JP2000206114A

JP2000206114A - 免疫学的測定方法

Info

Publication number: JP2000206114A
Application number: JP11008064A
Authority: JP
Inventors: Masaru Sato; 賢佐藤; Kenjiro Mori; 健二郎森
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 2000-07-28

Abstract

(57)【要約】【課題】迅速かつ簡便で、高感度な免疫学的測定方法お
よびそれに用いられるキットを提供すること。【解決手段】被検物質と結合しうる第一免疫体を吸水性
基材上に固定化した固定部で、該第一免疫体および、該
被検物質と結合しうる第二免疫体を標識体に結合してな
る標識免疫体により該被検物質を挟み込むサンドイッチ
型免疫学的測定方法において、前記標識体にさらにビオ
チンが結合しており、該ビオチンと結合するアビジンを
介して複合体を形成し、該複合体中の標識体により被検
物質を検出することを特徴とする免疫学的測定方法、な
らびに被検物質と結合しうる第一免疫体を吸水性基材上
に固定化した固定部を有する免疫学的検査片、該被検物
質と結合しうる第二免疫体およびビオチンを標識体に結
合してなる標識免疫体ならびにアビジンを含有してなる
免疫学的測定キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検物質の免疫学
的測定方法および免疫学的測定キットに関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】感染性病原体等の検査または感染症を始
めとする種々の疾患の診断分野において、被検物質を高
感度かつ再現性よく測定するために、酵素免疫法（ＥＩ
Ａ法）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等が汎用さ
れている。かかる方法は、標識物質として用いる酵素標
識抗体または放射性物質等の安定性や特別な設備の必要
性等により、測定には種々の制約がある。さらに、操作
時間、反応時間または検出時間が長いため、結果が出る
までに時間がかかるという問題点があった。

【０００３】近年、迅速かつ簡便に免疫学的検査が行え
る方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されてい
る。当該方法は、例えば以下のような工程を経る。吸水
性基材上に被検物質と結合しうる免疫体を固定化した固
定部に、当該被検物質と結合しうる標識免疫体と当該被
検物質との複合体を結合させる。続いて固定部にて結合
した標識免疫体を検出することにより、被検液中の被検
物質を測定することができる。

【０００４】しかしながら、一刻を争う感染症等の病原
体を特定するために、迅速性、簡便性さらには感度に関
して十分満足の得られる免疫クロマトグラフ法の開発が
求められているものの、そのような免疫学的測定方法は
確立されていないのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、迅速
かつ簡便で、高感度な免疫学的測定方法およびそれに用
いられるキットを提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１）被検物質と結合しうる第一免疫体を吸水性基材上
に固定化した固定部で、該第一免疫体および、該被検物
質と結合しうる第二免疫体を標識体に結合してなる標識
免疫体により該被検物質を挟み込むサンドイッチ型免疫
学的測定方法において、前記標識体にさらにビオチンが
結合しており、該ビオチンと結合するアビジンを介して
複合体を形成し、該複合体中の標識体により被検物質を
検出することを特徴とする免疫学的測定方法、および
（２）被検物質と結合しうる第一免疫体を吸水性基材上
に固定化した固定部を有する免疫学的検査片、該被検物
質と結合しうる第二免疫体およびビオチンを標識体に結
合してなる標識免疫体ならびにアビジンを含有してなる
免疫学的測定キット、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の免疫学的測定方法は、被
検物質と結合しうる第一免疫体を吸水性基材上に固定化
した固定部で、該第一免疫体および、該被検物質と結合
しうる第二免疫体を標識体に結合してなる標識免疫体に
より被検物質を挟み込むサンドイッチ型免疫学的測定方
法であり、前記標識体にさらにビオチンが結合してお
り、該ビオチンと結合するアビジンを介して複合体〔例
えば、吸水性基材−第一免疫体−被検物質−第二免疫体
−標識体−ビオチン−アビジン−ビオチン−標識体−第
二免疫体〕を形成し、該複合体中の標識体により被検物
質を検出することを特徴とする。

【０００８】本発明において被検物質とは、通常の免疫
反応により検出可能な物質であれば特に限定されない
が、細菌およびその構成成分、細菌が産生する毒素、タ
ンパク質、ウイルス抗原および抗体ならびにマイコプラ
ズマ等が挙げられる。細菌およびその構成成分として
は、例えば、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ菌、ブドウ球
菌溶連菌、カンピロバクター菌、ウェルシュ菌、腸炎ビ
ブリオ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、クラミジア・ト
ラコマティス菌およびその構成成分等が挙げられる。細
菌が産生する毒素としては、例えば、ベロトキシン、ス
トレプトリシンＯ等が挙げられる。タンパク質として
は、例えば、ヒトトランスフェリン、ヒトアルブミン、
ヒト免疫グロブリン、マイクログロブリンおよびＣ反応
性タンパク質等が挙げられる。ウイルス抗原および抗体
としては、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｃ、ＨＢｅおよびＨ
Ｂｓ抗原ならびに抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗原および抗
体、ヒト免疫不全ウイルス抗原および抗体、ロタウイル
ス抗原および抗体ならびにアデノウイルス抗原および抗
体等が挙げられる。

【０００９】前記被検物質と結合しうる第一免疫体およ
び第二免疫体とは、測定対象の被検物質と特異的に結合
しうる物質であり、抗体または抗原が挙げられ（ここ
で、抗原としてはタンパク質、ペプチド、ハプテン等が
含まれる）、測定対象の被検物質に応じて、サンドイッ
チ法などで用いられる公知のものを適宜選択する。例え
ば被検物質が抗原の場合は、対応する抗体を免疫体とし
て用いることができる。この場合、固定部に固定化する
第一免疫体と標識免疫体の構成要素として用いる第二免
疫体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体を使用することができ、一方の免疫体がモノクローナ
ル抗体である場合には、もう一方の免疫体は当該モノク
ローナル抗体とは異なる抗原決定基を認識するものが好
ましい。また、被検物質が抗体の場合は、対応する抗原
を免疫体として用いることができる。この場合、第一免
疫体および第二免疫体として、対応する抗原および被検
物質である抗体に対する抗抗体（抗免疫グロブリン抗
体）をそれぞれ用いてもよい。

【００１０】本発明における吸水性基材は、被検物質を
含有する被検試料、例えば、血清、血液、尿、便、唾液
等を吸収できるもの、前記被検試料を緩衝液によって希
釈した希釈液を吸収するもの、標識免疫体を含有する液
を吸収するものであれば特に限定されない。ここで使用
される緩衝液としては、特に限定されないが、ほう酸緩
衝液、りん酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が挙げ
られる。

【００１１】本発明においては、被検試料中の被検物質
が標識免疫体や固定部の第一免疫体と充分な反応を行な
うための時間を確保できるような吸水性基材が用いられ
る。吸水性基材が吸水性に劣る場合には、被検試料が固
定部に到達するのに長時間を要し、その結果、迅速な測
定を行なうことができない。一方、吸水性基材の吸水性
があまりに高すぎる場合には、被検試料中の被検物質が
標識免疫体や固定部の第一免疫体と充分な反応を行なう
ために必要な時間が不足するので、正確な測定を行なう
ことが困難となる。

【００１２】好ましい具体例としては、不織布、濾紙、
ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフ
ィルター、多孔質材料などが挙げられる。これらの基材
は適度な吸水速度を有すると共に、標識免疫体が着色さ
れている場合には発色の目視確認性に優れるものであ
る。

【００１３】以上の点を考慮すると、本発明における吸
水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断し
た吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸
水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが好ましい。

【００１４】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、吸水性基材に親水性重合体、タンパク質もしくは
乳化剤等を被覆し、または含浸させてもよい。さらに、
本発明においては吸水性基材として同一材料からなる基
材を用いてもよいし、あるいは異種の材料からなるもの
を任意の接着手段によって接合して得た連続した基材を
用いることもできる。

【００１５】吸水性基材の形状は、被検試料を展開でき
る形状であれば特に限定されるものではなく、例えば、
矩形のシート状（片状）やロッド状などが好ましい。

【００１６】本発明において固定部とは、前記第一免疫
体が前記吸水性基材上に固定化された領域をいう。第一
免疫体を吸水性基材上に固定化する方法（固定部の作製
方法）は、特に限定されるものではないが、従来から知
られている物理吸着法や共有結合法によるのが好適であ
る。

【００１７】固定化する第一免疫体の量は、用いる免疫
体の種類や特性によっても異なるが、通常、０．００１
〜１０ｍｇ／ｃｍ²程度である。

【００１８】また、固定部を形成した後の吸水性基材
は、被検物質または標識免疫体の非特異的吸着を防ぐた
めに、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウ
レート（Ｔｗｅｅｎ^TM２０）、ポリオキシエチレン（２
０）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ^TM８０）、
ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル
（Ｔｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００）、ドデシルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム等の界面活性剤やウシ血清アルブミ
ン、スキムミルク、カゼイン等のタンパク質や、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニル
ピロリドン等の水溶性高分子でブロックすることが好ま
しい。

【００１９】本発明における標識免疫体とは、標識体に
前記第二免疫体、さらにはビオチンを結合させたものを
いう。ここで用いる標識体としては特に限定されない
が、検出の簡便性という観点から着色粒子が好ましい。
着色粒子は、肉眼で着色が検出可能なものであれば制限
はなく、例えば金、銀、銅などの金属からなるコロイド
粒子、スダンブルー、スダンレッドIV、スダン III、オ
イルオレンジ、キニザリングリーンなどに代表される顔
料や染料などでラテックスを着色した着色ラテックスな
どを用いることができる。目視確認性の点からは、金コ
ロイドや青色、赤色、緑色、オレンジ色に着色した着色
ラテックスを用いることが好ましく、さらに好ましくは
青色や赤色などで着色した水分散型高分子重合体粒子か
らなる着色ラテックスを用いることが分散安定性や被検
物質の検出感度の調整し易さ等の点から望ましい。

【００２０】前記着色粒子の粒子径としては保存安定性
や調製しやすさの点から、０．０１〜５μｍ、好ましく
は０．０５〜３μｍの範囲とする。粒径があまりに小さ
すぎると、１粒子当たりの着色の程度が少ないので、固
定部に結合しても発色の程度が悪く、目視確認性に劣る
ようになる。また、粒径が大きすぎると、着色粒子が僅
かに凝集しただけで吸水性基材に目詰まりを起こして吸
水性を低下させたり、非特異発色を起こしたりすること
がある。

【００２１】ビオチンとしては、アビジンと特異的に結
合するものであれば特に限定されるものではなく、ビオ
チンまたはその誘導体であってもよい。ビオチンの誘導
体としては、例えば、ビオチンメチルエステル、ビオチ
ノール、ビオチニルω−ブロミド、ビオシチン、デスチ
オビオチン、ビオチンＬ−スルホキシド等が挙げられ
る。特に、ビオチン、ビオシチンが好ましい。

【００２２】前記着色粒子に第二免疫体およびビオチン
を結合する方法としては、従来からよく知られている方
法、例えば共有結合法、物理吸着法、イオン結合法など
を用いることができるが、結合後の第二免疫体およびビ
オチンの脱離がなく安定である点から共有結合法を採用
することが好ましい。第二免疫体およびビオチンが結合
した着色粒子の色は異なっても構わないが、同一である
のが好ましい。

【００２３】こうして得られた標識免疫体は、緩衝液に
分散させて使用することができる。ここで使用する緩衝
液としては、ほう酸緩衝液、りん酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液等が挙げられ、抗原抗体反応を阻害しない
ｐＨ及び塩濃度の緩衝液を適宜使用する。標識免疫体の
使用量は、本発明の各種の態様において適宜設定するこ
とができる。例えば、標識免疫体を含有する緩衝液中の
標識免疫体濃度は、０．００５〜５重量％、好ましくは
０．０１〜０．５重量％の範囲とする。濃度があまりに
も低すぎると、固定部に結合する着色粒子数が少なく、
発色が悪くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なば
かりでなく、過剰の着色粒子が固定部以外に残留し、固
定部の発色を不明瞭にする等の問題が発生する（以下、
標識免疫体を含有する緩衝液を標識免疫体液ともい
う）。

【００２４】本発明に用いられるアビジンとしては、ビ
オチンと特異的に結合するものであれば、特に限定され
ない。アビジンは、卵白から単離したもの、Streptomyc
es avidinii から単離したストレプトアビジンでもよ
い。特に、アビジンが好ましい。

【００２５】アビジンの適用方法としては、吸水性基材
上の一端と第一免疫体を固定化した固定部との間の任意
の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持され
ていてもよく、標識免疫体液に混合させて用いてもよ
い。また、緩衝液に混合させて用いてもよい。ここで用
いられる緩衝液は、前記標識免疫体を分散させるのに用
いられるものと同様のものが挙げられる。

【００２６】本発明においては、アビジンを被検試料や
緩衝液などの水との接触によって吸水性基材から脱離し
うるように、吸水性基材上に塗布することが好ましい。
塗布方法としては、例えばアビジンの溶液を吸水性基材
に塗布したのち、適当な条件にて乾燥させる。乾燥の一
態様として凍結乾燥させることもできる。

【００２７】本発明のサンドイッチ型免疫学的測定方法
は、前記アビジンと前記ビオチンとの間の高いアフィニ
ティーとアビジン１分子に対して複数のビオチン分子が
結合し得るため、固定部での被検物質と第一免疫体との
複合体に、ビオチンの結合した標識免疫体がアビジンを
介して多数結合することによりさらに高次の複合体が形
成され、その結果、被検物質と第一免疫体との結合シグ
ナルが増幅され、着色した標識免疫体の検出が容易にな
るという効果を奏する。

【００２８】即ち、本発明における複合体は、最もシン
プルな結合様式として吸水性基材−第一免疫体−被検物
質−第二免疫体−標識体−ビオチン−アビジン−ビオチ
ン−標識体−第二免疫体で表現することができるが、ア
ビジンに結合する−ビオチン−標識体−第二免疫体は同
一のアビジン分子に複数個結合することができるので、
吸水性基材−第一免疫体−被検物質−第二免疫体−標識
体−ビオチン−アビジン−（ビオチン−標識体−第二免
疫体）n で表現することができる。

【００２９】また、前記複合体の末端にある第二免疫体
には、さらに被検物質が結合可能であるため、その第二
免疫体にさらに被検物質が結合し、次いで−第二免疫体
−標識体−ビオチン−アビジン−（ビオチン−標識体−
第二免疫体）n が結合することもできる。即ち、吸水性
基材−第一免疫体−被検物質−第二免疫体−標識体−ビ
オチン−アビジン−（ビオチン−標識体−第二免疫体）
n −〔被検物質−第二免疫体−標識体−ビオチン−アビ
ジン−（ビオチン−標識体−第二免疫体）n 〕ｎのよう
に複雑な複合体となる。本発明におけるこれらの複合体
は一例であり、ビオチン−アビジン結合を介した種々の
複雑な複合体が含まれる。

【００３０】また、本発明においては、被検試料、標識
免疫体液、被検試料および標識免疫体液の混合物、緩衝
液などの吸液が開始される部位（以下、滴下部とも称す
る）と固定部との間の距離は、１〜６ｃｍ、好ましくは
３〜４ｃｍ程度とする。距離があまりに遠すぎると、固
定部まで被検物質と標識免疫体が到達しなかったり、発
色感度が強すぎたり、測定に時間がかかったりするとい
う問題点を生じる恐れがあり好ましくない。一方、距離
が近すぎると固定部での発色が均一でなく、まばらにな
ったり、発色感度が低すぎるという問題が生じる恐れが
ある。

【００３１】本発明の免疫学的測定方法の態様を以下に
説明する。第１の態様は、図１に示すように、被検試料
を、標識免疫体４を含有する緩衝液およびアビジン８と
混合し、混合液を吸水性基材１上の滴下部１１から展開
して、第一免疫体２が固定化されている固定部３に移動
させる。この間に、標識免疫体４中の第二免疫体６と被
検物質９との結合や、標識免疫体４中のビオチン７とア
ビジン８との結合が起こる。固定部３に到着すると、吸
水性基材１上に固定化された第一免疫体２と被検物質９
とが結合し、複合体〔吸水性基材−第一免疫体−被検物
質−第二免疫体−標識体−ビオチン−アビジン−標識
体〕１０を形成する。

【００３２】第２の態様は、図２に示すように、吸水性
基材１上の滴下部１１から、被検試料を、標識免疫体４
を含有する緩衝液と共に展開して、第一免疫体２が固定
化されている固定部３に移動させる。この途中に、アビ
ジン８が塗布されている相（アビジン相）に到着し、水
との接触によりアビジン８が脱離する。さらに、吸水性
基材１上を移動して第一免疫体２が固定化されている固
定部３に到達する間に、標識免疫体４中の第二免疫体６
と被検試料中の被検物質９との結合や、標識免疫体４中
のビオチン７と吸水性基材１上に固定されていたが水と
の接触により脱離したアビジン８との結合が起こる。固
定部３に到着すると、吸水性基材上に固定化された第一
免疫体２と被検物質９とが結合し、複合体〔吸水性基材
−第一免疫体−被検物質−第二免疫体−標識体−ビオチ
ン−アビジン−標識体〕１０を形成する。

【００３３】こうして形成された複合体１０は、免疫標
識体を構成する標識体５としての着色粒子がアビジン−
ビオチンを介する高次結合により集合して発色が明瞭と
なり、目視確認することができる。

【００３４】本発明の免疫学的測定方法の感度は、例え
ば、比較例に記載のアビジン−ビオチン系を利用しない
方法に比べて、約４倍以上上昇する。

【００３５】本発明において、第一免疫体が固定化され
た固定部を有する吸水性基材を本発明の免疫学的検査片
ともいう。

【００３６】さらに、本発明は、前記免疫学的検査片、
前記標識免疫体ならびにアビジンを含有する免疫学的測
定キットを提供する。本発明のキットは、本発明の免疫
学的測定方法に好適に用いられるものである。

【００３７】本発明のキットに含有される免疫学的検査
片および標識免疫体は、前記本発明の免疫学的測定方法
で定義した通りである。

【００３８】本発明のキットに含有されるアビジンは、
前記本発明の免疫学的測定方法で定義した通りである
が、免疫学的検査片の吸水性基材の一端と固定部との間
の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保
持されていることが好ましい。

【００３９】

【実施例】以下、本発明の実施例を挙げ、さらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定され
るものではない。

【００４０】実施例１〔水分散型高分子重合体粒子の作製〕スチレンモノマー
５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエチレングリコール
ジメタクリレート０．２ｇ、及び蒸留水４４０ｇを窒素
気流下で温度７５℃にて攪拌しながら、これに過硫酸カ
リウム０．２５ｇを水１０ｇに溶解した水溶液を加え、
１０時間重合させて、平均粒径０．２２μｍの水分散型
高分子重合体粒子の水分散液を得た。

【００４１】得られた重合体粒子分散液をアルカリ、
酸、蒸留水の順序にて遠心洗浄した後、固形分濃度１０
重量％に調整した（担体粒子分散液）。

【００４２】スダンブルー０．２ｇをトルエン２０ｍｌ
に溶解し、これにドデシル硫酸ナトリウム０．２ｇ及び
蒸留水１００ｍｌを加え、超音波分散機でこの混合液を
乳化した。

【００４３】得られた乳化液に前記担体粒子分散液（固
形分濃度１０重量％）３０ｍｌを加え、室温にて２４時
間攪拌した。この液をエバポレータにてトルエンを除去
した後、０．０１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて遠
心洗浄を行い、固形分濃度５重量％に調整した。

【００４４】この液５０ｍｌに１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌおよび０．０３Ｍｍ−キシ
レンジアミン水溶液５０ｍｌを加え、室温にて５時間反
応させた後、７５℃にて５時間加熱処理し、前記と同じ
緩衝液にて遠心洗浄を行い、固形分濃度１重量％になる
ように調整した（スダンブルー染色キシレンジアミンス
ペーサ化粒子分散液）。

【００４５】〔標識免疫体の作製〕前記スダンブルー染
色キシレンジアミンスペーサ化粒子分散液１０ｍｌにグ
ルタルアルデヒド水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを
加え、室温にて２時間反応させた後、前記と同じ緩衝液
にて遠心洗浄し、固形分濃度１重量％の分散液に調整し
た。得られた分散液１０ｍｌに、ビオシチン１ｍｇと抗
ヒトＨＢｓ抗体（ウサギＩｇＧ、５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ
とを加え、１０℃にて２４時間攪拌した。これを前記と
同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度１重量％となるよ
うに再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブル
ー染色粒子標識ビオシチン−抗ヒトＨＢｓ抗体（標識免
疫体）を得た。

【００４６】〔固定部の作製〕抗ヒトＨＢｓ抗体（ウサ
ギＩｇＧ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に
て希釈し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液を調製した。
この水溶液をニトロセルロースメンブランフィルター
（東洋濾紙、５×１００ｍｍ）の一端から２ｃｍ部位に
１０μｌ塗布した後、直ちに３７℃で１時間静置した
後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出
し、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０の水溶液に１時間浸漬させた。

【００４７】その後、ニトロセルロースメンブランフィ
ルターを取り出し、室温で３時間風乾静置し、ニトロセ
ルロースメンブランフィルターの一端に不織布（５ｍｍ
×１０ｍｍ）の滴下部を有し、抗ヒトＨＢｓ抗体を固定
化した固定部を有するニトロセルロースメンブランフィ
ルター（免疫学的検査片）を得た。

【００４８】〔ヒトＨＢｓの検出〕ヒトＨＢｓ抗原を生
理食塩水溶液に溶解させた被検試料、標識免疫体および
アビジン混合溶液（固形分濃度０．２重量％）を混合
し、この液１００μｌを、前記免疫学的検査片の一端
（滴下部）から滴下して展開し、２０分後の固定部の発
色を観察した。結果を表１に示す。

【００４９】実施例２実施例１と同様にして、スダンブルー染色粒子標識ビオ
シチン−抗ヒトＨＢｓ抗体（標識免疫体）を得た。

【００５０】〔固定部とアビジン相の作製〕抗ヒトＨＢ
ｓ抗体（ウサギＩｇＧ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）にて希釈し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液
を調製した。この水溶液に、ニトロセルロースメンブラ
ンフィルター（東洋濾紙、５×１００ｍｍ）の一端から
２ｃｍ部位に１０μｌ塗布した後、直ちに３７℃で１時
間静置した後、ニトロセルロースメンブランフィルター
を取り出し、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ２０の水溶液に１時間浸漬した。

【００５１】その後、ニトロセルロースメンブランフィ
ルターを取り出し、室温で３時間静置し、ニトロセルロ
ースメンブランフィルターの一端に不織布（５ｍｍ×１
０ｍｍ）の滴下部を有し、抗ヒトＨＢｓ抗体が固定化さ
れた固定部を有するニトロセルロースメンブランフィル
ター（免疫学的検査片）を得た。その後、０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したアビジン（１ｍｇ／
ｍｌ）を、前記免疫学的検査片の固定部と滴下部の間に
１０μｌ塗布した後、直ちに３７℃で１時間静置し、ア
ビジン相を有する免疫学的検査片を得た。

【００５２】〔ヒトＨＢｓの検出〕前記免疫学的検査片
のアビジン相側の一端から、ヒトＨＢｓ抗原を生理食塩
水溶液に溶解させた被検試料と標識免疫体（固形分濃度
０．２重量％）の混合液１００μｌを滴下部に滴下して
展開し、２０分後の固定部の発色を観察した。

【００５３】結果を表１に示す。なお、表１における判
定基準は以下の通りである。＋：強い発色 ±：弱い発色 −：発色なし

【００５４】

【表１】

【００５５】表１より、本発明の免疫学的方法によるヒ
トＨＢｓ抗原の検出感度は、約０．２５ｎｇ／ｍｌであ
った。

【００５６】比較例実施例１と同様にして抗ヒトＨＢｓ抗体を固定化したニ
トロセルロースメンブランフィルター、スダンブルー染
色粒子標識抗ヒトＨＢｓ抗体（標識免疫体）を得た。

【００５７】前記ニトロセルロースメンブランフィルタ
ーからなる試験片の一端から、ヒトＨＢｓ抗原を生理食
塩水溶液に溶解させた被検試料と標識免疫体（固形分濃
度０．２重量％）の混合液１００μｌを滴下させ、２０
分後の固定部の発色を観察した。

【００５８】結果を表２に示す。なお、表２における判
定基準は以下の通りである。＋：強い発色 ±：弱い発色 −：発色なし

【００５９】

【表２】

【００６０】表２より、比較例の方法によるヒトＨＢｓ
抗原の検出感度は、約１０ｎｇ／ｍｌであった。本発明
の免疫学的方法は、従来法に比較して約４０倍感度が上
昇することがわかる。

【００６１】

【発明の効果】本発明により、迅速かつ簡便で、高感度
な免疫学的測定方法およびそれに用いられるキットを提
供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の免疫学的測定方法の１つの態
様を示す模式図である。

【図２】図２は、本発明の免疫学的測定方法の別の態様
を示す模式図である。

【符号の説明】１吸水性基材２第一免疫体３固定部４標識免疫体５標識体６第二免疫体７ビオチン８アビジン９被検物質１０複合体１１滴下部

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検物質と結合しうる第一免疫体を吸水
性基材上に固定化した固定部で、該第一免疫体および、
該被検物質と結合しうる第二免疫体を標識体に結合して
なる標識免疫体により該被検物質を挟み込むサンドイッ
チ型免疫学的測定方法において、前記標識体にさらにビ
オチンが結合しており、該ビオチンと結合するアビジン
を介して複合体を形成し、該複合体中の標識体により被
検物質を検出することを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項２】アビジンが、吸水性基材の一端と固定部
との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状
態で保持されている、請求項１記載の免疫学的測定方
法。
【請求項３】被検物質と結合しうる第一免疫体を吸水
性基材上に固定化した固定部を有する免疫学的検査片、
該被検物質と結合しうる第二免疫体およびビオチンを標
識体に結合してなる標識免疫体ならびにアビジンを含有
してなる免疫学的測定キット。
【請求項４】アビジンが、免疫学的検査片の吸水性基
材の一端と固定部との間の任意の領域に水との接触によ
って脱離しうる状態で保持されている、請求項３記載の
免疫学的測定キット。