ITRM20110403A1 - Microvescicole isolate da cellule mesenchimali come agenti immunosoppressori. - Google Patents
Microvescicole isolate da cellule mesenchimali come agenti immunosoppressori. Download PDFInfo
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Description
Microvescicole isolate da cellule mesenchimali come agenti immunosoppressori
La presente invenzione concerne microvescicole isolate da cellule mesenchimali come agenti immunosoppressori. In particolare, l'invenzione concerne microvescicole isolate da cellule mesenchimali come agenti immunosoppressori nel trattamento di patologie infiammatorie e immunitarie.
Le proprietà immunomodulanti delle cellule mesenchimali stromali sono oggetto di crescente interesse e di applicazioni cliniche in continua espansione, ma la riproducibilità del loro effetto à ̈ controversa e i meccanismi coinvolti sono stati chiariti solo in parte. Le cellule stromali mesenchimali (MSC) possiedono proprietà immunoregolatorie dimostrate in vitro, in modelli animali e in applicazioni cliniche come la malattia del trapianto contro l'ospite (vedi le rassegne di Nauta 2007, Zhao 2010, Caimi 2010). Tuttavia, i meccanismi di azione non sono stati completamente definiti. In particolare, mentre l'effetto immunosoppressivo delle MSC sui linfociti T attivati à ̈ stato più studiato (Krampera, 2003), e sono stati descritti molteplici fattori coinvolti, sia l'effetto delle MSC sui linfociti B che il meccanismo di azione sono molto controversi (Cord one 2006, Tabera 2008, Comoli 2008, Traggiai 2008, Rasmussen 2007). Essendo state documentate differenze tra le specie (uomo vs. topo) nell'interazione tra MSC e cellule B (Ren, 2009), saranno discussi di seguito solo i risultati di lavori che hanno utilizzato cellule di origine umana. Si ammette generalmente l'esistenza di fattori solubili mediatori dell'interazione MSC-linfociti B, e anzi à ̈ stato descritto che questi fattori avrebbero un effetto più rilevante con i linfociti B che con i linfociti T (Augello, 2006).
Come si à ̈ accennato, l'effetto delle MSC sui linfociti B non sembra essere univoco. Sono stati infatti descritti sia effetti inibitori (Corcione 2006, Tabera 2008, Comoli 2008) che stimolatori (Traggiai 2008, Rasmussen 2007) sulla proliferazione, differenziazione e produzione di anticorpi da parte dei linfociti B. È interessante ricordare che in determinate condizioni, le MSC possono assumere un ruolo di cellule presentanti l'antigene (Chan, 2006), amplificando così la risposta immunitaria. Questo fenomeno sembra manifestarsi in alcune condizioni ambientali, ad esempio in presenza di bassi livelli di interferone-gamma (Chan, 2006). In uno studio sull'interazione con i linfociti B, le MSC hanno mostrato effetti opposti (inibitori o stimolatori) a seconda dell'intensità dello stimolo usato per le cellule B o a seconda del donatore di origine (Rasmussen, 2007). Questi risultati contraddittori e non prevedibili provocano remore nell'utilizzo delle MSC in malattie autoimmuni complesse.
Alla luce di quanto esposto sopra risulta pertanto evidente l'esigenza di poter disporre di nuovi metodi terapeutici per il trattamento delle malattie infiammatorie e immunitarie che superino gli svantaggi della tecnica nota.
Di recente, à ̈ stato dimostrato che molteplici interazioni tra le cellule del sistema immunitario sono mediate da microparticelle o microvescicole (MV), formazioni rivestite da membrana secrete da molti fenotipi cellulari (Théry, 2009). Sono state descritte diverse specie di MV, con dimensioni che variano da 50 a oltre 1000 nanometri, e con proprietà strutturali e biochimiche diverse a seconda del compartimento intracellulare di origine. Una mole crescente di evidenze sperimentali indicano che queste MV giocano un ruolo fondamentale nella comunicazione intercellulare, mediante il trasferimento di proteine, mRNA e microRNA (Valadi, 2007; Camussi, 2010).
Il ruolo delle MV come convogliatori di risposte immunitarie à ̈ stato dimostrato per fenotipi cellulari come le cellule dendritiche o i linfociti T. Microvescicole isolate da cellule dendritiche che esprimevano antigeni tumorali sono state utilizzate in due trials clinici di fase I in pazienti con melanoma o carcinoma polmonare (Escudier, 2005; Morse, 2005), con lo scopo di stimolare la risposta immune contro il tumore. Questi studi hanno dimostrato la sicurezza dell'uso sistemico di MV nell'uomo, con risultati clinici incoraggianti in singoli pazienti. L'utilizzo di esosomi con attività immunosoppressiva à ̈ stato studiato da P Robbins et al. (US20060116321) che isolano gli esosomi da differenti tipi cellulari comprese cellule presentanti 1'antigene (cellule dendritiche e macrofagi) . Analogamente à ̈ stato prospettato l'utilizzo di microvescicole da cellule dendritiche a scopo immunoterapeutico (Lamparsky, US 6812023) come la prevenzione di una risposta immune non desiderata ad un autoantigene, o ad un antigene di trapianto o riduzione di una risposta esagerata ad un antigene (Mattews Albert L, US 20020004041).
Gli esosomi da cellule presentanti 1'antigene sono stati anche studiati come veicolo per vaccinazione (Delcayre A, US20060222654) o per generare risposte antitumorali {Delcayre A, US7704964).
Microvescicole derivate da cellule endoteliali, preferibilmente da progenitori endoteliali, sono state studiate come possibili adiuvanti nel trapianto di isole pancreatiche-cellule endoteliali per il trattamento del diabete di Tipo 1 o di Tipo 2. L'effetto adiuvante consentirebbe la sopravvivenza e funzionalità delle isole trapiantate (Cantaluppi V, US20100233216) .
È stato inoltre descritto che l'effetto inibitorio delle MSC sui linfociti B à ̈ presente anche se le due popolazioni cellulari sono separate da membrane permeabili, un'osservazione che à ̈ stata portata a riprova dell'esistenza di mediatori solubili (Corcione, 2006; Augello, 2005). Tuttavia, l'effetto inibitorio era assente (Corcione, 2006) o solo parziale (Augello, 2005) se veniva usato il sopranatante di MSC in coltura. Si à ̈ perciò ipotizzato che l'effetto inibitorio delle MSC richiedesse il contatto intercellulare o la liberazione di segnali dai linfociti B per essere pienamente espletato (Corcione, 2006) .
Per quanto riguarda le cellule mesenchimali, le micro vescicole da cellule mesenchimali (MSC-MV) sono state descritte come possibili mediatori dell'effetto antiapoptotico e prò rigenerativo associato con la somministrazione di MSC in modelli animali (Bruno 2009; Herrera, 2009; Gatti, 2011}.
Gli inventori della presente invenzione hanno ora trovato che le microvescicole isolate da cellule staminali sono in grado di mediare in modo efficace l'effetto immunosoppressore sui linfociti B. Infatti, gli inventori hanno identificato i mediatori specifici dell'effetto inibitorio delle cellule mesenchimali sul linfocita B nelle microparticelle prodotte dalle cellule mesenchimali, denominate anche microvescicole (MV) e riconosciute di recente come mediatori della comunicazione intercellulare. Pertanto, le microvescicole o esosomi da cellule staminali mesenchimali possono essere vantaggiosamente impiegati come immunosoppressori, in particolare nella patologia infiammatoria cronica e nelle malattie autoimmuni quali ad esempio il diabete di Tipo 1. In particolare, à ̈ stato osservato che utilizzando MV isolate dal medium di coltura delle cellule mesenchimali si ottiene un forte effetto inibitorio dose -dipendente sulla proliferazione, differenziazione e produzione di anticorpi da parte del linfocita B stimolato con CpG. Utilizzando una marcatura fluorescente, à ̈ stato documentato sia al FACS che al microscopio confocale che le MV si associano ai linfociti B stimolati con CpG ma non ad altre cellule immunitarie come il linfocita T, le cellule dendritiche o le cellule NK, un dato che supporta ulteriormente la specificità dell'effetto riscontrato .
Questi risultati indicano che le MV prodotte dalle cellule mesenchimali sono i convogliatori dell'effetto inibitorio esercitato dalle cellule stesse sul linfocita B. Pertanto, le MV, prodotte in determinate condizioni di coltura dalle MSC, possono essere utilizzate in terapia al posto delle cellule di origine, con importanti vantaggi in termini di standardizzazione, maneggevolezza, sicurezza ed efficacia. Sia con le MSC che con le MSC-MV si à ̈ ottenuta anche l'inibizione funzionale del linfocita B, dimostrata dalla riduzione della secrezione di immunoglobuline . Inoltre, à ̈ stata osservata una correlazione lineare tra la concentrazione di MSC-MV e l'inibizione della proliferazione e della differenziazione di cellule B.
Per verificare se i fenomeni osservati fossero mediati dall'interazione con altre popolazioni cellulari presenti nei PBMC, le MSC-MV sono state marcate con un colorante fluorescente nelle condizioni sperimentali sopra descritte, ed à ̈ stata verificata l'associazione con i diversi fenotipi cellulari marcati con anticorpi fluorescenti contro marcatori specifici di superficie, sia al FACS che al microscopio confocale. Le MSC-MV sono risultate associate esclusivamente ai linfociti B, e non ai linfociti T, alle NK o alle cellule dendritiche. Questi dati indicano che l'effetto inibitorio delle MSC sulle cellule B à ̈ mediato in gran parte, se non completamente, dal rilascio di MV.
L'uso di MSC-MV al posto delle cellule viventi in toto potrebbe pertanto offrire una serie di vantaggi significativi, sia in termini di sicurezza che di maneggevolezza. L'impiego di MSC-MV offre inoltre vantaggi sia per quanto riguarda la produzione sia nell'impiego clinico.
I vantaggi nella produzione sono i seguenti:
Possono essere prodotte grazie al loro rilascio continuo da parte delle MSC nel medium di coltura, da dove possono essere isolate mediante ultrafiltrazione/ultracentrifugazione .
La produzione può essere amplificata con l'uso di bioreattori che consentono di accomodare un elevato numero di cellule in strutture tridimensionali, e di facilitare l'isolamento delle MSC-MV a flusso continuo .
La produzione di MSC-MV da parte delle cellule può essere stimolata variando la composizione del medium mediante l'uso di sostanze aggiunte (es. citochine come Interferon-gamma) o variando le condizioni fisiche (es. tensione di 02).
Le MSC-MV possono essere isolate dal medium mediante ultrafiltrazione, con filtri di cut-off variabile da 30 a 100 kD.
Dopo essere state concentrate mediante ultrafiltrazione, le MSC-MV possono essere purificate mediante ultracentrifugazione a 100.000 g.
Le MSC-MV isolate e purificate possono essere eventualmente sottoposte ad un processo di sterilizzazione mediante irradiazione, a differenza delle cellule viventi.
Le MSC-MV possono essere facilmente congelate in PBS, eventualmente con l'aggiunta di crioprotettivi approvati per uso clinico (DMSO), e dopo scongelamento essere sottoposti a lavaggio mediante ultrafiltrazione/ultracentrifugazione. A questo punto sono pronte all'uso, ovvero non richiedono (a differenza delle cellule) la verifica della loro vitalità e funzionalità .
Il prodotto à ̈ più facilmente standardizzabile rispetto alle cellule viventi; questo comporta una più semplice compliance con le normative farmaceutiche e riduzione dei costi.
Le MSC-MV possono essere usate come vettrici per molecole che ne amplificano l'effetto, come l'annexina V (vedere figura 9)
I vantaggi a livello clinico sono i seguenti:
Le MSC-MV sono rapidamente metabolizzate (Gatti, 2011) e non pongono problemi di colonizzazione ectopica come le cellule viventi.
Le MSC-MV non comportano il rischio di trasformazione oncogena presente con le cellule viventi, specialmente se soggette a manipolazione in vitro (Tolar, 2007).
Le MSC-MV hanno un'azione più specifica e riproducibile sulle cellule bersaglio attivate (linfocita B) rispetto alle MSC.
La somministrazione sistemica, rispetto alle MSC, comporta l'infusione di volumi molto inferiori di materiale corpuscolato, con minor rischio di embolizzazione .
Le somministrazioni ripetute, anche ravvicinate, non pongono i problemi di sicurezza sopra citati legati all'uso di cellule viventi, facilitando il raggiungimento dell'effetto desiderato.
Le MSC-MV sono entità più semplici e stabili delle cellule da cui derivano e hanno un comportamento più riproducibile e prevedibile, mentre il destino delle MSC dopo trapianto à ̈ incerto. Ad esempio, il comportamento delle MSC può cambiare a seconda dell'ambiente con cui interagiscono, come confermato anche dai nostri dati sperimentali. L'effetto delle MSC-MV sul linfocita non ha risentito invece delle variazioni ambientali.
Tutti i vantaggi sopra citati assumono importanza ancor maggiore a livello pediatrico, sia per motivi etici sia in considerazione delle minori dimensioni corporee e della maggiore spettanza di vita.
Formano pertanto oggetto specifico della presente invenzione microvescicole isolate da cellule mesenchimali per l'uso nella terapia immunosoppressiva. In particolare, le microvescicole secondo l'invenzione possono essere impiegate nel trattamento delle malattie infiammatorie e infiammatorie croniche. Le patologie infiammatorie e immunitarie possono essere acute e croniche, in particolare malattie con componente anticorpo-mediata, con l'obiettivo di ridurre l'entità della flogosi, i sintomi e le complicanze correlate. Le malattie infiammatorie croniche sono ad esempio le malattie autoimmuni, le malattie reumatologiche come le connettiviti e vasculiti. Ad esempio, malattie che possono essere trattate con le MV secondo la presente invenzione sono le seguenti: Vasculite sistemica, Poliarterite nodosa, Arterite a cellule giganti, Crioglobulinemia, Mononeurite multipla, Malattia di Buerger, Granulomatosi di Wegener, Porpora di Henoch-Schonlein, Arterite di Takayasu, Vasculite del Sistema Nervoso Centrale, Mononeuropatia dell'arto superiore, Malattia di Bel^et, Tiroidite di Hashimoto, Anemia emolitica autoimmune, Malattia di Addison, Diabete mellito tipo I, Diabete autoimmune dell'adulto a insorgenza tardiva, Diabete autoimmune ricorrente in pazienti diabetici di lunga data dopo trapianto di insule o pancreas, Artrite reumatoide, Lupus eritematoso sistemico, Dermatomiosite, Sclerodermia, Sindrome di Reiter, Sindrome di Sjogren, Sclerosi multipla, Miastenia grave, Artrite reattiva, Malattia di Graves, Morbo celiaco, Epatite cronica autoimmune,Cirrosi biliare primitiva. Psoriasi, Alopecia areata, Vitiligo, Sindrome di Goodpasture, Sindrome di Guillain-Barré, pondilite anchilosante, Colite collageno sica, Colite linfocitica, Colite ischemica, Colite da diversione, Glomerulonefrite cronica, Fibrosi cistica, Sinusite, Bronchite cronica, Malattia periodontale, Diverticolosi/diverticolite.
Inoltre, le microvescicole secondo la presente invenzione possono essere impiegate nel trattamento e nella prevenzione del rigetto del trapianto. Ad esempio le micro vescicole possono essere impiegate nei trapianti di cellule, di tessuti e di organi solidi, con l'obiettivo di favorire la compatibilità donatore/ricevente, sia riducendo la risposta immune che favorendo lo sviluppo di tolleranza immunitaria: malattia del trapianto contro l'ospite (graft-versushost-disease) , rigetto del trapianto (graft) sia cellulare che di organo solido. Le microvescicole dell'invenzione possono essere, inoltre, impiegate per inibire la reazione immunitaria che si sviluppa in seguito a trapianto di cellule allogeniche/xenogeniche o a terapia genica.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente o consistente nelle microvescicole isolate da cellule mesenchimali , come principio attivo, eventualmente leganti molecole che ne potenziano l'attività immuonosoppressiva come ad esempio annessina, assieme ad uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili. La composizione farmaceutica secondo l'invenzione può essere impiegata per gli usi come definiti sopra.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati in cui: Figura 1 mostra una co-coltura di CLM stimolate con CPG e MSC. 1A-1B) Density Plots rappresentativi di analisi citofluorimetrica di CLM marcate con CFMDA ( C ) o di CLM dopo co-coltura con SCM (MSC/C) in rapporto MSC/C di 1:20, 1:50 e 1:100. 1A) Le cellule CD19 positive erano selezionate nel gate RI dalla coltura di sole CLM (C) o co-coltivate con MSC. 1B) Nel quadrante superiore sinistro Q1 la percentuale di cellule positive CD19/CMFDA à ̈ mostrata per la coltura di sole CLM (C) o dopo co-coltura con MSC. 1C) Istogramma (sinistra) e curva (sulla destra) che mostrano rispettivamente la media e la percentuale di inibizione della vitalità di linfociti CD19 positivi (cellule B) di 3 esperimenti indipendenti da una coltura di sole CLM ( C ) o co-coltivate con MSC. 1D) Istogrammi (sinistra) e curva (destra) che mostrano rispettivamente la media e la percentuale di inibizione della proliferazione di cellule positive per CD19 e marcate con CMFDA relative a 3 esperimneti indipendenti da un coltura di sole cellule CLM ( C ) o co-coltivate con MSC.
Figura 2 mostra una co-coltura parallela di CLM-stimolate con CpG con MSC o MSC-MV. 2A) Density Plots rappresentativi di analisi citofluorimetrica di CLM marcate con CMFDA del gruppo di controllo ( C ) e di CLM dopo co-coltura con MSC o con MSC-MV. I linfociti erano selezionati nel gate Q1 tramite parametri morfologici (FSC-H; SSC-H) come cellule vitali (sinistra). Venivano successivamente analizzati sulla base del tasso di proliferazione selezionando gli eventi CD19/CD27 positivi (destra, pannello superiore} o per lo stadio di differenziamento in plasma cellule (PC) selezionando gli eventi CD19/CD27 positivi (destra, pannello in basso). 2B-2C) Istogrammi che mostrano rispettivamente la media e la percentuale di inibizione della proliferazione di linfociti CMFDA/CD19 positivi da una coltura di sole CLM ( C ) o dopo cocoltivazione con MSC o MSC-MV . 2D-2E) Istogrammi che mostrano rispettivamente la media e la percentuale di inibizione del differenziamento di plasma cellule (PC) CD19/CD27 positive da una coltura di sole CLM ( C ) o dopo co-coltura con MSC o MSC-MV. I risultati sono mostrati come media ed errore standard di 3 esperimenti indipendenti.<*>p<0.05 ;Figura 3 mostra l'inibizione della produzione di immunoglobuline in CLM stimolate con CpG dopo coltura con MSC o MSC-MV. Saggio ELISA di supernatanti da una coltura di sole CLM ( C ), incubate con MSC o con MSC-MV. I risultati erano espressi come media e deviazione standard della concentrazione di igM, IgG o IgA (ng/ml) in 3 esperimenti indipendenti. *p< 0.05
Figura 4 mostra la caratterizzazione delle MSC-MV. Scatter plot rappresentativo ottenuto mediante citof luorimetro FACSCanto di MV rilasciate da MSC. 4A) Il gate delle MV veniva selezionato usando beads di calibrazione dimensionale (Beads) con dimensioni di 0.5-1Î1⁄4ιη. 4B) Le MSC-MV derivate dal gate mostrato in 4A venivano identificate nel quadrante Q4 mediante beads Trucount (PI) , annessina V e 7-AAD.
Figura 5 mostra l'effetto dose -dipendente delle MSC-MV sui linfociti B in CLM. Il pannello A mostra la inibizione di proliferazione (sinistra) e differenziamento (destra) di CLM stimolati con CpG dopo coltura con MSC-MV non diluite (MV) o a diluizione 1:3 o 1:6. Si osserva una forte inibizione. I risultati erano derivati da 4 esperimenti indipendenti.
Figura 6 mostra l'analisi al FACS della incorporazione di MV marcate con PKH26 da parte di popolazioni selezionate di CLM dopo stimolazione con CpG. 6A) Density Plots di linfociti CD3+, CD86+ e doppi negativi (Dneg) selezionati in 3 gates differenti; 6B) Plots in istogramma delle intensità di fluorescenza dei linfociti CD3-FITC, CD86-APC positivi selezionati ed analizzati prima (pannello superiore) o dopo incubazione con MSC-MV marcate con PKH26 (pannello inferiore) . La intensità di fluorescenza à ̈ maggiore nelle cellule CD86 positive. 6C) Density Plots dei linfociti CD56+, CD19+ e doppi negativi (Dneg), selezionati in 3 gates differenti. 6D) Plots in istogramma delle intensità di fluorescenza dei linfociti CD56-FITC, CD19-APC-Cy7 positivi analizzati prima (pannello superiore) o dopo incubazione con MSC-MV marcate con PKH26 (pannello inferiore) . La intensità di fluorescenza aumenta nelle cellule CD19 positive .
Figura 7 mostra la microscopia confocale di CLM. Le cellule sono state colorate con anticorpi diretti contro CD3 , CD19 e CD86 coniugati con APC (pseudocolorazione in verde) e anti-CD 56 coniugato in verde (in verde) con aggiunta (pannello superiore) o senza (pannello di sinistra) incubazione con MSC-MV colorate con PKH26 (in rosso) . Le MV sono prevalentemente riscontrate nel citoplasma di cellule CD19 positive (punta di freccia) e CD86 positive (freccia) . I nuclei venivano controcolorati con Hoechst. Barra di ingrandimento: ΙΟÎ1⁄4πι.
Figure 8 mostra la microscopia confocale con ricostruzione Z di sottopopolazioni cellulari. Microfotografie di ricostruzioni Z (a, d) effettuate tramite microscopìa confocale a scansione laser di linfociti incubati con MSC-MV positive per PKH26, colorate con anticorpi anti-CD19 (a-c) e anti-CD86 (df) . Le proiezioni sugli assi XZ e XY (b-c, e.f) ottenute da sezioni ottiche consecutive multiple mostravano la localizzazione intracellulare di MSC-MV marcate con colorante rosso fluorescente in cellule positive per CD19 (c, in verde) e positive per CD86 (f, in verde) . I nuclei venivano colorati con Hoechst. Barre di ingrandimento: 5 Î1⁄4πι (a, d) e 2 Î1⁄4ιη (b-c, e-f).
Figura 9 mostra gli istogrammi che dimostrano la media delle cellule proliferanti e differenzianti ottenute da una coltura di soli PBMC ( C ), con MV diluiti 1:3 o con MV 1:3 incubati con annessina V (range di concentrazione da 10 pg a 0.1 pg). L'effetto inibitorio delle MV risulta potenziato dall 'annexina V in modo dose-dipendente
Esempio 1: Isolamento delle microvescicole da cellule mesenchimali e studio in vitro sull'effetto delle micro vescicole sui linfociti B
MATERIALI E METODI
Coltura delle cellule staminali mesenchimali ed espansione
Cellule staminali mesenchimali umane commerciali derivate da midollo (MSC; Lonza, Basilea, Svizzera) sono state piastrate in fiasche di coltura di polistirene di 75cm<2>con tappo ventilato (Becton Dickinson , USA) alla densità di 4X10<3>cellule/cm<3>in un volume di 10ml di mezzo di coltura Mesencult basale (Stem Celi Technologies, Vancouver, BC, Canada) addizionato di siero fetale bovino (20%, FBS, Hyclone Laboratories), 100U/ml di penicillina e ΙΟΟÎ1⁄4Ï‚/πιΙ di streptomicina (Gibco, Grand Island, NY). Le colture venivano incubate a 37°C in una atmosfera umidificata contenente il 5% di C02. Le cellule venivano in seguito mantenute nel medesimo mezzo di coltura, distaccate dalle piastre in soluzione tripsina/EDTA (Invitrogen, Life Technologies, Italia) quando raggiungevano 1' 80-90% di confluenza e ripiastrate diluendole 1:2. Il mezzo di coltura veniva cambiato una volta alla settimana.
Isolamento di cellule linfomononuclearì da sangue periferico
Campioni di sangue da donatori sani sono stati raccolti presso il Centro Trasfusionale dell' Ospedale Pediatrico Bambino Gesù in Roma. Dopo avere ottenuto il consenso informato, cellule linfomononuclearì del sangue periferico (CLM) venivano separate mediante gradiente Ficoll (Histopaque, Sigma-Aldrich Chemical C., St Louis, MO, USA) da 50 mi di sangue venoso eparinizzato, lavate due volte in tampone fosfato salino, quindi criopreservate in azoto liquido.
Co-coltura di cellule linfomononucleari del sangue periferico con MSC
Sono stati allestiti esperimenti per saggiare la vitalità dei linfociti B in co-coltura con MSC adese in piastre di coltura a 96 pozzetti (Cornig-Costar , Celbio, Milano, Italia) alle concentrazioni iniziali di 2.5xl0<4>, 1X10<4>o 5xl0<4>cellule per pozzetto in mezzo di coltura Mesencult basale addizionato di FBS al 20%. Per gli esperimenti di immunomodulazione le MSC venivano adese a piastre di coltura di 96 pozzetti alla concentrazione inferiore di 5xl0<3>per pozzetto e coltivate in mezzo di coltura Mesencult basale addizionato di FBS al 20%. Il giorno successivo nei pozzetti in cui erano state adese le MSC, il mezzo di coltura veniva aspirato e sostituito con CLM (5xl0<5>per pozzetto corrispondente ad un rapporto di MSC/CLM di 1:20, 1:50, 1:100 rispettivamente). Le MSC erano state pre -marcate con 5-clorometilf luoresceina diacetato (CMFDA, Celi Tracker, Molecular Probes) alla concentrazione 0.5Î1⁄4Îœ e co-coltivate con MSC in mezzo di coltura RPMI 1640 (BioWhittaker , Lona, Belgio) addizionato di FBS al 10%. La stimolazione dei linfociti B era ottenuta tramite incubazione con 2.5yg/ml di oligodeoxinucleotidi CpG umani (Hycult Biotechnology) . Dopo una settimana le cellule coltivate venivano lavate in tampone fosfato salino Dulbecco (D-PBS, Euro-Clone, Milano, Italia) ed analizzate tramite FACS (Fluorescent activating celi sorter analysis, FACSCanto II, BD Biosciences).
Co-coltura di CLM con microvescicole derivate da MSC (MSC-MV)
Colture di MSC al 90% di confluenza erano usate per la preparazione di mezzo condizionato (CM). Dopo 5 di giorni in coltura, il mezzo veniva recuperato da piastre in cui erano state inizialmente piastrate alla concentrazione di 2xl0<6>, recuperato e centrifugato a 1000 g per 20min per rimuovere residui cellulari. Le microvescicole prodotte dalle MSC (MSC-MV) erano poi isolate come descritto nel paragrafo successivo, e aggiunte a 5xl0<5>linfociti marcati con CFMDA dopo 1 ora e 24 ore di stimolazione con CpG (Hycult Biotechnology) . Per esperimenti selezionati, le MSC-MV venivano diluite 1:3, 1:6 in mezzo RPMI 1640 (BioWhittaker), poi aggiunte alle colture di CLM marcate dopo 1 ora e 24 ore dall' inizio della coltura. Dopo una settimana in presenza di 2.5 pg/ml di oligodeoxinucleotidi CpG umani aggiunti sin dall' inizio della coltura, le CLM venivano recuperate tramite centrifugazione, lavate ed analizzate al FACS.
Dettaglio della metodologia di isolamento delle microvescicole dal medium di coltura
La metodica di isolamento delle microvescicole à ̈ stata modificata dal metodo di Lamparski et al (2002)-1.MSC al 90% di confluenza: n=6 T75/cm<2>(llml/piastra)
2. recupero del terreno di coltura
3.centrifugare lOOOg per 10 min per eliminare detriti cellulari
4. recupero di 10ml di terreno per ogni campione 5. concentrare il terreno con filtri 30kDa da 4 mi (Millipore)
6. recuperare il terreno concentrato (circa 50Î1⁄41 per filtro) e diluirlo in 10ml di PBS in tubi da ultracentrifuga
7. ultracentrifugare a 100,000 g per Ih a 4°C
8. recuperare il pellet di MSC-MV e diluirlo in 10ml di PBS
9. concentrare la soluzione di MSC-MV in filtri 30kDa da 4 mi (Millipore)
10. recuperare circa 15-20Î1⁄41 di campione selezionato (MSC-MV)
Per 1' isolamento di microvescicole da MSC, il mezzo condizionato ottenuto secondo la procedura sopradescritta veniva diluito in 10ml di PBS in tubi di poliallomero (Beckman Coulter, Milano, Italia) , poi ultracentrifugato a 100.000 g a 4°C per 1 ora. Al termine della procedura, venivano raccolti 2 mi di ultracentrifugato dal fondo dei tubi diluito in 10ml di PBS e concentrato tramite centrifugazione per 20-30min a 2000 g in un filtro sterile da 30kDa MWCO Amicon Ultra Centrifugai (Millipore) fino ad un volume finale di 15-20Î1⁄41.
Valutazione della produzione di inununoglobuline CLM marcate con CFMDA venivano co-coltivate in piastre da 96 pozzetti sia con MSC (in rapporto 1:100) o con MSC-MV in RPMI 1640 (BioWh.ittaker) addizionato di FBS al 10% (Hyclone) . Dopo una settimana le piastre venivano centrifugate a 300 g per 5 min, i supernatanti recuperati e testati con saggio ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Allo scopo di stimare la produzione di immunog lobuline, immunoglobuline purificate di capra contro IgA, IgG o IgM umane (IgA 10ug/ml, IgG 15 Î1⁄4g/ml, IgM 2.5 Î1⁄4g/ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) diluite in PBS, venivano adese alla superficie dei pozzetti di piastre ELISA da 96 pozzetti (Corning) tramite incubazione per tutta la notte a 4°C. Dopo 3 lavaggi in PBS/Tween 0.1% il supernatante delle colture cellulari veniva aggiunto alle piastre (50Î1⁄41 per pozzetto) ed incubato a 37°C per 1 ora in una atmosfera umidificata. Dopo lavaggio, le piastre venivano incubate per 1 ora a 37°C con anticorpi coniugati con perossidasi contro IgA umane (1:1000), IgG umane (1:2000) o IgM umane (1:1000) diluite in PBS (Jackson ImmunoResearch Laboratories) (50 pi). Pasticche di σ-fenilendiamina (Sigma-Aldrich) diluite in PBS venivano usate come sustrato cromogeno per sviluppare il test. La reazione veniva interrotta dopo 30 min con 1' aggiunta di sodio dodecilsulfato al 10% (50Î1⁄41 per pozzetto). Al termine della procedura le piastre venivano lette con spettrofotometro (microplate spectrophotometer Benchmark Plus) a 460 OD.
Analisi citofluorimetrica
Al termine della co-coltura le CLM venivano recuperate dalle piastre di coltura, centrifugate a 300 g per 5 min e risospese in PBS/ FBS (2%). Le sospensioni di singole cellule venivano incubate al buio per 20 min a 4°C con anticorpi monoclonali direttamente coniugati diretti contro le seguenti molecole umane di superficie: CD19 (1:7, coniugato con Cy5), CD27 [1:7, coniugato con ficoeritrina (PE)], CD38 (1:30, coniugato con PE-Cy7), IgM (1:100, coniugato con Cy5), CD86 (1:5, coniugato con APC) , CD3 [1:7, coniugato con fluoresceina (FITC)], CD56 (1:7, coniugato con FITC), CD19 [1:20 coniugato con alloficocianina (APC)-Cy7]. Tutti gli anticorpi erano acquistati da Becton Dickinson (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) . Dopo legame con gli anticorpi, le cellule venivano lavate 2 volte in PBS/BSA al 2% ed i dati acquisiti con FACSCanto II (BD). I profili citof luorimetrici venivano analizzati mediante Celi Quest Software (BD). Un minimo di 20,000 eventi venivano registrati per singolo esperimento.
Per ottenere una caratterizzazione delle MSC-MV, in esperimenti separati, le MSC-MV derivate dai sopranatanti di 2xl0<6>MSC secondo il metodo sopraindicato venivano incubate con 5Î1⁄41 di anticorpo monoclonale diretto contro la molecola umana di superficie annessina V coniugato con APC (BD) in complesso con il colorante vitale 7-amino-actinomicina [7-AAD, coniugato con complesso peridina-proteina clorofilliana (PerCP) BD] in un volume finale di 500Î1⁄41 di tampone di legame della annessina V lx (BBlx) secondo le istruzioni del kit. Questo complesso consente la specifica identificazione di MSC-MV non apoptotiche derivate da MSC. Dopo 15min di incubazione al buio a temperatura ambiente, i campioni di MSC-MV venivano trasferiti in provette Troucount (BD) che contengono beads per calibrazione dimensionale. Queste ultime venivano utilizzate per definire il gate delle MSC-MV sulla base di parametri morfologici (forward scatter, FSC-H; side scatter, SSC-H).
Incorporazione delle MSC-MV da CLM
MV venivano isolate dal mezzo di coltura di 2X10<6>MSC (vide supra) e marcate con colorante PKH26 alla concentrazione 2.5xl0<'6>(Sigma, Saint Louis, USA) secondo le istruzioni della ditta commerciale. Le MV marcate venivano incubate con CLM (5X10<5>cellule per pozzetto) in RPMI addizionato di FBS al 10%. Dopo 1 ora di incubazione a 37°C in una atmosfera umidificata contenente il 5% di C02, la popolazione cellulare veniva lavata in PBS e suddivisa in 2 aliquote, una analizzata in citofluorimetria, 1' altra in microscopia confocale .
Imraunofluorescenza
Le CLM incubate con MV marcate con PKH26 venivano lavate in PBS, fissate in formaldeide al 4%, incubate con PBS/FBS al 5% per 30 min e colorate singolarmente con i seguenti anticorpi monoclonali: anti-CD86 (1:10), anti- CD3 (1:10) e anti-CD19 (1:10) coniugati con APC (BD) e anti-CD56 coniugato con FITC (1:30) (BD). Tutti gli anticorpi venivano diluiti in PBS/BSA all' 1% ed incubati per 1 ora. Controlli negativi venivano allestiti utilizzando campioni di CLM senza incubazione con le MV, o con omissione dell' anticorpo primario nella procedura di colorazione.
I nuclei venivano controcolorati con Hoechst 33342 lpg/ml (Invitrogen, Molecular Probes, OR, USA). Dopo lavaggio in PBS, i campioni venivano montati con reagente Pro-long Anti-Fade (Invitrogen).
Microscopia confocale ed analisi di immagine
La analisi confocale à ̈ stata eseguita con microscopio confocale Olympus Fluoview FV1000 con annesso software FV10-ASW versione 2.0, Multi Ar (458-488 e 515nm), con diodi laser 2X He/Ne (543 e 633 nm) e 405 usando obiettivo 60x (1.35 NA oil). Sezioni ottiche singole venivano acquisite con modalità di scansione 1024X1024 pixels, con una dimensione 207 nm/pizel, velocità di campionamento di 40 psec/pixel e immagini di 12 bits/pixel. Il mescolamento dei fluorocromi veniva evitato tramite acquisizione sequenziale automatica di immagini multicanale, allo scopo di ridurre la interferenza di spettro tra i canali. La apertura 'pinhole' era di 1 unità Air.
La ricostruzione 2 delle singole sezioni ottiche seriate veniva eseguita con modalità di scansione di 1024x1024 pixels con zoom electronico 2 che corrisponde a 103 nm/pixel, con velocità di campionamento di 20 ps/pixel e distacco Z di 0.40 psec/sezione. Le immagini venivano processate secondo la versione software Photoshop 9.0 (Adobe System Ine, CA).
Analisi statistica
I dati sono stati analizzati in termini di mediana, valore quantitativo massimo e minimo dei dati. Una analisi non parametrica di varianza (Kruskal-Wallis test) Ã ̈ stata eseguita per confrontare i dati quantitativi tra i gruppi; il test Mann-Whitney U Ã ̈ stato utilizzato come test dopo analisi di varianza. P<0.05 veniva considerato statisticamente significativo. La analisi statistica veniva condotta utilizzando software GraphPad (GraphPad Prism, Release 3.03, Avenida de la Playa La Jolla, CA).
RISULTATI
Co-coltura di CLM con MSC
Effetto sulla vitalità B cellulare
Abbiamo in primo luogo studiato gli effetti della co-coltura con MSC sulla vitalità dei linfociti B dopo stimolazione con CpG. Abbiamo co-coltivato CLM marcate ( C ) con CMFDA ottenute da 7 donatori sani con MSC. Dopo 7 giorni di incubazione abbiamo analizzato nel campione totale delle CLM marcate le cellule CD19 positive mediante analisi citofluorimetrica . La massima inibizione della vitalità B cellulare veniva osservata con un rapporto MSC/C di 1:20 (Figura 1A); questo effetto era ancora dimostrabile alle diluizioni di 1:50 e di 1:100 (Figura 1A, 1B).
Effetto sulla proliferazione B cellulare Abbiamo inoltre valutato 1' effetto della cocoltura con MSC sulla proliferazione B cellulare. Dopo 7 giorni nelle precedenti condizioni sperimentali veniva selezionato in analisi citofluorimetrica il gate delle cellule con doppia marcatura CD19/CMFDA. Come dimostrato nella Figura 1C ottenevamo la massima inibizione sulla proliferazione B cellulare con un rapporto MSC/C di 1:20. Era dimostrabile una inibizione anche nel rapporto MSC/C di 1:50 ed un effetto minore nel rapporto 1:100. Il quadrante Q1 della Figura 1D mostra la percentuale di linfociti B proliferanti (CD19 positivi e marcati con CFMDA) rispetto al numero totale dei linfociti; la proliferazione era già altamente inibita (90.3%) ad un rapporto MSC/C di 1:100. Pertanto, questo rapporto à ̈ stato utilizzato in tutti i successivi esperimenti di co-coltura.
Co-coltura parallela di CLM con MSC o MSC-MV
In esperimenti paralleli abbiamo studiato gli effetti della co-coltura con MSC o MSC-MV sulla proliferazione e differenziamento del linfociti B. A tale scopo MSC-MV sono state aggiunte a CLM dopo 1 ora e 24 ore dall' inizio dell' esperimento. Colture parallele venivano allestite in cui CLM venivano cocoltivate con MSC nel medesimo rapporto di 1:100. È stata osservata una significativa inibizione sulla proliferazione B cellulare sia in presenza di MSC che di MSC-MV (Figura 2A). Simili percentuali di inibizione erano ottenute sia in presenza di MSC e MSC-MV essendo rispettivamente del 70% e del 60% (Figura 2B) . In questi esperimenti paralleli abbiamo anche studiato il differenziamento plasmacellulare. La linea delle plasmacellule (PC) veniva identificata dalla doppia colorazione con CD19 e CD27. Abbiamo dimostrato una significativa inibizione della produzione plasmacellulare rispettivamente del 98% e del 100%, in presenza sia di MSC che di MSC-MV. Come per le MSC, le MSC-MV inibivano la produzione di IgM, IgG e IgA (Figura 3).
Abbiamo inoltre valutato la produzione di immunoglobuline dalle medesime colture cellulari. Dopo 7 giorni, i supernatanti venivano recuperati e saggiati in ELISA. Sia le MSC che Le MSC-MV inibivano la produzione di IgM, IgG ed IgA come mostrato nella Figura 3.
Caratterizzazione delle MSC-MV
Abbiamo verificato che il nostro metodo consentiva di isolare MSC-MV purificate, stimandone le dimensioni tramite analisi citofluorimetrica. La popolazione di MSC-MV à ̈ stata distinta dai frammenti di cellule apoptotiche per la negatività del marker di DNA 7-AAD ed à ̈ risultata positiva per annessina V (Figura 4).
Effetto dose-dipendente delle MSC-MV sui linfociti B
È stato evidenziato un effetto dose-dipendente delle MSC-MV sia sulla proliferazione sia sul differenziamento dei linfociti B (Figura 5). L'effetto di inibizione era maggiore sul differenziamento che sulla proliferazione.
Incorporazione delle MSC-MV da parte di CLM
La analisi citofluorimetrica di CLM preincubate con MSC-MV marcate con PKH26 dimostrava che la loro incorporazione era selettiva in una sottopopolazione di cellule CD86 positive e tra queste in cellule CD19 positive che corrispondono ai linfociti B. Risultavano negative le cellule CD3 positive che corrispondono ai linfociti T. Risultavano anche negative le cellule CD56 positive che corrispondono alle cellule NK (Figura 6}.
Mediante analisi in microscopia confocale laser, veniva effettuata la analisi in immunofluorescenza di campioni di CLM preincubate o no con MSC-MV marcate con PKH26, allo scopo di valutare la interazione delle MSCMV con un particolare tipo cellulare (Figura 7). Un pannello di anticorpi coniugati con fluoresceina diretti contro le molecole CD3 , CD19, CD56 e CD86 era stato utilizzato e la analisi di colocalizzazione dimostrava una ricorrente associazione delle MSC-MV con cellule CD19 e CD86 positive, mentre nessuna associazione era riscontrata con cellule CD19 e CD56 positive (Figura 7). La analisi della localizzazione di MSC-MV marcate con PKH26 in rosso era basata sulla ricostruzione Z di sezioni ottiche seriali singole di cellule positive per CD19 e CD86 (Figura 8). La distribuzione delle MSC-MV nelle dimensioni laterali ed assiali, rilevata dalle proiezioni sugli assi XZ- e YZ, deponeva per una localizzazione intracellulare nel citoplasma di cellule positive per CD19 e CD86 (Figura 8) .
ESEMPIO 2 : Il legame delle MV con annexina V potenzia l'effetto inibitorio sui linfociti B L'annessina V lega la fosfatidilserina esposta sulle membrane cellulari e modifica la risposta immunitaria nei confronti delle cellule stesse (Munoz, 2007) . In questo esperimento, le MV ottenute secondo la procedura sopra descritta e diluite 1:3 sono state incubate per 15min a temperatura ambiente con annessina V ricombinante purificata (BD, range di concentrazione da 10 Î1⁄4Ï‚ a 0.1 Î1⁄4Ï‚) in un volume finale di 100 Î1⁄4Î di tampone di legame della annessina V (BBBlx) secondo le istruzioni della casa. Le MV sono state successivamente lavate in PBS tramite ultracentrifugazione e co-coltivate con PBMC marcati con CFMDA e stimolati con CpG. Dopo 7 giorni le colture sono state analizzate al citofluorimetro per valutare la proliferazione e il differenziamento dei linfociti B. L'aggiunta di annexina V ha potenziato notevolmente l'effetto inibitorio delle MV sui linfociti B attivati, in maniera dose-dipendente. Questa strategia può essere utilizzata per potenziare l'effetto immunomodulante delle MV.
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Claims (2)
- RIVENDICAZIONI 1) Microvescicole isolate da cellule mesenchimali per l'uso nella terapia immunosoppressiva.
- 2) Microvescicole per l'uso secondo la rivendicazione 1, nel trattamento delle malattie infiammatorie acute e croniche, le malattie autoimmuni, le vasculiti, le connettiviti, Vasculite sistemica, Poliarterite nodosa, Arterite a cellule giganti, Crioglobulinemia, Mononeurite multipla, Malattia di Buerger, Granulomatosi di Wegener, Porpora di Henoch-Schonlein, Arterite di Takayasu, Vasculite del Sistema Nervoso Centrale, Mononeuropatia dell'arto superiore, Malattia di Behc^et, Tiroidite di Hashimoto, Anemia emolitica autoimmune, Malattia di Addison, Diabete mellito tipo I, Diabete autoimmune dell'adulto a insorgenza tardiva, Diabete autoimmune ricorrente in pazienti diabetici di lunga data dopo trapianto di insule o pancreas, Artrite reumatoide, Lupus eritematoso sistemico, Dermatomiosite , Sclerodermia, Sindrome di Reiter, Sindrome di Sjogren, Sclerosi multipla, Miastenia grave, Artrite reattiva, Malattia di Graves, Morbo celiaco, Epatite cronica autoimmune,Cirrosi biliare primitiva, Psoriasi, Alopecia areata, Vitiligo, Sindrome di Goodpasture, Sindrome di Guillain-Barré, pondilite anchilosante, Colite collageno sica, Colite linfocitica, Colite ischemica, Colite da diversione, Glomerulonefrite cronica, Fibrosi cistica, Sinusite, Bronchite cronica, Malattia periodontale, Diverticolosi/diverticolite . 3<)>Microvescicole per l'uso secondo la rivendicazione 1, nel trattamento e nella prevenzione del rigetto del trapianto. 4) Microvescicole per l'uso secondo la rivendicazione 1, nel trattamento e nella prevenzione della malattia del trapianto verso l'ospite. 5) Microvescicole per l'uso secondo la rivendicazione 1, per inibire la reazione immunitaria che si sviluppa in seguito a trapianto di cellule allogeniche/xenogeniche o a terapia genica. 6) Composizione farmaceutica comprendente o consistente nelle microvescicole isolate da cellule mesenchimali , come principio attivo, eventualmente legate a annessina V, assieme ad uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili. 7) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, per l'uso nella terapia immunosoppressiva . 8) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, per l'uso secondo la rivendicazione 7, nel trattamento delle malattie infiammatorie acute e croniche e delle malattie autoimmuni. 9) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, per l'uso secondo la rivendicazione 7, nel trattamento e nella prevenzione del rigetto del trapianto. 10) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, per l'uso secondo la rivendicazione 7, nel trattamento e nella prevenzione della malattia del trapianto verso l'ospite. 11) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, per l'uso secondo la rivendicazione 7, per inibire la reazione immunitaria che si sviluppa in seguito a trapianto di cellule allogeniche/xenogeniche o a terapia genica.
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