ITTO940543A1 - Materiale proteico ricombinante legante anticorpi contro il citomegalovirus umano, reagenti diagnostici derivati da tale - Google Patents
Materiale proteico ricombinante legante anticorpi contro il citomegalovirus umano, reagenti diagnostici derivati da tale Download PDFInfo
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Abstract
Materiale proteico consistente in una proteina di fusione incorporante determinanti antigenici della proteina strutturale pp150 e della proteina non strutturale p52 del Citomegalovirus umano (HCMV); il materiale antigenico include una prima sequenza di amminoacidi (H10) corrispondente alla sequenza carbossil - terminale degli ultimi 233 amminoacidi della proteina p52 o a sue parti, una seconda sequenza di amminoacidi (F3) corrispondente alla sequenza carbossil - terminale degli ultimi 44 amminoacidi della proteina pp150 o a sue parti, ed una terza sequenza di amminoacidi (A1C2) corrispondente, procedendo in direzione 5'-->3', alla sequenza di amminoacidi da 595 a 614 della proteina pp150; la sequenza risultante è espressa da un plasmide ricombinante introdotto in un vettore espressivo procariota od eucariota e presenta una reattività sostanzialmente pari a quella del virus sia verso IgG che verso IgM umane; può essere utilizzato come reagente antigenico in un kit ELISA per la ricerca di immunoglobuline HCMV - specifiche, oppure per la produzione di sieri policlonali monospecifici e/o di MaB anti - HCMV da utilizzare in kit diagnostici per il riconoscimento diretto dell'antigene virale.
Description
D E S C R I Z I O N E
di Brevetto per Invenzione Industriale
La presente invenzione è relativa ad un materiale proteico capace di legarsi per reazione immunitaria con anticorpi contro il Citomegalovirus umano; in particolare, l’invenzione è relativa ad un peptide ricombinante prodotto come proteina di fusione e incorporante epitopi della proteina DNA-legante non strutturale di 52 kD (p52) del Citomegalovirus umano, qui e di seguito indicato per brevità come HCMV, e epitopi della fosfoproteina strutturale da 150 kD (ppl50) del HCMV, contro le quali sono prodotte nell'organismo umano sia IgG che IgM specifiche. L'invenzione è inoltre relativa a reagenti diagnostici derivati da tale materiale proteico e ad un plasmide esprimente lo stesso.
La infezione da Citomegalovirus umano (HCMV) è la causa più comune di infezione congenita neH'uomo. Per esempio, le infezioni intrauterine primarie sono seconde solamente alla sindrome di DOWN come causa di ritardo mentale; le infezioni secondarie sono anche origine di gravi complicanze, sebbene meno severe. Poiché le madri di neonati infetti raramente mostrano segni della infezione durante la gravidanza, le tecniche di laboratorio sono l'unico mezzo per accertare infezioni acute da HCMV in tali soggetti.
La diagnosi di infezioni da HCMV può essere ottenuta per dimostrazione diretta della prtresenza del virus o di sue componenti nel materiale patologico, oppure indirettaramente attraverso le tecniche sierologiche (Landini M.P. 1993. New approactches and perspectives in cytomegalovirus diagnosis. Progress in Medicai Virology 40:157-177). La diagnosi della infezione primaria è esclusivamente ottenuta ranediante metodi sierologici, cioè mediante dimostrazione della presenza di anticorpi verso il HCMV in soggetti che erano sieronegativi; in particolare, è indicazione sensibile e specifica di infezione primaria la comparsa di IgM CMV-specifiche . Infatti, IgM sono rilevate nel 55-75% dei sieri di donne in gravidanza soggette ad infezione primaria e nel 70% approssimativamente dei sieri di neonati con infrazione congenita. Però, il livello di affidabilità della diagnosi sierologica varia grandemente in funzione della composizione dell'antigene utilizzato, a causa della mancanza di standardizzazione nella scelta degli antigeni.
I materiali antigenici composti da singole proteine virali ben caratterizzate o da porzioni di esse, prodotti con tecniche di biologia molecolare o di chimica peptidica si sono dimostrati strumenti molto promettenti per migliorare la diagnosi sierologica [JiahnGG. et al 1987. The two major phosphoproteins (pp65 and ppl50) of human cytomegalovirus and their antigenic properties. J. Gen. Viro!. 68:1327-1337; Landini M.P. et al. 1990. Large scale screening of human sera with cytome galovirus recombinant antigens. J.Clin.Microbiol. 28:1375-1379; Scholl B.C. eet aL 1988. Procaryotic expression of immunogenic poiypeptides of thè large phosph oprotein (pp150) of human cytomegalovirus. J. Gen. Virol. 69:1195-1204).
In particolare, l'analisi della risposta immunitaria umorale che emerge durante la infezioone naturale ha ripetutamente dimostrato che la fosfoproteina di 150kD codificaata dal gene UL32 e localizzata al tegumento virale (ppUL32) è altamente immunogena ed è riconosciuta dai sieri provenienti da quasi il 100% dei soggetti
HCMV-si eropositivi testati, essendo prodotte contro di essa sia IgG (di tutte le
sottoclassi), sia IgM ed IgA (Landini M.P. et al. 1985. Human immune response to
Cytomegalovirus structural polypeptides studied by immunoblotting. J. Med. Virol.
17: 303-311). In questa molecola, sono stati identificati almeno due epitopi diversi
che si sono dimostrati in grado di reagire efficacemente con immunoglobuline
umane: una prima regione costituita dagli ultimi 25 amminoacidi (aa 1024-1048)
dell'estremità carbossil-terminale della molecola (Landini M.P. et al. 1991. Human
Cytomegalovirus structural proteins: immune reaction against ppl50 synthetic
peptides. J. Clin. Microbiol. 29:1868-1872), capace di reagire con circa l80% dei
sieri positivi per IgM; ed una seconda regione costituita dalla sequenza di
amminoacidi, presa in direzione 5' — >3', da 595 a 614 della molecola, capace di dare
una reazione positiva con quasi il 100% di sieri positivi per IgG (Novak J.P. et al. s 1991. Mapping of serologically relevant regions of human cytomegalovirus
phosphoprotein ppl50 using synthetic peptides. J. Gen. Virol. 72:1409-1413). Nel
tentativo di migliorare la antigenicità di questi due epitopi relativamente brevi di
ppUL32 le sequenze di DNA codificanti per tali epitopi sono state clonate in un
vettore di espressione procariotico esprimendo una proteina di fusione portante i
due epitopi fusi insieme in un singolo polipeptide, che può essere espresso in un
largo numero di cellule batteriche (Ripalti A. et al. 1994. Construction of a
polyepitope fusion antigen of human cytomegalovirus ppUL32; reactivity with
human antibodies. J. Clin. Microbio!. 32:358-363).
Ulteriori studi (Landini M.P. et al. 1990. J.Clin.MicrobioJ. 28:1375-1379)
hanno messo in luce che un'altra proteina virale altamente immunogena è la proteina
non strutturale da 52 kD, codificata dal gene UL44, parte della quale può essere prodotta come proteina di fusione in Lac- E.coli Y1089 infettando una coltura di questo batterio con un batteriofago ricombinante G2 (Ripalti A. et al 1989. Identification and preliminary use of recombinant lambda gt11 fusion proteins in Cytomegalovirus diagnosis. J. Gen. Virol. 70:1247-1251) individuato in una genoteca espressiva del fago LambdaGTll (Mocarski E. et aL 1985. Proc. Nat. Academy of Sciences. 82:1266-1270) e inducendo la produzione della proteina di fusione con isopropil-fi-D-tiogalatopiranoside (IPTG). La proteina di fusione, denominata G2, è costituita da uno o più epitopi localizzati nella regione carbossilterminale della p52 espressa insieme con β-gaiattosidasi e si è dimostrata utilizzabile con successo nella diagnosi della infezione primaria da HCMV, in quanto altamente reattiva alle IgM. La sequenza di DNA esprimente tale regione è stata inserita nel plasmide p-ROS (che reca una sequenza troncata di LacZ) nel sito Smal e clonata in E.coli ottenendo una proteina di fusione denominata H10 che ha dato buoni risultati. (Ripalti A. et al. 1994. Prokariotic expression of a large fragment of thè most antigenic cytomegalovirus DNA-binding protein (ppUL44) and its reactivity with human antibodies. J. Virol. Methods 46:39-50).
Tutti gli studi sopra riportati, tuttavia, non hanno ancora permesso di trovare proteine di fusione veramente capaci di sostituire il virus o le sue parti (vinoni purificati) nei kit diagnostici di uso corrente.
Scopo della presente invenzione è quello di fornire un materiale proteico ricombinante, in particolare una proteina di fusione, capace di legare per reazione immunitaria anticorpi prodotti contro il Citomegalovirus umano, in particolare sia IgM che IgG, che possa essere impiegato come antigene per la cattura di tali anticorpi nei relativi test sierologici con efficacia sostanzialmente pari a quella del" virus e/o di lisati di cellule infette.
Ε' anche uno scopo dellinvenzione quello di realizzare reagenti diagnostici derivati da tale materiale proteico.
E' infine uno scopo del'invenzione quello di fornire un plasmide inseribile in un organismo ospite procariotico e/o eucariotico per esprìmere detto materiale proteico ricombinante come una proteina di fusione.
In base all'invenzione viene fornito un materiale proteico ricombinante atto a legare anticorpi contro il Citomegalovirus umano (HCMV), caratterizzato dal fatto che consiste in una proteina di fusione comprendente una prima regione costituita da almeno parte della sequenza carbossil-terminale degli ultimi 233 amminoacidi della proteina p52, una seconda regione costituita da almeno parte della sequenza carbossii-terminale degli ultimi 44 amminoacidi della proteina ppl50, ed una terza regione costituita da almeno parte della sequenza, presa procedendo in direzione 5'->3', di amminoacidi da S9S a 614 della proteina ppl5O; dette regioni essendo tra loro comunque disposte nella proteina di fusione.
Preferìbilmente, le dette regioni includono per intero le dette sequenze di amminoacidi dela p52 e della pp150 e, secondo una preferita ma non limitativa forma di attuazione, la proteina di fusione dell'invenzione comprende in sequenza, procedendo in direzione 5'— >3'·. la detta prima regione, immediatamente a valle della quale è disposta la detta terza regione, e poi la detta seconda regione, che è disposta a valle della detta terza regione, tra le dette terza e seconda regione essendo inserita una sequenza ponte.
Tale sequenza ponte è costituita, procedendo in direzione 5* — >3' dalia seguente serie di amminoacidi: lys leu gin giu phe.
L'invenzione fornisce inoltre un reagente diagnostico per la determinatone sierologica di uno stato di infezione da HCMV, caratterizzato dal fatto di comprendere una proteina di fusione come sopra definita.
In particolare, il reagente diagnostico comprende una proteina di fusione almeno una parte degli amminoacidi della quale è codificata dalla sequenza di nucleotidi indicata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 1, letta a partire dal nucleotide 001 e fino al nucleotide 900.
Fanno anche parte dell'invenzione reagenti diagnostici per la ricerca «erologica diretta di HCMV comprendenti almeno un siero policlonale monospecifico oppure anticorpi monoclonali (MaB) diretti contro la detta proteina di fusione.
L'invenzione è infine relativa ad un plasmide inseribile in un organismo ospite procariota od eucariota, caratterizzato dal fatto di comprendere, in combinazione, una prima sequenza di DNA codificante per almeno parte degli ultimi 233 amminoacidi carbossil-terminali della proteina p52 del HCMV, una seconda sequenza di DNA codificante per almeno parte degli ultimi 44 amminoacidi della sequenza carbossil-terminale della proteina pp150, ed una terza sequenza di DNA codificante per la sequenza di amminoacidi compresa, procedendo in direzione 5-3', tra l'amminoacido 595 e l'amminoacido 614 inclusi della proteina pp150.
In particolare, il plasmide include la sequenza di nucleotidi indicata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 1, a partire dai nucleotide 002 e fino al nucleotide 907.
Per una migliore comprensione dell'invenzione verrà ora data una descrizione non limitativa di alcuni suoi esempi di attuazione, con riferimento alle figure dei disegni annessi, nelle quali:
- la figura 1 illustra in forma schematica la posizione dei frammenti di DNA codificanti per due delle parti caratterizzanti la proteina di fri sione dell'invenzione, nel gene UL32 contenuto nel frammento EcoRI-Y del virus ceppo AD 169;
- le figure da 2 a 5 illustrano in forma schematica i metodi di preparazione di plasmidi utilizzati nel perfezionamento dell'invenzione; e
> le figure 6 e 7 riportano due tabelle comparative di dati sperimentali di riconoscimento di IgG e IgM provenienti da individui infetti da HCMV effettuato con test ELISA utilizzanti l'intero virus oppure diverse proteine ricombinanti di fusione inclusa quella dell'invenzione.
Dal brevetto europeo nr. 262S31 sono note parti immunogene della fosfoproteina strutturale di HCMV da 1 SO kD che dovrebbero essere codificate dal gene che si trova nel frammento Hind ΙI-Υ/Ν del genoma virale; sempre secondo tale brevetto europeo, tali parti immunogene delia proteina pplSO dovrebbero essere codificate in particolare da un frammento da circa 1,5 kilobasì EcoRI-PstI, che si trova all'interno della regione del frammento EcoRi-Y derivante dal genoma di HCMV ceppo AD 169
Studi successivi, più approfonditi, hanno permesso di accertare che tali deduzioni erano erronee, in quanto (figura 1) la proteina ppl50 risulta codificata dal gene UL32 che è molto più lungo di 1,5 kilobasì e che si trova comunque abbondantemente fuori a qualsiasi frammento EcoRI-PstI che può essere definito all’interno del frammento EcoRI-Y di AD169. Inoltre, il frammento EcoRI-Y si trova completamente al di fuori (in particolare a fianco, spostato verso l'estremità -NH2 terminale) del frammento Hind III-Y/N. I Richiedenti, ritengono pertanto che le proprietà immunogene evidenziate dal materiale proteico richiamato nel brevetto citato (che, però, identifica il polipeptide non correttamente e, quindi, lasciandolo sostanzialmente indeterminato) fossero correlate all'inclusione nel peptide dell'epitopo chiamato A1C2 codificato dai nucleotidi di UL32 che vanno, procedendo in direzione 5'~>3', dal nucleotide 1783 al nucleotide 1842, cioè all'inclusione della regione corrispondente alla sequenza di amminoacidi da 595 a 614 di ppUL32 identificata posteriormente (Novak J.P. et al. 1991. Mapping of serologically relevant regions of human cytomegalovirus phosphoprotein pp15O using synthetic peptides. J. Gen. Virol. 72:1409-1413)
Sulla base di quanto sopra, di quanto esposto nel proprio studio sulle proteine di fusione poliepitopiche pubblicato sul J. Clin. Microbi ol. 32:358-363 (Ripalti A. et al. 1994. op.cit.), il cui contenuto è qui incorporato per le parti necessarie per semplice riferimento, e sulla base di studi successivi, che hanno permesso di dimostrare come l'immunogenicità dell'altra regione della ppUL32 già nota come altamente immunogena, costituita dagli ultimi 25 amminoacidi dell'estremità carbossil-terminale della molecola (Landini M.P. et al. 1991. op.cit.), potesse essere ulteriormente migliorata dall'aggiunta di altri 19 amminoacidi (Ripalti A. ancora pubblicato), i Richiedenti, operando con il plasmide p-ROS secondo le : tecniche di Maniatis et al (1982. Molecular clonig: a iaboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y.) hanno preparato una serie di cloni che, inseriti in E, coli ed attivati con IPTG, sono atti a produrre tutta una serie di proteine di fusione includenti una porzione di β-galattosidasi (β-Gal), che sono poi state cimentate comparativamente con tecniche note (Western blott, Immunoblott, ELISA, eccetera) con sieri IgM ed IgG positivi per HCMV provenienti da pazienti trapiantati allo scopo di verificarne i diversi gradi di riconoscimento.
In particolare, sono stati preparati un primo plasmide denominato pMB28 adatto ad esprimere la sequenza di amminoacidi A1C2; un secondo plasmide denominato pGTl adatto ad esprimere una nuova sequenza immunogena della ppUL32 costituita dagli ultimi 44 amminoacidi della estremità carbossil-terminale della proteina virale ppl50, denominata F3 e codificata dai nucieotidi di UL32 che vanno, procedendo in direzione 5'— >3', dal nucleotide 3013 al nucleotide 3144; ed un terzo plasmide denominato pMB34 capace di esprimere insieme le sequenze di A1C2 e di F3 come un'unica proteina di fusione con β-Gal; il primo plasmide è stato ottenuto inserendo un frammento di DNA modificato ed amplificato per PCR tra i siti Sali e HindIII della regione di policlonazione del vettore di espressione procarìotica p-ROS operando secondo Platchter et al. (1992. "Detection of cytomegalovirus...", J. Clin. Microbio!. 30:201-206); il secondo, invece, è stato ottenuto inserendo nel sito Smal di p-ROS un frammento EcoRI di DNA estratto da un clone lambdaGT11 e opportunamente alterato per mutagenesi mediante vettore p-Alter in modo da sostituire un codone di STOP con un corrispondente sito EcoRI. Il terzo plasmide è stato ottenuto a partire dal plasmide pMB28, inserendo in esso il medesimo frammento EcoRI di 78 bp (base pairs) codificante per F3 utilizzato per pGTl nel sito StuI, lasciando così tra le due sequenza di DNA codificanti per A1C2 e per F3 una sequenza ponte di cinque amminoacidi: tys leu gin giu phe (K, Q, L, E ed F secondo la codifica IUPAC).
Secondo l'intuizione alla base dell'invenzione, è stata inoltre inserita nel raffronto comparativo anche la valutazione dell'epitopo noto altamente immunogeno della proteina virale p52 costituito dagli ultimi 233 amminoacidi della estremità carbossilterminale della stessa (denominato H10).
A questo scopo, la sequenza di nucleotidi H10 contenuta nel genoma del fago LambdaGT11 tra due siti ravvicinati di restrizione EcoRI disposti immediatamente a monte del gene lacZ viene ottenuta, operando secondo le ben note tecniche di Berg e Kaiser, per digestione con EcoRI; successivamente, le estremità (terminanti a gradino) vengono rese terminanti a filo (blunt) mediante una operazione di riempimento (filling in) in presenza di DNA-polimerasi, in cui le basi adenina/tirnina (A/T) spaiate vengono complementate con i nucleotidi corri ispondenti. Nel contempo, il plasmide p-ROS viene digerito con Smal, che ne determina l’apertura e la linearizzazione, poi il frammento EcoRI H10 di LambdaGTl 1 e i plasmide aperto vengono incubati insieme in presenza di DNA-ligasi, ottenendo lInserzione del frammento H10 nel sito apposito Smal previsto in p-ROS e Ida conseguente formazione di un plasmide pGHIO. Questo è a sua volta insedino in E. coli per eiettroporazione e clonato.
Infine, a partire dai plasmidi precedenti, viene preparato un ultimo plasmide "misto", includente sia le sequenze di DNA codificanti per AlCZ2-e per F3, che quella codificante per H10. A tale scopo, sono sintetizzali una coppia di oligonucleotidi per pGHIO ed una coppia di oligonucleotidi per pMB34, le cui sequenze consentono di utilizzarli per l'amplificazioone a catena mediata della polimerasi termostabile (PCR) della sequenza di H10 e della sequenza di A1C2-F3 rispettivamente, poi, tali coppie di. oligonucleotidi, che contengono ideile sequenze atte a introdurre opportuni siti di riconoscimento per prefissati di restrizione (nella fattispecie EcoRI) alle estremità 5' e sequenze in comune tra lestremo 5* e quello 3* di H10 e A1C2-F3 rispettivamente all'estremo opposto, sono utilizzate per ottenere l'amplificazione di un unico frammento di DNA contenentte tutti e tre gli epitopi considerati, già nell'ordine dì espressione desiderato e p ronto ad essere clonato nei siti scelti del vettore di espressione, nella fattispecie nel sto Smal di pROS per l'espressione degli epitopi sotto forma di proteina di fusione con β-Gal; in definitiva, il plasmide derivante, denominato pMB40 risulta pertanto ccomprendere in corrispondenza del sito Smal la sequenza di DNA SEQ ID NO. 1, a partire dal nucleotide 002 e fino al nucleotide 907, codificante per una nu ova proteina di fusione includente, simultaneamente, sia l'epitopo noto più immunogeno per IgG di pp150 (A1C2), sia l'epitopo noto più immunogeno di p52 (H10), sia il nuovo epitopo immunogeno di pp15O (F3) derivante dall'aggiunta di altri 19 amminoacidi al l'epitopo noto di pp15O costituito dagli ultimi 25 amminoacidi (sequenza denominata DI) della estremità carbossil-terminale della stessa.
Sorprendentemente, questa nuova proteina di fusione, denominata H10/A1C2/F3, ha dimostrato una reattività sìa verso IgG che IgM molto superiore a quella ottenibile dosando opportunamente le proteine contenenti i tre epitopi separati in un unico kit di ricerca. Vi è pertanto un effetto sinergico, che deve probabilmente essere ricercato nel fatto che, disponendo strettamente vicini tra loro epitopi che si trovano normalmente molto distanti sulla stessa proteina virale (]'A1C2 e l'3 di ppUL32 per esempio) o addirittura su proteine diverse (come H10 di pUL44) si vengono a "mimare" epitopi conformazionali probabilmente presenti nelle proteine virali originarie complete e/o sui vinoni.
La nuova proteina di fusione includente le sequenze suddette si è dimostrata infatti altrettanto attiva dei vinoni purificati nel legarsi con le IgG e IgM di soggetti infetti, offrendo finalmente, per la prima volta, la disponibilità di un antigene P quantitativamente e qualitativamente standardizzato, capace di sostituire realmente i vinoni purificati e/o le cellule infettate nella preparazione di kit diagnostici per le analisi sierologiche di infezione da HCMV. E' ovvio che la nuova proteina di fusione secondo l'invenzione può includere i suddetti epitopi nell'ordine presente nella sequenza SEQ ID NO: 2, che è quella attualmente preferita, oppure in una qualsiasi altra sequenza diversa, con inserite o meno delle sequenze ponte tra loro, come quella espressa dalla sequenza di nucleosidi da 757 a 771 della SEQ ID NO: 1.
Il plasmide pMB40 che esprìme tale proteina può essere inserito in un organismo ospite procariotico, come E. coli. Inoltre, il particolare metodo di ottenimento descritto per il frammento "misto", permette anche la sua clonazione in un vettore diverso, in particolare, dopo digestione con EcoRI, nel sito corrispondente del vettore pHIL-Sl, ottenendo così il plasmide pHIL-D1, che consente l'espressione della proteina ricombinante nel lievito Pichia pastoris. fusa ad un breve peptide che costituisce un segnale di secrezione al di fuori della cellula del lievito, nel mezzo di coltura. Quest'ultima modalità di espressione consente tra l'altro di indurre la produzione della proteina di fusione con metanolo, e non con IPTG, come per l'espressione in E, coli, risultando perciò enormemente meno costosa. Conseguentemente, si è anche in grado di produrre la proteina di fusione secondo l'invenzione in modo massiccio, semplice e poco costoso.
La proteina di fusione secondo l'invenzione è utilizzabile per preparare direttamente reagenti diagnostici per la determinazione sierologica della presenza di anticorpi verso il HCMV, in quanto presenta la capacità di legare con una efficienza del sostanzialmente 100% sia le IgM che le IgG anti-HCMV e, in particolare, anche quelle che vengono prodotte durante una fase primaria asintomatica dell'infezione citomegalica. Tali reagenti diagnostici comprendono la proteina di fusione H10/A1C2/F3, da sola oppure, eventualmente, in associazione con altri antigeni HCMV (ad esempio le proteine codificate dai geni UL83 e UL84 o parti di esse), oppure una proteina di fusione più complessa, includente le suddette tre sequenze immunogene A1C2, F3 e H10, ripetute più volte e comunque combinate tra loro, da sole e/o in associazione con altre sequenze delle medesime proteine virali pp150 e p52 o di altre proteine virali.
Il materiale proteico costituito dalla proteina di fusione secondo l'invenzione è inoltre utilizzabile per preparare, con tecniche note, reagenti
ricerca sierologica diretta del Citomegalovirus umano e/o di antigeni dello stesso costituiti da sieri policlonali monospecifici contro la proteina di fusione HI0/A1C2/F3 stessa, oppure da anticorpi monoclonali (MaB) diretti contro la proteina H10/A1C2/F3 e variamente ottenuti.
I reagenti diagnostici suddetti, contenenti la proteina secondo l'invenzione, possono a loro volta venire utilizzati per produrre un kit diagnostico per la determinazione sierologica della presenza di anticorpi verso il Citomegalovirus umano (HCMV), in cui il reagente è adsorbito su un supporto solido di nitrocellulosa (reazione di "blotting"). La proteina dell'invenzione può infine, previa purificazione, essere impiegata in saggi ELISA, agglutinazione al lattice, RIA e in tutte le altre reazioni sierologiche note per la ricerca di IgG e IgM specifiche, eseguite sia manualmente che in modo parzialmente o completamente automatizzato.
L'invenzione verrà ora ulteriormente descritta con riferimento ai seguenti esempi non limitativi di attuazione.
ESEMPIO 1
H10 in pROS:
Operando con le tecniche standard del DNA ricombinante, secondo Maniatis et al.(1982. Molecular clonig: a laboratory manual. Cold Spring Haibor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y.) e a partire da plasmidi pROS fomiti dagli autori degli stessi (Ellinger et al. op.cit.) si purifica il genoma di un clone ottenuto da una genoteca espressiva di Lambda Gtll, che produce una proteina di fusione con βgalattosidasi molto reattiva con sieri umani positivi per CMV. Il genoma viene poi digerito con l'enzima di restrizione EcoRI per estrarne il frammento di DNA espresso dal fago. Il frammento viene quindi clonato nel vettore pUC 18 e sequenziato. La sequenza è risultata rappresentare un frammento di 699 paia di basi esprìmenti 233 aminoacidi dell'estremo carbossilico di p52 (UL44). Il frammento è stato infine clonato nel sito Smal del vettore espressivo pROS, dopo "fìlling in" delle estremità EcoRI del frammento, secondo lo schema illustrato in figura 2. D plasmide ottenuto è stato chiamato pROSH10.
ESEMPIO 2
A1C2;
Operando con le tecniche di cui all'esempio 1 ed utilizzando il metodo di sintesi peptidica in fase solida secondo Merrifield, sono stati prodotti due oligonucleotidi tali da servire da primer per l'amplificazione di un frammento genomico del HCMV, di 60 paia di basi, esprimente un epitopo centrale della proteina pp15O (aa595-614). Tali oligonucleotidi sono stati sintetizzati con estremità recanti sequenze di riconoscimento per enzimi di restrizione: il primer in 5' recava la sequenza riconosciuta da Sali, mentre quello in 3' la sequenza riconosciuta da Hindm. Utilizzando DNA genomico virale purificato come "template" e i due primer appena i descritti, è stato amplificato il frammento di DNA desiderato e, dopo digestione con Sali e Hindin, clonato nei corrispondenti siti del plasmide espressivo pROS come da schema in figura 3, ottenendo il plasmide pMB28.
ESEMPIO 3
F3:
Operando con le tecniche di cui all'esempio 1, è stato purificato il genoma di un clone, ottenuto da una genoteca espressiva di Lambda Gtl 1, che produce una proteina di fusione con β -galattosidasi molto reattiva con sieri umani positivi per CMV. Il genoma e stato digerito con l'enzima di restrizione EcoRI per estrarne il frammento di DNA espresso dal fago. Il frammento è stato quindi clonato nel vettore pUC18 e sequenziato. La sequenza è risultata rappresentare un frammento di 132 paia di basi esprimenti 44 aminoacidi dell'estremo carbossilico di pp15O (UL32). Il frammento è stato infine clonato nel sito Smal del vettore espressivo pROS, dopo "filling in" delle estremità EcoRI del frammento, operando secondo il medesimo schema dell'esempio 1. Il plasmide ottenuto é stato chiamato pGTl .
ESEMPIO 4
A1C2-F3:
Per l'espressione dei due epitopi di pp15O, precedentemente espressi mediante i plasmidi pMB28 (A1C2) e pGT1 (F3), il frammento codificante per F3 è stato clonato nel sito StuI di pMB28 dopo "filling in" delle estremità EcoRI, generate dall'estrazione di F3 dal vettore pUC18, nel quale era stato clonato per il sequenziamento. Π nuovo plasmide risultante è stato chiamato pMB34 ed esprime t due epitopi separati da un ponte di cinque aminoacidi, come risulta dallo schema in figura 4.
ESEMPIO 5
H10-A1C2-F3:
A partire dai plasmidi precedentemente descritti, ed in base ai metodi dell'esempio 1 e 2, si opera secondo lo schema di figura 5, nel modo seguente: sono sintetizzate due coppie di oligonucleotidi, le cui sequenze consentono di utilizzarli per ramplificazione a catena mediata dalla polimerasi termostabile (PCR) della sequenza di H10 e della sequenza di A1C2-F3, presenti nei plasmidi pGHIO e pMB34. Le sequenze di oligonucleotidi che costituiscono questi primer sono le seguenti:
per amplificare H10 da pGHIO, introdurre un sito EcoRI in 5' nella sequenza amplificata e una sequenza di 12 paia di basi omologa a A1C2 in 3' nel frammento amplificato; e
per amplificare il frammento A1C2-F3 dal plasmide pMB34 introducendo una sequenza omologa ad H10 in 5' nell'amplificato e un sito EcoRI in 3'.
I due frammenti risultanti dalle due amplificazioni indipendenti (EcoH10A1C2 e H10 A1C2-F3Eco) vengono in seguito mescolati, insieme ai primer esterni EcoH10 e F3Eco, e quindi sottoposti a nuova amplificazione. Grazie alla complementarietà dell'estremo 3' diEcoH10A1C2 <e >dell'estremo 5' di H10 A1C2-F3Eco, ne risulta un amplificato che riunisce tutti e tre gli epitopi e risulta avere un sito EcoRI ad ogni estremità di questo.
La sequenza amplificata è infine clonata in pROS, e il plasmide risultante, chiamato pMB40, risulta includere, in corrispondenza del sito Smal, la sequenza di DNA SEQ ID NO: 1, a partire dal nucleotide 002 e fino al nucleotide 907.
ESEMPIO 6
I plasmidi degli esempi da 1 a 5 vengono inseriti in E.coli per elettroporazione e clonati; viene poi indotta la produzione delle proteine di fusione desiderate con IPTG e le proteine prodotte vengono rese disponibili Usando i batteri e denaturando il lisato batterico in presenza di SDS e B-mercaptoetanolo; le proteine sono poi separate per SDS-PAGE in 9-12% acrilamide gel ed elettrotrasferite su nitrocellulosa, dove le immuno-reazioni sono sviluppate; si fa uso di una camera Miniblotter (Immunetics, Cambridge-Mass. USA) per screening preliminare di alcuni campioni di siero; IgG purificate (Endobulin, della ImmunoAG, Vienna AT) sono utilizzate a diluizione 1:100, cosi come anche un gruppo di sieri altamente positivi per IgM. I campioni di siero umano individuali sono diluiti 1:80 sia pei/laj ricerca di IgG che di IgM; come secondo anticorpo si utilizza un coniugato perossidasato anti-γ o anti-μ.
1 sieri umani usati appartengono a due gruppi: il primo consiste di 17 sieri positivi per IgG CMV-specifiche, aventi alti (per 8) o medio/bassi (per 7) titoli ELISA; tali titoli vengono anche tutti confermati per "immunoblotting". Il secondo gruppo consiste di 19 sieri positivi per IgM CMV-specifiche, aventi alti (per 10) o medio/bassi (per 9) titoli ELISA, anche in questo caso tutti confermati per "immunoblotting".
La valutazione del titolo di IgG anti-HCMV è effettuata con un test kit CVM della M.A.Bioproducts (Walkersville, Md. USA); le piastre vengono lette su un lettore automatico Micro-ELISA (Dynatech Products, Alexandria, Va. USA). Per standardizzare il test ed eseguire l'analisi statistica per regressione lineare, ciascuna piastra include tre calibratori di siero. Per la valutazioned el titolo di IgM anti-HCMV viene invece usato il test kit CMV IgM ELA della Technogenetics (Amburgo, Germania). I risultati vengono interpretati come suggerito dai produttori dei tests.
Tutti i campioni vengono anche sottoposti per sicurezza (onde escludere i risultati falso-positivi) a test per la ricerca del fattore reumatoide per agglutinazione al lattice (Rheuma-Wellco test della Wellcome, a Dartford, Gran Bretagna) e solo i campioni negativi sono utilizzati per le comparazioni.
I risultati sono riportati nelle Tabelle 1 e 2 di figure 6 (IgG) e 7 (IgM).
Come è possibile rilevare, non solo i risultati ottenuti con H10/A1C2/F sono nettamente migliori che quelli ottenuti con tutte le altre proteine di fusione esaminate, sia verso IgG che IgM, ma sono addirittura del tutto paragonabili ai risultati ottenuti con antigeni costituiti dal virus intero.
LISTATO DELLE SEQUENZE
Claims (18)
- RIVENDICAZIONI 1. Materiale proteico ricombinante atto a legare anticorpi contro il Citomegalovinis umano (HCMV), caratterizzato dal fatto che consiste in una proteina di fusione comprendente una prima regione costituita da almeno parte della sequenza carbossil-terminale degli ultimi 233 amminoacidi della proteina p52, una seconda regione costituita da almeno parte della sequenza carbossil-terminale degli ultimi 44 amminoacidi della proteina pp150, ed una terza regione costituita da almeno parte della sequenza, presa procedendo in direzione 5'— >3', di amminoacidi da 595 a 614 della proteina pp150; dette regioni essendo tra toro comunque disposte nella proteina di fusione.
- 2. Materiale proteico ricombinante secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che le dette regioni includono per interno le dette sequenze di amminoacidi della p52 e della pp150.
- 3. Materiale proteico ricombinante secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto di comprendere in sequenza, procedendo in direzione 5'-- >3': la detta prima regione, immediatamente a valle della quale è disposta la detta terza regione, e poi la detta seconda regione, che è disposta a valle della detta terza regione, tra le dette terza e seconda regione essendo inserita una sequenza ponte.
- 4. Materiale proteico ricombinante secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detta sequenza ponte è costituita, procedendo in direzione 5' — >3’ dalla seguente serie di amminoacidi: lys leu gin giu phe.
- 5. Materiale proteico ricombinante secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la detta proteina di fusione comprende almeno una parte di β-Ga!attosidasi.
- 6. Materiale proteico ricombinante atto a legare anticorpi contro il Citomegalovirus umano (HCMV), caratterizzato dal fatto di comprendere una proteina di fusione, almeno una parte degli amminoacidi della quale è codificata dalla sequenza di nucleotidi SEQ ID NO: 1, letta a partire dal nucleotide 001 e fino al nucleotide 900.
- 7. Plasmide inseribile in un organismo ospite procariota od eucariota, caratterizzato dal fatto di possedere, in combinazione, una prima sequenza di DNA codificante per almeno parte degli ultimi 233 amminoacidi carbossil-terminali della proteina pS2 del HCMV, una seconda sequenza di DNA codificante per almeno parte degli ultimi 44 amminoacidi delia sequenza carbossil-terminale della proteina pp150, ed una terza sequenza di DNA codificante per la sequenza di amminoacidi compresa, procedendo in direzione 5'— >3', tra l'amminoacido 595 all'amminoacido 614 inclusi della proteina pp150.
- 8. Plasmide secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto di includere parti selezionate della sequenza di DNA di SEQ ID NO: 1.
- 9. Plasmide secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto di includere per intero la sequenza di DNA di SEQ ID NO: 1.
- 10. Plasmide inseribile in un organismo ospite procariota od eucariota, in particolare E.coli. caratterizzato dal fatto di essere costituito da un vettore espressivo pROS, nel quale è stata inserita la sequenza di DNA SEQ ID NO: 1, in corrispondenza del sito Smal, a partire dal nucleotide 002 e fino al nucleotide 907.
- 11.Plasmide inseribile in un organismo ospite procariota od eucariota, in particolare Pichia pastoris. caratterizzato dal fatto di essere costituito da un vettore espressivo pHIL-Dl, nel quale è stata inserita la sequenza di DNA SEQ ID NO: I, in corrispondenza del sito EcoRI, a partire dal nucleotide 002 e fino al nucleotide 907.
- 12. Organismo ospite ricombinante comprendente il plasmide secondo una delle rivendicazioni da 7 a 11, ato a produrre una proteina di fusione comprendente una prima regione costituita da almeno parte della sequenza carbossil-terminale degli ultimi 233 amminoacidi della proteina p52, una seconda regione costituita da almeno parte della sequenza carbossil-terminale degli ultimi 44 amminoacidi della proteina pp150, ed una terza regione costituita da almeno parte della sequenza, presa procedendo in direzione 5' — >3', di amminoacidi da 595 a 614 della proteina ppl50; dette regioni essendo tra loro comunque disposte nella proteina di fusione.
- 13. Materiale proteico ricombinante atto a legare anticorpi contro il Citomegalovirus umano (HCMV), caraterizzato dal fato che consiste in una proteina di fusione espressa in un organismo ospite in cui è stato inserito un plasmide secondo una delle rivendicazioni da 7 a 11.
- 14. Reagente diagnostico per la determinazione sierologica di uno stato di infedone da HCMV, caraterizzato dal fato di comprendere una proteina di fusione secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6 e 13.
- 15. Reagente diagnostico per la ricerca sierologica diretta del Citomegalovirus umano e/o di antigeni dello stesso, comprendente almeno un siero policlonale mono specifico contro la proteina di fusione secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6 e 13.
- 16. Reagente diagnostico per la ricerca sierologica direta del Citomegalovirus umano do di antigeni dello stesso comprendente anticorpi monoclonali (MaB) diretti contro la proteina di fusione secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6 e 13.
- 17. Reagente diagnostico per la determinazione sierologica di uno stato di infezione da HCMV, caraterizzato dal fato di comprendere una proteina di fusione almeno una parte degli amminoacidi della quale è costituita dalla sequenza SEQ ID NO: 2.
- 18. Kit diagnostico per la determinazione sierologica della presenza di anticorpi 1 verso il Citomegalovirus umano (HCMV), caratterizzato dal fatto di comprendere un reagente diagnostico secondo una delle rivendicazioni da 14 a 17, eventualmente adsorbito su un supporto solido.
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