RS57286B1 - Novi fragmenti antitela, njihove mešavine i primene - Google Patents

Description

Opis

Oblast ovog pronalaska

[0001] Ovaj opis odnosi se na nove fragmente antitela sa poboljšanom in vivo stabilnošću.

Pozadina

[0002] Ciljana terapija, nova granica lečenja kancera, upošljava farmakološke alatke (lekovi ili antitela) koji specifično blokiraju glavne genske proizvode koji održavaju transformisani fenotip. Trenutno, ciljana terapija za kancer koristi se u klinici za lečenje hroničnih mijelogenih leukemija (CML), zavisnih od ABL molekula tirozin kinaze, za lečenje podskupa kancera pluća ne-malih (NSCLC) i kancera kolonrektum (CRC) koji se oslanjaju na aktivaciju epidermalnog receptora faktora rasta (EGFR/HER-1) i za lečenje BRAF-zavisnih melanoma.

[0003] Receptori sa tirozin kinaza aktivnošću (RTK-i) predstavljaju zanimljive kandidate za ciljanu terapiju budući da su hiper aktivirani u nekoliko vrsta tumora. Oni mogu biti inhibirani različitim vrstama ciljujućih molekula, kao što su antitela, koji nakon interakcije sa ekstracelularnim delom receptora mogu da uznemire receptor-indukovanu intraćelijsku signalizaciju, i hemijski-sintetizovane male molekule koji se mešaju u katalitičku aktivnost receptora.

[0004] Među različitim RTK-a, proizvod c-met proto-onkogena, receptor faktora rasta hepatocita (HGFR/Met), izdvaja se kao jedan od najznačajnijih aktiviranih onkogena kod kancera. Met kontroliše genetski program poznat kao 'invazivni rast' koji indukuje promitogene, pro-invazivne i anti-apotoptične znake. Kroz ove fiziološke signale, Met obezbeđuje sa boljom pogodnošću tumor, pomagajući mu da prevaziđe selektivne barijere u progresiji kancera. Štaviše, Met održava rast tumora svojom sposobnošću da promoviše angiogenezu tumora. Poslednjih godina, Met takođe izbija kao odgovoran za agresivnost razvijenu od strane tumora i lečenih anti-angiogenim agensima i u otporu na konvencionalnu radioterapiju. Dodatno, MET genska izmena može biti primarni uzrok transformacije, u svim onim slučajevima koji su genetski odabrani za dugoročno održavanje primarno transformisanog fenotipa.

[0005] Sva prethodna otkrića ubrzala su razvoj nekoliko molekula pogodnih da inhibiraju Met signalizaciju, uključujući kompetitivne inhibitore HGF, inhibitore hemijske Met kinaze, anti-HGF i antiMet antitela. Neki od ovih molekula, do sad, ispitani su samo u istraživačke svrhe. Trenutno se izvode klinička ispitivanja sa neutrališućim anti-HGF antitelima, anti-Met antitelima i nekoliko malih molekula.

[0006] Sa nekoliko tački gledišta, poželjno bi bilo anti-Met antitelo koje može da inhibira Met signalizaciju. Antitela su veoma specifična, stabilna i, zahvaljujući njihom prirodnom dizajnu, domaćin ih generalno dobro toleriše. U nekoliko poslednjih godina, spovedeno je nekoliko napora da se generišu terapeutska anti-Met antitela. Međutim, prijavljeno je dosta promašaja, budući da se većina anti-Met antitela ponaša kao agonisti, oponašajući HGF aktivnost. To je uglavnom zbog činjenice da, zahvaljujući njihovoj dvovalentnoj strukturi, antitela mogu da stabilišu receptor dimere, omogućavajući transfosforilaciju Met-a, sa konsekventnom aktivacijom. U jednom slučaju, agonist anti-Met antitelo (5D5) konstruisano je i konvertovano u monovalentni oblik (jednokraki-5D5) koji je, ulazeći u kompeticiju sa HGF vezivanjem, obdaren terapijskim potencijalem (1,2). Ovaj molekul trenutno je ušao u fazu III kliničkog ispitivanja lečenja podskupa pacijenata obolelih od kancera pluća ne-malih ćelija, okarakterisani visokim nivoom Met ekspresije u tumorima, u kombinaciji sa erlotinibom (3).

[0007] Monoklonalno antitelo DN30 je mišje IgG2A usmereno prema ekstracelularnom ostatku humanog Met receptora (4). Ono se vezuje sa pod-nanomolarnim afinitetom za IPT domen Met receptorskog ekstraćelijskog regiona. Na početku, okarakterisano je kao delimični agonist za Met, koji može da promoviše neke, ali ne sve, Met-posredovane biološke ćelijske odgovore. Kasnije je pokazano da može da deluje kao inhibitor rasta tumora i metastaza putem mehanizma receptorskog 'rasipanja' (5). Receptorsko rasipanje je fiziološki celularni mehanizam raspadanja proteina koji deluje na različite faktore rasta, citokine, receptore i adhezione molekule. Met rasipanje artikuliše se u dva koraka: prvo metaloproteaza, ADAM-10, cepa ekstraćelijski domen Met-a prepoznavanjem specifične sekvence smeštene neposredno ispred trans-membranskog regiona; zatim, preostali transmembranski fragment postaje supstrat druge proteaze (γ-secretaza) koja oslobađa kinaza-sadržavajući deo iz membrane i rapidno je usmerava ka putu degradacije proteazoma (6,7). Ojačavanje ovog mehanizma ispoljeno sa DN30 vodi ka redukciji u broju Met receptora izloženih na ćelijskoj površini. U isto vreme, oslobađa rastvorivi, 'mamac' ekto-domen u esktraćelijskom prostoru. On ulazi u kompeticiju sa netaktnutim trans-membranskim receptorom za ligand vezivanje i inhibira receptor homo-dimerizacije obrazujući hetero-dimerne kompekse sa bona fide Met. Sve ove akcije snažno onesposobljavaju Met-posredovanu signalizaciju i rezultiraju u prevenciji nizvodnih bioloških efekata.

[0008] Pronalazači su nedavno demonstrirali da je monovalentni Fab fragment DN30 anti-Met monoklonalnog antitela (DN30 Fab) očišćen od bilo koje agonističke aktivnosti i održava sposobnost da indukuje rasipanje, čime rezultira kao potentan Met inhibitor (8). Indukovanje Met rasipanja sa DN30Fab zavisno je od selektivne antitelo-antigen interakcije, ali je nezavisno od aktivacije receptora. Ovaj mehanizam aktivnosti, baziran na jednostavnoj eliminaciji Met-a iz ćelijske površine, daje DN30-Fab-u jaku prednost u odnosu na druge inhibitore, budući da može biti efektivan protiv svih oblika Met aktivacije, bilo HGF-zavisan ili ne, indukovan preteranom ekspresijom, mutacijom ili genskom amplifikacijom.

[0009] Dok je rekombinantni DN30-Fab veoma atraktivan za kliničke primene, kratak polu-život Fab-a u plazmi – uglavnom zbog klirensa iz bubrega – ozbiljno ograničava njegovu upotrebu u lečenju pacijenata.

[0010] Trenutno, najujedinjenija tehnika za poboljšanje farmakoloških karakteristika Fab fragmenta je da se poveća njegova molekulska masa konjugovanjem sa Poli Etilen Glikolom (PEG). Fab PEGilacija je put koji se prati u većini slučajeva u kojima se upošljava Fab u klinikama. Kovalentno pričvršćivanje polimernih lanaca za fragment antitela, dobijenih efikasno i bez gubitka antigen vezujućih karateristika, nije očigledan proces i zahteva snažan napor za njegovo postavljanje.

[0011] Još jedna tehnika koja se koristi da poboljša farmakološke karakteristike Fab fragmenta opisana je u EP-A-1718677. Takva procedura, koja je upotrebljena da se generiše jedan Armed oblik monoklonalnog antitela 5D5 koji je prethodno komentarisan, predstavlja proizvodnju – na rekombinantnoj osnovi – tri različita lanca antitela u istoj ćeliji, laki lanac (VL-CL), teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3) i Fc deo teškog lanca (CH2-CH3). CH2-CH3 domeni nisu divljeg tipa: uključene su mutacije, koje daju porast specifičnim trodimenzionim strukturama. U jednom polipeptidu, CH2-CH3 region uključuje sekvencu koja obrazuje ispupčenje, dok u drugom polipeptidu CH2-CH3 region sadrži šupljinu za formiranje sekvenci, u koju se može umetnuti ispupčenje (struktura dugme-u-otvoru). Prisustvo ovih trodimezionalnih struktura omogućava poželjno formiranje heterodimera u kojima teški lanac formira disulfidne veze sa Fc fragmentom, ali ne isključuje uopšte formiranje homodimera (tj. dva teška lanca međusobno povezana i dva Fc međusobno povezana). Prečišćavanje koje omogućava odvajanje neželjenih homodimera od željenih heterodimera je obavezno. Na taj način "jednokraka procedura", iako veoma elegantna, otežana je jer zahteva dodatne faze u ukupnom procesu koji komplikuju proizvodnju i redukuju prinos rekombinantnog antitela. Nekoliko strategija za povećanje polu-života fragmenata antitela opisano je u i.a. u Konstantaninou et al., Biotechnology Letters 2010; 32(5):609-622, i Wier et al., BiochemicalSociety Transactions (2002); 30(4): 512-516.

[0012] Zbog svega toga postoji potreba za različitim rešenjem kako bi se povećao polu-život Fab-a u plazmi za in vivo terapeutsku upotrebu.

Suština ovog pronalaska

[0013] Cilj ovog opisa je da obezbedi fragment antitela sa poboljšanom in vivo stabilnošću.

[0014] U skladu sa ovim pronalaskom, gornji cilj se postiže zahvaljujući predmetnoj materiji koja je specifično ponovljena u pratećim patentnim zahtevima, za koje se podrazumeva da čine sastavni deo ovog opisa.

[0015] Primer izvođenja ovog opisa obezbeđuje fragment antitela koji obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca i dva konstantna domena i drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca i dva konstantna domena, u kojem su dva konstantna domena nekog lanca konstantni domeni lakog lanca, a dva konstantna domena su CH1 konstantni domeni teškog lanca, fuzionisani u različitim kombinacijama za varijabilne domene.

[0016] Dalji primer izvođenja ovog opisa tiče se fragmenta antitela kakav je prethodno definisan koji je stabilniji in vivo u odnosu na Fab molekul koji obuhvata varijabilne domene lakog i teškog lanca.

[0017] Još dalji primer izvođenja tiče se fragmenta antitela kakav je prethodno definisan koji se specifično vezuje za receptor faktora rasta hepatocita (HGFR/Met).

Kratak opis crteža

[0018] Ovaj pronalazak biće detaljnije opisan u nastavku, čisto kao ilustrativan neograničavajući primer i, uz pozivanje na priložene crteže, na kojima:

● FIG.1: Met rasipanje i usporena-regulacija u Met-zavisnim ćelijama tretiranim himernim MvDN30 ili mišjim DN30 Fab. A SNU-5 humana ćelijska linija želudačnog karcinoma; B H1993-NCl ćelijska linija karcinom pluća ne-malih ćelija. Ćelije su inkubisane tokom 48 sati u podlozi bez seruma sa indikovanim koncentracijama dva fragmenta antitela izvedena iz DN30 mAb. Ukupni Met nivoi određeni su Western blot analizom ćelijskih ekstrakata upotrebom anti-Met antitela. Dve Met trake odgovaraju neobrađenim (p190 Met) i zrelim (p145 Met) oblicima receptora. Met rasipanje određeno je Western blot analizom kondicionirane podloge upotrebom anti-Met antitela. Oba molekula efikasno indukuju Met-rasipanje/usporenu-regulaciju.

● FIG.2: Ispitivanje rasta Met-zavisnih ćelija tretiranih himernim MvDN30 ili mišjim DN30 Fab. A EBC-1 ćelijska linija karcinom pluća ne-malih ćelija; B Hs746T humana ćelijska linija želudačnog karcinoma. Ćelije su zasejane u sudove sa 96 bazenčića (1000/bazenčić) u 10% FCS podlozi. Nakon 24 sata ćelije su tretirane povećavajućim koncentracijama antitela tokom dodatna 72 sata. Broj ćelija procenjen je ćelijskim titer-glo (Perkin Elmer). Svaka tačka predstavlja sredinu trojnih vrednosti; stubići predstavljaju standardnu devijaciju. Oba molekula efikasno inhibiraju ćelijski rast Met-zavisnih ćelija.

FIG.3: Šematski prikaz novih DN30 izvedenih molekula. Gornji: himerizovani DN30 Fab (MvDN30); Srednji: Dvostruki Konstantan domen Fab sa dupliranim konstantnim domenima u tandemu (DCD-MvDN30.1); Donji: Dvostruki konstantan domen Fab sa dupliranim konstantnim domenima uzajamno zamenjeni (DCD-MvDN30.2). VH: varijabilni domen DN30 teškog lanca. VL: varijabilni domen DN30 lakog lanca. CH1: konstantan domen 1 izveden iz humanog IgG1 teškog lanca. CL: konstantan domen izveden iz humanog kapa lakog lanca. Strep i His Oznaka: sekvence uključene kako bi se obezbedilo proteinsko prečišćavanje i imuno-detekcija.

FIG.4: Analiza novih DN-30 izvedenih molekula. Indikovani prečišćeni proteini podvrgnuti su SDS-PAGE pod redukujućim uslovima. Gel je obojen sa Gel Code plavo (Pierce). Svi molekuli pokazuju dve trake sa očekivanom molekulskom masom.

FIG.5: Vezivanje za Met DCD-MvDN30 molekula. Analiza ELISA vezivanja MvDN30, DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 (tečna faza) za Met-Fc himeru (čvrsta faza). Vezivanje je otkriveno upotrebom anti-strepTAG antitela. O.D.: Optička gustina; A.U.: proizvoljne jedinice. Svaka tačka predstavlja sredinu trojnih vrednosti; stubići predstavljaju standardnu devijaciju. Novi molekuli vezuju se za Fc-Met sa istim visokim afinitetom.

FIG.6: Agonistička aktivnost DCD-MvDN30 molekula. A549 ćelije su izgladnjivane tokom 24 sata , a zatim stimulisane tokom 10min na 37°C sa različitim molekulima pri indikovanim koncentracijama. Met aktivacija određena je imuno-taloženjem sa anti-Met antitelima praćeno Western blotingom sa anti-Met antitelima specifičnim za fosforilisane Tyr 1234/1235 Met ostatke, glavno mesto fosforilacije (Gornja). Isti blot je ponovo ispitan sa anti-Met antitelima (Donja). Novi molekuli ne aktiviraju značajno Met receptor.

FIG.7: Agonistička aktivnost DCD-MvDN30 molekula. A549 ćelije su izgladnjivane tokom 24 sata, a zatim stimulisane tokom 10min na 37°C sa različitim molekulima pri indikovanim koncentracijama. Aktivacija AKT i ERK-1,2 određeno je Western blotingom sa anti-AKT ili anti-ERK antitelima specifičnim za fosforilisani oblik. Isti blot je ponovo ispitan sa anti-Vinculin antitelima (Donja) kako bi se kontrolisalo uvođenje proteina. Novi molekuli ne aktiviraju značajno Met- zavisnu signalizaciju.

FIG.8: Met rasipanje i usporena-regulacija u ćelijama tretiranim DCD-MvDN30 molekulima.

A549 ćelije su inkubisane tokom 72 sata u podlozi bez seruma sa indikovanim molekulima (500 nM). Ukupni Met nivoi određeni su Western blot analizom ćelijskih ekstrakata upotrebom anti-Met antitela. Dve Met trake odgovaraju neobrađenim (p190 Met) i zrelim (p145 Met) oblicima receptora. Kao kontrola uvođenja, filter je ispitan sa nepovezanim proteinom (aktin). Met rasipanje određeno je Western blot analizom kondicionirane podloge upotrebom anti-Met antitela. Novi molekuli efikasno indukuju Met rasipanje.

FIG.9: Inhibicija HGF-indukovane Met-aktivacije DCD-MvDN30 molekulima. A549 ćelije su inkubisane tokom 24 sata u podlozi bez seruma plus indikovani molekuli (1000nM), a zatim stimulisane tokom 10 min sa HGF (100ng/ml). Met aktivacija određena je u ukupnim ćelijskim lizatima Western blotingom sa anti-Met antitelima specifičnim za fosforilisane Tyr 1234/1235 Met ostatke, glavno mesto fosforilacije. Isti blot je ponovo ispitan anti-Met antitelima. Aktivacija AKT i ERK-1,2 određena je Western blotingom sa anti-fosfoAKT ili anti-fosfoERK antitelima. Isti blot je ponovo ispitan sa anti-AKT ili ERK-1,2 antitelima. Kako bi se kontrolisalo uvođenje proteina, filter je takođe ispitan sa anti-Vinculin antitelima. Novi molekuli snažno inhibiraju HGF-indukovanu Met-aktivaciju i Met-zavisnu signalizaciju.

FIG.10: Od sidrenja-zavisan rast Met-zavisnih ćelija tretiranih sa DCD-MvDN30.1 ili DCDMvDN30.2 ili MvDN30. A, B, C, D humane ćelijske linije želudačnih karcinoma; E, F ćelijske linije karcinom pluća ne-malih ćelija. Ćelije su zasejane u 96 costar bazenčića (1000/bazenčić) u 5% FCS podlozi. Nakon 24 sata ćelije su tretirane povećavajućim koncentracijama različitih molekula tokom dodatna 72 sata. Broj ćelija procenjen je pomoću ćelijskog titra-glo (Promega). Grafički podaci predstavljaju procenat živih ćelija u odnosu na netretiranu kontrolu. Svaka tačka predstavlja sredinu trojnih vrednosti. Novi molekuli efikasno inhibiraju ćelijski rast Met-zavisnih ćelija.

FIG.11: Od sidrenja-nezavisan rast ćelija tretiranih sa DCD-MvDN30.1 ili DCD-MvDN30.2 ili MvDN30. A549 ćelije su zasejane u polu-čvrstoj podlozi (5% agaroza) sa ili bez HGF (50 ng/ml) u prisustvu 1.5 mM DCD-MvDN30.1, ili DCD-MvDN30.2 ili MvDN30. Nakon 21 dana, kolonije su obojene tetrazolijum solju. Kolonije su izbrojane pikselima brojanja u svakoj oblasti bazenčića sa MetaMorphOffline Softverom. Svaka tačka predstavlja sredinu trojnih vrednosti. Novi molekuli efikasno inhibiraju HGF-zavisan od sidrenja-nezavisan ćelijski rast.

FIG.12: Farmakokinetički profil in vivo za DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 i MvDN30.

Imunodeficijentnim miševima injektovano je intraperitonealno jedna doza (100 µg) DCD-MvDN30.1, ili DCD-MvDN30.2 ili MvDN30. Periferna krv sakupljena je u različitim vremenskim tačkama. Serumske koncentracije terapeutskih molekula izmerene su pomoću ELISA. Grafikon predstavlja količinu cirkulišućih molekula u funkciji vremena. Uzorci su u triplikatu, stubići predstavljaju standardne devijacije.

FIG.13: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence prvog primera izvođenja prvog polipeptida fragmenta antitela u skladu sa ovim otkrićem. Sekvence koje odgovaraju polipeptidu izvedene su iz lakog lanca, VL-CL-CL. CDR regioni podvučeni su i u nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama.

● FIG.14: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence prvog primera izvođenja drugog polipeptida fragmenta antitela u skladu sa ovim otkrićem. Sekvence odgovaraju polipeptidu izvedenom iz teškog lanca, VH-CH1-CH1-Oznake. CDR regioni podvučeni su i u nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama. Strep i Histidin Oznake napisane su velikim zakošenim slovima. ● FIG.15: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence drugog primera izvođenja prvog polipeptida fragmenta antitela u skladu sa ovim otkrićem. Sekvence odgovaraju polipeptidu izvedenom iz lakog lanca, VL-CL-CH1-Oznake. CDR regioni podvučeni su i u nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama. Strep i Histidin Oznake napisane su velikim zakošenim slovima.

● FIG.16: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence drugog primera izvođenja drugog polipeptida fragmenta antitela u skladu sa ovim otkrićem. Sekvence odgovaraju polipeptidu izvedenom iz teškog lanca, VH-CH1-CL. CDR regioni podvučeni su i u nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama.

● FIG.17: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence DN30 varijabilnog domena lakog lanca. CDR regioni podvučeni su i u nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama.

● FIG.18: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence DN30 varijabilnog domena teškog lanca. CDR regioni podvučeni su i u nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama.

Deataljan opis ovog pronalaska

[0019] Ovaj pronalazak biće detaljnije opisan u nastavku, putem neograničavajućeg primera, sa pozivanjem na fragmente antitela koji mogu da se specifično vezuju za receptor faktora rasta hepatocita.

[0020] Jasno je da se obim ovog opisa ni na koji način ne ograničava na takav ciljani antigen, budući da ovde opisani fragmenti antitela mogu biti okarakterisani specifičnim vezivanjem različitim od ciljanih antigena.

[0021] U opisu koji sledi, dati su brojni specifični detalji kako bi se obezbedilo temeljno shvatanje primera izvođenja. Primeri izvođenja mogu se izvesti bez jednog ili više specifičnih detalja, ili drugim postupcima, komponentama, materijalima, itd. U drugim slučajevima, bazenčić-poznate strukture, materijali, ili operacije nisu detaljnije prikazane ili opisane kako bi se zaobišli nejasni aspekti primera izvođenja.

[0022] Pozivanje kroz ovu specifikaciju na "jedan primer izvođenja" ili "primer izvođenja" označava da je određena osobina, struktura, ili karakteristika opisana u vezi sa tim primerom izvođenja uključena u najmanje jednom primeru izvođenja. Na taj način, pojavljivanje fraza "u jednom primeru izvođenja" ili "u primeru izvođenja" na raznim mestima kroz ovu specifikaciju ne odnose se nužno na isti primer izvođenja. Pored toga, određene osobine, strukture, ili ctures, ili karakteristike mogu se kombinovati na bilo koji pogodan način u jednom ili više primera izvođenja.

[0023] Ovde navedeni naslovi su prikazani samo radi praktičnosti i ne sužavaju obim ili značenje primera izvođenja.

[0024] Antitela su kompleksni tetrameri u kojima su i teški i laki lanci sastavljeni višestrukim Ig domenima, od kojih se svaku umnožava nezavisno. Na samom početku ere antitela, pokazano je da, kroz enzimatski tretman, antitelo može dati fragmente koji održavaju originalnu strukturu i antigenvezujuće karakteristike.

[0025] Naknadno, primenjivanjem tehnika proteinskog inženjeringa, generisano je obilje različitih konstruisanih fragmenata antitela. U skladu sa molekulskim dizajnom, svaki novi fragment antitela je okarakterisan određenim osobinama (tj. povećana avidnost, viševalentnost, multispecifičnost, ADCC-deficijenciju, himerizaciju, itd.).

[0026] Međutim, ni jedno od prethodnih ispitivanja nije usmereno na problem klirensa iz bubrega radi produženja polu-života fragmenata antitela in vivo.

[0027] U tom smislu, pronalazači su razvili rekombinantni fragment antitela koji obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca i dva konstantna domena i drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca i dva konstantna domena, pri čemu dva konstantna domena lanca su konstantni domeni lakog lanca, a dva konstantna domena su CH1 konstantni domeni teškog lanca, fuzionisane u različitim kombinacijama za varijabilne domene.

[0028] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani fragment antitela stabilniji je in vivo u odnosu na Fab molekul koji obuhvata pomenute varijabilne domene lakog i teškog lanca.

[0029] U jednom primeru izvođenja, fragment antitela ima produženi polu-život in vivo kada se daje humanom pacijentu u odnosu na Fab molekul koji obuhvata pomenute varijabilne domene lakog i teškog lanca zbog redukovanog klirensa iz bubrega.

[0030] Ovi fragmenti antitela nazvani su 'Dab-ovi dvostrukog konstantnog domena' (DCD-Fabs) .

[0031] U poželjnom primeru izvođenja, ovo otkriće tiče se fragmenta antitela koji obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca i dva konstantna domena i drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca i dva konstantna domena, pri čemu dva konstantna domena predstavljaju humane konstantne domene lakog lanca, a dva konstantna domena predstavljaju humane CH1 konstantne domene teškog lanca, fuzionisane u različitim kombinacijama za varijabilne domene, gde je fragment antitela stabilniji in vivo u odnosu na Fab molekul koji obuhvata pomenute varijabilne domene lakog i teškog lanca, i gde se fragment antitela specifično vezuje za receptor faktora rasta hepatocita (HGFR/Met).

[0032] U jednom primeru izvođenja, varijabilni domen lakog lanca je fuzionisan na njegovom C-terminusu za jedan konstantni domen lakog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za jedan konstantni domen lakog lanca.

[0033] U još jednom primeru izvođenja, varijabilni domen lakog lanca fuzionisan je na njegovom C-terminusu za konstantni domen lakog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za jedan CH1 konstantni domen teškog lanca.

[0034] U jednom primeru izvođenja, varijabilni domen teškog lanca fuzionisan je na njegovom C-terminusu za jedan CH1 konstantni domen teškog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za jedan CH1 konstantni domen teškog lanca.

[0035] U još jednom primeru izvođenja, varijabilni domen teškog lanca fuzionisan je na njegovom C-terminusu za CH1 konstantni domen teškog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za konstantni domen lakog lanca.

[0036] U jednom primeru izvođenja, konstantni domeni sadržani u prvom i drugom polipeptidu – kada su kuplovani zajedno u fragmentu antitela – mogu da generišu disulfidne mostove.

[0037] U daljem poželjnom primeru izvođenja, ovo otkriće tiče se fragmenata antitela kakvo je prethodno definisano u kojem je antigen specifičnost obezbeđena upošljavanjem kao varijabilnih domena lakog i teškog lanca DN30 varijabilne domene lakog i teškog lanca ili humanizovane varijabilne domena lakog i teškog lanca koji obuhvataju regione koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) iz DN30 monoklonalnog antitela. DN30 monoklonalno antitelo opisano je u međunarodnoj patentnoj prijavi WO-A-2007/090807.

1

[0038] Fragment antitela ovog pronalaska generalno je terapeutsko antitelo. Na primer, antitelo ovog pronalaska može biti antagonističko antitelo, blokirajuće antitelo ili neutrališuće antitelo.

[0039] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke lečenja ili odlaganja napredovanja bolesti davanjem bolesnom subjektu efektivne količine fragmenta antitela ovog pronalaska, efektivne u lečenju ili odlaganju napredovanja bolesti.

[0040] U jednom primeru izvođenja, bolest je tumor ili metastaza tumora.

[0041] U još jednom primeru izvođenja, bolest povezana sa disregulacijom signalizacije i/ili aktivacije receptora faktora rasta hapetocita.

[0042] Fragment antitela ovog pronalaska pogodan je za lečenje ili sprečavanje patoloških stanja povezanih sa abnormalnostima unutar HGF/HGFR signalizacionog puta.

[0043] U jednom primeru izvođenja, antitelo ovog pronalaska je HGFR antagonist.

[0044] U jednom primeru izvođenja, fragment antitela obuhvata antigen vezujuće sekvence iz nehumanog donora graftovane za heterologne ne-humane, humane ili humanizovane sekvence (npr. okvir rada i/ili sekvence konstantnog domena). U jednom primeru izvođenja, ne-humani donor je miš.

[0045] U jednom primeru izvođenja, antigen vezujuće sekvence obuhvataju sve CDR-ove i/ili sekvence varijabilnih domena anti-HGFR mišjeg antitela.

[0046] U jednom poželjnom primeru izvođenja, mišji varijabilni domen lakog lanca fuzionisan je na njegovom C-terminusu za jedan humani kapa konstantni domen lakog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za jedan humani kapa konstantni domen lakog lanca. U još jednom primeru izvođenja, mišji varijabilni domen lakog lanca fuzionisan je na njegovom C-terminusu za humani kapa konstantni domen lakog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za jedan humani IgGl CH1 konstantni domen teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, mišji varijabilni domen teškog lanca fuzionisan je na njegovom C-terminusu za jedan humani IgGl CH1 konstantni domen teškog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za jedan humani IgGl CH1 konstantni domen teškog lanca. U još jednom primeru izvođenja, mišji varijabilni domen teškog lanca fuzionisan je na njegovom C-terminusu za humani IgGl CH1 konstantni domen teškog lanca, koji je fuzionisan na njegovom C-terminusu za humani kapa konstantni domen lakog lanca.

[0047] U jednom poželjnom primeru izvođenja, fragment antitela ovog pronalaska obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR sekvence anti-HGFR mišjeg antitela, poželjnije CDR-ove od DN30, i dva konstantna domena, gde dva konstantna domena predstavljaju: dva konstantna domena lakog lanca ili jedan konstantni domen lakog lanca i jedan CH1 konstantni domen teškog lanca. U jednom primeru izvođenja dva konstantna domena su humani konstantni domeni.

[0048] U jednom primeru izvođenja, fragment antitela ovog pronalaska obuhvata drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR sekvence anti-HGFR mišjeg antitela, poželjnije CDR-ovi za DN30, i dva konstantna domena, gde dva konstantna domena predstavljaju: dva CH1 konstantna domena teškog lanca ili jedan CH1 konstantni domen teškog lanca i jedan konstantni domen lakog lanca. U jednom primeru izvođenja dva konstantna domena su humani Konstantni domeni.

[0049] Ovaj pronalazak obezbeđuje, u najpoželjnijem primeru izvođenja, humanizovani fragment antitela koji se vezuje za human HGFR, gde je antitelo efektivno da inhibira HGF/HGFR aktivnost in vivo, pri čemu antitelo obuhvata i) u varijabilnom domenu teškog lanca (VH) tri CDR sekvence varijabilnog domena teškog lanca DN30 monoklonalnog antitela (SEQ ID No.:19, 21,23) i suštinski humanu konsenzus sekvencu npr. suštinski humane ostatke konsenzus okvira rada (FR) podgrupe humanih teških lanaca i ii) u varijabilnom domenu lakog lanca (VL) tri CDR sekvence varijabilnog domena lakog lanca DN30 monoklonalnog antitela (SEQ ID No.:25,27,29) i suštinski ostatke humanog konsenzus okvira rada (FR) K podgrupe I humanog lakog lanca I (VKI).

[0050] U jednom primeru izvođenja, fragment antitela ovog pronalaska obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata kao varijabilni domen lakog lanca sekvencu varijabilnog domena lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 12 (DN30 varijabilni domen lakog lanca) i drugi polipeptid koji obuhvata kao varijabilni domen teškog lanca sekvencu varijabilnog domena teškog lanca navedena u SEQ ID NO: 4 (DN30 varijabilni domen teškog lanca).

[0051] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđen je za upotrebu fragmenta antitela ovog pronalaska (npr. HGFR antagonist fragment antitela prema ovom pronalasku) u pripremi leka za terapeutsko i/ili profilaktičko lečenje bolesti, kao što je kancer, tumor, poremećaj ćelijske proliferacije.

[0052] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak lečenja patološkog stanja povezanog sa disregulacijom HGFR aktivacije kod subjekta, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine HGFR antagonist fragmenta antitela ovog pronalaska, čime se leči pomenuto stanje.

[0053] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak inhibiranja rasta ćelije koja eksprimira HGFR, pri čemu pomenuti postupak obuhvata dovođenje u konakt pomenute ćelije sa HGFR antagonist fragmentom antitela ovog pronalaska čime se izaziva inhibicija rasta pomenute ćelije.

[0054] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak terapeutskog lečenja sisara sa kancerogenim tumorom koji obuhvata ćeliju koja eksprimira HGFR, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje pomenutom sisaru efektivne količine HGFR antagonist fragmenta antitela ovog pronalaska, čime se efektivno leči pomenuti sisar.

[0055] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili sprečavanje poremećaja ćelijske proliferacije povezane sa povećanom ekspresijom ili aktivnošću HGFR, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje subjektu kome je potreban takav tretman efektivne količine HGFR antagonist fragmenta antitela ovog pronalaska, čime se efektivno leči ili sprečava pomenuti poremećaj ćelijske proliferacije.

[0056] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak terapeutskog lečenje tumora kod sisara, gde je rast pomenutog tumora najmanje delom zavisan od efekta potencijacije rasta HGFR, pri čemu pomenuti postupak obuhvata dovođenje u kontakt tumor ćelija sa efektivnim količinama HGFR antagonist fragmenta antitela ovog pronalaska, čime se efektivno leči pomenuti tumor. Tumor ćelija može biti odabrana od tumor ćelije dojke, kolorektuma, pluća, kolona, pankreasa, prostate, jajnika, grlića materice, centralnog nervnog sistema, bubrega, hepatoćelija, bešike, želuca, glave i vrata, papilarnog karcinoma (npr. tiroidna žlezda), melanoma, limfoma, mijeloma, glioma/glioblastoma (npr. anaplastični astrocitom, glioblastom multiforme, anaplastični oligodendrogliom, anaplastični oligodendroastrocitom), ćelije leukemije. U jednom primeru izvođenja, ćelija koja je ciljana u postupku ovog pronalaska je hiperproliferativna i/ili hiperplastična ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija koja je ciljana u postupku ovog pronalaska je displastična ćelija. U još jednom primeru izvođenja, ćelija koja je ciljana u postupku ovog pronalaska is metastatična ćelija. U daljem primeru izvođenja, ćelija koja je ciljana u postupku ovog pronalaska je HGFR eksprimirajuća ćelija koja pripada mikrookruženju koje održava tumor i/ili metastazu.

1

[0057] Postupci ovog pronalaska mogu dalje da obuhvataju dodatne faze lečenja. Na primer, u jednom primeru izvođenja, postupak dalje obuhvata fazu u kojoj se ciljana tumor ćelija i/ili tkivo izlaže radijacionom tretmanu ili hemoterapijskom agensu. U još jednom primeru izvođenja, ciljana tumor ćelija i/ili tkivo se tretira, pored antagonist fragmenta antitela ovog pronalaska, sa HGF inhibitorima (tj. anti-HGF antitela) ili drugim anti-HGFR jedinjenjima (tj. inhibitori kinaze malog molekula). U daljem primeru izvođenja, ciljana tumor ćelija i/ili tkivo tretira se, pored antagonist fragmenta antitela ovog pronalaska, sa molekulima koji specifično pogađaju druge ciljeve relevantne u održavanju transformisanog fenotipa (tj. anti-EGFR molekuli).

[0058] Aktivacija HGFR je važan biološki proces; njegova deregulacija vodi ka brojim patološkim stanjima. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja postupaka ovog pronalaska, ćelija koja je ciljana (npr. ćelija kancera) je ona u kojoj je aktivacija HGFR pojačana u odnosu na normalnu ćeliju koja potiče iz istog tkiva. U jednom primeru izvođenja, postupak ovog pronalaska izaziva smrt ili zaustavljanje ćelijskog rasta ciljane ćelije. Na primer, kontakt sa antagonist fragmentom antitela ovog pronalaska može rezultovati kao nemogućnost ćelije da pošalje signal kroz HGFR put, što rezultuje kao ćelijska smrt ili zaustavljanje ćelijskog rasta.

[0059] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na imunokonjugate, ili antitelo-lek konjugate (ADC), koji obuhvataju fragment antitela konjugovan za citotoskični agens kao što je hemoterapijski agens, lek, agens inhibiranja rasta, toksin (npr. enzimatski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj. radiokonjugat).

[0060] Upotreba antitelo-lek konjugata za lokalnu dostavu citotoskičnog ili citostatičnog agensa, tj. lekova koji ubijaju ili inhibiraju rast tumor ćelija u lečenju kancera, omogućava ciljanu dostavu ostatka leka do tumora, i intraćelijsku akumulaciju u njemu, pri čemu sistemsko davanje ovih nekonjugovanih agenasa leka može rezultovati u neprihvatljivim nivoima toksičnosti u normalnim ćelijama kao i tumor ćelijama za koje se nastoji da se eleminišu.

[0061] Terapeutske formulacije koje obuhvataju fragment antitela ovog pronalaska pripremljene su za skladištenje mešanjem fragmenta antitela sa željenim stepenom čistoće sa fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku vodenih rastvora, liofilizovanih ili drugačije osušenih formulacija. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce pri uposlenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere; antioksidanse; prezervative; polipeptide niske molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilni polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate; helirajuće agense; šećere; kontra-jone koji obrazuju soli; komplekse metala i/ili ne-jonske surfaktante.

[0062] Ovde formulacija može takođe da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja ukoliko je potrebno za određene indikacije koje se tretiraju, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi molekuli pogodno su prisutni u kombinaciji u količinama koje su efektivne za namenjenu svrhu.

[0063] Aktivni sastojci takođe mogu biti enkapsulirani u mikrokapsulama pripremljenim tehnikama opisanim u i.a. u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0064] Formulacije koje su namenjene za upotrebu u in vivo davanju moraju biti sterilne.

[0065] Mogu se pripremiti preparati sa održivim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa održivim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrži fragment antitela ovog pronalaska, pri čemu su te matrice u nekom obliku, npr. filmovi, ili mikrokapsule.

[0066] Fragment antitela ovog pronalaska može se koristiti u in vitro, ex vivo i in vivo terapeutskim postupcima. Ovaj pronalazak obezbeđuje razne postupke bazirane na upotrebi fragmenata antitela sa superiornim karakteristikama u poređenju sa uobičajenim monovalentnim antitelima.

[0067] Ovaj pronalazak obezbeđuje fragmente antitela, koji se mogu primeniti u razne svrhe, na primer kao terapeutici, profilaktici i dijagnostici.

[0068] Fragmenti antitela ovog pronalaska mogu se primeniti sami ili u kombinaciji sa drugim mešavinama u terapiji. Primera radi, fragment antitela ovog pronalaska može se davati zajedno sa drugim antitelom, hemoterapijskim agensom(ima) (uključujući koktele hemoterapijskih agenasa), drugim citotoskičnim agensom(ima), anti-angiogenim agensom(ima), citokinima, i/ili agensom(ima) inhibiranja rasta. Takve navedene kombinovane terapije uključuju kombinovano davanje (u kojima je uključeno jedan ili više agensa u istim ili odvojenim formulacijama), i odvojeno davanje, u kojem slučaju, davanje antitela ovog pronalaska može se izvesti pre, i/ili nakon davanja dopunskog tretmana ili terapija.

[0069] Fragment antitela ovog pronalaska (i dopunski terapeutski agens) dat je/su na bilo koji pogodan

1

način, uključujući parenteralno, subkutano, intraperitonealno, intrapulmonarno, i intranazalno, i, ukoliko postoji potreba za lokalnim tretmanom, intralezionalno davanje. Fragment antitela pogodno se daje pulsnom infuzijom, naročito sa opadajućim dozama antitela. Doziranje može biti bilo kojim pogodnim putem, npr. injekcijama, kao što su intravenozne ili subkutane injekcije, delimično zaviseći od toga da li je davanje kratko ili hronično. Fragment antitela ovog pronalaska može se takođe dostaviti genskim transferom upotrebom vrusnih vektora (tj. lentivirusni vektori), dat lokalno ili sistemski.

[0070] Fragment antitela ovog pronalaska formuliše se, dozira, i daje na način konzistentan sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koji se uzimaju u obzir u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se tretira, određeni sisar koji se tretira, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto dostave agensa, postupak davanja, šemu davanja, i druge faktore poznate lekaru. Antitelo ne treba da bude, ali opciono jeste formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste da spreče ili tretiraju poremećaj o kojem je reč. Efektivne količine takvih i drugih agenasa zavise od količine antitela ovog pronalaska prisutne u formulaciji, vrste poremećaja ili tretmana, i drugih ovde diskutovanih faktora. Oni se generalno upotrebljavaju u istim dozama i sa putevima davanja koji su prethodno opisani ili od oko 1 do 99% gore pomenutih uposlenih doza.

[0071] Za prevenciju ili lečenje bolesti, pogodna doza fragmenta antitela ovog pronalaska (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa drugim agensima kao što su hemoterapijski agensi) zavisiće od vrste bolesti koja se tretira, vrste antitela, ozbiljnosti i toka bolesti, da li se fragment antitela daje preventivno ili terapeutski, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i diskrecije zaduženog lekara. Fragment antitela pogodno se daje pacijentu u jednom ili tokom serije tretmana. U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti bolesti, oko 1 mg/kg do 15 mg/kg antitela predstavlja inicijalnu predloženu dozu za davanje pacijentu, bilo, na primer, jednim ili više odvojenih davanja, ili kontinulanom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može da se kreće od oko 1 mg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Za ponavljajuće davanje tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje j održivo dok ne dođe do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedna primerna doza fragmenta antitela bila bi u opsegu od oko 0.05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se davati nizmenično, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi oko dve do oko davadeset, npr. oko šest doza antitela). Može se dati inicijalna veća uvodna doza, praćena jednim ili više manjih doza. Primer doznog režima obuhvata davanje u inicijalnoj uvodnoj dozi od oko 4 mg/kg, praćeno nedeljnom održavajućom dozom od oko 2 mg/kg antitela.

Međutim, i drugi dozni režimi mogu biti korisni. Progres ove terapije lako se prati konvencionalnim tehnikama i ogledima.

1

REZULTATI

Generisanje himernog DN30 Fab-a i karakterizacija njegovih biohemijskih i bioloških karakteristika.

[0072] Kao i ostala monoklonalna antitela sa terapeutskim potencijalem, DN30 je uzgajano u miševima. Zbog toga, njegovo direktno uključivanje kod ljudi u terapijske svrhe nije primenjivo, budući da bi mišji molekuli bili prepoznati od strane humanih anti-mišjih antitela (HAMA) što bi vodilo do imunoposredovanog klirensa aktivnosti antitela. Supstitucija mišjih konstantnih regiona antitela sa sekvencama izvedenim iz humanih imunoglobulina (himerizacija antitela) dovoljna je da snažno redukuje HAMA odgovor. Himerizovana mAbs i Fabs trenutno se koriste u klinici. Putem klasičnih molekulskih bioloških tehnika, pronalazači su supstituisali konstantne domene DN30 Fab teških i lakih lanaca sa konstantnim domenima izvedenim iz humanih imunoglobulina: konstantni domen lakog lanca supstituisan je humanim kapa tipom domena, onaj koji je reprezentniji u prirodnim humanim antitelima, dok je CH1 konstantni domen teškog lanca supstituisan homolognim domenom izvedenim iz humanog IgG1. Ova kombinacija je efektivna: himerizovani DN30 Fab (MvDN30) vezuje se za Met sa visokim afinitetom, indukuje Met rasipanje i inhibira proliferaciju Met-zavisnih ćelija, preklapajući karakteristike odgovarajućeg mišjeg molekula (Fig 1 i Fig.2).

Molekularni dizajn Fab-a sa dvostrukim konstantnim domenom.

[0073] Upotrebom MvDN30 sekvence kao šablona, pronalazači su duplirali konstantne domene u svakom lakom i teškom lancu (Dvostruki konstantan domen-Fab). Novi konstruisani molekul ima predviđenu molekulsku masu od 75 kD. Pronalazači su generisali dva različita DCD-Fab-a. U prvom molekulu, humani konstantni domeni duplirani su u tandemu, čime se generiše VH-CH1-CH1 himerni teški lanac i VL-CL-CL himerni laki lanac. U drugom molekulu, terminalni domeni uzajamno su zamenjeni, čime se generiše VH-CH1-CL himerni teški lanac i VL-CL-CH1 himerni laki lanac (Fig.3). Odgovarajući dimerni rekombinantni molekuli nazvani su DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2. cDNK koje kodiraju ove nove molekule klonirane su u ekspresioni plazmid, a zatim eksprimirane u eukariotskim ćelijama.

Proteini su prečišćeni od supernatanta ćelijske kulture zahvaljujući StrepTAG koji je umetnut u C-terminus sekvence. FIG.4 prikazuje SDS-Page odvajanje pod redukujućim uslovima prečišćenih rekombinantnih molekula sa pravilnom veličinom molekulske mase.

DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 vezuju se za Met sa visokim afinitetom.

[0074] Prečišćeni DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 karakterizovani su na njihovu sposobnost da se vežu za Met receptor. U tom smislu, pronalazači su izveli ELISA ispitivanje upotrebom Met ektodomena u čvrstoj fazi i MvDN30, DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 u tečnoj fazi. Vezivanje je otkriveno upotrebom anti-strepTAG antitela (Fig.5). Ova analiza pokazala je da se tri DN30-izvedenih monovalentnih molekula

1

vezuje za Met sa sličnim afinitetom (MvDN30, Kd= 0.141 ± 0.03 nM; DCD-MvDN30.1, Kd= 0.133 ± 0.02 nM; DCD-MvDN30.2, Kd= 0.130 ± 0.03 nM).

DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 ne indukuju Met fosforilaciju.

[0075] Pronalazači su testirali da li novi DN30-izvedeni molekuli mogu da pokažu Met agonističku aktivnost u ispitivanju Met fosforilacije. To je analizirano upotrebom A459 ćelija humanog karcinoma pluća, što predstavlja standardni sistem za određivanje Met aktivacije kao odgovor na akutnu stimulaciju liganda. Zapravo, A549 ćelije ispoljavaju fiziološke nivoe Met-a, inaktivne u baznim uslovima, ali sklone da se aktiviraju od strane HGF ili ligand-mimetičnog molekula (4, 10). Ćelije su stimulisane tokom 15 minuta povećavajućim količinama MvDN30, DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2. Ćelije su takođe stimulisane sa HGF i DN-30 mAb kao pozitivne kontrole. Met aktivacija određena imunoblotingom sa anti-fosfoMet antitelima. Kako je prikazano na Fig.6, novi molekuli nisu pokazali bilo kakvu značajnu agonističku aktivnost. DCD-MvDN30.1 se ne može razlikovati od MvDN30, budući da je lišen bilo kakve agonističke aktivnosti. DCD-MvDN30.2 zadržava minimalnu preostalu agonističku aktivnost, koja je u u svakom slučaju zanemarljiva u poređenju sa DN30 mAb ili HGF. Pronalazači su takođe proverili aktivaciju molekula koji deluju nizvodno od efektora Met-a. Dok stumulacija sa HGF indukuje aktivaciju obe ekstraćelijski signal-regulisane kinaze 1 i 2 (ERK-1 i ERK-2) i AKT/Protein Kinaze B (AKT), DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2, kao i MvDN30, ne utiču na status fosforilacije ovih signalnih transduktora (Fig.7).

DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 indukuju Met rasipanje.

[0076] Pronalazači su takođe ispitali da li novi molekuli izvedeni iz MvDN30 zadržavaju sposobnost da promovišu rasipanje receptora i usporenu regulaciju. A549 ćelije su inkubisane sa DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 i MvDN30. Nakon 48 sati, prisustvo Met ektodomena u kondicioniranoj podlozi, analizirano je imunoblotingom upotrebom monoklonalnog antitela usmerenog prema ekstracelularnom delu Meta. Ukupni celularni nivoi Met-a takođe su određeni na ćelijskim lizatima upotrebom istog antitela. Ova analiza otkrila je da oba i DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 efikasno indukuju Met rasipanje i promovišu Met usporenu-regulaciju, što rezultuje u oslobađanju rastvorljivog Met ektodomena u esktraćelijskom prostoru i snižava Met nivoe u ćelijama (Fig.8). Prema tome, novi MvDN30 izvedeni molekuli, kao MvDN30, postižu postupnu disocijaciju između antagonističkih i agonističkih karakteristika roditeljskog DN-30 mAb.

DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 inhibiraju HGF-indukovanu Met fosforilaciju i nizvodnu signalizaciju.

[0077] Pronalazači su ispitali da li DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 mogu da inhibiraju HGF-indukovanu Met fosforilaciju i nizvodnu signalizaciju. A549 ćelije inkubisane su sa DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 i

1

MvDN30 tokom 24 sata, a zatim stimulisane tokom 15 minuta sa HGF. Met aktivacija određena je imunoblotingom sa anti-fosfoMet antitelima. Kako je prikazano na Fig.9, dva konstruisana molekula, kao MvDN30, efikasno usporavaju Met receptora i snažno oslabljuju nivo njegove fosforilacije. To rezultuje kao inhibicija AKT i ERK-1,2 aktivacije (Fig.9).

DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 inhibiraju MET-zavisni od sidrenja-zavisan ćelijski rast.

[0078] Od sidrenja-zavisan rast može se oslabiti Met-inhibitorom samo u ćelijama koje se oslanjaju na Met-signalizaciju za proliferaciju/opstanak, koje su takozvane MET-zavisne ćelije. Pronalazači su analizirali potpuni panel MET-zavisnih tumor ćelija (GTL-16, SNU-5, Hs746T, MKN-45 – ćelije humanog karcinoma želuca - i H1993, EBC-1 – ćelije humanog karcinoma pluća). Eksponencijalno rastuće ćelije inkubisane su povećavajućim koncentracijama DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2. MvDN30 je uključen u ovaj ogled kao pozitivna kontrola. Nakon 72 sata ćelijski rast određen je upotrebom ATP ogleda na bazi iluminescencije. Oba MvDN30-izvedena molekula inhibirala su sav MET-zavisni ćelijski rast na doznozavisan način (Fig.10). Inhibitorne karakteristike ova dva DCD molekula mogu se uporediti sa onima od MvDN30 u svim testiranim ćelijama.

DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 inhibiraju od sidrenja-nezavisan ćelijski rast.

[0079] Pronalazači su testirali sposobnost DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 da inhibiraju od sidrenja nezavisan rast A549 ćelija. Ćelije su zasejane u polu-čvrstoj podlozi inkubisane ili ne sa HGF i tretirane jednom dozom DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 i MvDN30. Nakon dve nedelje, ćelijske kolonije obojene su i izbrojane. I u ovom ogledu, DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 redukuju HGF-zavisno obrazovanje kolonija na način sličan onom od MvDN30 (Fig.11).

DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 pokazuju poboljšan farmakokinetički profil in vivo u poređenju sa MvDN30.

[0080] Pronalazači su ispitali farmakokinetičke karakteristike DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2, u poređenju sa MvDN30. Jedna doza prethodno pomenutih molekula dostavljena je intraperitonealnom injekcijom imunodeficijentnim miševima. Periferna krv tretiranih miševa sakupljena je u različitim vremenskim tačkama nakon dostave. Cirkulišuće koncentracije ispitanih molekula određene su pomoću ELISA izvedene na uzorcima seruma. DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 dostižu veće cirkulišuće nivoe u poređenju sa MvDN30. Štaviše, oba molekula pokazuju povećan polu-život i dugotrajniji su u cirkulaciji, pri čemu su biološki dostupni duži vremenski period. DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 klirens snažno je poboljšan u poređenju sa MvDN30 (redukcija klirensa u poređenju sa MVDN30: 9.6 i 13.7 puta respektivno za DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2)(Fig.12 i Tablela 1).

1

Tabela 1. Farmakokinetički parameteri različitih DN30-izvedenih molekula

MATERIJALI I POSTUPCI

Uzgajanje ćelija

[0081] EBC-1 ćelija humanog karcinoma pluća i MKN-45 ćelijska linija želudačnog karcinoma dobijene su iz japanske kolekcije od Research Bioresources (Osaka, Japan). GTL-16 ćelije humanog karcinoma želuca izvedene su iz MKN-45 ćelija kako je opisano (11). Sve druge ćelijske linije dobijene su od ATCC-LGC Standardnus partnership (Sesto San Giovanni, Italy). Sve ćelijske linije zadržane su u RPMI osim Hs746T -u DMEM - i SNU-5 - u IMDM. Ćelijska podloga dopunjena je sa 10% (20% za SNU-5) fetalnim goveđim serumom i 2 mM glutaminom (Podloga, serum i glutamin su od Sigma Life Science, St. Louis, Missouri).

Konstruisanje proteina

[0082] DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 sastavljene su od teškog lanca i lakog lanca.

[0083] DCD-MvDN30.1 teški lanac (SEQ ID NO.:1 i 2) odgovara VH domenu divljeg-tipa DN30 Fab (2; SEQ ID No.: 3 i 4) fuzionisan sa CH1 domenom humanog imunoglobulina G1 ponovljen u tandemu (SEQ ID NO.: 5 i 6). Na C-terminusu, Strep oznaka (ST, SEQ ID NO.:7) i poli-histidin oznaka (HT, SEQ ID NO.:8) dodate su za prečišćavanje i detekciju. Ukupna struktura odgovara sledećem (od N- do C-terminusa): VH-CH1-CH1-ST-HT. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence teškog lanca za DCD-MvDN30.1 prikazane su na FIG.14A i B, respektivno.

[0084] DCD-MvDN30.1 laki lanac (SEQ ID No.:9 i 10) odgovara VL domenu divljeg-tipa DN30 Fab (SEQ ID No.:11 i 12) fuzionisan sa CL domenom humanog imunoglobulina kapa (SEQ ID NO.:13 i 14) ponovljen u tandemu. Ukupna struktura odgovara sledećem (od N- do C-terminusa): VL-CL-CL. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence lakog lanca za DCD-MvDN30.1 prikazane su na FIG.13A i B, respektivno.

[0085] DCD-MvDN30.2 teški lanac (SEQ ID No.:15 i 16) odgovara VH domenu divljeg-tipa DN30 Fab (SEQ

2

ID No.: 3 i 4) fuzionisan sa CH1 domenom humanog imunoglobulina G1 (SEQ ID NO.: 5 i 6) plus CL region humanog imunoglobulina kapa (SEQ ID NO.:13 i 14). Ukupna struktura odgovara sledećem (od N-do C-terminusa): VH-CH1-CL. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence teškog lanca za DCD-MvDN30.2 prikazane su na FIG.16A i B, respektivno.

[0086] DCD-MvDN30.2 laki lanac (SEQ ID No.:17 i 18) odgovara VL domenu divljeg-tipa DN30 Fab (SEQ ID No.:11 i 12) fuzionisan sa CL domenom humanog imunoglobulina kapa (SEQ ID NO.:13 i 14) plus CH1 humanog imunoglobulina G1 (SEQ ID NO.: 5 i 6) plus Strep oznaka (ST, SEQ ID NO.:7) i poli-histidin oznaka (HT, SEQ ID NO.:8). Ukupna struktura odgovara sledećem (od N- do C-terminusa): VL-CL-CH1-ST-HT. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence su lakog lanca za DCD-MvDN30.2 prijavljeno na FIG.15A i B, respektivno.

[0087] cDNK koje kodiraju DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 sintetizovane su hemijski od strane GeneArt® servisa (Life Technologies, Paisley, United Kingdom). Nukleotidne i aminokiselinske sekvence DN30 Fab varijabilnih domena lakog i teškog lanca prikazane su na FIG.17 i 18, respektivno. CDR regioni podvučeni su i u nukleotidnim i aminokiselinskim sekvencama, gde CDR-ovi varijabilnog domena teškog lanca imaju aminokiselinske i nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID No.:19 do 24, a CDR-ovi varijabilnog domena lakog lanca imaju aminokiselinske i nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID No.:25 do 30.

[0088] Svi konstrukti konstruisani su da sadrže BamHI mesto na 5' kraju i NotI mesto na 3' kraju. BamHI-NotI fragmenti podklonirani su u pUPEX ekspresioni vektor (U-Protein Express, Utrecht, The Netherlands). Proizvodnja srednje skale za DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 autsorsovana je u U-Protein Express koji su je postigli tranzijentnom transfekcijom u HEK (Human Epithelial Kidney) ćelijama. Proteini su prečišćeni afinitetnom hromatografijom upotrebom Strep oznake i poli-histidin oznake. Prečišćeni proteini konzervirani su u PBS plus 0.02% Tween-80 (Sigma-Aldrich) i uskladišteni na 4° C. Čistoća je određena sa SDS-PAGE i u redukujućim i u neredukujućim uslovima praćeno Coomassie bojenjem.

Imunotaloženje i Western bloting

[0089] Imunotaloženje izvedeno je kako je opisano (12) upotrebom DO-24 anti-Met mAb (4). Western bloting izveden je upotrebom sledećih antitela: antihumani Met mAb klon DL-21 koji prepoznaje domen smešten u ekstraćelijskom delu Met-a (4); anti-fosfotirozin mAb klon 4G10 mAb (Millipore, Temecula, California); anti-fosfo-Met (Tyr 1234/1235), anti-fosfo-Met (Tyr 1349), anti-fosfoAkt (Ser 473), anti-Akt, anti-fosfo-ERK (Thr 202/Tyr 204) i anti-ERK poliklonalna Abs (Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts).

ELISA ogledi vezivanja

[0090] Vezivanje MvDN30, DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 određeno je pomoću ELISA upotrebom Met-Fc himere u čvrstoj fazi (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) i povećavajućih koncentracija FLAG-obeleženog rekombinantnog antitela u tečnoj fazi. Vezivanje je otkriveno upotrebom antistrepTAG II antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (IBA, Olivette, Missouri). Podaci su analizirani i uklopljeni upotrebom Prism softvera (Graph Pad Softwar, San Diego, California). Met-Fc himera je fuzioni protein kod kojeg je Fc domen izveden iz humanog IgG fuzionisanog u okviru sa Met ekstraćelijskim delom.

Analiza Met aktivacije

[0091] Subkonfluentne A549 ćelije humanog karcinoma pluća inkubisane su u podlozi bez seruma tokom 48 sati, a zatim stimulisane tokom 10 minuta sa indikovanim koncentracijama rekombinantnih HGF (R&D Systems) ili prečišćenih DN-30 mAb, MvDN30, DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 kako je opisano (13). Nakon stimulacije, ćelije su odmah lizirane i obrađene kako je opisano (12). Ekstrakti ćelija su imunoistaloženi anti-Met antitelima (DO-24), razblaženi sa SDS-PAGE i analizirani Western blotingom upotrebom anti-fosfotirozin antitela (Millipore). Isti blotovi ponovo su ispitani sa anti-Met antitelima (DL-21) kako bi se normalizovala količina Met imunotaloga.

[0092] Za inhibiciju HGF-indukovane Met fosforilacije A549 ćelije su tretirane tokom 24 sata u podlozi bez seruma sa MvDN30, DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2 i zatim stimulisane sa HGF kako je opisano iznad. Ćelijski monoslojevi lizirani su sa Laemmli puferom, a jednake količine ukupnih proteina, odvojene su u akrilamid gelu pomoću SDS-PAGE i analizirane imunoblotingom sa anti-fosfo-Met (Tyr 1234/1235) antitelima.

Analiza Met rasipanja

[0093] Subkonfluentni A549 monoslojevi oprani su dva puta sa PBS, a zatim inkubisani u podlozi bez seruma sa indikovanim koncentracijama DN-30 FAb ili mAb. Nakon 48 sati, kondicionirana podloga je sakupljena, a ćelije su lizirane Laemmli puferom. Nivoi Met proteina određeni su u 50 µg ukupnih ćelijskih lizata i u 50 µl supernatanta ćelijske kulture Western blotingom upotrebom anti-Met DL-21 mAb.

In vitro biološka ispitivanja

[0094] Za analizu ćelijskog rasta, ćelije su zasejane u posude sa 96 bazenčića (1,000 ćelije/bazenčić) u podlozi koja sadrži 10% FBS. Nakon 24 sata, podloga je zamenjena svežom koja sadrži DN30-izvedene molekule plus 5% FCS antitela pri indikovanim koncentracijama. Broj ćelija procenjen je nakon 72sata upotrebom ogleda CellTiter-Glo luminescentne ćelijske vijabilnosti (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Hemo-luminescencija je primećena sa Multilabel Reader PerkinElmer 2030 aparatom (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland).

[0095] Za od sidrenja-nezavisna ispitivanja rasta, ćelije su zasejane u sudove sa 48 bazenčića (500 ćelija/bazenčić) u podlozi koja sadrži 2% FBS i 0.5% SeaPlaque agarozu (BMA, Rockland, Maine). Antitela (1.5 µM) i HGF (50 ng/ml) su dodata u podlogu za rast svaka 3 dana. Nakon 21 dana uzgajanja, kolonije su obojene tetrazolijum solju (Sigma Life Science) i ocenjene MetaMorphOffline Softverom (Molecular Device LLC, Sunnyvale, California).

Farmakokinetički analiza

[0096] Odraslim imunodeficijentnim NOD-SCID miševima (telesna masa između 18 i 22 gr, u proseku 20 gr) injektovano je IP 100 µg DCD-MvDN30.1 ili DCD-MvDN30.2 ili MvDN30. Periferna krv sakupljena je u različito vreme (za MvDN30: 10, 20 i 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48 sati; za DCD-MvDN30.1 i DCD-MvDN30.2: 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48, 72, 96, 144 sati nakon dostave). Terapeutse molekularne koncentracije procenjene su sa ELISA kako je opisano iznad u delu o ogledu vezivanja, umetanjem vrednosti apsorbancije uzoraka na linerani deo standardne krive dobijene serijskim razblaženjima različitih prečišćenih molekula. Svaka vremenska tačka bila je prosečna vrednost najmanje 3 miša.

REFERENCE

[0097]

1) Martens, T., et al. A novel one-armed anti-c-Met antibody inhibits glioblastoma growth in vivo. Clin Cancer Res. (2006); 12: 6144-52.

2) Jin, H., et al. MetMAb, the one-armed 5D5 anti-c-Met antibody, inhibits orthotopic pancreatic tumor growth and improves survival. Cancer Res. (2008); 68: 4360-8.

3) www.clinicaltrial.gov; Identifier: NCT01456325."A study of Onartuzumab (MetMab) in combination with Tarceva (Erlotinib) in patients with Met diagnostic-positive Non-Small Cell Lung cancer who have received chemotherapy for advanced or metastatic disease (MetLung)".

4) Prat, M., et al. Agonistic monoclonal antibodies against the Met receptor dissect the biological responses to HGF. J Cell Sci. (1998); 111: 237-47.

5) Petrelli, A., et al. Ab-induced ectodomain shedding mediates hepatocyte growth factor receptor down-regulation and hampers biological activity. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006); 103: 5090-5.

2

6) Foveau, B., et al. Down-regulation of the met receptor tyrosine kinase by presenilin-dependent regulated intramembrane proteolysis. Mol Biol Cell. (2009); 20: 2495-507.

7) Schelter, F, et al. A disintegrin and metalloproteinase-10 (ADAM-10) mediates DN30 antibodyinduced shedding of the met surface receptor. J Biol Chem. (2010); 285: 26335-40.

8) Pacchiana G, et al. Monovalency unleashes the full therapeutic potential of the DN-30 anti-Met antibody. J Biol Chem. (2010); 285: 36149-57.

9) Reichert JM. Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs. (2011); 3: 76-99.

10) Michieli P, et al. An HGF-MSP chimera disassociates the trophic properties of scatter factors from their pro-invasive activity. Nat Biotechnol (2002); 20:488-495.

11) Giordano S, et al. p145, A protein with associated tyrosine kinase activity in a human gastric carcinoma cell line. Mol Cell Biol 19888:3510-3517.

12) Longati P, et al. Tyrosines1234-1235 are critical for activation of the tyrosine kinase encoded by the MET proto-oncogene (HGF receptor). Oncogene 19949:49-57.

13) Vigna E, et al. "Active" cancer immunotherapy by anti-Met antibody gene transfer. Cancer Res 200868:9176-9183

LISTA SEKVENCI

[0098]

2

2

2

2

2

�

2

4

4

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Fragment antitela koji obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca i dva konstantna domena i drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca i dva konstantna domena, u kojem dva konstantna domena su konstantni domeni lakog lanca, a dva konstantna domena su CH1 konstantni domeni teškog lanca, pri čemu pomenuti fragment antitela ima produženi in vivo polu-život u odnosu na Fab fragment koji obuhvata pomenute varijabilne domene lakog i teškog lanca, pri čemu prvi polipeptid obuhvata jedan varijabilni domen lakog lanca i dva humana konstantna domena lakog lanca, pri čemu je varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa prvim humanim konstantnim domenom lakog lanca koji je fuzionisan sa drugim konstantnim domenom lakog lanca u N-do C-terminalnom pravcu, čime se generiše VL-CL-CL himerni laki lanac, i

pri čemu drugi polipeptid obuhvata jedan varijabilni domen teškog lanca i dva humana konstantna domena teškog lanca, pri čemu je varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa prvim humanim CH1 konstantnim domenom teškog lanca koji je fuzionisan sa drugim humanim CH1 konstantnim domenom teškog lanca u N- do C-terminalnom pravcu, čime se generiše VH-CH1-CH1 himerni teški lanac.

2. Fragment antitela koji obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca i dva konstantna domena i drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca i dva konstantna domena, pri čemu su dva konstantna domena konstantni domeni lakog lanca, a dva konstantna domena su CH1 konstantni domeni teškog lanca, pri čemu pomenuti fragment antitela ima produženi in vivo polu-život u odnosu na Fab fragment koji obuhvata pomenute varijabilne domene lakog i teškog lanca, pri čemu prvi polipeptid obuhvata jedan varijabilni domen lakog lanca, jedan humani konstantni domen lakog lanca i jedan humani teški CH1 konstantni domen, pri čemu je varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa humanim konstantnim domenom lakog lanca, a humani konstantni domen lakog lanca fuzionisan je sa humanim CH1 konstantnim domenom teškog lanca u N- do C-terminalnom pravcu, čime se generiše VL-CL-CH1 himerni laki lanac, i

pri čemu drugi polipeptid obuhvata jedan varijabilni domen teškog lanca, jedan humani CH1 konstantni domen teškog lanca i jedan humani konstantni domen lakog lanca, pri čemu je varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa humanim CH1 konstantnim domenom teškog lanca, a humani CH1 konstantni domen teškog lanca fuzionisan je sa humanim konstantnim domenom lakog lanca u N- do C-terminalnom pravcu, čime se generiše VH-CH1-CL himerni teški lanac.

3. Fragment antitela prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, u kojem je pomenuti varijabilni domen lakog lanca odabran između ne-humanog varijabilnog domena lakog lanca ili humanog ili humanizovanog varijabilnog domena lakog lanca koji obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) iz nehumanog antitela.

4. Fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kojem je pomenuti varijabilni domen teškog lanca odabran između ne-humanog varijabilnog domena teškog lanca ili humanog ili humanizovanog varijabilnog domena teškog lanca koji obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) iz ne-humanog antitela.

5. Fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4, u kojem je konstantni domen lakog lanca humani kapa konstantni domen lakog lanca.

6. Fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 5, u kojem je CH1 konstantni domen teškog lanca humani gama CH1 konstantni domen teškog lanca.

7. Fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 6, u kojem je CH1 konstantni domen teškog lanca iz humanog IgG1.

8. Fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 7, u kojem se pomenuti fragment antitela specifično vezuje za receptor faktora rasta hepatocita (HGFR).

9. Fragment antitela prema zahtevima 3 i 4, u kojem humanizovani varijabilni domen lakog lanca obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) sa sekvencama navedenim u SEQ ID No.: 25, 27 i 29, a humanizovani varijabilni domen teškog lanca obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) sa sekvencama navedenim u SEQ ID No.: 19, 21 i 23.

10. Farmaceutska mešavina koja obuhvata fragment antitela prema jednom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

11. Fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za upotrebu u lečenju pacijenta koji ima tumor i/ili metastazu.

12. Fragment antitela za upotrebu prema zahtevu 11, gde je pomenuti tumor i/ili metastaza povezana sa disregulacijom HGFR signalizacije i/ili aktivacije.

4

13. Proizvod koji sadrži fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i najmanje jedan od HGF inhibitora i HGFR inhibitora, kao kombinovani preparat za simultanu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u lečenju tumora i/ili metastaza, poželjno tumora i/ili metastaze povezane sa disregulacijom HGFR signalizacije i/ili aktivacije.

14. Proizvod za upotrebu prema zahtevu 13, u kojem je najmanje jedan inhibitor odabran od anti-HGF antitela, rekombinantnih molekula koji ulaze u kompeticiju sa HGF, inhibitora HGFR malog molekula, anti-HGFR antitela ili inhibitora.

15. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

16. Vektor koji obuhvataju najmanje nukleotidnu sekvencu koja kodira fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

17. Mešavina koja obuhvata dve ili više nukleinske kiseline koje kodiraju fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

18. Izolovana nukleinska kiselina prema zahtevu 15, vektor prema zahtevu 16, ili mešavina prema zahtevu 17 za upotrebu u lečenju pacijenta koji ima tumor i/ili metastazu, poželjno tumor i/ili metastazu povezanu sa disregulacijom HGFR signalizacije i/ili aktivacije.