere, in ogni caso, una soglia di glutine inferiore a 20 ppm (Stern et al., 2001. Analysis and clinical effects of gluten in celiac disease. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol.
13:741-747). Un recente studio condotto da Rizzello et al. (Rizzello et al., 2007. Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease. Appl. Environ. Microbiol.
73:4499-4507) ha considerato l’uso di una miscela molto complessa di 10 batteri lattici selezionati, enzimi proteolitici di origine fungina e lunghi tempi di fermentazione (48 h a 37°C), in condizioni di impasto semi-liquido. Come testimoniato da analisi elettroforetiche, cromatografiche ed immunologiche, il glutine contenuto nella farina di grano tenero à ̈ stato degradato ad una concentrazione inferiore alla soglia di 20 ppm.
E’ nota inoltre la domanda di brevetto WO2006/097415 che, analogamente allo studio sopra menzionato, descrive un procedimento di degradazione del glutine mediante l’impiego di una miscela complessa di almeno sei batteri lattici e/o bifidobatteri e lunghi tempi (24-31 ore) di fermentazione.
Sulla base dei dati riportati in letteratura e precedentemente descritti, alcune problematiche appaiono prioritarie per la produzione di alimenti senza glutine ottenuti da farina di cereali detossificata: (i) semplificare la composizione dei batteri lattici selezionati da usare per il processo di degradazione; (ii) ridurre considerevolmente i tempi di fermentazione così da renderli compatibili con i processi industriali; (iii) dimostrare la capacità dei batteri lattici e degli enzimi fungini di agire efficacemente su farine di grano tenero e duro appartenenti a varietà diverse, e su farine di orzo, segale ed avena; (iv) mettere a punto un processo biotecnologico di idrolisi del glutine che consenta di impiegare la farine di cereali detossificate per la produzione di alimenti glutenfree; e (v) dimostrare, mediante trial medici in vivo di tipo cronico, l’assoluta tolleranza nei pazienti celiaci dopo somministrazione prolungata dei prodotti gluten-free a base di farina di grano detossificata.
Alla luce di quanto descritto sopra, risulta pertanto evidente l’esigenza di poter disporre di materiale e metodi per la preparazione di prodotti da forno gluten-free a base di farina di cereali detossificata che non presentino, da un lato, gli svantaggi emersi dall’esame dei dati di letteratura e, dall’altro, gli svantaggi economici, sociali, nutrizionali e sensoriali dei prodotti gluten-free attualmente in commercio.
Gli Autori della presente invenzione hanno ora osservato che mediante l’impiego di solamente due batteri lattici selezionati, in combinazione con enzimi proteolitici fungini, si riducono notevolmente i tempi di fermentazione necessari alla degradazione del glutine. Inoltre, à ̈ stata dimostrata la capacità dei batteri lattici e degli enzimi fungini di degradare completamente il glutine a partire da varietà diverse di grano tenero e duro, e farine di orzo, segale ed avena; à ̈ stato messo a punto un protocollo biotecnologico per la produzione di diversi lievitati da forno a partire da farina di grano detossificata; ed à ̈ stata dimostrata l’assoluta tolleranza del prodotto in pazienti celiaci, così da consentire, in maniera del tutto innovativa, l’uso di farina di grano come ingrediente per la produzione di lievitati da forno senza glutine.
I batteri lattici secondo la presente invenzione appartengono al genere Lactobacillus e sono stati isolati da “lieviti naturali†per la produzione di pani tipici del Sud Italia. Sono stati selezionati ed impiegati Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (depositato presso il DSMZ in data 28 Novembre 2008 con N. DSM22063) e Lactobacillus plantarum DPPMA125 (depositato presso il DSMZ in data 28 Novembre 2008 con N. DSM22064).
E’ stato standardizzato ed ottimizzato un protocollo biotecnologico che prevede l’uso dei batteri lattici selezionati e di enzimi fungini proteolitici in un processo di fermentazione estremamente rapido (12-20 h a 30-37°C) della farina di cereali risospesa in acqua nella percentuale del 20-50% e la sua successiva utilizzazione, in percentuali diverse in funzione delle caratteristiche desiderate, come ingrediente per una breve lievitazione (ca. 1-3 h) mediante lievito di birra, per la produzione di lievitati da forno senza glutine (contenuto residuo di glutine inferiore a 20 ppm).
Di seguito à ̈ descritto uno schema del protocollo biotecnologico per la produzione di lievitati da forno con farina di grano detossificata.
Coltivazione, lavaggio e sospensione in acqua delle colture di batteri lattici
Miscelazione di farina di grano (30%)
con acqua (70%)contenente i due
batteri lattici selezionati (densità cellulare 10<8>ufc/g) e gli enzimi fungini (400 ppm ciascuno)
Fermentazione per 18 h a 37°C
Impastamento con mais nativo (10%), farina di riso (10%), uova (5%), zucchero (3%), burro (1%) e lievito di birra (1,5%)
Fermentazione per 1,5 h a 30°C
Cottura a 250°C per 50 min
In una delle formulazioni possibili, prodotti da forno, contenenti l’equivalente di 10 g di glutine iniziale, sono stati somministrati quotidianamente a pazienti celiaci per un periodo di 60 gg. Rilievi di natura immunochimica ed istologici hanno dimostrato la completa tolleranza della preparazione gluten-free a partire da farina di grano detossificata.
Come dimostrato da analisi complementari mediante tecniche elettroforetiche, cromatografiche ed immunologiche, il processo di fermentazione mediante batteri lattici selezionati, non impiegati in precedenti studi, ed enzimi proteolitici fungini, secondo la presente invenzione, consente: (i) la completa detossificazione del glutine (contenuto di glutine residuo inferiore a 20 ppm); (ii) l’ottenimento di farina idrolizzata che corrisponde ad una miscela di peptidi a basso peso molecolare e, soprattutto, aminoacidi (ca. 15.000 mg/kg rispetto a < 1.000 mg/kg nella farina di grano) e che migliora marcatamente le caratteristiche nutrizionali dei convenzionali prodotti gluten-free; (iii) una notevole riduzione dei tempi di processo rispetto ai dati riportati in letteratura, rendendo il processo stesso idoneo ad una trasformazione su scala industriale; (iv) la produzione di lievitati da forno gluten-free con formulazioni diverse di ingredienti che prevedono l’uso di farina di grano detossificata secondo concentrazioni diverse (20-50%); e (v) l’assoluta tolleranza della preparazione su pazienti celiaci dopo somministrazione prolungata, come testimoniato per la prima volta da riscontri di natura medica.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una miscela comprendente o consistente in batteri lattici Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 e Lactobacillus plantarum DSM 22064. La miscela può comprendere ulteriormente enzimi fungini proteolitici, quali ad esempio proteasi di Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o loro miscele.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l’uso della miscela come definita sopra per degradare completamente il glutine nelle farine di grano tenero, duro, orzo, segale o avena.
La presente invenzione concerne, inoltre, un procedimento per la preparazione di un impasto liquido di farina con glutine completamente degradato adatto alla produzione di lievitati da forno senza glutine comprendente le o consistente nelle seguenti fasi:
a) propagare in coltura i due batteri lattici Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 e Lactobacillus plantarum DSM 22064;
b) miscelare farina in concentrazione pari a 20-50%, preferibilmente 30%, e acqua 50-80%, preferibilmente 70%, contenente la miscela dei due batterici della fase a) con una densità cellulare di ca. 10<8>ufc/g; c) aggiungere uno o più enzimi fungini proteolitici in concentrazione pari a 200-500 ppm ciascuno, preferibilmente 400 ppm;
d) fermentare per 8-20 h, preferibilmente 12 h, a 30-37°C.
Il procedimento può comprendere ulteriormente una fase e) di essiccamento dell’impasto liquido ottenuto nella fase d). Tra le farine che possono essere impiegate nel procedimento si possono menzionare la farina di grano tenero, duro, orzo, segale, avena o loro miscele, preferibilmente di grano duro o tenero.
Gli enzimi fungini proteolitici possono essere scelti nel gruppo che consiste in proteasi di Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o loro miscele.
Pertanto, l’invenzione concerne anche un impasto di farina in forma liquida o essiccata in cui il glutine à ̈ completamente degradato mediante il procedimento definito sopra.
Costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione una miscela comprendente o consistente in un impasto come definito sopra in combinazione con una o più farine naturalmente senza glutine, quali ad esempio quelle scelte nel gruppo che consiste in mais nativo, mais bianco, farina di riso, quinoa, teff o amaranto, e farina di grano saraceno. In particolare, le farine sopra menzionate possono essere impiegate nelle seguenti percentuali: mais nativo 5-15%, preferibilmente 10%, mais bianco 5-15%, preferibilmente 10%, farina di riso, quinoa, teff o amaranto 10-30%, preferibilmente 20%, e farina di grano saraceno 1-10%, preferibilmente 5%, in cui dette percentuali sono espresse in peso rispetto al peso totale della composizione di farine. Altri ingredienti che possono essere previsti nella formulazione di prodotti da forno dolciari senza glutine a base di farina di grano detossificata sono ad esempio zucchero, burro, uova e panna liquida animale.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un procedimento per la preparazione di lievitati da forno mediante l’impiego di farina detossificata da glutine mediante il procedimento come definito sopra comprendente le o consistente nelle seguenti fasi:
a) aggiungere una miscela di farine naturalmente senza glutine in percentuale del 10-40%, preferibilmente 30%, lievito di birra 1-2%, sale 0,1-1,0% ed agenti strutturanti 0,5-1% all’impasto liquido di farina di grano detossificata da glutine mediante il procedimento come definito sopra e impastare;
b) lasciare fermentare per circa 1-3 h, preferibilmente 1,5 h, a 30°C;
c) cuocere per 50 minuti a 220°C. Qualora l’impasto di farina detossificata da glutine à ̈ essiccato, il rapporto percentuale tra gli ingredienti e acqua sarà circa 1,2:0,8.
Le farine naturalmente senza glutine possono essere scelte nel gruppo che consiste in mais nativo, mais bianco, farina di riso, quinoa, teff, amaranto, farina di grano saraceno o loro miscele. Mentre la farina detossificata da glutine può essere scelta nel gruppo che consiste in farina di grano tenero, duro, orzo, segale, avena o loro miscele, preferibilmente di grano duro o tenero.
Pertanto, costituisce oggetto della presente invenzione anche il prodotto lievitato da forno ottenibile mediante il procedimento definito sopra.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ rappresentato dal procedimento per la preparazione di lievitati da forno dolciari comprendente le o consistente nelle seguenti fasi:
a) aggiungere direttamente mais nativo, farina di riso, uova, zucchero, burro e lievito di birra all’impasto di farina detossificata da glutine mediante il procedimento come definito sopra e impastare;
b) lasciare fermentare per 1,5 a 30°C e
c) cuocere l’impasto lievitato per 50 minuti a 250°C.
In particolare, nella fase a) le percentuali degli ingredienti sono le seguenti: mais nativo 10%, farina di riso 10%, uova 5%, zucchero 3%, burro 1% e lievito di birra 1,5%.
Pertanto, costituiscono oggetto della presente invenzione i prodotti lievitati da forno dolciari ottenibili mediante il procedimento descritto sopra.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ anche l’uso dei prodotti secondo la presente invenzione, ossia dell’impasto di farina, della miscela dell’impasto con le farine senza glutine, del prodotto lievitato da forno, dei prodotti lievitati da forno dolciari per la preparazione di alimenti adatti a colmare gli squilibri nutrizionali alla base del regime alimentare privo di glutine.
Infine, costituiscono oggetto della presente invenzione il batterio lattico Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 e il batterio lattico Lactobacillus plantarum DSM 22064.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.
Figura 1 mostra l’attività aminopeptidasi tipo N (PepN), dipeptidasi (PepV) e tripeptidasi (PepT) (A) e prolina iminopeptidasi (PepI), prolidasi (PepQ), prolinasi (PepR), dipeptidil-peptidasi (PepX) (B) di Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (DSM22063) e Lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM22064), rispettivamente sui substrati sintetici Leu-p-NA, Leu-Leu, Leu-Leu-Leu e Pro-p-NA, , Val-Pro Pro-Gly e Gly-Pro-Ala. I batteri lattici impiegati nello studio di Rizzello et al. (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507) sono stati impiegati come controllo: Lactobacillus alimentarius 15M, Lactobacillus brevis 14G, L. sanfranciscensis 7A, Lactobacillus hilgardii 51B e L. sanfranciscensis LS3, LS10, LS19, LS23, LS38 e LS47. L’attività enzimatica à ̈ stata espressa in unità di attività (U), ovvero la quantità di enzima necessaria per liberare 1 µmol di p-nitroanilide per minuto o 1 µmol di aminoacido per minuto per le attività su substrati non p-nitroanilidi.
Figura 2 mostra i profili elettroforetici bidimensionali di alcuni esempi di varietà di grano duro (Svevo e Duilio) prima e dopo trattamento con batteri lattici selezionati ed enzimi fungini proteolitici.
Figura 3 mostra la composizione proteica della farina di grano prima e dopo il processo di idrolisi ad opera di batteri lattici selezionati ed enzimi fungini proteolitici.
Esempio 1: Attività peptidasica dei batteri lattici selezionati
L. sanfranciscensis DPPMA12 e L. plantarum DPPMA125 appartenenti alla Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell’Università degli Studi di Bari, precedentemente isolati da “lieviti naturali†, sono stati propagati a 30°C per 24 h in MRS modificato (mMRS), contenente, oltre agli ingredienti normali, 5% maltosio e 10% di acqua di lievito – pH finale 5,6. Come controllo per il saggio delle attività di tipo peptidasi sono stati impiegati i batteri lattici usati nella recente pubblicazione di Rizzello et al. (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507): Lactobacillus alimentarius 15M, Lactobacillus brevis 14G, L. sanfranciscensis 7A, Lactobacillus hilgardii 51B e L. sanfranciscensis LS3, LS10, LS19, LS23, LS38 e LS47.
Cellule coltivate per 24 h, raccolte mediante centrifugazione (10.000 g x 10 min, 4°C), lavate due volte in tampone fosfato 50 mM, pH 7,0 e risospese nello stesso tampone ad una densità ottica di 2,5 (A620nm), corrispondente alla densità cellulare di 10<8>ufc/ml, sono state impiegate nei saggi di attività enzimatica. Le attività aminopeptidasiche tipo N (PepN) e prolina iminopeptidasi (PepI), sono state determinate usando i substrati sintetici, rispettivamente, Leu-p-NA e Pro-p-NA. La miscela di reazione consisteva in: 0,9 ml di tampone K-fosfato 50 mM, pH 7,0 in cui era disciolto il substrato sintetico (concentrazione finale 2 mM) e 100 µl di sospensione cellulare. L’attività enzimatica, espressa in unità di attività (U), à ̈ corrisposta alla quantità di enzima necessaria per liberare 1 µmol di p-nitroanilide per minuto (Gobbetti et al., 1996. The proteolytic system of Lactobacillus sanfranciscensis CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidas. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3220-3226). Prolidasi (PepQ), prolinasi (PepR) e dipeptidil-peptidasi (PepX) sono state determinate come descritto da Di Cagno e collaboratori, (Di Cagno et al., 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and starter with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients, Appl. Environ. Microbiol.
70: 1088-1096) su, rispettivamente, Val-Pro, Pro-Gly e Gly-Pro-Ala. Dipeptidasi (PepV) e tripeptidasi (PepT) sono state determinate mediante il metodo Cdninidrina (Gobbetti et al., 1999. Study of the effects of temperature, pH, NaCl, and aw on the proteolytic and lipolytic activities of cheeserelated lactic acid bacteria by quadratic response surface methodology, Enzyme Microbial Technol 25: 795-809) usando, rispettivamente, Leu-Leu e Leu-Leu-Leu. Una unità di attività (U) à ̈ stata definita come la quantità di enzima necessaria per liberare 1 µmol di aminoacido per min.
Esempio 2: Estrazione delle proteine dalla farina di grano ed analisi elettroforetica
Le proteine sono state estratte dalla farina di grano in accordo con il metodo descritto da Weiss et al. (Weiss et al., 1993. Electrophoretic characterization of wheat grain alergens from different cultivars involved in bakers’ asthma. Electrophoresis. 14:805-816). L’analisi elettroforetica bidimensionale di ca. 30 µg di proteina dalle frazioni estratte à ̈ stata condotta mediante il sistema immobiline-poliacrilammide (De Angelis et al., 2005. Biochim. Biophys. Acta.
1762:80-93). Quattro gel per ogni fermentazione indipendente sono stati analizzati ed i dati sono stati normalizzati in accordo con la procedura proposta da Bini et al. (Bini et al., 1997. Protein expression profiles in human breast ductal carcinoma and histologically normal tissue. Electrophoresis.
18:2831-2841).
Esempio 3: Analisi immunologiche e spettrometria di massa MALDI-TOF
Le analisi immunologiche sono state condotte mediante l’uso dell’anticorpo R5, e del test sandwich e competitivo ELISA (Transia Plate, Diffchamb) (Valdez et al., 2003. Innovative approach to lowlevel gluten determination in foods using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 15:465-474). L’analisi spettrometrica MALDI-TOF à ̈ stata condotta mediante Voyager-De Pro-workstation (PerSeptive Biosystems United Kingdom) in accordo con la metodica riportata da Hernando et al. (Hernando et al., 2003. New strategy for the determination of gliadina in maize or rice-based foods matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fractionation of gliadina from maize or rice-prolamins by acid treatment. J. Mass Spectrom.
38:862-871).
La concentrazione di proteine dei campioni à ̈ stata determinata mediante metodo Bradford (Bradford, 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantitities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254). La concentrazione di azoto organico à ̈ stata determinata mediante metodo Kjeldahl. La concentrazione di aminoacidi liberi à ̈ stata determinata mediante analizzatore di aminoacidi (Biochrom Ltd., Cambridge Science Park, United Kingdom) (Di Cagno et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70:1088-1096).
Esempio 4: produzione di lievitati da forno mediante farina di grano detossificata
Colture dei due batteri lattici selezionati sono state propagate in terreno colturale, lavate e risospese in acqua come descritto precedentemente. Farina di grano à ̈ stata miscelata al 30% con acqua (70%), contenente la miscela dei due batteri lattici ad una densità cellulare di ca. 10<8>ufc/g, ed aggiunta degli enzimi fungini alla concentrazione di 400 ppm ciascuno. La fermentazione à ̈ stata condotta per 12 h a 37°C. Dopo fermentazione, sono stati aggiunti direttamente all’impasto liquido mais nativo (10%), farina di riso (10%), uova (5%), zucchero (3%), burro (1%) e lievito di birra (1,5%). Le concentrazioni sono da riferire al peso totale dell’impasto. Dopo impastamento la fermentazione à ̈ proceduta per 1,5 h a 30°C, prima di avviare l’impasto lievitato alla cottura per 50 minuti a 250°C.
Il procedimento può comprendere ulteriormente una fase di essiccamento dell’impasto liquido a base di farina di grano. Ingredienti diversi sono stati impiegati anche per la produzione di pane senza glutine.
Esempio 5: Somministrazione di prodotti lievitati da forno a base di farina di grano detossificata a pazienti celiaci
Prodotti dolciari a base di farina di grano detossificati, prodotti come precedentemente descritto, sono stati somministrati a 5 pazienti celiaci. A suo tempo la diagnosi della patologia celiaca à ̈ stata eseguita in accordo con i criteri proposti dall’European Sciety for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition. L’età media dei pazienti era di ca. 15 anni. I pazienti celiaci erano in remissione da almeno due anni e sottoposti ad un regime alimentare controllato privo di glutine. Tutti i pazienti al momento dell’arruolamento hanno mostrato indicatori sierologici per la patologia negativi, così come lo erano i rilievi istochimici. Ciascun paziente, durante un periodo di tempo pari a 60 gg, ha consumato quotidianamente porzioni di prodotti dolciari a base di farina di grano detossificata pari a 10 g di glutine equivalente. I rilievi immunochimici ed istologici sono stati eseguiti presso il Dipartimento di Pediatria e Gastroeneterologia dell’’Università degli Studi di Napoli, Federico II. L’arruolamento dei pazienti à ̈ avvenuto con il pieno consenso dei genitori a cui à ̈ stato preventivamente sottoposto il piano sperimentale, precedentemente approvato dal Comitato Etico dell’Università di Napoli.
Risultati
(1) Attività peptidasica dei batteri lattici selezionati
L’attività peptidasica à ̈ stata saggiata su substrati sintetici relativamente specifici per le attività peptidasi che (Figura 1). E’ possibile osservare come L. sanfranciscensis DPPMA12 e L. plantarum DPPMA125 siano in possesso di tutte le attività enzimatiche considerate. Con l’eccezione dell’attività di tipo tripeptidasi (PepT), i due batteri lattici selezionati, ed in particolare L. plantarum DPPMA125, hanno mostrato valori delle altre attività peptidasiche significativamente (P<0,05) superiori ai biotipi utilizzati nello studio condotto da Rizzello et al. (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507). Marcate differenze sono state riscontrate soprattutto per le attività PepI, PepQ, PepR e PepX, contenenti residui di prolina nelle diverse posizioni di legame. Glutenine, ed in particolare gliadine, contengono una percentuale molto elevata ed inusuale (45-60%) di residui di glutammina e prolina. Quest’ultimo iminoacido à ̈, di conseguenza, particolarmente presente negli epitopi tossici, generati a partire dalla farina di grano, e responsabili della patologia celiaca. Disporre di microrganismi che siano in grado di degradare intensamente legami in cui à ̈ coinvolta prolina à ̈ sicuramente un pre-requisito per una intensa degradazione del glutine e per un rapido processo di idrolisi. La disponibilità di un’ampia Collezione di Colture su cui eseguire lo screening e l’elevato numero di attività enzimatiche saggiate costituiscono, quindi, la premessa per l’ottenimento di ceppi selezionati non comunemente disponibili. L’attività peptidasica dei batteri lattici selezionati à ̈ fortificata dall’impiego combinato con proteasi fungine usualmente impiegati nei processi di panificazione. Tali enzimi sono impiegati nell’industria di panificazione per correggere il contenuto in proteine e, quindi, la †forza delle farine†, in funzione della tipologia di prodotto da forno a cui esse sono destinate.
(2) Caratterizzazione della farina idrolizzata Dopo fermentazione per 12 h a 37°C, sono state estratte selettivamente le diverse frazioni proteiche e sottoposte a riscontri analitici complementari. Come dimostrato dalle analisi mediante elettroforesi bidimensionale (Figura 2), al termine del processo di fermentazione non sono più osservabili tracce di proteine della frazione delle gliadine nelle varietà di grano duro Svevo e Duilio. Gli stessi risultati sono stati ottenuti per la frazione delle glutenine, per la farina di grano tenero commerciale tipo “00†, per le altre varietà di grano duro considerate (Arcangelo, Ciccio, Colosseo, Gargano e Simeto) e per le farine di orzo, segale ed avena. Proteine della farina di grano, estratte mediante etanolo al 60%, sono state analizzate con tecnica MALDI-TOF MS. I picchi corrispondenti allo standard europeo di gliadine sono completamente scomparsi dopo fermentazione per 12 h a 37°C. Solo alcuni picchi aventi massa molecolare inferiore a 8 kDa sono stati evidenziati mediante analisi spettrometrica. Le analisi immunologiche eseguite mediante anticorpi R5 e saggio ELISA hanno confermato che nessuna traccia di gliadine à ̈ stata determinata nel campione sottoposto a fermentazione. Impiegando lo stesso metodo la concentrazione residua di glutine determinata nella farina di grano tenero commerciale tipo “00†, nelle varietà di grano duro e nelle farine di orzo, segale ed avena à ̈ risultata essere, in tutti i casi, inferiore a 20 ppm. Il metodo impiegato per tale determinazione à ̈ quello riconosciuto come ufficiale dall’AIC (Associazione Italiana Celiachia) WHO e FAO. Rispetto ai dati riportati in letteratura (Rizzello et al., 2007. Appl. Environ. Microbiol.
73:4499-4507), il processo di idrolisi à ̈ compiuto con la stessa efficacia (< 20 ppm di glutine residuo) ma in tempi marcatamente inferiori (12 contro 48 h). Tale rapidità di processo à ̈ da imputare, da un lato all’uso di una maggiore concentrazione di ciascuno degli enzimi proteolitici fungini (400 ppm) e, dall’altro, soprattutto alla più intensa attività peptidasica dei biotipi di batteri lattici selezionati. Sempre rispetto al riferimento bibliografico precedente che ha considerato solo farina di grano tenero con una bassa concentrazione iniziale di glutine, la presente invenzione riporta l’efficacia del protocollo anche su diverse varietà di grano duro, e farine di orzo, segale ed avena, aventi anche elevate concentrazioni proteiche iniziali.
In Figura 3 à ̈ riportata la composizione in azoto organico della farina di grano tenero commerciale tipo “OO†prima e dopo il processo di fermentazione. La farina idrolizzata corrisponde quasi totalmente ad una miscela di peptidi a basso molecolare ed aminoacidi. Solo una quantità inferiore al 20% delle glutenine iniziali persiste nella farina idrolizzata. La concentrazione di aminoacidi della farina idrolizzata risulta essere pari a ca. 15.000 mg/kg rispetto alla concentrazione < 1.000 mg/kg presente nella farina di grano. La maggiore biodisponibilità di aminoacidi liberi rende tale farina di grano idrolizzata una materia prima ad elevato contenuto nutrizionale, conservando nel contempo le altre caratteristiche nutrizionali dei cereali in termini di sali minerali, vitamine e fibre. Qualora impiegata come ingrediente per la produzione di alimenti senza glutine, la farina di grano utilizzata andrebbe a colmare gli squilibri nutrizionali alla base del regime alimentare privo di glutine (Grehn et al., 2001. Scand J Nutr 45: 178-182; Mariani et al., 1998. J Pediart Gastroenterol Nut 27: 519-523; Thompson et al., 2005. J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169).
(3) Produzione di lievitati da forno mediante farina di grano detossificata
Un esempio di applicazione del protocollo biotecnologico per la produzione di lievitati da forno a base di farina detossificata à ̈ riportato nella Figura 4. Oltre che per la produzione di prodotti dolciari, il protocollo à ̈ stato standardizzato ed ottimizzato anche per la produzione di pane senza glutine secondo gli ingredienti descritti precedentemente. In aggiunta al possibile impiego diretto della farina di grano detossificata, à ̈ possibile un trattamento della stessa mediante spry dryier ed il successivo utilizzo come materia essiccata. Questa ulteriore possibilità tecnologica consente una agevole conservazione della materia prima nel tempo, senza alterare minimamente le caratteristiche nutrizionali della farina di grano.
(4) Somministrazione di prodotti lievitati da forno a base di farina di grano detossificata a pazienti celiaci
Prodotti da forno preparati secondo il protocollo biotecnologico descritto precedentemente (Figura 4) sono stati somministrati quotidianamente a pazienti celiaci sulla base di un carico di glutine equivalente pari alla dose di 10 g per giorno. Nella Tabella 1 sono riportati gli indici immunochimici ed istologici.
Tabella 1. Indici immunochimici ed istologici di pazienti celiaci in remissione sottoposti ad alimentazione (10 g di glutine equivalente al giorno per 60 gg) a base di farina di grano detossificata.
Anti-tTG Immunochimica Marsh
CD3 CD25 γΠ́ Grade
60 -60 -60 -60 -60
F.I . 1,6 1 39 38 6 5 5,6 8,6 0 0 I.C. 1,9 1,1 3,7 11 11 9 0,9 3.8 0 0 R.R. 0,3 0,3 53 56 3 4 11,5 17.8 1 1 1 .1. 0,5 0,3 31 36 21 21 8,4 12.8 0 0 Come à ̈ possibile osservare, tutti i pazienti al momento dell’arruolamento (T0) hanno presentato indicatori sierologici e valori istologici (Marsh Grade) normali. Dopo assunzione giornaliera di 10 g di glutine equivalente, per un periodo di 60 gg (T60), nessuno dei valori biochimici ed immunoistochimici à ̈ variato rispetto all’inizio della sperimentazione. In particolare, à ̈ da osservare che il Marsh Grade che rappresenta lo stato di integrità e funzionalità della mucosa intestinale, rilevato sulla base di prelievi bioptici, à ̈ assolutamente identico al valore iniziale. Nessuno dei pazienti ha sviluppato atrofia dei villi intestinale durante il challenge. Solo uno dei 5 pazienti arruolati ha interrotto la prova per motivi personali e non legati ad eventuali stati patologici. Sulla base dei risultati acquisiti che si basano sui più accurati esami clinici in vivo, à ̈ possibile affermare che la farina di grano detossificata à ̈ stata tollerata da tutti i pazienti. In conclusione, la farina di grano detossificata può essere utilizzata per la preparazione di alimenti senza glutine.

Claims (24)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Miscela comprendente o consistente in batteri lattici Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 e Lactobacillus plantarum DSM 22064.
  2. 2. Miscela secondo la rivendicazione 1, che comprende ulteriormente enzimi fungini proteolitici.
  3. 3. Miscela secondo la rivendicazione 2, in cui gli enzimi fungini proteolitici sono scelti nel gruppo che consiste in proteasi di Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o loro miscele.
  4. 4. Uso della miscela come definita in ognuna delle rivendicazioni precedenti per degradare completamente il glutine nelle farine e/o fermentare le farine stesse.
  5. 5. Uso secondo la rivendicazione 4, in cui le farine sono scelte nel gruppo che consiste in farina di grano tenero, duro, orzo, segale o avena.
  6. 6. Procedimento per la preparazione di un impasto liquido di farina in cui il glutine à ̈ completamente degradato adatto alla produzione di lievitati da forno senza glutine comprendente le o consistente nelle seguenti fasi: a) propagazione in coltura dei due batteri lattici Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 e Lactobacillus plantarum DSM 22064; b) miscelare farina in concentrazione pari a 20-50%, preferibilmente 30%, e acqua 50-80%, preferibilmente 70%, contenente la miscela dei due ceppi batterici della fase a) con una densità cellulare di ca. 10<8>ufc/g; c) aggiungere una o più enzimi fungini proteolitici in concentrazione di 200-500 ppm ciascuno, preferibilmente 400 ppm; d) fermentare per 8-20 h, preferibilmente 12 h, a 30-37°C.
  7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, che comprende ulteriormente una fase e) di essiccamento dell’impasto liquido ottenuto nella fase d).
  8. 8. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni 6-7, in cui la farina à ̈ scelta nel gruppo che consiste in farina di grano tenero, duro, orzo, segale, avena o loro miscele, preferibilmente di grano duro o tenero.
  9. 9. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni 6-8, in cui gli enzimi fungini proteolitici sono scelti nel gruppo che consiste in proteasi di Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o loro miscele.
  10. 10. Impasto di farina in forma liquida o essiccata in cui il glutine à ̈ completamente degradato ottenibile mediante il procedimento definito in ognuna delle rivendicazioni 6-9.
  11. 11. Miscela comprendente o consistente in un impasto come definito nella rivendicazione 10 in combinazione con una o più farine naturalmente senza glutine.
  12. 12. Miscela secondo la rivendicazione 11 in cui le farine naturalmente senza glutine sono scelte nel gruppo che consiste in mais nativo, mais bianco, farina di riso, quinoa, teff o amaranto, e farina di grano saraceno.
  13. 13. Miscela secondo ognuna delle rivendicazioni 11-12 in cui le farine sono presenti nelle seguenti percentuali: mais nativo 5-15%, preferibilmente 10%, mais bianco 5-15%, preferibilmente 10%, farina di riso, quinoa, teff o amaranto 10-30%, preferibilmente 20%, e farina di grano saraceno 1-10%, preferibilmente 5%, in cui dette percentuali sono espresse in peso rispetto al peso totale della composizione di farine.
  14. 14. Procedimento per la preparazione di lievitati da forno mediante l’impiego di farina detossificata da glutine mediante il procedimento come definito in ognuna delle rivendicazioni 6-9 comprendente le o consistente nelle seguenti fasi: a) aggiungere una miscela di farine naturalmente senza glutine in percentuale del 10-40%, preferibilmente 30%, lievito di birra 1-2%, sale 0,1-1,0% ed agenti strutturanti 0,5-1% all’impasto liquido di farina di grano detossificata da glutine mediante il procedimento come definito in ognuna delle rivendicazioni 6-9 e impastare; b) lasciare fermentare per circa 1-3 h, preferibilmente 1,5 h, a 30°C; c) cuocere per 50 minuti a 220°C.
  15. 15. Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui qualora l’impasto di farina detossificata da glutine à ̈ essiccato, il rapporto percentuale tra gli ingredienti e acqua à ̈ 1,20:0,80.
  16. 16. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni 14-15, in cui le farine naturalmente senza glutine sono scelte nel gruppo che consiste in mais nativo, mais bianco, farina di riso, quinoa, teff, amaranto, farina di grano saraceno o loro miscele.
  17. 17. Procedimento secondo ognuna delle rivendicazioni 14-116, in cui la farina detossificata da glutine à ̈ scelta nel gruppo che consiste in farina di grano tenero, duro, orzo, segale, avena o loro miscele, preferibilmente di grano duro o tenero.
  18. 18. Prodotto lievitato da forno ottenibile mediante il procedimento definito in ognuna delle rivendicazioni da 14-17.
  19. 19. Procedimento per la preparazione di lievitati da forno dolciari comprendente le o consistente nelle seguenti fasi: a) aggiungere direttamente mais nativo, farina di riso, uova, zucchero, burro e lievito di birra all’impasto di farina detossificata da glutine mediante il procedimento come definito in ognuna delle rivendicazioni 6-9 e impastare; b) lasciare fermentare per 1,5 a 30°C e c) cuocere l’impasto lievitato per 50 minuti a 250°C.
  20. 20) Procedimento secondo la rivendicazione 19, in cui nella fase a) le percentuali degli ingredienti sono le seguenti: mais nativo 10%, farina di riso 10%, uova 5%, zucchero 3%, burro 1% e lievito di birra 1,5%.
  21. 21) Prodotti lievitati da forno dolciari ottenibili mediante il procedimento come definito in ognuna delle rivendicazioni 19-20.
  22. 22) Uso dell’impasto di farina definito nella rivendicazione 10, della miscela definita nelle rivendicazioni 11-13, del prodotto lievitato da forno definito nella rivendicazione 18, dei prodotti lievitati da forno dolciari definiti nella rivendicazione 21 per la preparazione di alimenti adatti a colmare gli squilibri nutrizionali alla base del regime alimentare privo di glutine.
  23. 23) Batterio lattico Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063.
  24. 24) Batterio lattico Lactobacillus plantarum DSM 22064.
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