ITRM930613A1 - Uso di anticorpi anti-molecole hla classe i libere da beta-2 microglobulina per saggi di evidenziazione dell'esposizione al virus della immunodeficienza acquisita (hiv) e per la preparazione di composizioni ad azione protettiva dall'infezione da hiv. - Google Patents
Uso di anticorpi anti-molecole hla classe i libere da beta-2 microglobulina per saggi di evidenziazione dell'esposizione al virus della immunodeficienza acquisita (hiv) e per la preparazione di composizioni ad azione protettiva dall'infezione da hiv. Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo: "Uso di anticorpi anti-molecole HLA classe I libere da ?-2 microglobulina per saggi di evidenziazione dell'esposizione al virus della immunodeficienza acquisita (HIV) e per la preparazione di composizioni ad azione protettiva dall'infezione da HIV"
La presente invenzione concerne l'uso di anticorpi antimolecole HLA classe ! libere da ?-2 microglobulina per saggi di evidenziazione dell'esposizione al virus della immunodeficienza acquisita (HIV) e per la preparazione di composizioni ad azione protettiva dall'infezione da HIV.
Pi? in particolare l'invenzione riguarda saggi diagnostici e composizioni in grado di conferire una immunit? passiva, da utilizzarsi rispettivamente nella diagnostica e nella terapia preventiva dell'AIDS (sindrome di immunodeficienza acquisita).
L'infezione e la vaccinazione con il virus dell'immunodeficienza umana di tipo I (HIV-I) inducono sia una risposta cellulare che umorale (Lewis D.E. et al. Int. Rev. Immunol. 7:1 -13 1990; Tacket C.Q. et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 6: 535-542, 1990; Abrignani S. et al. Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 87:6136-6140, 1990). Tuttavia non ? ancora chiarito ii ruolo di tali risposte nella possibilit? di ottenere una protezione all'infezione virale. Anticorpi anti-HIV vengono prodotti da individui infettati da HIV e sono in grado di inibire la crescita del virus in vitro (Robert-Guroff, M. et al. Nature 316:72-74 1985; Ho, D.D. et al. J. Virol. 61 :2024-2028, 1987; Matthews, T.J., et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:9709-9714, 1986). Tuttavia, in animali da esperimento, l'induzione di anticorpi neutralizzanti in vitro a mezzo di antigeni virali ricombinanti non ? correlata con una protezione dall'infezione virale. Nel modello sperimentale scimmia-virus SIV ? stata ottenuta una protezione con l'esposizione a cellule non infettate {Stott E. J. Nature 353:393,1991 ), correlata con la presenza di anticorpi contro componenti cellulari presenti nelle preparazioni di vaccini, dimostrando che un'immunit? per antigeni non virali pu? essere pi? efficace di quella per antigeni virali (Langlois A.J. et al. Science 255 :292-293,1 992). Il bersaglio cellulare di tale risposta protettiva non ? stato, tuttavia, ancora identificato.
Studi recenti hanno dimostrato che individui sieronegativi, ad alto rischio di infezione da HIV, hanno linfociti T del sangue periferico sensibilizzati in modo specifico per HIV (Clerici M. et al. J. Inf. Diseases 164: 178-182, 1991 ; Clerici M. et al. J. Inf. Diseases 165:1012-1019, 1991 ), rivelando cos? l'esistenza di uno stato di resistenza all'infezione, caratterizzato da un'immunit? virus-specifica cellulare, in cui non sono evidenziabili anticorpi virus-specifici. Ci? suggerisce che le cellule T-helper virus-specifiche del tipo TH1 possano coadiuvare altri meccanismi effettori che, a loro volta, conferiscono una protezione dall'infezione. Pertanto, gli individui sieronegativi ad alto rischio di esposizione a HIV possono, teoricamente, essere considerati protetti dall'infezione.
Ad oggi, nessun tipo di immunit? simile a quella evidenziata in animali vaccinati ? stata rilevata in tali individui. Invece sono stati evidenziati anticorpi contro antigeni cellulari (HLA di classe l e II) in individui infettati con HIV (Golding H. et al. J. Exp. Med. 167:914-923, 1988; Golding H. et al. J. Clin. Invest. 83:1430-1435; 1989; Zaitzeva MB. et al. Scand. J. Immunol. 35:267-273,1992). L'autore della presente invenzione {Domanda di Brevetto PCT N. IT/93/00049, qui incorporata come riferimento) ha trovato che una immunizzazione con proteine ricombinanti dell 'envelope di HIV (gp 160) induce la produzione di anticorpi contro antigeni HLA di classe I. Gli anticorpi riconoscono epitopi delle catene pesanti di HLA C libere da ?-2 microglobulina (HLA FHC), immunologicamente omologhi ad epitopi di gp160 di HIV I. Gli epitopi sono localizzati nel dominio ?-l di HLA C e nella regione C5 di gp120. Poich? gli antigeni HLA di classe I sono coinvolti direttamente nella risposta immune anti-virale, essendo in grado di presentare i peptidi virali alle cellule T, ? possibile che gli anticorpi anti-HLA di classe I indotti dalla immunizzazione costituiscano un effetto collaterale, potenzialmente dannoso.
Gli anticorpi cross-reattivi per HLA di classe I e per gp120 possono essere evidenziati con peptidi sintetici specifici, o con un saggio di competizione con anticorpi monoclonali aventi la stessa specificit? di legame (Beretta A. et al. Eur. J. Immunol. 1 7:1793-1798, 1987; Grassi F. et al. J. Exp. Med. 174:5362, 1991 ).
L'autore della presente invenzione ha trovato che individui sieronegativi ad aito rischio di esposizione a HIV hanno nel loro siero anticorpi anti-HLA FHC. L'autore ha pertanto messo a punto un saggio per la evidenziazione di anticorpi specifici per HLA FHC in individui sieronegativi per HIV ad alto rischio di esposizione a HIV.
Anticorpi con una specificit? analoga a quelli evidenziati in tali individui, possono vantaggiosamente essere utilizzati per la preparazione di composizioni in grado di indurre una immunizzazione passiva a HIV. Uno di tali anticorpi utilizzabili ? l'anticorpo denominato M38, ottenuto immunizzando topi BALB/c con virioni di HIV-I e saggiando i sovranatanti delle culture di ibridomi su linee cellulari monocitiche non infettate (Beretta A. et al. Eur. J. Immunol. 17:1793-1798, 1987). E' da intendersi che anticorpi con specificit? analoga sono utilizzabili e rientrano nell'ambito dell?invenzione. Tali anticorpi possono essere ottenuti usando come immunogeni peptidi di sequenze descritte nella domanda di brevetto PCT IT/93/00049 e riportate nella tabella 1 (peptidi HIV-26 0 HLA-22) e sondando gli ibridomi per la presenza di anticorpi che si legano a linfociti attivati, o a qualsiasi linea cellulare che esprima HLA FHC.
Forma pertanto oggetto della presente invenzione l'uso di un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla microglobulina ?-2, (HLA FHC) per la produzione di un saggio diagnostico per la evidenziazione dell?infezione da HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV, detto saggio caratterizzato dai seguenti passaggi:
- incubare detto analito con un campione comprendente molecole di HLA FHC, immobilizzate su un supporto solido, in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC;
- lavare con un tampone in condizioni non dissociami per detto complesso;
- incubare detto complesso con detto anticorpo in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC-anticorpo;
- rivelare detto complesso analito-HLA FHC-anticorpo.
Preferibilmente dette molecole di HLA FHC immobilizzate su un supporto solido comprendono cellule in coltura esprimenti dette molecole di HLA FHC sulla porzione esterna della membrana cellulare.
Preferibilmente detto anticorpo ? ottenuto immunizzando con un peptide comprendente una delle sequenze amminoacidiche dei peptidi HIV-26 o HLA-31 .
Costituisce un oggetto dell'invenzione un metodo immunologico per la evidenziazione dell'infezione da HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV, detto metodo caratterizzato dai seguenti passaggi:
incubare detto analito con un campione comprendente molecole di HLA FHC, immobilizzate su un supporto solido, in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC;
- lavare con un tampone in condizioni non dissodanti per detto complesso;
- incubare detto complesso con un sistema rivelatore - rivelare detto complesso analito-HLA FHC-sistema rivelatore.
Preferibilmente detto sistema rivelatore comprende alternativamente:
- un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla microglobulina ?-2, (HLA FHC), in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC-anticorpo;
- anticorpi anti immunoglobuline umane.
Preferibilmente dette molecole di HLA FHC immobilizzate su un supporto solido comprendono cellule in coltura esprimenti dette molecole di HLA FHC sulla porzione esterna della membrana cellulare.
Secondo una forma preferita di attuazione detto anticorpo ? ottenuto immunizzando con un peptide comprendente una delle sequenze amminoacidiche dei peptidi HlV-26 o HLA-31 .
Sono oggetto dell'invenzione corredi diagnostici (kit) immunologie] per attuare il metodo descritto.
Ulteriore oggetto dell'invenzione ? l'uso di un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla microglobulina ?-2, (HLA FHC) per la produzione di una preparazione in grado di conferire un'immunit? passiva all'infezione del virus HIV.
Preferibilmente detto anticorpo ? ottenuto immunizzando con un peptide comprendente una delle sequenze amminoacidiche dei peptidi HIV-26 o HLA-31 .
La presente invenzione verr? ora descritta in suoi esempi esplicativi, ma non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure, in cui:
- la figura 1 rappresenta un profilo citofluorimetrico dell'anticorpo G7 sulla linea MT4 (Dr. Martin Gullberg, Universit? di Umea, Svezia) e su linfociti periferici di soggetti sieronegativi, attivati con la proteina SEB (PBMC-SEB);
- la figura 2 rappresenta un saggio ELISA dell'anticorpo G7 su lisato virale;
- la figura 3 rappresenta un saggio di inibizione della formazione di sincizi con l'anticorpo G7;
- la figura 4 rappresenta un saggio di inibizione della formazione di sincizi da parte di sieri negativi di soggetti ad alto rischio di esposizione ad HIV; la numerazione si riferisca a quella utilizzata in Tabella 2.
Esempio 1 Sintesi di peotidi
I peptidi sono sintetizzati con un sintetizzatore automatico {modello ABT 431 /A Applied Biosystems) secondo il metodo di Merrifield R.B. Science 232:341 -347, 1 986, e purificati aH'omogeneit? utilizzando HPLC in fase inversa prima dell'accoppiamento alla fase solida. Un'analisi degli amminoacidi dei peptidi idrolizzati con 6N HCI ? in accordo con i valori attesi. I peptidi utilizzati nei seguenti esperimenti hanno le sequenze descritte nella Tabella 1.
Tabella 1
Sequenze dei peptidi contenenti le regioni di omologia HLA/gp1 20
gp120-C5 NNGSEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKWKIEPLGVAPTKAKRRWQREKR
470 480 490 500 510
HiV-26
SE L YKYKWKI E PLGVAPTKAKRRW
HIV-31
IEPLGVAPT
HLAa-1 EPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQADRVNLRKLRGYYNQSEDGSH
50 60 70 80 90
HLA-22
TQKYKRQAQADRVNLRKLRGYY
ctrl-pep
DPVTPAEEAGHQKWFY
Le sequenze sono derivate dalle seguenti fonti bibliografiche: gp120-C5: Wein-Hobson S. et al. Celi 40:9-17, 1985;
HLA a-1 C: Grassi et al. J. Exp. Med. 174: 53-62:
ctrl-pep: peptide di controllo con sequenza non correlata.
Esempio 2 Generazione dell'anticorpo monoclonale G7
Due topi femmine BALB/c sono immunizzati 6 volte a distanza di 1 5 giorni con iniezioni subcutanee di 10 pg del peptide HIV-26, senza adiuvante. Dopo un mese, i sieri degli animali sono saggiati per la presenza di anticorpi che legano il peptide HIV-26. Uno dei due animali ha un titolo di 1 /2400.
L'animale ? sacrificato e le cellule di milza sono fuse con la linea di mieloma NS1 , secondo metodi noti. Tutti i cloni risultanti sono sondati per la presenza di anticorpi anti-HLA FHC, con un saggio ELISA con i peptidi HLA-22 e HIV-26. Gli stessi cloni sono saggiati per ELISA su piastre ricoperte con isolati virali HIV-I.
Per i saggi ELISA sui peptidi, 0.2 ?g di peptidi per pozzetto in tampone Na2C03/NaHC03 pH 9.5, sono utilizzati per ricoprire piastre da microtitolazione (Nunc, Denmark) per 3 ore a temperatura ambiente, seguito da saturazione per 1 ora con 5% albumina serica bovina (BSA) in tampone fosfato. Si aggiungono diverse diluizioni di siero, o una diluizione 1 /2 di sovranatanti di ibridoma in 3 % BSA in tampone fosfato, e si incuba per 1 ora a 37?C, si lava e si rivela la reazione con immunoglobuline di coniglio anti-topo, coniugate con perossidasi (Dakopatts. Denmark). I cloni sono positivi quando 1'assorbanza ? maggiore di quella ottenuta con le sole immunoglobuline di coniglio anti-topo.
Per i saggi ELISA per HIV, si usano piastre ricoperte con HIV (Sorin Biomedica, Italia). Si aggiunge una diluizione 1 /2 dei sovranatanti di ibridoma, e si incuba per 1 ora a 37?C, si lava e si rivela la reazione con immunoglobuline di coniglio anti-topo, coniugate con perossidasi (Dakopatts. Denmark).
I cloni positivi in tutti i tre saggi (peptidi HLA-22 e HIV-26 e lisati virali HIV) sono selezionati. Uno di tali cloni (G7) ? saggiato per citometria a flusso sulla linea cellulare MT4 e su linfociti T da sangue periferico da un donatore HIV-negativo, dopo attivazione con il superantigene batterico SEB (Sigma Chemicals). Le cellule attivate con SEB sono ottenute coltivando per 3-5 giorni linfociti T da sangue periferico separati con Ficoll Hypaque in terreno RPMI, con 10% siero fetale bovino e con 1 pg/ml di SEB. La figura 1 mostra Io schema ottenuto per citometria a flusso con l'anticorpo G7 sulla linea MT4 (pannello A) e su linfociti T da sangue periferico attivati da SEB (pannello B). Lo schema ? molto simile a quello ottenuto con gli altri anticorpi monoclonali anti-HLA FHC (M38 and L31 ). La figura 2 mostra una curva di titolazione per ELISA ottenuta con l'anticorpo G7 su tre peptidi della Tabella 1 e sul Usato virale HIV-I. Il peptide HIV-26 contiene gli epitopi di gp120 C5, gi? identificati come omologhi a HLA (Domanda di brevetto PCT N. IT/93/00049). Il peptide HIV-31 contiene la sequenza di 9 aminoacidi adiacente ai due epitopi omologhi ad FILA. Il peptide FILA-22 contiene la sequenza HLA C cc-1 , comprendente le due regioni omologhe a gp120. L'anticorpo G7 ? positivo sui peptidi HIV-26 e HLA-22, ma negativo sul peptide HIV-31 peptide, in maniera simile a M38.
La figura 3 mostra un saggio di inibizione della formazione di sincizi, come descritto nell'Esempio 3, da parte dell'anticerpo G7 e di anticorpi monoclonali di controllo delio stesso isotipo (IgG ?1 ), dimostrando l'attivit? biologica dosedipendente di G7.
I dati mostrano che immunizzando con un peptide sintetico si ottengono anticorpi monoclonali con la stessa specificit? e attivit? biologica di M38.
Esempio 3 Gli anticorpi anti-HLA FHC sono marcatori specifici dell'esposizione a HIV e inibiscono HIV in vitro
Un saggio per la evidenziazione di anticorpi anti-HLA FHC per citometria a flusso ? descritto qui di seguito.
Due linee cellulari umane linfocitiche (MT4) sono usate in tutti gli esperimenti. Le linee esprimono quantit? significative sia di HLA FHC, che di catene pesanti di HLA associate a ?-2 microglobulina. Gli anticorpi monoclonali M38 e G7 danno un quadro di colorazione per immunofluorescenza sulle cellule MT4 molto simile.
Per evidenziare anticorpi serici diretti contro una delle due forme delle catene pesanti di HLA di classe I, quella libera 0 quella associata alla ?-2 microglobulina, si aggiunge una diluizione 1 /10 di siero da analizzare a 5 x 10^ cellule in un volume totale di 0.5 mi di terreno RPMI 1640, si incuba per 30 minuti a 37?C, si lava con RPMI e si incuba con una diluizione 1 /200 dell'anticorpo monoclonale M38 o G7. Dopo 1 ora di incubazione a 37?C, le cellule sono lavate e incubate con una diluizione 1 /1000 di un antisiero di coniglio anti-immunoglobuline di topo coniugato con FITC (Sigma). La fluorescenza ? misurata con un apparato Becton Dickinson FACScan. I risultati sono espressi come percentuale di inibizione di legame dell'anticorpo monoclonale in presenza di siero, secondo la formula (1 ):
fluorescenza media del canale del monoclonale in presenza di siero
? . - . X 100 (1 ) fluorescenza media del canale del monoclonale in assenza di siero
Il valore soglia del saggio ? misurato come la media pi? tre deviazioni standard della percentuale della competizione ottenuta con 50 sieri da donatori di sangue sani HIV sieronegativi. Un campione ? considerato positivo per anticorpi anti-HLA FHC, quando la percentuale di competizione ottenuta ? maggiore del valore soglia. I valori soglia sono 5% e 20%, rispettivamente per gli anticorpi M38 e G7.
I dati sono riassunti nella tabella 2.
Tabella 2
Anticorpi anti-HLA FHC, neutralizzazione di HIV e produzione di interleuchina 2 (IL2) in risposta a peptidi gp160 in soggetti sieronegativi ad elevato rischio di esposizione al virus.
n. anticorpi inibizione IL2 del paziente anti-HLA FHC di HIV
1. 1 /320 NT
2. 1 /640 NT
3. 1/320 NT 4. 1/1280 NT 5. 1/320 NT 6. 1/2560 NT 7. 1/160 NT 8. 1/640 NT 9. NT 10. NT 11. NT 12. NT 13. NT 14. NT 15. NT 16.
17.
18. 1/160 19. 1/320 20. 1/320 21.
22. 23.
24.
25.
26. 1/260 27.
29.
30. 31. 1/160 32. 1/320 33. 1/160 34. 1/320 35. 36. 1 /640 37. 1 /160
38.
39.
40. 1/320 41 . 1/320 42. 1/640 43. 1 /640 44.
45.
46. 1 /160 47.
48.
49.
50.
51. 1 /640 NT: non testato
I sieri vengono saggiati per la presenza di anticorpi anti-HLA FHC e di anticorpi neutralizzanti anti-HIV, a mezzo di un saggio di inibizione. In breve, si saggiano i sieri in un saggio di neutralizzazione del virus in assenza di cellule, come descritto da Nara et al. AIDS Res. Hum. Retrovir. 3:283-287, 1987 e da Nara et al. Nature 332:469-471 , 1988. Si risospendono 10^ cellule CEM-SS {AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog. cat. #776, NIH) in 25 ?g di dietii-amino-etildestrano (Pharmacia) per 30 minuti a 37?C e poi si piastrano in piastre da microtitolazione pre-ricoperte con 250 ng of poli-L-lisina idrobromuro (Sigma cat.#P-1 399). Si incuba per 60 minuti a temperatura ambiente e si lava. Si aggiungono circa 100 unit? formanti sincizi di HIV-I IIIB (HTLV-lllg/H9, AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog. cat. #398, NIH) o HIV-I MN (HTLV-IIIMN/H9, AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog. cat. #317, NIH) in 50 ?? a ciascun pozzetto e si incuba per 5 giorni a 37?C. Si aggiungono anticorpi o sieri a diverse diluizioni in 100 ??. Dopo 5 giorni, si contano i sincizi. Si determinano i titoli inibitori della formazione di sincizi, identificando la diluizione maggiore del siero in grado di determinare una percentuale di inibizione del numero di sincizi maggiore del 10%. Controlli negativi HIV sono effettuati in ciascun esperimento.
I risultati sono mostrati nella tabella. In un primo esperimento si saggiano i sieri di soggetti sieronegativi, ad alto rischio di esposizione ad HIV, essendo partner sessuali di individui sieropositivi. I pazienti da 1 a 15 apprtengono a questa categoria. 8 di tali soggetti (53%) risultano positivi per la presenza di anticorpi anti-HLA FHC, con almeno uno degli anticorpi monoclonali utilizzati. Gli stessi soggetti hanno anche anticorpi neutralizzanti anti-HIV. La figura 4 mostra un saggio di inibizione della formazione di sincizi con sieri da 5 dei soggetti analizzati. I sieri 12 e 14 sono negativi per anti-HLA FHC, mentre i sieri 3, 7 e 8 sono positivi, indicando pertanto che la presenza di anticorpi anti-HLA FHC ? correlata con la presenza di un'attivit? HlV-inibitoria.
Anticorpi anti-HLA FHC sono pertanto presenti in percentuale significativa in individui ad alto rischio di esposizione a HIV, e la loro presenza ? correlata con la presenza di anticorpi anti-HIV neutralizzanti.
Solo 3 dei soggetti esaminati hanno anticorpi specifici per le catene pesanti HLA di classe I associate a ?-2, come evidenziato dal saggio di competizione con l'anticorpo monoclonale W632 (Barnstable C.J. et al. Celi 14, 9, 1978). Nessuno di questi 3 campioni mostra un'attivit? neutralizzante anti-HIV. Pertanto, nonostante anticorpi monoclonali specifici per antigeni HLA di classe I associati a ?-2 inibiscano in vitro HIV (Arthur L.O. Science 258:1935-1938, 1992), gli anticorpi con una specificit? simile non sono evidenziabili in una percentuale significativa di individui ad alto rischio di esposizione a HIV, n? sono correlati con l'inibizione di HIV in vitro.
Ulteriori evidenze che la presenza di anticorpi anti-HLA C ? una conseguenza diretta dell'espsizione a HIV deriva da esperimenti in cui un gruppo di 36 individui IVDU sieronegativi (pazienti da 16 a 51 della Tabella 2) sono esaminati sia per la presenza di anticorpi anti-HLA C nel siero, che per la capacit? di produrre interleuchina 2 (IL2) dopo stimolazione con peptidi derivati da gp120 di HIV. Infatti Clerici et al. (Clerici M. et al. J. Inf. Diseases 165:1012-1019, 1991 ) hanno dimostrato che individui il cui comportamento sessuale pone loro ad alto rischio di infezione da HIV, restano sieronegativi ed hanno cellule T helper circolanti sensibilizzate per HIV-I. Il livello di sensibilizzazione specifica ? determinato saggiando cellule ?
mononucleate del sangue periferico per la produzione di IL2 in risposta a peptidi sintetici antipatici derivati dall' e/7 ve/ope di HIV-I. I risultati di Clerici et al. dimostrano che una risposta immune cellula-mediata pu? essere evidenziata ben prima di una sieroconversione e della possibilit? di evidenziare il genoma di HIV per PCR. Pertanto, la presenza di una risposta positiva a peptidi da gp160, a mezzo di produzione di IL2 nel sangue periferico di individui sieronegativi, indica l'esposizione a HIV.
L'autore ha pertanto esaminato i sieri di 36 individui utilizzatori abituali di droghe sieronegativi, potenzialmente gi? esposti a HIV, per la presenza di anticorpi anti-HLA C e per la produzione in vitro di IL2 in risposta a peptidi di gp160, come descritto da Clerici M. et al. J. Inf. Diseases 165:1012-1019, 1991. Tutti i sieri sono anche saggiati per la presenza di anticorpi neutralizzanti anti-HIV.
Cellule mononucleate del sangue periferico da soggetti sieronegativi per HIV, ad alto rischio di infezione, sono ottenute da sangue eparinizzato dopo separazione su Ficoll-Hypaque. 3 x 10^ cellule sono coltivate in terreno RPMI supplementato con 5% siero umano. Peptidi sintetici, le cui sequenze sono pubblicate da Clerici M. et al. J. Inf. Diseases 165: 1012-1019, 1991 , sono aggiunti ad una concentrazione di 2.5 ??. Come controllo positivo di risposta proliferativa, ? utilizzato l'antigene della tossina tetanica (Tetatox, Berna), a 8-10 U/ml. Per la produzione di IL2, i sovranatanti delle culture sono prelevati dopo 7 giorni e saggiati per la capacit? di indurre la proliferazione di una linea cellulare IL2-dipendente, CTLL, piastrata a 8x1 0^ cellule/pozzetto di piastre da microtitolazione a 96 pozzetti. Dopo 24 ore, le cellule sono marcate con un "pulse? di 1 pCi di ^H-timidina e bloccate dopo 4 ore. Una risposta ? considerata positiva quando le cpm dai sovranatanti delle colture di CTLL stimolate con i peptidi superano le cpm ottenute dalle colture di controllo non stimolate. Una risposta positiva ad almeno due peptidi ? richiesta per classificare un individuo come positivo.
I risultati sono mostrati nella tabella 2. Dei 36 soggetti studiati (da paziente 16 a 51 ), 18 (50%) sono positivi ad entrambi i saggi, 1 5 (41 %) sono negativi ad entrambi i saggi, 1 ? positivo per gli anticorpi anti-HLA FHC e negativo per la produzione di IL2, e gli ultimi 2 sono positivi per la produzione di IL2 e negativi per gli anticorpi anti-HLA FHC. Risultati simili sono ottenuti con entrambi gli anticorpi M38 e G7. Dei 19 sieri contenenti anticorpi anti-HLA FHC, 15 hanno titoli di HIV neutralizzanti da 1 /160 a 1 /2560.
I risultati mostrano che vi ? una forte correlazione tra la presenza nel siero di anticorpi per HLA FHC e la capacit? delle cellule T del sangue periferico di rispondere a peptidi di gp120. L'esposizione a HIV induce pertanto sia una risposta specifica a gp160, che la produzione di anticorpi anti-HLA C in individui sieronegativi ad alto rischio di infezione da HIV.
II fatto che anticorpi anti-HLA FHC presenti in individui sieronegativi per HIV abbiano un'attivit? anti-HIV in vitro suggerisce che possano essere coinvolti nella protezione dell'infezione da HIV e rende possibile la preparazione di composizioni immunoglobuliniche in grado di indurre una immunizzazione passiva a HIV.
Il saggio anti-HLA FHC descritto ? rapido, di facile attuazione e utilizzabile abitualmente, mentre il saggio di produzione di IL2 ? lungo e richiede laboratori specializzati.
Il saggio pu? essere utilizzato per esaminare individui ad alto rischio di infezione, o per sondare donatori di sangue per escludere materiale potenzialmente infetto di HIV.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1 . Uso di un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp! 60 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe l, libera dalla microglobulina ?-2, (HLA FHC) per la produzione di un saggio diagnostico per la evidenziazione dell'infezione da HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV, detto saggio caratterizzato dai seguenti passaggi: - incubare detto analito con un campione comprendente molecole di HLA FHC, immobilizzate su un supporto solido, in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC; - lavare con un tampone in condizioni non dissodanti per detto complesso; - incubare detto complesso con detto anticorpo in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC-anticorpo; - rivelare detto complesso analito-HLA FHC-anticorpo.
- 2. Uso di un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla ?-2 microglobulina, (HLA FHC) per la produzione di un saggio diagnostico per la evidenziazione dell'infezione di HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV, secondo la rivendicazione 1 in cui dette molecole di HLA FHC immobilizzate su un supporto solido comprendono cellule in coltura esprimenti dette molecole di HLA FHC sulla porzione esterna della membrana cellulare.
- 3. Uso di un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla microglobulina ?-2, (HLA FHC) per la produzione di un saggio diagnostico per la evidenziazione dell'infezione di HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto anticorpo ? ottenuto immunizzando con un peptide comprendente una delle sequenze amminoacidiche dei peptidi H1V-26 o HLA-31 .
- 4. Metodo immunologico per la evidenziazione dell'infezione da HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV, detto metodo caratterizzato dai seguenti passaggi: incubare detto analito con un campione comprendente molecole di HLA FHC, immobilizzate su un supporto solido, in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC; - lavare con un tampone in condizioni non dissodanti per detto complesso; - incubare detto complesso con un sistema rivelatore - rivelare detto complesso analito-HLA FHC-sistema rivelatore..
- 5. Metodo immunologico per la evidenziazione dell'infezione da HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV secondo la rivendicazione 4 in cui detto sistema rivelatore comprende alternativamente: - un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla microglobulina ?-2, (HLA FHC), in condizioni tali da permettere la formazione di un complesso analito-HLA FHC-anticorpo; - anticorpi anti immunoglobuline umane.
- 6. Metodo immunologico per la evidenziazione dell'infezione da HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV secondo la rivendicazione 4 o 5 in cui dette molecole di HLA FHC immobilizzate su un supporto solido comprendono cellule in coltura esprimenti dette molecole di HLA FHC sulla porzione esterna della membrana cellulare.
- 7. Metodo immunologico per la evidenziazione dell'infezione da HIV in un analito negativo per la presenza di anticorpi specifici anti-HIV secondo una qualsiasi delie rivendicazioni precedenti in cui detto anticorpo ? ottenuto immunizzando con un peptide comprendente una delle sequenze amminoacidiche dei peptidi HIV-26 o HLA-31 .
- 8. Corredi diagnostici (kit) immunologici per attuare il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7.
- 9. Uso di un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla microglobulina ?-2, {HLA FHC) per la produzione di una preparazione immunogena in grado di conferire un'immunit? passiva all'infezione del virus HIV.
- 10. Uso di un anticorpo in grado di riconoscere sia epitopi della proteina gp160 del virus HIV che della catena pesante di HLA di classe I, libera dalla microgiobulina ?-2, {HLA FHC) per la produzione di una preparazione immunogena in grado di conferire un'immunit? passiva all'infezione del virus HIV in cui detto anticorpo ? ottenuto immunizzando con un pept?de comprendente una delle sequenze amminoacidiche dei peptidi HIV-26 o HLA-31 .
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