ITRM960199A1

ITRM960199A1 - Uso di l-carnitina o derivati della l-carnitina ed antiossidanti nella prevenzione e trattamento di patologie derivanti da danni ossidativi

Info

Publication number: ITRM960199A1
Application number: IT96RM000199A
Authority: IT
Inventors: Claudio Cavazza
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 1997-09-29
Also published as: DE69713431T2; JPH1087483A; DE69713431D1; US5998474A; MX9702280A; EP0797993A1; KR100489371B1; KR970064603A; CA2200540A1; CA2200540C; ES2177843T3; DK0797993T3; ITRM960199A0; ZA972671B; EP0797993B1; PT797993E; IT1283967B1; ATE219360T1

Description

“Uso di L-carnitina o derivati della L-carnitina ed antiossidanti nella prevenzione e trattamento di patologie derivanti da danni ossidativi al sistema nervoso e cardiovascolare”.

La presente invenzione riguarda un nuovo uso terapeutico della L-carnitina, di alcune alcanoil L-carnitine e dei loro sali farmacologicamente accettabili nella prevenzione e trattamento di disfunzioni e patologie derivanti da danni ossidativi.

Più precisamente, la presente invenzione riguarda l’uso coordinato di L-carnitina o di alcune alcanoil L-carnitine o loro sali farmacologicamente accettabili con antiossidanti naturali lipofili quali la vitamina E o la vitamina A e/o antiossidanti naturali idrofili quali la vitamina C, il glutatione (GSH) o il selenio.

Sono già note varie utilizzazioni terapeutiche sia della L-carnitina che delle alcanoil L-carnitine, nessuna delle quali è correiabile a quella qui descritta.

Nell’ambito della presente invenzione per "uso coordinato” dei composti anzidetti si intende indifferentemente sia la cosomministrazione, cioè la somministrazione sostanzialmente simultanea, di L-camitina o alcanoil L-camitina o loro sale farmacologicamente accettabile e di antiossidanti naturali lipofìli quali la vitamina A o la vitamina E, o di antiossidanti naturali idrofili quali la vitamina C, il GSH o il selenio, sia la somministrazione di una associazione comprendenti i predetti principi attivi oltre ad opportuni eccipienti.

La presente invenzione riguarda perciò anche composizioni farmaceutiche somministrabili per via orale, parenterale, rettale o transdermica atte al trattamento di disfunzioni e patologie associate con l’ossidazione delle proteine e degli acidi grassi, comprendenti quali principi attivi, L-carnitina, una alcanoil L-carnitina o un loro sale farmacologicamente accettabile e un an dossi dante naturale lipofilo quale vitamina E o vitamina A e/o un antiossidante idrofilo quale la vitamina C, il GSH o il selenio.

Le alterazioni e patologie associate con l’ossidazione delle proteine includono malattie del sistema nervoso centrale quali il parkinson ismo, il trauma, la paralisi cerebrale, la neuropatia diabetica e l’invecchiamento ; malattie del sistema nervoso periferico quali la neuropatia periferica diabetica, il danno traumatico ai nervi; malattie del sistema cardiovascolare quali la claudicatio intermittens, il danno da ischemia-riperfusione, lo stroke; alterazione del sistema immunitario in condizione di bassa tensione di ossigeno.

Benché sia stato già da lungo tempo ipotizzato che la formazione di radicali liberi è la probabile causa da danno ischemico, è stato difficile dimostrare direttamente che tale formazione avveniva e/o che era sufficientemente pronunciata da sopraffare le difese antiossid attive dei tessuti, come riportato da Curran, et al., Mol. Celi. Biol. 5. 167-172, 1985.

I tessuti ossigenati in molti casi subiscono danni, anche permanenti, se diventano ischemie! e vengono quindi riperfusi.

I prodotti di riduzione dell’ossigeno molecolare (PROM) sono considerati responsabili del danno cellulare in corso di ischemia e di riperfusione post-ischemica di organi quali l'encefalo, il cuore, l’intestino e il rene [Braughler, J.M. and Hall, E.D. (1989) Free Rad. Biol. Med. 6, 289-301).

Inoltre, l’infiammazione, l'invecchiamento ed altri importanti processi biologici riconoscono i PROM come mediatori e/o modulatori di svariate risposte cellulari [Turner, E. et al. (1988) Science 242, 939-941).

Sono stati messi a punto diversi protocolli terapeutici tendenti principalmente ad annullare l'effetto tossico dei PROM nei confronto di strutture biologiche bersaglio quali la membrana cellulare. L’approccio più seguito è stato quello di utilizzare molecole, le quali mimano la ben nota azione antiossidante di composti naturali, che fanno parte del cosidetto fronte antiossidante primario [Bolli, R. (1989) J. Am. Coll. Cardiol. 12, 239-249). Le sostanze maggiormente utilizzate sono ad es. la superossido dismutasi, un enzima in grado di rimuovere specificamente l’anione superossido. e la vitamina E, molecola appartenente alla famiglia dei tocoferoli capace di interrompere pericolose reazioni ossidative a carico degli acidi grassi poliinsaturi. In questi ultimi anni si è osservata la commercializzazione di prodotti OTC,

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In cui sono presenti varie combinazioni tra antiossidanti non enzimatici (Vit. E, Vit. A, Vit. C, Selenio, Glutatione, etc.). Risulta evidente che questo tipo di approccio tende esclusivamente alla rimozione dei PROM o di altre molecole reattive che si producono per interazione dei PROM con macromolecole di interesse biologico. Tale strategia non tiene conto di quelle alterazioni biologiche che si instaurano anche quando sia possibile ridurre il potenziale tossico originale dei PROM. Inoltre eventi patologici di imprevedibile insorgenza, come l’ischemia d'organo, spesso non consentono un’efficace intervento terapeutico atto a far fronte all’azione ossidante dei PROM. Quindi, bisogna sensibilizzare e/o potenziare i meccanismi di riparazione cellulare allo scopo di minimizzare gli effetti tossici derivanti dall’azione nociva dei PROM.

L’esclusione di un’azione antiossidante diretta, cioè di tipo primario, della L-carnitina e dei suoi esteri nei confronti dei PROM è già stata ampiamente dimostrata [Arduini, A. et al. (1990) Free Rad. Res. Commun. 10, 325-332].

Il bersaglio tipico dei PROM in corso di stress ossidativo è la membrana piasmatica, la cui integrità è essenziale per la sopravvivenza cellulare. Gli acidi grassi poliinsaturi dei fosfolipidi di membrana sono particolarmente sensibili all’azione ossidante dei PROM. Questi acidi grassi hanno la capacità di propagare le reazioni perossidative innescate dai PROM, stabilizzando così le specie radicaliche intermedie [Mead, J.F. (1976) in “Free Radicale in Biology" (Pryor, W.A. ed.) Voi. 1, pp. 51-80 Academic Press, New York]. La perossidazione delle membrane biologiche può generare vari prodotti di ossidazione che causano alterazioni significative nella struttura e nella funzione delle membrane [Arduini, A. et al. (1989) Arch. Biochem. Biophys., 273, 112-119].

La presente invenzione si basa sul sorprendente effetto sinergico che si verifica tra la L-carnitina o uno dei suoi derivati e gli antiossidanti naturali lipofìli quali la Vit. E o la Vit. A e/o idrofili quali la Vit. C, il GSH o il selenio. Tale effetto sinergico è particolarmente sorprendente a causa della precedentemente menzionata mancanza di azione antiossidante diretta della L-camitina e suoi derivati.

E’ stato ora infatti trovato che l’uso coordinato di L-camitina o delle suddette alcanoil L-carnitine e di antiossidanti primari o secondari, annullando l'effetto tossico dei PROM nei confronti di strutture biologiche bersaglio della cellula, ha un effetto non solo nella prevenzione del danno, ma anche nel potenziamento dei processi di riparazione cellulare consentendo un efficace intervento terapeutico.

Le alcanoil L-camitine utili per il nuovo uso terapeutico secondo la presente invenzione sono quelle in cui l’alcanoile, lineare oppure ramificato, ha da 2 a 8 atomi di carbonio, preferibilmente da 2 a 6 atomi di carbonio.

Particolarmente preferite sono acetil, propionil, butirril, valerli e isovaleril L-carnitina.

Per sale farmacologicamente accettabile della L-carnitina o di alcanoil L-camitine si intende qualsiasi sale di queste con un acido che non dia origine ad indesiderati effetti tossici o collaterali. Tali acidi sono ben noti ai farmacologi ed agli esperti di tecnologia farmaceutica.

Esempi non limitativi di tali sali sono ad esempio cloruro.

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bromuro, orotato, aspartato acido, citrato acido, fosfato acido, fumarato e fumarato acido, lattato, maleato e maleato acido, ossalato acido, solfato acido, glucosio fosfato, tratrato e tartrato acido.

Nel seguito, a scopo di brevità e semplicità di esposizione, si farà riferimento alla sola L-carnitina, restando inteso che quanto viene descritto si applica alle citate alcanoil L-carnitine ed ai sali farmacologicamente accettabili sia della L-carnitina che delle citate alcanoil L-camitine.

Le composizioni secondo l'invenzione si dimostrano particolarmente efficaci nell’inibire l'effetto tossico dei PROM agendo sia da antiossidanti primari che secondari così da poter venir impiegate in campo farmaceutico per la prevenzione o il trattamento di patologie del sistema nervoso centrale quali il parkinsonismo, la paralisi cerebrale, la neuropatia diabetica: del sistema nervoso periferico quali la neuropatia periferica diabetica, il danno traumatico ai nervi; del sistema cardiovascolare quali lo stroke, il danno da ischemiariperfusione e la claudicatio intermittens; danni al sistema immunitario in condizioni di bassa tensione di ossigeno.

L'efficacia dell’uso coordinato secondo la presente invenzione è stata confermata da diverse prove farmacologiche, alcune delle quali vengono di seguito riportate.

PROVE FARMACOLOGICHE

I) Indice di danno ossidativo tramite valutazione dei prodotti di reazione dell’acido tiobarbiturico (TBARS1 prodotti dagli eritrociti. Trattamento animali.

Per questo studio sono stati utilizzati 20 ratti Wistar di sesso maschile e di 3 mesi di età. Tutti gli animali sono stati trattati con una miscela di antiossidanti primari (vitamina E 200 Ul/kg e acido ascorbico 30 mg/kg) somministrata per via orale per 30 giorni continuativi. In un sottogruppo di 10 ratti è stato aggiunto al trattamento di base L-carnitina per via orale (50 mg/kg). Lo studio è stato condotto secondo il disegno sperimentale "in aperto” e la scelta del sottogruppo di animali che hanno ricevuto il trattamento combinato antiossidanti più L-camitina è stata effettuata con metodo random.

Preparazione globuli rossi.

Al termine del trattamento, è stato prelevato sangue venoso in provette contenenti eparina. Leucociti e piastrine sono stati rimossi attraverso una colonna cromatografica, contenente cellulosa ed alfacellulosa (1:1 p/p). I globuli rossi sono stati successivamente lavati tre volte con soluzione fisiologica.

Condizioni di incubazione.

Tutte le incubazioni sono state effettuate con bagno oscillante a 37°C. Per esperimenti con cellule intatte, i globuli rossi sono stati lavati un’ultima volta con tampone d’incubazione Krebs (NaCl 120 mM; KC1 5 mM; MgS04 1 mM; NaH2P04 1 mM; saccarosio 40 mM; glucosio 5 mM; Tris-HCl 10 mM; pH 7,4) e risospesi nello stesso tampone ad un ematocrito del 5%. Gli eritrociti sono stati trattati con il ter-butil idroperossido (t-BOOH), agente chimico capace di generare fenomeni lipoperossidativi a carico della membrana eritrocitaria, ad una concentrazione di 2 mM. Al termine del trattamento con t-BOOH, gli eritrociti sono stati lavati tre volte con il tampone d’incubazione. Tutti i lavaggi sono stati effettuati a 4°C.

Determinazione dell’indice del danno ossidativo.

L’indice del danno ossidativo scelto è stato quello dei prodotti di reazione dell’acido tiobarbiturico (TBARS). Per la determinazione e la quantificazione dei TBARS prodotti dagli eritrociti è stato utilizzato il metodo di Tsun-Yee Chiù and Claster [Methods in Hematology Voi. 19, pp. 203-236. Churchill Livingstone. New York, 1988].

I risultati sono riportati in Figura 1.

II) Indice di stress ossidativo tramite valutazione del rapporto fosfatidiletanolnmina/ sfingomielina.

Il trattamento degli animali e la preparazione dei globuli rossi sono stati condotti come nella prova precedente. Anche le condizioni di incubazione erano identiche a quelle della prova precedente.

Estrazione e separazione dei fosfolipidi.

I lipidi componenti la membrana eritrocitaria sono stati estratti secondo il metodo di Rose and Oklander [Rose H.G. and Oklander M., J. Lipid Res. (1965) 6: 428-431], Per prevenire fenomeni ossidativi il butilidrossitoluene (BHT 0.1%) è stato aggiunto ai solventi di estrazione. L’estratto lipidico è stato essiccato sotto flusso di azoto e

./ risospeso con toluene. Per la separazione delle singole classi fosfolipidiche è stata usata una cromatografia su strato sottile bidimensionale [Rouser G. et al., Lipids {1970) 5: 494-496). Le classi fosfolipidiche sono state evidenziate con vapori di iodio. Le singole classi fosfolipidiche sono state identificate mediante l’uso di standard. La determinazione del fosforo presente nelle singole specie fosfolipidiche è stata effettuata secondo Bottcher [Bottcher C.J.F. et al., Anal. Chim. Acta (1961) 24: 203-208).

I risultati sono riportati in Figura 2.

III) Emolisi in corso di stress ossidatlvo.

Determinazione deH’emolisi.

L’emolisi eritrocitaria è stata valutata misurando la quantità di emoglobina rilasciata nel corso dell'incubazione con l’agente ossidante.

Al termine dell’incubazione, gli eritrociti sono stati centrifugati e il supernatante è stato utilizzato per la determinazione della emoglobina rilasciata in corso di stress ossidativo.

La determinazione dell’emoglobina è stata eseguita spettrofotometricamente secondo il metodo descritto da Winterbourn C., Handbook of Methods for oxygen radicai research (ed. R. Greenwad) pp. 13-41, CRC Press, Boca Raion, 1985.

I risultati sono riportati in Figura 3.

L’aggiunta di L-carnitina alla miscela di antiossidanti riduce significativamente i danni ossidativi a carico della membrana cellulare. La quantità di TBARS si riduceva significativamente negli eritrociti ottenuti da ratti trattati con L-camitina e antiossidanti rispetto a quelli trattati solo con antiossidanti (Figura 1). In seguito a stress ossidativo, il rapporto fosfatidiletanolamina/sfingomielina degli eritrociti di animali trattati solo con antiossidanti si riduceva in misura maggiore di quello di eritrociti ottenuti da animali trattati con antiossidanti e L-carnitina (Figura 2). Infine, Temolisi misurata in corso di stress ossidativo risultava significativamente incrementata negli eritrociti di animali trattati solo con antiossidanti rispetto a quelli trattati con antiossidanti e L-camitina (Figura 3).

Una opportuna composizione farmaceutica in forma di dosaggio unitario comprende da circa 0,3 a circa 0,5 g di L-carnitina o una quantità equivalente di alcanoil L-carnitina o loro sali farmacologicamente accettabili e da circa 50 a circa 2000 U/I o meglio da circa 300 a circa 1000 U/I di vitamina E e/o da circa 50 a circa 500 mg o meglio da circa 100 a circa 300 mg di vitamina C.

A titolo esemplificativo e non limitativo vengono forniti alcuni esempi di formulazioni secondo la presente invenzione.

Esempi

1 ) L-camitina mg 500; Vit. E U/I 1000; Vit. C mg 300

2) acetil l-camitina mg 500; Vit. E U/I 1000; Vit. C mg 300

3) propionil L-camitina mg 500; Vit. E U/I 1000; Vit. C mg 300

4) isovaleril L-carnitina mg 500; Vit. E U/I 1000; Vit. C mg 300

5) valerli L-carnitina mg 500; Vit. E U/I 1000; Vit. C mg 300

6) butirril- L- camitina mg 500; Vit. E U/I 1000; Vit. C mg 300 7) L-camitina mg 500: Vit. A mg 1000; Vit C. mg. 300

8) acetil L-camitina mg 500; Vit. A mg 1000; Vit C. mg. 300

9) propionil L-camitina mg 500: Vit. A mg 1000; Vit C. mg. 300 10)isovaleril L-camitina mg 500; Vit. A mg 1000; Vit C. mg. 300 11) valeril L-carnitina mg 500; Vit. A mg 1000; Vit C. mg. 300 12) butirril L-carnitina mg 500; Vit. A mg 1000; Vit C. mg. 300 13) L-carnitina mg 500; Vit. E U/I 1000; GSH mg 500

1 4) L-camitina mg 500; Vit. E U/I 1000; Vit C. mg. 300; GSH mg 500 1 5) L-camitina mg 500; Vit. A mg 100; Vit. C mg 300, selenio mg 40.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Uso di L-carnitina o di una alcanoil L-camitina in cui l’alcanoile, lineare o ramificato ha 2-8 atomi di carbonio, preferibilmente 2-6 atomi di carbonio, o dei loro sali farmacologicamente accettabili, in associazione con un antiossidante lipofilo e/o un antiossidante idrofilo per preparare un medicamento per la prevenzione o il trattamento di patologie del sistema nervoso centrale quali il parkinsonismo, il trauma, la paralisi cerebrale, la neuropatia diabetica; del sistema nervoso periferico quali la neuropatia periferica diabetica, il danno traumatico ai nervi; del sistema cardiovascolare quali lo stroke, il danno da ischemia-riperfusione, la claudicatio intermittens; danni al sistema immunitario in condizioni di bassa tensione di ossigeno.
2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui l’alcanoil L-carnitina è acetil, propionil, butirril, valerli o isovaleril L-camitìna.
3. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui l’antiossidante lipofilo è la vitamina E o la vitamina A.
4. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui l'antiossidante idrofilo è la vitamina C, il glutatione (GSH) o il selenio.
5. Composizione farmaceutica somministrabile per via orale, parenterale, rettale o transdermica per la prevenzione o il trattamento di patologie del sistema nervoso centrale quali il parkinsonismo, il trauma, la paralisi cerebrale, la neuropatia diabetica; del sistema nervoso periferico quali la neuropatia periferica diabetica, il danno traumatico ai nervi; del sistema ./ cardiovascolare quali lo stroke, il danno da ischemia -ri perfusione, la claudicalo intermittens; danni al sistema immunitario in condizioni di bassa tensione di ossigeno, comprendente come principi attivi locami tina o una alcanoll L-carnitina in cui l’alcanoile, lineare o ramificato ha 2-8 atomi di carbonio preferibilmente 2-6 atomi di carbonio, o un loro sale farmacologicamente accettabile in associazione con un antiossidante lipofilo e/o un antiossidante idrofilo e un eccipiente farmacologicamente accettabile.
6. Composizione secondo la rivendicazione 5 in cui l’antiossidante idrofilo è vitamina C, GSH o selenio.
7. Composizione secondo la rivendicazione 5 in cui l’antiossidante lipofilo è la vitamina A o la vitamina E.
8. Composizione secondo le rivendicazioni 5, 6 e 7 in cui l’antiossidante può essere presente come tale o sotto forma di estratti o polveri di prodotti naturali in cui l’antiossidante sia presente in alta concentrazione.
9. Composizione secondo la rivendicazione 6 sotto forma di dosaggio unitario comprendente 0,3-0, 5 g di L-carnitina o alcanoil L-camitina e 300-500 mg di vitamina C.
10. Composizione secondo la rivendicazione 7 sotto forma di dosaggio unitario comprendente 0,3-0, 5 g di L-carnitina o alcanoil L-camitina e di 50-2000, preferibimente 300- 1000 U/I di vitamina E.
11. Composizioni farmaceutica secondo la rivendicazione 5 per il trattamento della claudicatio intermittens in cui l’alcanoil L-carnitina è la propionil L-camìtina.
12. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente ulteriormente polifenoli, antocianine, antocianosidi, sali minerali e fibre vegetali.