ITRM990166A1

ITRM990166A1 - Uso della pirenoxina per la protezione dei tessuti corneali in interventi di fotocheratectomia.

Info

Publication number: ITRM990166A1
Application number: IT1999RM000166A
Authority: IT
Inventors: Enrico Boldrini; Mario Ciuffi
Original assignee: Farmigea Spa
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 1999-03-17
Publication date: 2000-09-17
Also published as: ATE349244T1; EP1173255B1; ES2277831T3; US6610686B1; WO2000054757A3; IT1305306B1; WO2000054757A2; DE60032594D1; DE60032594T2; EP1173255A2; PT1173255E; AU3324100A; JP5167499B2; JP2002539153A

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione avente per titolo: "Uso della pirenoxina per la protezione dei tessuti corneali in interventi di fotocheratectomià''

La presente invenzione riguarda l’uso della pirenoxina per la protezione dei tessuti corneali in interventi di fotocheratectomia. Più in particolare, l'invenzione concerne l'impiego della pirenoxina e dei suoi sali come agenti capaci di inibire, nella cornea, i fenomeni ossidativi dovuti alle specie reattive dell’ossigeno (o ROS, reactive oxygen species) che si producono nei tessuti in seguito all'irraggiamento con laser.

Come è noto, la chirurgia oftalmica, ed in particolare quella refrattiva, che si propone lo scopo di modificare il potere refrattivo dell’occhio per correggere difetti visivi normalmente di entità non modesta, si avvale di numerose tecniche operative più o meno consolidate o in evoluzione, di cui alcuni esempi sono la cheratotomia radiale, l’epicheratofachia, la cheratomileusi. Oltre a queste, si è notevolmente affermato anche in campo oculistico l’uso del laser, in particolare il laser a stato solido (come quello a neodimio:ittrio-alluminio-granato noto come Nd:YAG) e, soprattutto, il laser ad eccimeri.

I laser ad eccimeri sono laser pulsatili capaci di emettere, per effetto del decadimento di dimeri di gas nobili eccitati (eccimeri, ottenuti a partire da miscele gassose di alogeni e gas nobili), grandi quantità di energia sotto forma di radiazioni nel campo del lontano ultravioletto (UV-C), in serie di impulsi di durata, frequenza e fluenza determinate. Ciascun fotone emesso con l'irraggiamento ha una quantità di energia tale da rompere i legami intramolecolari del materiale esposto, in modo tale che le molecole irradiate vengono “spezzate” in piccoli frammenti volatili che sono espulsi a velocità supersoniche, realizzando un processo noto come ‘totodecomposizione”.

Nell’applicazione del laser ad eccimeri in interventi di chirurgia corneale si utilizza normalmente un tipo di laser all'argon-fluoro con emissione alla lunghezza d'onda di 193 nm, che è risultato in grado di effettuare operazioni della massima precisione, con un ottimo controllo sulla profondità di penetrazione e un minimo effetto di danneggiamento termico o meccanico sui tessuti adiacenti a quelli esposti. A differenza di altri tipi di laser usati in ambito clinico, il laser a eccimeri non emette energia concentrata in un punto di fuoco, ma ha un raggio di ampia sezione trasversale, che attraversando opportune aperture viene indirizzato a colpire ampie zone superficiali della cornea, con un accurato controllo della forma e delle dimensioni delle zone esposte. L’energia emessa viene assorbita quasi completamente in uno strato superficiale di pochi micron e determina l'ablazione, per evaporazione, di spessori di cornea di dimensioni poco più che molecolari ad ogni impulso, con una riproducibilità non raggiungibile da nessun altro mezzo.

Il laser ad eccimeri è ampiamente utilizzato per il rimodellamento corneale a scopo refrattivo, nelle tecniche note come fotocheratectomia refrattiva o PRK ( photo refractive keratectomy) e LASIK (laser intrastromal keratomileusis), per la correzione di diverse ametropie tra cui, in primo luogo, la miopia. Come è noto, quest'ultima è un difetto causato da una curvatura della cornea maggiore di quanto richieda la lunghezza del bulbo oculare, ciò che fa sì che i raggi luminosi provenienti dall'esterno vengano rifratti in modo tale da convergere in un punto di fuoco prima di arrivare a colpire la retina. L'uso del laser ad eccimeri consente in questo caso l’ablazione di strati di tessuto corneale di spessori via via crescenti verso il centro, con conseguente effetto di riduzione della curvatura della cornea stessa. Quando il sistema è utilizzato per la correzione dell’ipermetropia, in cui, al contrario, la modifica da ottenere è un aumento della curvatura della cornea, la quantità di tessuto asportato alla periferia della zona irradiata è più importante che al centro. Infine, per la correzione dell'astigmatismo che, come è noto, è un’ametropia causata da differenza di curvatura nei vari meridiani delia superficie oculare, la profondità dell’ablazione può essere asimmetrica, dipendendo dal meridiano che deve essere “appiattito”.

Più recentemente l’uso del laser ad eccimeri è stato proposto per la rimozione a scopo terapeutico di tessuto corneale superficiale, per il trattamento di irregolarità od opacità corneali di varia natura: distrofica, degenerativa, cicatriziale oppure infettiva. Tale tipo di intervento, denominato fotocheratectomia terapeutica o PTK (phototherapeutic keratectomy), è stato attuato, ad esempio, per il trattamento di erosioni corneali ricorrenti, di cheratiti postoperatorie, di distrofie corneali come quella di Reis-Bùckler, di opacizzazioni o cicatrici corneali dovute a Herpes simplex, di irregolarità superficiali indotte chirurgicamente, ad esempio in esito ad interventi di cheratoplastica o di chirurgia corneale refrattiva. Diversamente dal caso della fotocheratectomia refratti va , la PTK si propone di eliminare irregolarità dalla superficie corneale così da livellarne il profilo, e pertanto implica l’ablazione di spessori di tessuto diversi nei vari punti della superficie corneale trattata.

Benché gli interventi di fotocheratectomia sopra descritti si presentino come un'alternativa meno traumatica delle tecniche di chirurgia oftalmica convenzionale, il processo riparativo dopo la fotoablazione non è esente da inconvenienti più o meno transitori e fastidiosi o disabilitanti per il paziente, tra cui, ad esempio, problemi di cicatrizzazione corneale, formazione di opacità sottoepiteliali note con il nome di “haze”, che determinano una riduzione deH’efficienza visiva in conseguenza del fenomeno di “light scattering” (diffusione della luce) e, in alcuni casi, regressione dei valori refrattivi ottenuti con l’operazione. La letteratura del settore appare concorde nell’attribuire almeno in parte la genesi di tali effetti alla formazione di radicali liberi e, in generale, di specie reattive dell’ossigeno, che è stata rilevata come effetto collaterale della radiazione UV e dell’innalzamento termico creato nei tessuti interessati.

Come è noto, con il nome di “specie (o sostanze) reattive dell’ossigeno”, o ROS, vengono attualmente individuati cumulativamente i radicali liberi e le specie chimiche non radicaliche che prendono parte correntemente ai processi biologici ossidativi, ed il cui esubero rispetto alle naturali condizioni di equilibrio è ritenuto alla base di un numero sempre crescente di fenomeni degenerativi e patologici. In modo specifico, il termine ROS comprende il radicale anionico superossido, O2-·, il radicale ossidrilico, OH·, l’ossigeno singoletto, <1>O2, ed il perossido di idrogeno, H2O2, nonché i radicali alcossilici, RO·, e perossilici ROO·, che si formano dalle molecole organiche nel corso dei processi ossidativi. L’azione di queste specie si esplica, neH'organismo, su varie componenti cellulari, tra cui un gran numero di proteine strutturali e di enzimi, il DNA, l’RNA e, soprattutto, i lipidi di membrana.

La perossidazione lipidica è infatti il più noto dei meccanismi attraverso cui le ROS esercitano la loro attività degradativa sulle strutture cellulari, ai danni degli acidi grassi poliinsaturi (PUFA, polyunsaturated fatty acids) che sono presenti, spesso nella forma esterificata di fosfolipidi, nelle membrane citoplasmatiche. Nello stadio iniziale di tale processo, l’attacco di un radicale libero sottrae un atomo di idrogeno, H-, alla catena lipidica, formando un radicale libero, R·, che subisce un riarrangiamento molecolare dei doppi legami trasformandosi in un radicale di diene coniugato. Questo reagisce rapidamente con l’ossigeno formando un radicale perossilico lipidico, ROO·, il quale, avendo un potere ossidante sufficiente ad attaccare un altro PUFA, dà inizio alla fase di propagazione della reazione. Si forma così un idroperossido lipidico, ROOH, e corrispondentemente un altro radicale perossilico lipidico, ROO·. Il ramo principale della reazione, sopra descritto, si svolge quindi con attacchi radicalici a catena ai lipidi di membrana, che vengono trasformati via via nei corrispondenti idroperossidi, fino all’intervento di un radicale libero in grado di terminare la catena.

Diversi agenti presenti naturalmente nei tessuti cellulari possono svolgere l’azione predetta, esercitando in pratica una funzione di “scavengers" o antiossidanti. Tra questi, i più noti sono le vitamine E (αtocoferolo) e C (acido ascorbico), gli enzimi antiossidanti come superossido dismutasi (SOD), catalasi, glutatione perossidasi, e varie sostanze a basso peso molecolare, tra cui il glutatione (GSH), la tirosina, l’acido urico. La protezione naturale dagli stress ossidativi esplicata da tali sostanze, tuttavia, può non essere sufficiente ad antagonizzare l’effetto degradativo delle ROS, nel qual caso la lipoperossidazione può risultare in un danno irreversibile alle membrane cellulari.

È anche stato dimostrato che le forme ossidate di ioni di metalli idi transizione, come Fe<3+ >e Cu<2+>, in presenza di H2O2, possono accelerare il meccanismo ossidativo per mezzo di una reazione non enzimatica nota come reazione di Fenton. In presenza di un agente riducente, come l'ascorbato, parte dello ione ossidato passa allo stato di ossidazione inferiore (ad esempio Fe<2+>) e la reazione, la cui velocità dipende dal rapporto (Fe<3+>:Fe<2+>) procede, portando alla trasformazione del perossido di idrogeno in uno ione ossidrile, OH<">, più un radicale ossidrilico, OH·. Quest’ultimo rappresenta la ROS di gran lunga più reattiva.

Nonostante le difficoltà nell'individuazione delle ROS che sono legate alla loro reattività, e quindi alla loro breve vita, la formazione di radicali liberi in tessuti sottoposti a fotoablazione con laser ad eccimeri è stata consistentemente dimostrata. Ad esempio, la presenza di radicali liberi in cornee bovine esposte ad irraggiamento con laser ArF è stata evidenziata per mezzo della spettroscopia EPR (electron paramagnetic resonance) (R.J. Landry et al., Laser and Light in Ophthalmol., 6: dell’endotelio corneale e rilevamenti analitici sulla riduzione dell’attività della SOD a livello dell’umore acqueo hanno confermato la formazione di ROS nella cornea di conigli sottoposti a PRK (K. Bilgihan et al., Jpn. J. Ophthalmol., 40: 154-157, 1996). La perossidazione lipidica è stata evidenziata, sempre nella cornea di conigli, in seguito a trattamento di PTK con laser ad eccimeri, sia con esame istochimico che rilevando analiticamente in estratti di lipidi corneali la presenza di prodotti di degradazione, in particolare i dieni coniugati ed i chetodieni (S. Hayashi et al., British J. Ophthalmol., 81: 141-144, 1997).

È stato anche rilevato, mediante spettroscopia EPR, che radicali. liberi si formano anche quando i tessuti corneali vengono irradiati con laser allo stato solido Nd:YAG, ad una lunghezza d’onda di 213 nm anziché i 193 nm tipici del laser ad eccimeri all'argon-fluoro. In questo caso, tuttavia, oltre ad un danno ossidativo paragonabile a quello ottenuto con il laser ad eccimeri, si è anche avuto un effetto citotossico più marcato, in qualche modo legato alla maggiore lunghezza d’onda della radiazione (E. Ediger et al., Lasers Surg. Med., 21:88-93, 1997).

Oltre all'effetto diretto della radiazione UV nella produzione primaria di ROS, è anche stato osservato che l'attività chemotattica degli idroperossidi lipidici così formatisi richiama in situ cellule polimorfonucleate e macrofagi, che a loro volta, producendo altre ROS, amplificano l’azione dannosa della radiazione inducendo una serie di effetti citotossici (H. Goto et al., Curr. Eye Res., 10: 1009-1014, 1991).

Benché la letteratura citata dimostri la formazione di radicali liberi e specie reattive dell'ossigeno nel trattamento di fotoablazione, e colleghi tale fenomeno alle possibili complicazioni post-operatorie, non viene posta particolare attenzione all’opportunità di proteggere i tessuti corneali con la somministrazione di agenti esogeni ad attività antagonizzante le ROS, sia prima che dopo l’intervento. In effetti, la terapia farmacologica correntemente prescritta per i trattamenti di fotocheratectomia consiste nell’applicazione topica oculare, dopo l'intervento, di antibiotici, con l’evidente scopo di mantenere in asepsi la superficie oculare durante il processo di cicatrizzazione, e di antiinfiammatori (steroidei o, secondo gli indirizzi più recenti, non steroidei), con lo scopo di combattere stati di flogosi post-operatoria.

Con la presente invenzione si propone pertanto di fornire ai tessuti corneali interessati dall'irraggiamento UV, sia preventivamente che subito dopo il trattamento, un agente che svolga un’azione protettiva nei confronti del danneggiamento cellulare innescato dalle specie reattive dell’ossigeno, e che sia in grado di neutralizzarle o di inibire la loro azione. In particolare, l’agente proposto deve essere efficace nel contrastare la perossidazione lipidica nei tessuti cellulari della cornea.

Nell'ambito degli studi sugli effetti delle ROS e sull'Inibizione della lipoperossidazione da parte di varie molecole esogene con funzione di “scavengers" o antiossidanti, è stato trovato che la pirenoxina, un principio attivo già noto ed utilizzato a scopo terapeutico su un altro distretto oculare, il cristallino, mostra una notevole attività di inibizione della perossidazione lipidica nei tessuti corneali, ed è quindi capace di svolgere un’azione protettiva contro le alterazioni cellulari derivanti dall’irraggiamento laser.

La pirenoxina, o acido 1-idrossi-5-oxo-5H-pirido-[3,2a]-fenossazin-3-carbossilico (anche denominata pirfenossone), è un composto noto avente la seguente formula:

che è utilizzato in oftalmologia, usualmente nella forma del corrispondente sale di sodio, per il trattamento della cataratta. Quest’ultima è una condizione abnorme progressiva del cristallino dell’occhio, carat terizzata da una crescente perdita di trasparenza. Come è noto, le cateratte sono più spesso causate da cambiamenti degenerativi, spesso verificantisi dopo i 50 anni di età, mentre più raramente esse possono essere causate da traumi o da esposizione a veleni. All’inizio, la visione è offuscata, quindi le luci brillanti abbagliano diffusamente e si può sviluppare distorsione e visione doppia. Alla fine, se la cataratta non viene trattata, la vista viene persa del tutto. Oltre al trattamento chirurgico, che si rende necessario negli stadi degenerativi più avanzati e comporta l’asportazione del cristallino (con o senza inserimento chirurgico di una lente intraoculare), le cataratte possono essere trattate con la somministrazione topica oftalmica di pirenoxina in collirio.

La capacità della pirenoxina di inibire la formazione di opacità lenticolari è stata attribuita ad almeno tre differenti meccanismi d’azione: (a) inibizione dell’attività ossidante che le molecole chinoniche esercitano sulle proteine lenticolari, mediante un legame con i loro gruppi S H ; (b) attivazione e normalizzazione della funzione di pompa cationica della capsula del cristallino; (c) inibizione della sintesi di sorbitolo e riduzione del danno osmotico derivante dall'accumulo di questa sostanza (S. Iwata, J. Pharmac. Soc. Jap., 1964; 84: 435-440; F. Ikemoto et al. in: Proc. 50th Congr. Pharmacol. Soc. Jap., Kanto Region, 1974; i. Korte et al., Ophthalmic Res. 1979; 11: 123-125).

Nell’ambito di studi più recenti sull'attività biologica della pirenoxina è stato anche trovato, ed è oggetto della domanda di brevetto europeo No. EP 0885612, ceduta all’attuale Richiedente, che tale moecola, oltre ad essere attiva nel trattamento della cataratta, è anche dotata di proprietà antiinfiammatorie. Tali proprietà, che sono state verificate su modelli animali, si esplicano attraverso un meccanismo d’azione non chiarito nella domanda di brevetto citata, anche se la descrizione ipotizza un’azione inibitrice del catabolismo ossidativo dell’acido arachidonico, che porta alla produzione di prostaglandine.

Secondo la presente invenzione è stato trovato, come già esposto, che la pirenoxina può essere vantaggiosamente usata per la protezione dei tessuti corneali in corso di trattamento con laser ad eccimeri, in quanto essa è attiva nell’inibire la perossidazione lipidica nei tessuti cellulari della cornea.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione l’uso dell’acido 1-idrossi-5-oxo-5H-pirido-[3,2-a]-fenossazin-3-carbossilico (pirenoxina) o di un suo sale farmaceuticamente accettabile per la produzione di un farmaco topico oftalmico per la protezione dei tessuti corneali in interventi di fotocheratectomia. Come già notato, il farmaco proposto è indicato come inibitore dell’azione delle ROS (reactive oxygen species) a livello dei tessuti corneali e, in particolare, come inibitore della perossidazione lipidica a livello di tali tessuti.

L’uso della pirenoxina come agente protettivo pre- e post-operatorio trova applicazione in qualunque tipo di intervento di fotocheratectomia, essendo comunque presumibile un più ampio impiego in quei tipi di trattamenti che attualmente sono i più praticati, cioè quelli di fotoablazione corneale con laser ad eccimeri, sia a scopo refrattivo che terapeutico e, nel primo caso, sia con la PRK che con la tecnica LASIK.

I preparati oftalmici della presente invenzione contengono preferibilmente il principio attivo, cioè la pirenoxina o un suo sale farmaceuticamente accettabile, in quantità dallo 0,0001% allo 0,01% in peso, espressa come acido libero. Più convenientemente, detti medicamenti contengono dallo 0,001% allo 0,005% in peso di pirenoxina, espresso come acido libero, una concentrazione ottimale essendo la stessa attualmente usata per la terapia della cataratta, cioè lo 0,005% in peso. Ancora più convenientemente, detta pirenoxina è nella forma del corrispondente sale sodico. Quando utilizzato in forma di collirio allo 0,005% in peso del principio attivo, il preparato secondo l’invenzione può essere somministrato, per ottenere il desiderato effetto di inibizione delle ROS, ad un dosaggio di una-due gocce da due a tre volte al giorno, preferìbilmente due gocce tre volte al giorno, iniziando almeno uno o due giorni prima dell’intervento, e proseguendo, dopo l’intervento, per almeno uno o due giorni. In generale, il dosaggio e la posologia possono subire ampie variazioni senza che sia compromesso l’effetto complessivo di protezione contro le ROS esercitato dal prodotto.

Il farmaco oftalmico topico contenente pirenoxina o un suo sale può essere, in generale, nelle stesse forme realizzate o proponibili per l'uso dello stesso principio attivo nella terapia della cataratta, o nella terapia di infiammazioni oftalmiche, come descritto nella citata pubblicazione brevettale europea EP-A-0885612. In particolare, il prodotto può essere in forma di soluzione o sospensione acquosa per collirio o nella forma di emulsione, unguento, gel o crema. Preferibilmente, il prodotto è somministrato come soluzione oftalmica acquosa. A causa dell'instabilità del principio attivo, la pirenoxina viene normalmente formutata, nei prodotti medicinali già in uso per il trattamento della cataratta, come un preparato a due componenti, in cui un primo componente comprende pirenoxina liofilizzata, e il secondo componente comprende un veicolo o diluente acquoso accettabile a livello oculare. I due componenti vengono ricostituiti prima dell’uso e la soluzione così ottenuta può generalmente essere tenuta a temperatura ambiente per circa due settimane senza degradazione.

In generale, le composizioni contenenti pirenoxina o un suo sale secondo l’invenzione possono essere formulate secondo la tecnica nota, ad esempio secondo gli insegnamenti dati nel “Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook", Hack Pubi. Co., U.S.A.. Usualmente, uno o più agenti di regolazione della tonicità dovrebbero essere aggiunti, in modo da dare alla soluzione un corretto valore del’osmolarità. Uno qualsiasi dei prodotti correntemente impiegati nella tecnica può essere utilizzato, come, ad esempio, cloruro di sodio, cloruro di potassio, mannitolo, destrosio, acido borico, glicol propilenico. Il preparato può anche comprendere acidi o basi come agenti di regolazione del pH e/o tamponi come, ad es., il sistema fosfato monosodico - fosfato disodico, il sistema borato di sodio - acido borico o il sistema succinato di sodio - acido succinico. Per una buona tollerabilità nell’occhio il pH dovrebbe essere compreso tra 4,5 e 8,5, Inoltre, la composizione dovrebbe anche comprendere conservanti ed agenti antimicrobici, come cloruro di benzalconio, sodio mertiolato o timerosale, metil-, etil- e propil-parabene, cloro butano lo, nonché agenti chelanti o sequestranti come gli edetati o EDTA. Qualora il prodotto sia confezionato in contenitori per dosi unitarie la presenza di conservanti può essere evitata, ma quando si usano contenitori per dosi multiple, ad es. flaconi per collirio contenenti da 5 a 15 mi, la presenza dei conservanti è necessaria.

Inoltre, il preparato oftalmico può comprendere ulteriori ingredienti facoltativi, come agenti addensanti, antiossidanti, stabilizzanti, tensioattivi, ecc.. Esclusivamente a titolo di esempio, la composizione di un prodotto commerciale già in uso per il trattamento della cataratta viene descritto nel seguito. La formulazione può essere adatta anche per l’uso del prodotto come agente protettivo della cornea contro i radicali liberi e le ROS.

ESEMPIO

Formulazione di pirenoxina sodica liofilizzata Il componente di polvere secca del prodotto ha la seguente composizione, in cui le quantità sono date per la ricostituzione in una soluzione di 7 mi:

pirenoxina sodica mg 0,376

(corrispondente a mg 0,350 di pirenoxina)

taurina mg 34,34

Nella preparazione, la taurina e la pirenoxina sodica vengono disciolte separatamente in acqua deionizzata, le due soluzioni vengono sterilizzate per filtrazione e quindi mescolate tra di loro, e sottoposte alla procedura di liofilizzazione.

Il solvente acquoso ha la seguente composizione:.

alcool polivinilico mg 98

acido succinico mg 2,31

sodio succinato · 6H20 mg 89,215

cloruro di sodio mg 34,3

cloruro di benzalconio mg 0,175

sodio edetato mg 0,89

acqua deionizzata q.b. a 7 mi

Oltre agli ingredienti che sono già stati menzionati nella descrizione che precede, la formulazione di cui sopra contiene PVA come agente addensante, il pH del componente solvente è 6. La formulazione è preparata agitando e disciogliendo prima in acqua tutti gli ingredienti ad eccezione del cloruro di benzalconio. Dopo la completa dissoluzione di tutti i prodotti si aggiunge il cloruro di benzalconio continuando a tenere sotto agitazione, e la miscela viene sterilizzata per filtrazione, li prodotto ricostituito ha un pH di 6-6,3.

Prove di attività come inibitore della lipoperossidazione

Allo scopo di valutare le prestazioni della pirenoxina come agente protettivo contro l’azione delle ROS nei tessuti corneali, ed in particolare contro la perossidazione dei lipidi, sono stati effettuati alcuni esperimenti su modelli animali, come riportato nel seguito,

Effetto in vitro sull’azione delle ROS indotte in omogenati di epitelio di cornea di coniglio

trice della lipoperossidazione esercitata dalla pirenoxina in cellule epiteliali di cornea si è avvalsa del noto metodo di induzione del fenomeno perossidativo che utilizza il sistema Fe(lll) - acido ascorbico. L’attacco ossidativo sui lipidi di membrana è stato verificato sia con la determinazione spettrofotometrica dei dieni coniugati che con la determinazione delle sostanze liposolubili fluorescenti che, come è noto, sono generate dalla degradazione ossidativa delie molecole lipidiche.

La procedura sperimentale adottata si articolava nelle seguenti fasi: a) prelievo della cornea dall’occhio di conigli pigmentati maschi opportunamente selezionati e preparati per lo studio; b) incubazione della stessa in tampone fosfato 100 μΜ a pH 7,5, in presenza di 1000 U di collagenasi e CaCI2 5 μΜ per 20 ore a 37°C; c) centrifugazione a 35000 g a 0°C per 10 min. e lavaggio del sedimento con tampone fosfato; d) omogeneizzazione del sedimento cellulare in 1 mi di tampone pH 7,4 (10% p/v); e) incubazione di un’opportuna aliquota dì omogenato con FeCI3 10 pM e acido ascorbico 100 pM a 37°C per 30 min., in presenza ed in assenza (controllo) di pirenoxina; f) estrazione delle sostanze liposolubili con miscela cloroformio/metanolo (2:1 v/v). La determinazione dei dieni coniugati sull’estratto lipidico è stata effettuata secondo Buege et al. (Methods Enzymol, 52: 302-310, 1974), mentre per quella delle sostanze liposolubili fluorescenti si è applicato il metodo di Fletcher et al. (Anal. Biochem. 52: 1-9, 1973). I risultati delle prove sono esposti nella seguente tabella.

TABELLA 1

Ciascun valore ± SEM rappresenta la media di almeno 3 (x2) determinazioni.

<*>: p<0,05 e tt: p<0,001 verso i rispettivi valori basali;

<**>: p<0,001 e ##; p<0,005 verso i rispettivi controlli.

Dai dati esposti in tabella si evince che la pirenoxina esercita un evidente potere inibente nei confronti dell’azione lipoperossidante delle ROS, indotte dal sistema Fe(lll) - acido ascorbico, come è desumibile dal notevole decremento dei dieni coniugati e dalla significativa diminuzione delle sostanze liposolubili fluorescenti.

Effetto ex vivo della pirenoxina su cornee di coniglio sottoposte in vitro all’azione delle ROS

Utilizzando lo stesso sistema di induzione della perossidazione lipidica della prova precedente, l'azione protettiva della pirenoxina è stata valutata ex vivo con la seguente procedura sperimentale: a) l’occhio destro di conigli dello stesso tipo di quelli utilizzati nella prova precedente veniva trattato per via topica ogni ora per 8 ore e per 2 giorni con 2 gocce di pirenoxina allo 0,005% in NaCI 0,145 M (1 goccia = 30 μί, equivalenti a circa 1 ,5 pg), mentre l’occhio sinistro riceveva contemporaneamente solo gocce di soluzione salina (60 pi); b) al terzo giorno il coniglio veniva sacrificato mediante iniezione di pentobarbital (100 mg/kg di peso corporeo); c) le cornee, rimosse (115-120 mg), venivano incubate con FeCI3 e acido ascorbico in tampone fosfato pH 7,4 a 27°C per 30 min.; d) le cornee venivano quindi sottoposte ad incubazione con collagenasi e successiva omogeneizzazione secondo la metodica della prova precedente. Sugli omogenati si procedeva alla valutazione quantitativa dei dieni coniugati con lo stesso metodo già riferito. I risultati sperimentali sono riportati nella tabella che segue.

TABELLA 2

Ciascun valore ± SEM rappresenta la media di almeno 3 (x2) determinazioni.

<*>: p<0,05

I valori riportati nella tabella indicano che la pirenoxina, somministrata per via topica negli occhi di coniglio, raggiunge nella cornea concentrazioni tali da contrastare in vitro l'azione lipoperossidativa delle ROS, come è indicato dalla diminuzione dei dieni coniugati valutata negli omogenati di cellule epiteliali.

La presente invenzione è stata descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma è da intendersi che variazioni o modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Uso dell’acido 1-idrossi-5-oxo-5H-pirido-[3,2-a]-fenossazin-3-carbossilico (pirenoxina) o di un suo sale farmaceuticamente accettabile per la produzione di un farmaco topico oftalmico per la protezione dei tessuti corneali in interventi di fotocheratectomia.
2. Uso secondo la rivendicazione 1 , in cui detto farmaco è indicato come inibitore dell’azione delle ROS (reactive oxygen species) a livello dei tessuti corneali.
3. Uso secondo la rivendicazione 2, in cui detto farmaco è indicato come inibitore della perossidazione lipidica a livello dei tessuti corneali.
4. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui detti interventi di fotocheratectomia sono interventi di fotoablazione corneale con laser ad eccimeri.
5. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4, in cui detto farmaco contiene dallo 0,0001% allo 0,01% in peso di pirenoxina, espresso come acido libero.
6. Uso secondo la rivendicazione 5, in cui detto farmaco contiene dallo 0,001% allo 0,005% in peso di pirenoxina, espresso come acido libero.
7. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui detta pirenoxina è nella forma del corrispondente sale sodico.
8. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-7, in cui detto farmaco topico oftalmico è nella forma di una soluzione o sospensione acquosa per collirio, o nella forma di un’emulsione, un unguento, un gel o una crema.
9. Uso secondo la rivendicazione 8, in cui detta soluzione acquosa è ottenuta per ricostituzione di un preparato a due componenti, di cui un primo componente comprende pirenoxina liofilizzata, nella forma di sale sodico, insieme con un veicolo accettabile a livello oculare, e il secondo componente comprende un veicolo o diluente acquoso accettabile a livello oculare.
10. Uso della pirenoxina per la protezione dei tessuti corneali in interventi di fotocheratectomia secondo le rivendicazioni 1-9, sostanzialmente come sopra descritto.