JP2000209980A

JP2000209980A - インタ―ロイキン―１関連疾患モデルノックアウト動物

Info

Publication number: JP2000209980A
Application number: JP11130789A
Authority: JP
Inventors: Yoichiro Iwakura; 洋一郎岩倉; Reiko Horai; 玲子宝来; Masahide Asano; 雅秀浅野
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2000-08-02

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】正常生理および病理におけるIL-1ファミリー
のそれぞれの構成分子の機能を明らかにするための疾患
モデル動物として有用であるIL-1関連遺伝子欠損（KO）
マウスを、相同組換えを用いた遺伝子ターゲティング法
により提供する。【解決手段】ゲノム中のインターロイキン１受容体ア
ンタゴニスト（IL-1ra）遺伝子のDNA領域の一部または
全部を改変することにより、IL-1ra遺伝子を機能不能に
したマウス。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
１（IL-1）関連遺伝子を欠損した疾患モデル動物に関す
る。詳しくは、IL-1ファミリーを形成するIL-1α遺伝
子、IL-1β遺伝子およびIL-1受容体アンタゴニスト（IL
-1ra）遺伝子のうち、少なくとも一つのゲノム配列を一
部欠失等により変更させ外来性の配列に置換することに
より、当該遺伝子が機能しないようにした、疾患モデル
動物に関する。さらに、これらの遺伝子うちIL-1α遺伝
子とIL-1β遺伝子について同時に欠損した疾患モデル動
物にも関する。

【０００２】

【従来の技術】IL-1の機能サイトカインは、生理学的作用および病理学的作用を調
節する細胞間シグナル伝達分子であり、免疫系、神経系
そして内分泌系における細胞を含む様々な細胞に対して
効果を発揮し、そして恒常性の維持に重要な働きをす
る。

【０００３】IL-1は、炎症や宿主防御応答だけでなく神
経-免疫-内分泌系においても重要な機能を果たすサイト
カインである（総説として、Dinarello, 1996, Blood 8
7,2095-2147; Durum and Oppenheim, 1993, Proinflamm
atory cytokines and immunity, in Fundamental Immun
ology, 3rd ed. (W.E. Paul ed.), Raven Press,Ltd.,
New York; Tocci and Schmidt, 1997, Interleukin-1:
Structure and function, in Cytokines in health and
disease, 2nd ed. (D.G. Remick and J.S.Friedland e
ds), Marcel Dekker Inc., 1-27を参照）。IL-1は、も
ともと内在性の発熱物質、リンパ球活性化因子、ヘモポ
エチン-1、および破骨細胞活性化因子として同定された
ことからもわかる様に、多様な生理活性を有する（Dina
rello, 1996,上述）。IL-1はIL-1αおよびIL-1βの2種
類の分子種からなり、それらはマウスゲノムの第2染色
体上で50 kb離れたところに位置する別個の遺伝子に由
来する（D'Eustachio et al., 1987, Immunogenetics 2
6, 339-343; Silver etal., 1990, Somatic Cell Mol.
Genet. 16, 549-556）。IL-1α分子とIL-1β分子とのア
ミノ酸配列相同性は25％しかないが（Dinarello, 1996,
上述）、I型IL-1受容体（IL-1RI）を介して、完全には
オーバーラップしていないものの同様の生物学的活性を
発揮する（Sims et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 90, 6155-6159）。さらに、IL-1遺伝子ファミリ
ーのもう一つの構成分子であるIL-1受容体アンタゴニス
ト（IL-1ra）は、アゴニストとしての活性を発揮するこ
となくIL-1受容体に結合する（Carter et al., 1990, N
ature, 344, 633-638; Hannum et al., 1990, Nature 3
43, 336-340）。一方、もう一つの受容体であるII型IL-
1受容体（IL-1RII）も存在するが、この受容体はシグナ
ル伝達には関与していないと考えられており、むしろデ
コイとして調節的な役割をしている（Colotta et al.,
1993, Science 261, 472-475）。IL-1ファミリーの構成
分子の活性は、転写レベル、翻訳レベルおよび翻訳後レ
ベルで調節されており、シグナル伝達分子の複雑なネッ
トワークに関与している（Dinarello, 1996,上述）。し
かしながら、IL-1シグナル伝達の分子機構は、未だに完
全には解明されていない。

【０００４】IL-1の生理的・病理的機能は、炎症、急性
期反応、細菌感染やウィルス感染に対する宿主応答、胸
腺細胞成熟やTh2細胞増殖を含む免疫系の活性化、破骨
細胞活性化やメタロプロテアーゼの分泌を含む骨代謝、
発熱、そして視床下部-脳下垂体-副腎（HPA）軸におい
て示唆された（Dinarello, 1996,上述; Durum andOppen
heim, 1993,上述）。特にこれらの諸機能が中枢神経系
からの恒常性維持と免疫系調節において重要であるた
め、神経-免疫-内分泌系におけるIL-1の機能が注目され
ている。

【０００５】これまで、IL-1による生理的・病理的機能
を解明するための研究が多岐にわたって行われてきた。
すなわち、脳内におけるIL-1の機能、炎症、組織損傷ま
たは感染が血清中のグルココルチコイド濃度に対してIL
-1の与える影響、細菌感染に対する感染防御におけるIL
-1の関与、あるいは自己抗体産生を伴うリウマチ性関節
炎に対するIL-1の与える影響を解明する努力が行われて
きた。

【０００６】IL-1αおよびIL-1βの両方ともが発熱を誘
導することができ、そしてIL-1βに対する中和抗体の投
与により細菌由来LPS誘導発熱を阻害することが知られ
ている（Kluger, 1991, Physiol. Rev. 71, 93-127; Lo
ng et al., 1990, Am. J.Physiol. 259, R724-R728）。
最近、IL-1β遺伝子を欠損したマウス（IL-1βのKOマウ
ス）が作出され、これらを用いてLPS誘導発熱が調べら
れている。これらの実験の結果、IL-1β遺伝子の欠損に
よって、LPSに対する発熱応答が低下する場合（Kozak e
t al., 1995, Am. J. Physiol. 269, R969-R977）と、
過剰反応する場合（Alheim et al., 1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 2681-2686）とがあることが報告
された。現時点ではこのような矛盾した結果が生じた理
由については、完全には明らかにされていない。さらに
テレピン油誘導性発熱についても、IL-1βのKOマウス
（Zheng et al., 1995, Immunity 3, 9-19）およびIL-1
RI遺伝子欠損マウス（IL-1RIのKOマウス）（Leon et a
l., 1996, Am. J. Physiol.259, R724-R728）を用いて
調べられた。これらの研究から、内在性のIL-1βは局所
炎症後の発熱応答を調節する際に重要な機能を果たして
いることが示唆されている。しかしながら、炎症時には
IL-1αおよびIL-1βの両方が産生され、両方のIL-1種と
もが発熱応答を誘導するため、IL-1βの欠損が発熱を抑
制するために十分であるとする理由についてははっきり
とは示されていない。

【０００７】IL-1、IL-6およびTNF-αなどの炎症性サイ
トカインは、視床下部を刺激してコルチコトロピン（co
rticotropin、副腎皮質刺激ホルモン）放出ホルモン（C
RH）を放出させ、次いでCRHが下垂体からのコルチコト
ロピン（adrenocorticotropic hormone、副腎皮質刺激
ホルモン; ACTH）の分泌および副腎皮質からのコルチコ
ステロン分泌を誘導する。炎症、組織損傷または感染に
より血中グルココルチコイド濃度も影響を受けることが
示されたが（Chrousos, 1995, New Eng. J. Med. 332,
1351-1362）、炎症性サイトカインが、HPA軸を介してこ
の活性化に関与していることが示唆されている（Dunn,
1992, Brain Res. Bull. 29, 807-812;Perlstein et a
l., 1993, Endocrinology 132, 946-952）。動物におい
て全身性および局所性の炎症を引き起こすLPSおよびテ
レピン油は、それぞれHPA軸の活性化を介したコルチコ
ステロンの分泌を促進する（River et al., 1989, Endo
crinology 125, 2800-2805; Turnbull and Rivier, 199
6, Endocrinology 137, 455-463）。IL-1はこのような
ストレス下においてHPA軸を調節するための主要なメデ
ィエーターであることが考えられたが（Dunn, 1992, 上
述; Ebisui et al., 1994, Am. J. Physiol. 266, E986
-E992）。しかし最近の研究では、LPS（Fantuzziet a
l., 1996, J. Immunol. 157, 291-296）又はテレピン油
（Fantuzzi and Dinarello, 1996, J. Leukoc. Biol. 5
9, 489-493）処理を行った場合にIL-1βの欠損がコルチ
コステロンの誘導に与える影響を示すことができないこ
とがわかった。これらの結果からは、二つの可能性が示
唆される。一つは、IL-1がHPA軸の活性化に関与してい
ないとする可能性、またはもう一つは、IL-1αがIL-1β
の欠損を補っているという可能性である。細菌感染防御リステリア菌（L. monocytogenes）の感染により、宿主
中のIFN-γ、IFN-α、TNF-α、IL-1およびIL-6を含むサ
イトカインの誘導が引き起こされることが知られている
（Nakane et al., 1990, Infect. Immun. 58, 2386-138
8; Nakane etal., 1992, Infect. Immun. 60, 523-528;
Rogers et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 8
9, 1011-1015）。これらのサイトカインはこの細菌に対
する宿主防御のために機能していると考えられている。
例えば、遺伝子ターゲティングによりIFN-γ受容体また
はTNF受容体p55のいずれかを欠損するマウスは、野生型
マウスにとっては致死量以下のL. monocytogenes感染さ
せた場合にも致死となる（Huang et al., 1993, Scienc
e 259, 1742-1745; Pfeffer et al., 1993, Cell 73, 4
57-467; Rothe et al., 1993, Nature 364, 798-80
2）。IL-6欠損マウスもまた、L. monocytogenes感染に
対して感受性が高い（Dalrymple et al., 1995, Infec
t. Immun. 63, 2262-2268; Kopf et al., 1994, Nature
368, 339-342）。またIL-1α、IL-1βおよびIL-1RIに
対するそれぞれのモノクローナル抗体を同時に投与し
て、in vivoにおいてIL-1活性を中和すると、L. monocy
togenesに対する抵抗性が低下した（Rogers et al., 19
94, J. Immunol. 153, 2093-2101）。一方、IL-1を投与
すると、L. monocytogenesに対する抵抗性が増加した
（Czuprynski et al., 1988, J. Leukoc. Biol. 35, 19
3-197）。しかしながら、現在までのところ、細菌増殖
に対するこれらのサイトカインの効果およびこれらのサ
イトカインが最近増殖に対して関与する機構は完全には
解明されていない。IL-1と疾患 IL-1、IL-2、IL-6、TNF-αおよびIFN-γを含む様々なサ
イトカインがリウマチ性関節炎（RA）を患っている患者
の関節において過剰発現していることが知られている
（Feldmann et al., 1996, Annu. Rev. Immunol. 14, 3
97-440; Firestein et al., 1990, J. Immunol. 144, 3
347-3353）。RAは、全身性の慢性炎症性疾患であり、そ
の病態（病変）は主として関節にみられる。環境因子、
細菌そしてウィルスなどの様々な外因性物質がヒトにお
けるRAの原因と示唆されている。患者はしばしば、Ig
G、II型コラーゲン（IIC）および熱ショックタンパク質
（HSP）を含む様々な自己成分に対して自己抗体および
細胞性免疫を生じる。IgGのFc部分に対する自己抗体
（リウマチ因子；RF）は、滑液腔および周囲の血管中に
免疫複合体を形成する。この複合体はおそらく、滑液腔
組織および周囲の血管の表層の細胞から炎症性サイトカ
インの放出を刺激し、放出された炎症性サイトカインに
よりこれらの組織に炎症が誘導される。これらのサイト
カインが滑膜細胞の増殖を促進し、そして免疫系を活性
化することから、これらのサイトカインがリウマチ性関
節炎などの疾患の発症に重要な機能を果たしていると考
えられている。

【０００８】以前本発明者らは、HTLV-I env-pX領域を
その遺伝子自体のLTRの調節下において保持するトラン
スジェニックマウスが慢性炎症性多発関節症を高い頻度
で発症することを報告した（Iwakura et al., 1991, Sc
ience 253, 1026-1028）。関節の組織病理はヒトにおけ
るリウマチ性関節炎の組織病理と非常によく似ており、
そしてこのトランスジェニック動物は自己免疫状態にな
っていることが示された（Iwakura et al., 1995, J. I
mmunol. 155, 1588-1598; Yamamoto et al., 1993, Art
hritis Rheum. 36, 1612-1620）。興味深いことに、炎
症を起こしている関節において、IL-1α、IL-1β、IL-
6、TNF-αそしてIFN-γを含む炎症性サイトカイン遺伝
子の発現が亢進していた（Iwakura et al., 1995, 上
述）。IIC誘導関節炎などのRAの別のモデルでも、IL-1
が関与していることが観察された（Kasama et al., 199
0, Immunol. Lett. 26, 171-175; Marinova-Mutafchiev
a et al., 1997, Clin. Exp. Immunol. 107, 507-51
2）。さらに、正常ウサギ関節内へIL-1を投与すること
により、重度の関節炎を引き起こすことができることも
報告されている（Pettipher et al., 1986, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 83, 8749-8753）。また、β-アクチ
ンプロモーターの調節下でヒトIL-1α遺伝子を発現する
トランスジェニックマウスにおいて、炎症性関節炎が発
症することが示された。一方、患部関節中への抗IL-1抗
体またはIL-1raを投与することにより、疾患が改善され
ることも示されている（Joosten et al., 1996, Arthri
tis Rheum. 39,797-809; Makarov et al., 1996, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93, 402-406;Van den Berg et
al., 1994, Clin. Exp. Immunol. 95, 237-243）。これ
らの知見から、IL-1がRAの病因において重要な機能を果
たしていることが示唆される。しかしながら、サイトカ
インの過剰産生が生じる原因が、単に炎症反応の結果と
して増加しているためだけなのか、あるいは疾患の発症
において引き金となる機能を果たしているためなのかに
ついては、未だに解明されていない。

【０００９】このように、IL-1を含むサイトカイン類
は、体内で様々な生理的あるいは病理的機能を果たすこ
とが示唆されている。しかしながら、IL-1ファミリーが
他のサイトカイン（特に腫瘍壊死因子（TNF）-αおよび
IL-6）との間で相補性あるいは重複性を有するために、
上述した様々な生理および病理において、IL-1ファミリ
ーのそれぞれの構成分子が果たす正確な機能および重要
性は未だにはっきりとは明らかにされていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】特定の遺伝子の機能を
解析するための実験遺伝学的手段として、受精卵へのDN
A注入によるトランスジェニック動物の作製が知られて
いる。トランスジェニック技術は、適当な調節因子と結
合した遺伝子（DNA）を受精卵に注入し、その遺伝子を
染色体中に組み込み、そして発現させることができると
いう特徴を有する。しかしこの方法には、いくつかの問
題点が存在する。すなわち、（１）目的とする遺伝子の
過剰発現による効果しか調べられない、（２）目的とす
る遺伝子が染色体中にランダムに組み込まれるため、組
み込み部位の影響を予測することが難しく、発現の形態
は各々のトランスジェニックマウスにより異なる、
（３）トランスジーン（導入遺伝子）の発現のために使
用することができるプロモーターやエンハンサーが限ら
れている、などの問題点が存在する。

【００１１】そこで本発明は、正常生理および病理にお
けるIL-1ファミリーのそれぞれの構成分子の機能を明ら
かにするために、トランスジェニック技術とは別のアプ
ローチとして、相同組換えを用いた遺伝子ターゲティン
グ法により作製したIL-1関連遺伝子欠損（KO）マウスを
提供する。これらのKOマウスには、IL-1αのKOマウス、
IL-1βのKOマウス、IL-1α/βのKOマウスそしてIL-1ra
のKOマウスが含まれる。KOマウスは、IL-1関連遺伝子を
過剰発現させるのではなく、むしろその機能をなくする
ことによりそれらの遺伝子が生体内で果たしている機能
を解明することができる。

【００１２】従って、本発明の一態様において、これら
のKOマウスを用いることで、IL-1系の機能を解明し、in
vivoにおけるIL-1αおよびIL-1βの機能を調べるだけ
でなく、IL-1シグナル伝達を調節するためのIL-1raの重
要性を調べることができる。すなわち、IL-1α遺伝子、
IL-1β遺伝子、IL-1ra遺伝子のいずれか一つが欠損した
動物、あるいは、これらのうち２または全部を組み合わ
せて欠損した動物を用いて、正常の生理およびストレス
応答に対する効果を調べることができる。これにより、
IL-1関連遺伝子ファミリーのそれぞれの構成分子が、発
熱応答および神経-免疫-内分泌応答において果たしてい
る機能について明らかにすることができる。さらに、IL
-1遺伝子発現の相互誘導（IL-1α、IL-1βおよびIL-1ra
の相互誘導）についても検討する。

【００１３】さらに本発明の一態様において、これらの
マウスを用いてテレピン油による局所炎症ストレスに対
する発熱やグルココルチコイド合成などの宿主応答、お
よびLPSまたは細菌の刺激に対する敗血性ショックに対
する宿主応答について調べ、そして神経-免疫-内分泌系
におけるIL-1の機能を検討する。さらに、IL-1のKOマウ
スおよびIL-1raのKOマウスを用いて細菌感染に対する宿
主応答についても調べ、細菌を排除する際のIL-1の重要
性を検討する。

【００１４】さらに本発明の一態様において、IL-1raの
KOマウスが異常な免疫応答を示すことから、IL-1raのKO
マウスを使用して自己免疫疾患の発症におけるIL-1の病
理学的機能について検討することができる。これによ
り、免疫系におけるIL-1の機能について調べ、自己免疫
および関節炎の発症におけるIL-1およびIL-1raの機能を
検討する。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明のKO動物は、都合
よくは遺伝子ターゲティング法により作製することがで
きる。遺伝子ターゲティング法は、目的とするIL-1関連
遺伝子のゲノムDNAの一部を別個の遺伝子DNAにより置換
し、ゲノム上のその遺伝子本来の機能を失わせることを
目的とする方法である。そのため、遺伝子ターゲティン
グを行うためには、まず、機能を欠損させようとする目
的のIL-1関連遺伝子についてゲノムDNAを単離すること
が必要である。IL-1関連遺伝子ゲノムの単離ゲノムDNAは、胚性幹細胞（ES細胞）の相同組換えを行
うための、ターゲティングベクターを構築するために使
用する。従って、ゲノムDNAは、相同組換えを行うとき
により効率よく組換えが生じるよう、作製しようとする
ES細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離、使用
することが望ましい。より望ましくは、相同組換えの効
率をさらに上げるために、ES細胞が由来する同一種の動
物のうち同じ系統の動物から、ゲノムDNAを単離して使
用する。同種であっても系統が異なるとゲノム中にDNA
の配列変異が散在し、それらの変異が相同組換えの確率
を下げる可能性があるからである。

【００１６】マウスIL-1関連遺伝子のゲノムクローンを
採取する場合には、マウス由来のcDNAプローブまたはゲ
ノムDNAプローブを使用して、マウスゲノムライブラリ
ーからスクリーニングすることができる。cDNAプローブ
を使用する場合は、目的とするIL-1関連遺伝子について
のcDNAの全長を使用しても、その一部を使用してもよ
い。

【００１７】プローブに結合したIL-1関連遺伝子ゲノム
DNAを制限酵素で切り出し、市販のクローニング用ベク
ター中に挿入する。クローニング用ベクターとしては、
市販されているpBluescript、pBR322、pUCなどのいずれ
のプラスミドを用いてもよい。このようにして単離され
たゲノムクローンを部分配列決定することにより、単離
されたゲノムクローンが目的とするIL-1関連遺伝子につ
いてのゲノムクローンであることを確認することができ
る。ターゲティングベクターの構築ターゲティングベクターは、改変して機能不能にしたIL
-1関連遺伝子により、ES細胞中のIL-1関連遺伝子ゲノム
DNAを相同組換えするために使用するものである。従っ
て、本発明におけるIL-1関連遺伝子のターゲティングベ
クターは、一部を改変することにより機能不能にしたIL
-1関連遺伝子ゲノムDNAを含むことを必要とする。IL-1
関連遺伝子のゲノムDNAを挿入したプラスミドは、in vi
troにおいて当該IL-1関連遺伝子ゲノムDNA配列を改変す
ることにより、ゲノムDNAの切り出し・ライゲーション
などの工程を行うことなくターゲティングベクターとす
ることができる。

【００１８】本発明において「IL-1関連遺伝子ゲノムDN
Aの一部を改変する」とは、IL-1関連遺伝子ゲノムDNAの
一部に変更、削除、挿入または置換を生じさせることを
いう。IL-1関連遺伝子を機能不能にするためには、IL-1
関連遺伝子に対して、変更、削除、挿入または置換のう
ち２またはそれ以上の方法を同時に使用してもよい。ま
た、改変を生じさせるIL-1関連遺伝子は、１つの遺伝子
のみに限られず、２以上の遺伝子について同時に改変を
生じさせてもよい。

【００１９】本発明において、ゲノムDNAの「変更」と
は、IL-1関連遺伝子のゲノムDNA配列中に1またはそれ以
上の塩基置換を導入し、当該変更したIL-1関連遺伝子の
発現産物がIL-1関連分子として機能しないようにするこ
とをいう。本発明においてゲノムDNAの「削除」とは、I
L-1関連遺伝子のゲノムの一部または全部を欠失させる
ことにより、IL-1関連遺伝子の発現産物がIL-1関連分子
として機能しないかまたは存在しないようにすることを
いう。本発明において、ゲノムDNAに対して「挿入」と
は、IL-1関連遺伝子中に、IL-1関連遺伝子以外の配列を
有するDNAを挿入することにより、当該IL-1関連遺伝子
以外のDNAを挿入したIL-1関連遺伝子の発現産物がIL-1
関連分子として機能しないようにすることをいう。本発
明において、ゲノムDNAの「置換」とは、IL-1関連遺伝
子のゲノムの一部または全部をIL-1関連遺伝子とは関連
しない別個の配列により置換し、IL-1遺伝子の発現産物
がIL-1関連分子として機能しないかまたは存在しないよ
うにすることをいう。

【００２０】ターゲティングベクターの構築についてデ
ザインする場合、後の工程において行わなければならな
い相同組換え体のスクリーニングを、より容易に行うこ
とができるように考慮することが望ましい。たとえば、
相同組換え体のスクリーニングは、（１）ターゲティン
グベクターにより組換え体内に導入した薬剤耐性遺伝子
を用いて、培養中で行う細胞レベルの第一段階のスクリ
ーニング、そして（２）第一段階のスクリーニングによ
り選択された組換え体について、さらにPCR法、サザン
ブロットハイブリダイゼーション法などを行うことから
なるDNAレベルの第二段階のスクリーニングの２工程に
より行うことが好ましい。従って、この２工程のスクリ
ーニングをより容易に行うことができるようにターゲテ
ィングベクターをデザインすることが好ましい。

【００２１】本発明においては、IL-1関連遺伝子のゲノ
ムDNA配列を、IL-1関連遺伝子とは関連しないDNA配列、
たとえば選択マーカー遺伝子DNA配列などと置換する方
法により、ターゲティングベクターを作製する。これ
は、ターゲティングベクター中のDNAによって相同組換
えされた相同組換え体を、選択マーカーなどを用いるこ
とで、より容易にスクリーニングすることができるよう
にするためである。より具体的には、単離されたIL-1関
連遺伝子のゲノムDNAの一部を制限酵素処理により削除
し、削除されたDNA領域の代わりにプロモーターを連結
した選択マーカー遺伝子を挿入することにより、IL-1関
連遺伝子のターゲティングベクターを作製する。

【００２２】ES細胞中で強い発現活性を有するプロモー
ターとしてはホスホグリセリン酸キナーゼ-1（PGK-1）
プロモーター、伸長因子2（EF-2）プロモーター、MC-1
プロモーターなどを使用することができる。ターゲティ
ングを行う遺伝子座、およびそのDNA領域により、プロ
モーター活性は大きく影響されるため、一般にはプロモ
ーターは強力であるほどよい。従ってより望ましくは、
PGK-1プロモータを使用する。

【００２３】選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシ
ン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子、ネガティブ選択用にはチミジンキナーゼ
遺伝子、ジフテリア毒素A遺伝子断片、lacZ遺伝子など
を目的に応じて使用することができる。

【００２４】プロモーターと連結した選択マーカー遺伝
子は、たとえばネオマイシン耐性遺伝子カセット（neo
カセット、pKJ2として供与）、ハイグロマイシンBホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子カセット（hphカセッ
ト）、チミジンキナーゼ遺伝子カセット（tkカセット、
pMCtkとして供与）、ジフテリア毒素A遺伝子断片カセッ
ト（DT-Aカセット、pMCDT-AまたはpMC1DT-Aとして供
与）、lacZ遺伝子カセット（pBSlacZとして供与）など
の、プラスミドに挿入された状態で市販されている選択
マーカー遺伝子を使用してもよい。ターゲティングベク
ターは、これらのプロモーターを連結した選択マーカー
のうち、どの選択マーカーを使用して構築してもよい。ターゲティングベクターによる相同組換え次いで、上記の方法により作製したターゲティングベク
ターを使用して、相同組換えを行う。本発明において
「IL-1関連遺伝子の相同組換え」とは、IL-1関連遺伝子
と同一または類似の塩基配列を有する改変したIL-1関連
遺伝子を、IL-1関連遺伝子ゲノム上に、人工的に組み換
えさせることをいう。

【００２５】目的とする遺伝子の相同組換えが起こる頻
度は10^-6程度であることが知られている。したがって目
的とする相同組換え体を得るためには、理論上10⁶以上
の細胞に組換え操作を行う必要があり、少なくとも数十
〜数百検体の組換え体をスクリーニングする必要があ
る。しかしながら、10⁶個の受精卵を使用することは事
実上不可能であることから、受精卵に変わるものとし
て、受精卵と同様の多分化能を有し、かつin vitroで培
養することが可能な細胞を使用することが必要である。
このような目的を達成することができる方法として、胚
性幹細胞（ES細胞）を用いる方法、クローン動物作成技
術を用いた方法などを使用することができるが、これだ
けに限定されるものではない。

【００２６】現在確立されている遺伝子ターゲティング
法では、ES細胞を使用することが望ましい。現時点にお
いてES細胞はマウス由来のものしか作製されていない
が、将来多種の動物でマウスES細胞と同様な細胞が樹立
されれば、同様な方法を用いて遺伝子欠損動物を作製す
ることができる。

【００２７】現在使用することができるマウス由来のES
細胞は、TT2細胞、AB-1細胞、J1細胞、R1細胞、E14.1細
胞などがある。ターゲティング動物を作出するために、
これらのうちいずれのES細胞を用いるかは、採取したゲ
ノムDNAの由来するマウス系統、キメラ動物の選別方法
など、実験の目的や方法により任意に決定することがで
きる。

【００２８】IL-1関連遺伝子を機能不能な配列にしたタ
ーゲティングベクターをES細胞中に導入する。そしてES
細胞中の目的とするIL-1関連遺伝子のゲノムDNA配列
を、ターゲティングベクター中の機能不能にしたIL-1関
連遺伝子DNA配列による相同組換えによって置換する。
相同組換えは、IL-1関連遺伝子ゲノムDNA配列と、ター
ゲティングベクター中の非改変部分の配列との相同性を
利用して、確率的に生じさせることができる。

【００２９】ターゲティングベクターをES細胞に導入す
る方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カ
ルシウム法、DEAE-デキストラン法などを使用すること
ができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレク
トロポレーション法を用いることが好ましい。相同組換え体のスクリーニング得られた組換えES細胞を、マイトマイシンC-処理したNH
L7細胞あるいはネオマイシン耐性の初代培養細胞からな
るフィーダーレイヤー上にプレーティングする。そして
ES培養液中で、相同組換えによってES細胞に導入された
選択マーカーを用いて、第一段階のスクリーニングであ
る選択培養を行う。当該第一段階の選択工程において
は、前述した選択マーカーのうち、複数の選択マーカー
遺伝子を用いることもできる。ES細胞を培養するための
培養液は毎日交換するとよい。培養液中には、選択マー
カー遺伝子の種類に依存して、たとえばネオマイシン
（G418, GIBCO BRL）やハイグロマイシンB（Calbioche
m）が含まれている。選択培養6-8日目に生存するコロニ
ーを耐性クローンとして採取する。

【００３０】耐性クローンをピックアップし、増殖させ
る。その後、目的とするIL-1関連遺伝子がターゲティン
グされているかどうかを確実に調べるため、第二段階の
スクリーニングを行うことができる。第二段階のスクリ
ーニングは、DNAレベルで目的とするIL-1関連遺伝子が
ターゲティングされたかどうかを確認する工程である。
このような方法としては、PCR法、サザンブロットハイ
ブリダイゼーション法などが存在するが、そのうちのい
ずれを用いてもよく、またその中から2以上の方法を組
み合わせて用いてもよい。

【００３１】本発明においては、まず、第一段階のスク
リーニングにより選択されたES細胞クローンのプールの
それぞれからゲノムDNAを調製し、このゲノムDNAを鋳型
としてPCR法を行うことで、ES細胞について第二段階の
スクリーニングをする。このPCR法を用いたスクリーニ
ングにより組換えが起こったクローンを単離する。

【００３２】PCRプライマーは、ターゲティングにより
目的とするゲノムDNA領域を外来性の遺伝子により置換
することができたか否かをより効率的に確認できるよう
に設計することが望ましい。そのためにはターゲティン
グベクターの配列のうち目的とする遺伝子の外側のゲノ
ムDNA領域上と、選択マーカー遺伝子カセット領域上と
に設定し、挿入部位を増幅することができるように設計
するとよい。

【００３３】第二段階のスクリーニングにおいて、ES細
胞が相同組換え体であることを確認するため、ES細胞ク
ローンに対してサザンブロットハイブリダイゼーション
法による解析を行うことことができる。サザンブロット
ハイブリダイゼーション解析は、ターゲティングベクタ
ーに含まれないゲノム領域を認識するプローブとターゲ
ティングベクター中に存在する領域を認識するプローブ
を併用して行うことが望ましい。二種類のプローブを用
いることにより相同組換えのほかに非相同組換えが存在
するか否かを知ることができ、目的とするゲノム領域に
相同組換えが起こったことをより正確に確認することが
できるからである。

【００３４】これらのプローブをどのように設計するか
は、ターゲティングベクターを構築する際にどの選択マ
ーカーを使用するかにより、個々具体的に異なる。本発
明のIL-1関連遺伝子についてのサザンブロットハイブリ
ダイゼーション解析においては、プローブとして、ゲノ
ムクローンを適宜制限酵素処理することにより得られる
ゲノムDNA断片と、選択マーカーとして使用する薬剤耐
性遺伝子に対するプローブとを使用することが望まし
い。このようにサザンブロットハイブリダイゼーション
の条件は、当業者が適宜改変を加えることができ、必要
に応じてサザンブロットハイブリダイゼーション解析に
用いるプローブ数を増やして、さらに確実に相同組換え
体を選択することもできる。KO動物の作出次いで、相同組換えの結果得られた組換えES細胞を、8
細胞期または胚盤胞の胚内に移植する。このES細胞移植
胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによ
りキメラ動物を作製することができる。KO動物は、現在
はマウスについてのみ作出することができる。しかし将
来的に種々の動物について受精卵または胚の遺伝子組換
え技術が使用できる用になった場合には、それぞれの動
物についても作出することができる。

【００３５】ES細胞を胚内に移植する方法としては、た
とえばマイクロマニピュレーション法、凝集法などが知
られているがいずれを用いてもよい。また移植する方法
は当業者が適宜改変することができる。マウスの場合、
まず、ホルモン剤（たとえば、FSH様作用を有するPMSG
およびLH作用を有するhCGを使用）により過排卵処理を
施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、8
細胞期胚を用いる場合には受精から2.5日目に、胚盤胞
を用いる場合には受精から3.5日目に、それぞれ子宮か
ら初期発生胚を回収する。このように回収した胚に対し
て、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行っ
たES細胞をin vitroにおいて注入し、キメラ胚を作製す
る。

【００３６】一方、仮親にするための偽妊娠雌マウス
は、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢
した雄マウスと交配することにより得ることができる。
作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作成
したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることに
よりキメラ動物を作製することができる。キメラ胚の着
床、妊娠がより確実に起こるようにするために、受精卵
を採取する雌マウスと仮親になる偽妊娠マウスとを、同
一の性周期にある雌マウス群から作出することが望まし
い。

【００３７】このようなキメラマウスの中から、ES細胞
移植胚由来の雄マウスを選択する。選択したES細胞移植
胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウス
を純系マウス系統のメスマウスと交配させ、そして次世
代産仔にES細胞由来の被毛色が現れることにより、ES細
胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認す
ることができる。ES細胞が生殖系列へ導入されたことを
確認するためには、様々な形質を指標として用いること
ができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色により行
うことが望ましい。マウスにおいては、野ネズミ色（ag
outi）、黒色（black）、黄土色（cinnamon）、チョコ
レート色（chocolate）、および白色（アルビノ、albin
o）の被毛色が知られているが、使用するES細胞の由来
系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統
を適宜選択することができる。例えば本発明において
は、野ネズミ色（agouti）系統（129マウス）由来のES
細胞を使用して作出したオスのキメラマウスを、黒色で
あるC57BL/6メスマウスと交配させる。そして次世代産
仔の被毛色が野ネズミ色（agouti）であることにより、
ES細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確
認することができる。このように、胚内に移植された組
換えES細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、その
キメラ動物を繁殖することにより目的とする遺伝子を欠
損する個体を得ることができる。得られたIL-1関連遺伝
子欠損ヘテロ接合体マウスどうしを交配させることによ
り、目的とする遺伝子欠損ホモ接合体マウスを得ること
ができる。

【００３８】一般に実験動物を用いて研究するために
は、系統として確立された動物、すなわち遺伝的にホモ
の状態の動物を用いることが望ましい。このような動物
では、遺伝的背景が詳細に調べられているため、かかる
既知の遺伝的背景のもとで、当該動物に施した処置の効
果のみを特定できるからである。一方、雑種動物におい
ては種々の遺伝子がヘテロの状態で存在するため、当該
動物に対する処置の結果生じた効果が、当該処置にのみ
由来するものかまたは遺伝的背景に由来するものかを判
別することが困難である。

【００３９】KOマウスの作成の過程では、ES細胞が生殖
系列に導入されたか否かを被毛色の違いを指標にして確
認するために、交雑を行い雑種子孫を作製することが工
程を必ず行う必要がある。したがって、多くの遺伝子が
ヘテロの状態で存在するため、結果としてIL-1関連遺伝
子が欠損することのみによる特有の効果を調べることが
困難となってしまう。そこで、遺伝子欠損の特有の効果
のみを抽出するために、得られた遺伝子欠損マウスを純
系のマウス系統と戻し交配し、ターゲティングを行った
遺伝子を含むすべての遺伝子について可能な限り遺伝的
にホモの状態にすることが好ましい。目的とする遺伝的
構成の動物を得るためには、5世代〜8世代程度同一系統
と戻し交配を行うことが好ましい。戻し交配に用いるマ
ウスは当業者が適宜選択することができる。使用するこ
とができるマウスとしては、例えばBALB/c、C57BL/6、D
BA11、ICRなどが挙げられるが、これらに限定されな
い。また、自然交配のみにより戻し交配を行うと長い年
月がかかる場合があるので、世代交代を早めたい場合に
は適宜体外受精技術を用いることもできる。

【００４０】作出された遺伝子欠損マウスを用いたそれ
ぞれの実験では、性別および年齢が適合した成熟マウス
を用いることが好ましい。性別や年齢に依存する因子が
実験の結果に与える影響を排除するためである。また、
実験は、動物実験に対する研究所内倫理ガイドラインお
よび遺伝子操作実験に対する安全性ガイドラインに基づ
いて行う。

【００４１】

【発明の効果】以上のようにして作出したIL-1関連遺伝
子欠損マウスは、IL-1関連遺伝子が、炎症、細菌感染そ
して自己免疫疾患においてどのような働きをしているか
を調べるための試験に用いることができる。

【００４２】特に、本発明の自己免疫疾患を発症するIL
-1ra遺伝子欠損動物は、自己免疫疾患、例えばリウマチ
の発症の研究に使用できるばかりでなく、それら疾患の
治療薬の探索に使用することもできる。

【００４３】したがって、本発明は本発明の疾患モデル
動物を使用して、自己免疫疾患の予防および／または治
療薬を探索する方法も提供する。本発明の探索方法は、
当業者が適宜定めることができるが、例えば次の工程か
らなる：自己免疫疾患モデル動物、好ましくは約4〜8週
齢の自己免疫疾患モデルマウスに、薬剤候補の化合物ま
たは物質を静脈、皮下、筋肉内、経口等のルートで1日1
〜数回に分けて、1または複数回投与する。投与する化
合物または物質は、医薬用の溶媒または医薬用の希釈媒
体により希釈して用いてもよく、あるいは水もしくは餌
に混合して与えてもよい。自己免疫疾患の予防もしくは
治療効果の判定は、候補化合物の代わりに、同量の溶媒
または媒体を投与したモデル動物に比べて、疾患の発症
が抑制され、もしくは症状が軽減されていることにより
判定する。試験には、陽性対照として、市販の抗リウマ
チ剤であるインドメタシンやスリンダクを与えた群を含
めてもよい。

【００４４】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するためのもの
ではない。実施例においてすべてのマウスは、東京大学
医科学研究所実験動物研究施設（Laboratory Animal Re
search Center, Instituteof Medical Science, Univer
sity of Tokyo）において、特定病原体フリー（SPF）の
条件下、環境的に調節されたクリーンルーム内で飼育し
た。ケージ、水ビン、木クズそして餌粒を含めたすべて
の器具および糧食は、滅菌して用いた。また、本明細書
中を通じて、結果の統計学的評価のために、Studentのt
-検定を使用した。

【００４５】

【実施例】試験例１：IL-1αのKOマウスの作出 IL-1α遺伝子のゲノムDNAクローニングマウスIL-1αに対するゲノムDNAは、マウスIL-1αのcDN
A全長（SEQ ID No:1）、およびIL-1βのcDNA全長（SEQ
ID No:2）の混合物をプローブとして、AntonBerns博士
から譲渡された129OLAマウスゲノムファージライブラリ
から単離した。マウスIL-1αのcDNAはTetsuo Sudo博士
（Toray Industry）の好意により入手した。およそ9×1
0⁵のファージクローンをプラークハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングし、そして9個の陽性クローン
を得た。これらのクローンがIL-1αをコードしているか
否かを決定するために、IL-1αプローブを用いた第２ス
クリーニングを別個に行った。この結果単一のファージ
クローン由来の6個のIL-1α陽性クローンを得た。マウ
スIL-1αゲノム構造はこれまでに報告されていないた
め、本発明者はいくつかの制限酵素によるゲノムクロー
ンの消化および部分配列決定により、ゲノムクローンの
構造地図を作製した（図１）。得られたIL-1αクローン
は、遺伝子の15 kbをカバーし、そしてヒトIL-1α遺伝
子のエクソン5からエクソン7に対応する相同配列を含ん
でいた。

【００４６】IL-1αターゲティングベクターの構築 IL-1α遺伝子のターゲティングストラテジーを図1に示
す。IL-1α遺伝子のターゲティングベクターを作製する
ために、単離したゲノムクローンの一部を制限酵素によ
り削除し、そこにプロモーターを結合した選択マーカー
遺伝子を挿入した。ハイグロマイシンBホスホトランス
フェラーゼ遺伝子（hph）をES細胞中での陽性選択マー
カーとして、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1（PGK-1）
プロモーターの調節下において使用した。IL-1α遺伝子
の発現をモニターするために、β-ガラクトシダーゼ遺
伝子（lacZ）（Pharmacia）をIL-1α遺伝子中に挿入
し、IL-1α-lacZ融合タンパク質を作製した。

【００４７】IL-1αのターゲティングベクターの構築
は、それぞれエクソン5およびイントロン5中のSau3A I
およびKpn I部位間の成熟IL-1αについてのN-末端コー
ド領域を含む1.5 kbのDNA断片を削除し、そしてlacZ-pA
-PGK-hph-pAカセットをDNA断片の代わりに挿入した（こ
こでpAはポリAを意味する）。MC1プロモーター調節下の
ジフテリア毒素A断片遺伝子（DT）を、ネガティブ選択
のためにベクターの5'末端にライゲーションした（図
1）。5'-および3'-末端の相同領域は、それぞれ1.5 kb
および5.5 kbであった。

【００４８】ターゲティングベクターを導入したES細胞
の作製本発明において使用するES細胞は、129/SvJ×129/Sv-CP
マウスから得られたR1細胞である。R1細胞は、Andras N
agy博士（Nagy et al., 1993, Proc. Natl.Acad. Sci.
USA 90, 8424-8428）に記載されているように取得する
ことができる。ES細胞に対してエレクトロポレーション
を行うことにより、10⁷細胞あたり約20-25μgの直鎖化
ターゲティングベクターを導入する。エレクトロポレー
ションは例えばBio-Rad Gene Pulsar中で、250 Vおよび
500μFで行うことができる。次いで細胞を、ES培地（15
-20％ウシ胎児血清（Bioserum）、マウス白血病阻止因
子（LIF, ESGRO^TM; GIBCO BRL）、ピルビン酸ナトリウ
ム（GIBCO BRL）、非必須アミノ酸（GIBCO BRL）および
β-メルカプトエタノール（Sigma）を添加したDulbecco
改変Eagle培地（GIBCO BRL））中で、マイトマイシンC-
処理したNHL7細胞あるいはネオマイシン耐性の初代培養
細胞からなるフィーダーレイヤー上にプレーティング
し、そしてハイグロマイシンB（140μg/ml, Calbioche
m）を選択薬剤として用いて選択培養する。薬剤を含む
培地は毎日交換する。

【００４９】ハイグロマイシン存在下に生育した4つのE
Sクローンをプールし、それらからゲノムDNAを単離し
た。クローンは相同組換えが起こったかどうかを確認す
るため、プライマーP1：5'-CTT GGC CAT ACT GCA AAG G
TC ATG-3'（SEQ ID No:4）およびP2：5'-GAG GTG CTG T
TT CTG GTC TTC ACC-3'（SEQ ID No:5）を用いたPCRに
よってスクリーニングした。PCR反応バッファーは、50
mMのKCl、10 mMのTris-HCl（pH 9.0）、0.1％のTriton
X-100、1.5 mMのMgCl₂、0.2 mMの各dNTP、1μMのプライ
マー、そして2.5 U/50μlのTaqポリメラーゼ（Boehring
er）を含む。PCRサイクルの条件は、94℃で1分、66℃で
2分、72℃で3分を1サイクルとして40サイクルの反応を
行った。

【００５０】さらにES細胞から単離したゲノムDNA中に
目的とする遺伝子が相同組換えされたことを確認するた
めに、NheI-SpeI断片を5'プローブ（図1の下段を参照）
として、そしてSmaI-SmaI断片を3'プローブ（図1の下段
を参照）として使用し、ターゲティングされたIL-1α遺
伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーション解
析を行った。サザンブロットハイブリダイゼーション解
析に関しては後述する。

【００５１】目的とする遺伝子をターゲティングしたES
細胞を、改変した凝集法により受精卵中に移植し、キメ
ラマウスを作製した。このES細胞を用いて作製したキメ
ラマウスを用いて、IL-1α遺伝子欠損変異についてホモ
接合体のマウスを作出した。これら作出されたマウスが
目的とする遺伝子欠損を起こしているかどうかを確認す
るために、サザンブロットハイブリダイゼーション解析
を行った。

【００５２】サザンブロットハイブリダイゼーション解
析は、クローン化したES細胞由来のゲノムDNA（図4A）
または遺伝子ターゲティング産仔由来のゲノムDNA（図4
B）を単離し、得られたゲノムDNAをEcoR I（図4A）また
はBamH I（図4B）のいずれかにより消化し、そしてNheI
-SpeI切断断片およびSmaI-SmaI切断断片をそれぞれ5'お
よび3'プローブとして、そして同時にhphプローブ（図
1）を用いて行った。プローブは、ランダムプライム法
（Amersham）を用いて、³²P-dCTPで標識する。サザンハ
イブリダイゼーションは、以下の方法により行った。適
切な制限酵素で消化したDNA（10μg）を0.7％アガロー
スゲル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（Ge
ne Screen Plus, NEN）に転写する。ハイブリダイゼー
ションは5×SSCP、50％ホルムアミド、2×Denhardt溶
液、1％SDS、そして100μg/mlサケ精巣DNAを含むバッフ
ァー中で、³²P標識プローブを用いて42℃で行う。メン
ブレンは、室温で1％SDSを含む2×SSCで、そして65℃で
1％SDSを含む0.1×SSCで洗浄する。このメンブレンを用
いてイメージプレートに感光し、放射線標識されたバン
ドをBAS2000により検出した。

【００５３】5'プローブによるハイブリダイゼーション
により、IL-1αの野生型アリル由来のバンドに相当する
4.7 kbの予想されるバンド、および変異アリル由来のバ
ンドに相当する6.7 kbのDNAバンドを検出した。3'プロ
ーブおよびhphプローブによりハイブリダイゼーション
されるすべてのバンドもまた予想される長さであり、そ
れらからターゲティングされるESクローン中の野生型ア
リルのうちの一つが、変異遺伝子により正しく置換され
ていることを示していた。IL-1α遺伝子のターゲティン
グ効率は、4/282（1.4％）であった（表1）。このうち
ターゲティングされる遺伝子の生殖系列への導入は、4
クローン中３クローンで確認された。

【００５４】

【表１】

【００５５】IL-1αのKOマウスの作出 IL-1α遺伝子をターゲティングしたES細胞を、受精胚中
に移植する。移植する方法は当業者が適宜改変すること
ができるが、本発明においては、例えば、オリジナルの
報告（Nagy et al., 1993,上述）から改変した凝集法に
より、キメラ胚を作製した。すなわち、プラスチックデ
ィッシュ上の穴の中で、約10-15のES細胞塊を2個の8細
胞期胚と凝集させ、そしてBWW培地またはM16培地などの
適当な培地中で一晩培養し（Biggers et al., 1971, Th
e culture of mouse embryo invitro, in Methods in M
ammalian Embryology (J.C. Daniel, Jr., ed), W.H.Fr
eeman and Company, San Francisco, 86-116; Iwakura
and Nozaki, 1985, Dev. Biol. 112, 135-144）、その
後十分に形成した胞胚を偽妊娠メスマウスの子宮内に移
植する。凝集法において8細胞期胚として使用すること
ができる胚の由来する系統は、純系どうしの交配に由来
するものでも純系間での交配に由来するものでもよい。
本発明においては、C57BL/6×DBA/2のF₁由来の胚を使用
することが好ましい。

【００５６】ES細胞導入胚由来のオスのキメラマウスが
成熟した後、このマウスを純系マウス系統のメスマウス
と交配させ、そして次世代産仔の被毛色により、ES細胞
がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認す
る。例えば本発明においては、前述した様に野生色（ag
outi）系統（129マウス）由来のES細胞を使用するた
め、作出したオスのキメラマウスを、黒色であるC57BL/
6メスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色が
野ネズミ色（agouti）であることにより、ES細胞がキメ
ラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することが
できる。得られたIL-1関連遺伝子欠損ヘテロ接合体マウ
スを交配させることにより、目的とする遺伝子欠損ホモ
接合体マウスを得ることができる。

【００５７】表現型解析本実施例で作出されたIL-1αのKOマウスの仔は、ヘテロ
接合体同士の交配でメンデル比に従って産まれることを
見いだした。このことから、IL-1αはマウスの胚発生中
において重要ではないことを示している。IL-1αの変異
ホモ接合体マウスは、SPF条件下では健康で繁殖能力も
有していた。

【００５８】作出したそれぞれのKOマウス由来免疫系細
胞がどのような表現型を有するかを調べるため、フロー
サイトメトリー解析を行う。胸腺、脾臓およびリンパ節
（LN）由来の単一細胞懸濁液を調製し、そして10⁶の細
胞をFc受容体ブロック抗体により前処理して以下のモノ
クローナル抗体で45分間染色する。細胞はFACS溶液（HA
NKS-20％FCS）で洗浄し、そしてLysis IIプログラムを
用いるFACScan細胞計測器（Becton-Dickinson）で解析
する。染色用のモノクローナル抗体として、蛍光イソチ
オシアネート（FITC）-抗-B220、フィコエリトリン（P
E）-抗-CD3、FITC-抗-CD8、そしてPE-抗-CD4（Pharming
en）を使用する。フローサイトメトリー解析によれば、
T細胞とB細胞の比率、そして脾臓および胸腺におけるCD
4⁺T細胞とCD8⁺T細胞の比率は、IL-1αのKOマウスにおい
て顕著な影響を受けていないことを示した。

【００５９】試験例２：IL-1βのKOマウスの作出 IL-1β遺伝子のゲノムDNAクローニング IL-1βのゲノムクローンを、マウスIL-1βのcDNAの全長
（SEQ ID No.2）をプローブとして、129SvJマウスゲノ
ムライブラリー（λFIXII、Stratagene）から単離し
た。マウスIL-1βのcDNAはTetsuo Sudo博士（Toray Ind
ustry）の好意により入手した。ターゲティングベクタ
ーを構築する前に、これらのクローンのDNA配列を部分
配列決定し、すべてのエクソン（エクソン1〜エクソン
7）を含むIL-1β遺伝子の17 kbをカバーするクローン
（SEQ. ID. No:13）を得た。

【００６０】IL-1βターゲティングベクターの構築 IL-1β遺伝子のターゲティングストラテジーを図2に示
す。ネオマイシン耐性遺伝子（neo）を、ES細胞中での
相同組換えに対する陽性選択マーカーとして、ホスホグ
リセリン酸キナーゼ-1（PGK-1）プロモーターの調節下
において使用した。IL-1β遺伝子の発現をモニターする
ために、β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）（Pharmac
ia）をIL-1β遺伝子中に挿入し、IL-1β-lacZ融合タン
パク質を作製した。

【００６１】IL-1βのターゲティングベクターの構築
は、それぞれエクソン3およびエクソン5中のHinc IIお
よびBstX I部位間の成熟IL-1βについてのN-末端コード
領域を含む2.45 kbのDNA断片を削除し、そしてlacZ-pA-
PGK-neo-pAカセットをDNA断片の代わりに挿入した（こ
こではpAはポリAを意味する）（図2）。5'-および3'-末
端の相同領域は、それぞれ1.5 kbおよび3.9 kbであっ
た。

【００６２】ターゲティングベクターを導入したES細胞
の作製IL-1βのKOマウスの作出 IL-1β遺伝子のターゲティングベクターを前述したよう
に調製した。当該ベクターを導入したES細胞を試験例１
と同一のES培地中でマイトマイシンC-処理したネオマイ
シン耐性初代培養線維芽細胞のフィーダーレイヤー上に
プレーティングし、G418（300μg/ml、GIBCO BRL）を用
いて選択した。G418存在下に生育した1つのESクローン
をプールし、それらからゲノムDNAを単離した。クロー
ンは相同組換えが起こったかどうかを確認するため、プ
ライマーP2：5'-GAG GTG CTG TTTCTG GTC TTC ACC-3'
（SEQ ID No:5）およびP3：5'-GCG AAT GTG TCA CTA TC
T GCC ACC-3'（SEQ ID No:6）を用いて、試験例１と同
一の条件下でPCRによってスクリーニングした。

【００６３】さらにES細胞から単離したゲノムDNA中に
目的とする遺伝子が相同組換えされたことを確認するた
めに、XbaI-EcoRI断片を5'プローブ（図2の下段参照）
として、そしてHindIII-HindIII断片を3'プローブ（図2
の下段参照）として使用し、ターゲティングされたIL-1
β遺伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーショ
ン解析を行った。

【００６４】IL-1βのKOマウスの作出試験例１に記載した方法と同様に、IL-1β遺伝子欠損変
異についてホモ接合体のマウスを作出した。これら作出
されたマウスが目的とする遺伝子欠損を起こしているか
どうかを確認するために、サザンブロットハイブリダイ
ゼーション解析を行った。

【００６５】サザンブロットハイブリダイゼーション解
析を行った結果、5'プローブによるハイブリダイゼーシ
ョンにより、IL-1β遺伝子の野生型アリル由来のバンド
に相当する10 kbの予想されるバンド、および変異アリ
ル由来のバンドに相当する6.2 kbのDNAバンドを検出し
た。3'プローブおよびneoプローブによりハイブリダイ
ゼーションされるすべてのバンドもまた予想される長さ
であり、それらからターゲティングされるESクローン中
の野生型アリルのうちの一つが、変異遺伝子により正し
く置換されていることを示していた。IL-1β遺伝子のタ
ーゲティング効率は、1/501（0.2％）であった（表
1）。このうちターゲティングされる遺伝子の生殖系列
への導入は、1クローン中１クローンで確認された。

【００６６】表現型解析本試験例において作出されたIL-1β欠損ヘテロ接合体同
士の交配によりIL-1β変異を有するホモ接合体の仔は、
メンデル比に従って産まれることを見いだした。このこ
とから、IL-1βはマウスの胚発生中において重要ではな
いことを示している。IL-1βの変異ホモ接合体マウス
は、SPF条件下では健康で繁殖能力も有していた。

【００６７】作出したそれぞれのKOマウス由来免疫系細
胞がどのような表現型を有するかを調べるため、試験例
１において記載した方法と同一の方法によりフローサイ
トメトリー解析を行う。フローサイトメトリー解析によ
れば、T細胞とB細胞の比率、そして脾臓および胸腺にお
けるCD4⁺T細胞とCD8⁺T細胞の比率は、IL-1βのKOマウス
において顕著な影響を受けていなかった。

【００６８】試験例３：IL-1α/βのKOマウスの作出 IL-1α/βのKOマウスの作出試験例２において作製したIL-1β遺伝子欠損ES細胞に対
して、さらに試験例１において作製したIL-1α遺伝子タ
ーゲティングベクターを相同組換えにより導入すること
により、IL-1αおよびIL-1βの両方をターゲティングし
たES細胞を作製した。IL-1αのターゲティングベクター
およびIL-1βのターゲティングベクターは、使用する選
択マーカー遺伝子がそれぞれhph遺伝子およびneo遺伝子
と異なるため、それぞれのターゲティングベクターを導
入する際に、選択を容易に行うことができる。

【００６９】このようにして作製したIL-1α/β二重欠
損ES細胞を用いて、上述した方法と同一の方法によりキ
メラマウスを作出し、IL-1α/β二重欠損ホモ接合体マ
ウスを作出した。

【００７０】表現型解析本試験例において作出した、IL-1α/βの二重変異を有
するホモ接合体の子供も、メンデル比に従って産まれる
ことを見いだした。このことから、IL-1αおよびIL-1β
の両方とも、マウスの胚発生中において重要ではないこ
とを示している。またIL-1α/βのKOマウスでは、成長
遅延も成長促進もみられなかった（表2）。IL-1α/βの
変異ホモ接合体マウスは、SPF条件下では健康で繁殖能
力も有していた。

【００７１】

【表２】

【００７２】実施例１：IL-1raのKOマウスの作出 IL-1ra遺伝子のゲノムDNAクローニング IL-1raのゲノムクローンを、マウスIL-1raのcDNAのうち
分泌型IL-1raのコード領域の全長に相当する42番塩基か
ら599番塩基までの断片をプローブとして用いて、129Sv
Jマウスゲノムライブラリー（λFIXII、Stratagene）か
ら単離した。さらに、IL-1ra遺伝子のゲノム配列のう
ち、エクソン1を含むIL-1raゲノムDNAの5'末端部分のク
ローニングを行うため、SEQ ID No.14の配列中66番塩基
から548番塩基に相当するゲノムDNA断片を使用してクロ
ーニングを行った。

【００７３】マウスIL-1raのcDNAのコード領域は、脾臓
cDNAからPCRプライマー、5'-CCTCGG GAT GGA AAT CTG C
TG-3'（SEQ ID No:9）および5'-AGG CCT CGG CAG TAC T
AT TGG-3'（SEQ ID No:10）を用いてPCRにより増幅し
た。マウスIL-1raの523塩基対のゲノムDNAは、プライマ
ー5'-GAC TCG GAG TAC CTG TCA TGC-3'（SEQ ID No:1
1）および5'-GCT CTG GAC ATA TGG CAT GTG-3'（SEQ ID
No:12）を用いて増幅した。PCR法は、94℃にて1分、60
℃にて2分、72℃にて3分を1サイクルとして、40サイク
ル反応させることで行った。得られた断片を配列決定
し、そしてIL-1raのcDNAであることを確認した。

【００７４】プラークハイブリダイゼーションによる最
初のスクリーニングを行った9×10⁵のファージクローン
の中から、7個の陽性クローンを得た。しかしながら、
その中の1個だけが第二スクリーニングにおいて陽性で
あることが確認された。以前の報告（Zahedi et al., 1
991, J. Immunol., 146, 4228-4233）に従い当該クロー
ンの構造地図を作製したところ、当該クローンはエクソ
ン4から下流を含むIL-1ra遺伝子の15 kbをカバーしてい
た。IL-1ra遺伝子の上流配列を得るために、エクソン1
周辺のIL-1raゲノムDNAについてのプライマーを設計
し、そして別の1×10⁶個のファージクローンをライブラ
リからスクリーニングした。最終的に、IL-1ra遺伝子の
5'領域13 kbを含むクローンを得た。これらの2クローン
により、sIL-1raのすべてのエクソン（エクソン1〜エク
ソン4）を含む、IL-1ra遺伝子の28kbがカバーされた（S
EQ. ID. No:14）。

【００７５】IL-1raターゲティングベクターの構築 IL-1ra遺伝子のターゲティングストラテジーを図3に示
す。ネオマイシン耐性遺伝子（neo）を、ES細胞中での
陽性選択マーカーとして、ホスホグリセリン酸キナーゼ
-1（PGK-1）プロモーターの調節下において使用した。

【００７６】IL-1ra遺伝子産物の3種類すべてのアイソ
フォームを破壊するために、分泌型IL-1raに対するコー
ド領域すべてを含むAva IおよびSph I部位間の5.2 kbの
DNA断片を削除し、PGK-neo-pAカセットをDNA断片の代わ
りに挿入した（ここでpAはポリAを意味する）。ジフテ
リア毒素A断片遺伝子（DT）をネガティブ選択のために
ベクターの5'末端にライゲーションした（図3）。5'-お
よび3'-末端の相同領域は、それぞれ1.8 kbおよび4.5 k
bであった。

【００７７】IL-1raのKOマウスの作出 IL-1ra遺伝子のターゲティングベクターを前述したよう
に調製した。当該ベクターを導入したES細胞を血清（JR
H Bioscience）以外は試験例１と同一であるES培地中
で、マイトマイシンC-処理したNHL7細胞のフィーダーレ
イヤー上にプレーティングし、G418（300μg/ml、GIBCO
BRL）を用いて選択した。G418存在下に生育した6つのE
Sクローンをプールし、それらからゲノムDNAを単離し
た。クローンは相同組換えが起こったかどうかを確認す
るため、プライマーP4：5'-GCT GTGATA GCA ACA GTT TG
T ACC-3'（SEQ ID No:7）およびP5：5'-GAC TGC CTT GG
G AAA AGC GCC TCC-3'（SEQ ID No:8）を用いて、試験
例１と同一の条件下でPCRによってスクリーニングし
た。

【００７８】さらにES細胞から単離したゲノムDNA中に
目的とする遺伝子が相同組換えされたことを確認するた
めに、ScaI-HindIII断片を5'上流プローブ（図3の下段
を参照）として使用し、ターゲティングされたIL-1ra遺
伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーション解
析を行った。

【００７９】試験例１に記載した方法と同様に、IL-1ra
遺伝子欠損変異についてホモ接合体のマウスを作出し
た。これら作出されたマウスが目的とする遺伝子欠損を
起こしているかどうかを確認するために、サザンブロッ
トハイブリダイゼーション解析を行った。

【００８０】5'プローブによるハイブリダイゼーション
により、IL-1ra遺伝子の野生型アリル由来のバンドに相
当する5.0 kbの予想されるバンド、および変異アリル由
来のバンドに相当する7.0 kbのDNAバンドを検出した
（図4）。neoプローブによりハイブリダイゼーションさ
れるすべてのバンドもまた予想される長さであり、それ
らからターゲティングされるESクローン中の野生型アリ
ルのうちの一つが、変異遺伝子により正しく置換されて
いることを示していた。IL-1ra遺伝子のターゲティング
効率は、3/462（0.6％）であった（表1）。このうちタ
ーゲティングされる遺伝子の生殖系列への導入は、3ク
ローン中2クローン（IL-1ra）で確認された。

【００８１】表現型解析本実施例において作出したIL-1ra変異を有するホモ接合
体の子供も、メンデル比に従って産まれることを見いだ
した。このことから、IL-1raもマウスの胚発生中におい
て重要ではないことを示している。IL-1raに対する変異
ホモ接合体マウスもまた、通常は4週齢の離乳前まで野
生型と同様に成長し、生殖能力を有していた。しかしな
がら、その成長は6-8週齢以降遅延し始めた（表3）。こ
の異常は、マウスが加齢するに従って顕著になった。こ
れらの観察から、成長および恒常性の維持におけるIL-1
raの有益な機能が示唆される。

【００８２】

【表３】

【００８３】作出したそれぞれのKOマウス由来免疫系細
胞がどのような表現型を有するかを調べるため、試験例
１において記載した方法と同一の方法によりフローサイ
トメトリー解析を行う。フローサイトメトリー解析によ
れば、T細胞とB細胞の比率、そして脾臓、胸腺およびリ
ンパ節におけるCD4⁺T細胞およびCD8⁺T細胞の比率は、10
-12週齢時のIL-1raのKOマウスにおいて顕著な影響を受
けなかった。これらから、体重の増加が起こらないの
は、そのリンパ組織の異常によるものではないことが示
唆された。

【００８４】実施例２：遺伝子欠損の確認試験例１〜３および実施例１において作出したIL-1αの
KOマウス、IL-1βのKOマウス、IL-1α/βのKOマウス、
およびIL-1raのKOマウスにおいて、それぞれIL-1α遺伝
子、IL-1β遺伝子、IL-1αおよびIL-1βの両遺伝子、お
よびIL-1ra遺伝子が欠損していることを調べる。腹腔マ
クロファージをLPSにより刺激すると、通常IL-1関連遺
伝子の発現が増加する。この現象をもとに、作出したそ
れぞれのIL-1関連遺伝子のKOマウスについてLPS刺激後
のそれぞれIL-1α遺伝子、IL-1β遺伝子、およびIL-1ra
遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーション法を用い
て調べることにより、それぞれの遺伝子が確実に欠損し
ているかどうかを調べることができる。そこで、それぞ
れのKOマウスから腹腔マクロファージを調製し、LPS刺
激後の腹腔マクロファージ内でのそれぞれの遺伝子の発
現をノザンハイブリダイゼーションにより調べた（図
5）。

【００８５】2 mlの2％チオグリコレート培地（Nissu
i）を腹腔内（i.p.）投与し、4日後にマウスから腹腔滲
出細胞（PEC）を採取し、そして10％FCSを添加したRPMI
-1640培地（GIBCO）中で培養した。10⁶のPECを60 mmの
ディッシュに数時間または一晩かけて接着させた後、そ
れらを10μg/mlのLPS（O55:B5, Difco）の存在下または
非存在下でインキュベートした。

【００８６】LPS刺激後のPEC細胞から、全RNAを酸性グ
アニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出
法（AGPC法）を用いて単離し、そしてポリA⁺RNAをQuick
Prep Micro mRNA精製キット（Pharmacia）を用いて精製
した。全RNAまたはポリA⁺RNAを1.2％変性アガロースゲ
ル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレンに転写し
た。ノザンハイブリダイゼーションは、³²P標識したIL-
1α、IL-1βおよびIL-1raのcDNAを使用して（それぞ
れ、SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3）、50％
ホルムアミド、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 M NaCl、
5×Denhardt溶液、10％硫酸デキストラン、0.1％リン酸
二ナトリウム、1％SDS、そして200μg/mlサケ精巣DNAを
含むバッファー中42℃で行い、そしてメンブレンは、室
温で1％SDSを含む2×SSCで、そして65℃で1％SDSを含む
0.1×SSCで洗浄した。³²P放射活性は、BAS-2000システ
ム（Fuji Film）を用いて測定した。

【００８７】この結果、IL-1αのKOマウス、IL-1βのKO
マウスおよびIL-1raのKOマウスではそれぞれ、IL-1α、
IL-1βおよびIL-1raのmRNA遺伝子の発現は全く検出され
なかった。また、IL-1α/βの二重KOマウスにおいてはI
L-1αおよびIL-1βの両方のmRNAがともに全く検出され
なかった。以上の結果から、これらの遺伝子が完全に欠
損していることが示された（図5）。

【００８８】実施例３：敗血症性ショックに対する感受
性以前の研究において、IL-1はLPSにより誘導される敗血
症性ショックの主要メディエーターであることが示唆さ
れた（Alexander et al., 1991, J. Exp. Med. 173, 10
29-1032; Ohlsson et al., 1990, Cell 85, 1-4）。IL-
1関連遺伝子欠損マウスの敗血症性ショックに対する感
受性を調べるため、LPS投与後に生じる敗血症性ショッ
ク症状の観察を行った。

【００８９】野生型、ヘテロ接合体およびホモ接合体の
マウスに、高濃度のE. coli由来LPS（O55:B5, Difco）
をi.p.投与した。IL-1αのKOマウスに対しては40μg/g
体重、IL-1βのKOマウスに対しては60μg/g体重、そし
てIL-1raのKOマウスに対しては10μg/g体重を投与し
た。それぞれの実験において別ロットのLPSを使用しな
ければならなかったため、対照マウスにおけるLPSの致
死量を各実験の前に試験した。

【００９０】IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウス
は、野生型マウスおよびヘテロ接合体マウスと同様に致
死量のLPS（40-60μg/g体重）に対して感受性であった
（図6A、B）。これと対照的に、IL-1raのKOマウスは対
照マウスに比べて、致死量以下のLPS（10μg/g体重）に
対してより感受性が高かった（図6C）。

【００９１】実施例４：炎症ストレスにおけるIL-1の機
能解析 in vitroにおけるIL-1αとIL-1βの相互誘導マクロファージは、IL-1、IL-6およびTNF-αを含む炎症
性サイトカインの主要な産生細胞である。IL-1の欠損が
他のサイトカインの誘導に与える影響を調べるために、
チオグリコレート活性化マクロファージを腹腔から採取
し、様々な炎症性サイトカイン遺伝子の発現レベルを、
in vitroにおいてLPS刺激後0、3、6、および12時間の時
点で、ノザンブロットハイブリダイゼーション解析によ
り測定した。マウスIL-6およびTNF-αのcDNAはTakashi
Yokota博士（Institute of Medical Science, Universi
ty of Tokyo）より提供された。IL-1αのKOマウス由来
のマクロファージは、野生型マウス由来マクロファージ
のIL-1βのmRNAと比較して、IL-1β mRNAの発現がほぼ
半減した（図7A）。IL-1βのKOマウス由来のマクロファ
ージにおいても、IL-1α mRNAの発現レベルが低下した
（図7B）。これらの結果から、IL-1αはIL-1βの発現を
誘導することができ、そしてその逆にIL-1βもIL-1αの
発現を誘導することができると考えられる。IL-1ra、IL
-6およびTNF-αの発現レベルは、これらのマウスにおい
て顕著に影響されることはなかった（図7C-図7E）。

【００９２】テレピン油誘導局所炎症に対する発熱応答
の機能不全発熱は、多数の外来性の刺激物質により誘導することが
できる全身性の応答である。IL-1α、IL-1β、TNF-αお
よびIL-6は、内在性の発熱物質であると示唆されてきた
（Kluger, 1991）。マウスの後肢にテレピン油を皮下注
射することにより、局所炎症を引き起こし発熱を誘導す
ることができる。本発明者は、IL-1α/βのKOマウスを
用いて、テレピン油誘導発熱モデルにおけるIL-1の機能
を調べた。

【００９３】オスマウスの腹腔内体温を、電子体温計と
チップ（ELAMS^TMシステム、Bio Medical Research Comm
unity）を用いて精度±0.1℃で測定した。マウスをネン
ブタールで麻酔し、そしてチップを腹腔内に移植した。
それぞれの動物を別個のケージにわけ、そして1週間か
けて回復させた。通常の昼-夜体温リズムを、実験前の1
週間測定した。室温は24±1℃に維持した。およそ3ヶ月
齢のマウスに、150μlのテレピン油（Nakarai）を両後
肢の皮下（s.c.）に注射した。体温は正常のレベルに戻
るまで毎日正午に測定した。

【００９４】図8Aに示したように、IL-1α/βのKOマウ
スにおける発熱応答は、野生型マウスと比較して顕著に
低下し、このことからIL-1αまたはIL-1βのいずれかま
たはその両方が発熱誘導に重要な働きをしていることが
示唆される。次いで、IL-1αとIL-1βの機能を区別する
ために、IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウスを調
べた。IL-1βのKOマウスにおいては、テレピン油を注射
した対照マウスと比較して、テレピン油処置後に顕著な
体温の上昇はなかった（図8B）。一方、IL-1αのKOマウ
スにおいては、注射後1日目から5日目にかけて対照マウ
スと同様に体温上昇し、そして6日目までに正常に回復
した（図8B）。これらの結果は、追試により確認した。
これらの結果から、局所炎症に対する発熱応答におい
て、IL-1βは重要な機能をしているものの、IL-1αはそ
のような機能をしていないことが示された。

【００９５】一方、IL-1raのKOマウスにおける体温の変
化は、テレピン油を注射した対照マウスにおける体温の
変化と比較して、注射後1日目に顕著に大きかった（p<
0.01）（図8C）。IL-1raのKOマウスにおける体温は、テ
レピン油注射後1週間経っても正常の概日的な体温に回
帰しなかった（図8C）。これらの結果から、発熱応答に
おけるIL-1raの有する調節的機能が示唆される。

【００９６】マウス脳におけるテレピン油処理後のIL-1
関連遺伝子の発現抑制本発明者は、IL-1αの欠損ではなくIL-1βの欠損がテレ
ピン油による発熱の抑制を引き起こす理由について確認
するために、IL-1の欠損およびIL-1raの欠損が、テレピ
ン油注射後の脳内での関連遺伝子の発現に対して与える
影響を調べた。野生型マウスにおいては、テレピン油処
理後6時間の時点でIL-1α mRNAおよびIL-1β mRNAの両
方の誘導が観察され、そして12時間の時点でピークに達
し、その後の発熱反応と一致した（図9A）。両方のmRNA
レベルは類似しており、処理していない対照マウスにお
けるmRNAレベルと比較すると10-20倍高い範囲にあっ
た。興味深いことに本発明者は、IL-1αのmRNA発現がIL
-1βのKOマウスにおいてはほとんど検出されないことを
見いだした。この発現は野生型マウスにおけるIL-1αの
mRNAの発現と比較して1/30以下に抑制されていた（図9
A）。一方、IL-1βのmRNAは、対照マウスのIL-1β mRNA
の発現と比較して1/10に減少したものの、IL-1αのKOマ
ウスにおいては依然として検出することができた。これ
らの結果は、別の2回の実験により確認した。従って、I
L-1βの欠損により、脳内におけるIL-1βの発現だけで
なくIL-1αの発現も消失し、一方IL-1αの欠損によりIL
-1βの発現は完全に抑制されなかったことを示した。

【００９７】IL-1raのKOマウスにおけるIL-1β mRNAの
発現は、テレピン油注射後12時間の時点で、野生型マウ
スと比較して増加していた。一方、IL-1α mRNAの発現
レベルは影響を受けなかった（図9B）。これらの結果は
IL-1raのKOマウスにおける発熱応答の増大と一致してい
た（図8C）。予想されたように、IL-1α mRNAおよびIL-
1β mRNAのどちらも、IL-1α/βの二重KOマウスにおい
ては検出されなかった（図9B）。

【００９８】IL-1の発現を発熱と相関させるために、テ
レピン油注射後の脳内特定領域におけるIL-1α mRNAお
よびIL-1β mRNAの発現レベルを、ノザンブロットハイ
ブリダイゼーション解析により調べた。IL-1α mRNAお
よびIL-1β mRNAの強い発現が野生型マウスにおいては
大脳皮質および間脳において観察されたが、一方海馬お
よび小脳においては発現レベルが低かった（図10A）。
体温を調節していると考えられている間脳におけるIL-1
βの発現レベルは、IL-1αのKOマウスにおいては2/3に
低下したが、IL-1βのKOマウスにおいてはIL-1αもIL-1
βも検出されなかった。このことは、IL-1βKOマウスで
のIL-1αの発現が、野生型のIL-1αの発現に比べて1/30
以下に低下したことを示している（図10A）。これらの
データは、IL-1αの欠損がIL-1βの発現に与える影響は
間脳においては脳全体と比べて顕著でなかったが、脳全
体を解析に用いた図9Aのデータと一致する。本発明者は
これらの結果について2種類の別個の実験により確認し
た。これらの結果から、間脳におけるIL-1α遺伝子の発
現がほとんどIL-1βの発現に依存しているが、IL-1βの
発現はIL-1αの発現からは相対的に独立していることが
示される。

【００９９】IL-1αのKOマウス間脳におけるIL-1ra mRN
Aの発現レベルは、野生型マウスのIL-1ra mRNA発現レベ
ルと同様であった（図10A）。これに対して、IL-1ra発
現レベルは、IL-1βのKOマウスにおいて遙かに減少した
（野生型のレベルに対して1/10以下）（図10A）。IL-1r
aのKOマウス間脳におけるIL-1α mRNAおよびIL-1βmRNA
の発現レベルは、野生型マウスのそれぞれの発現と比較
して、1.5倍および2倍高かった（図10B）。これらの結
果から、IL-1raがストレス下においてIL-1発現の抑制物
質として機能している可能性が示唆される。

【０１００】脳内でのIL-1によるシクロオキシゲナーゼ
（COX-2）の誘導 IL-1は、COX-2遺伝子の転写を誘導することが知られて
いる（Ballou et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 200
44-20050）。COX-2は、プロスタグランジンE₂（PGE₂）
を含むプロスタグランジン類の合成を触媒する酵素であ
る。PGE₂が体内での発熱応答の強力なメディエーターで
あるため（Kluger, 1991, 上述）、テレピン油誘導発熱
中のCOX-2発現を調べた。マウスCOX-1およびCOX-2のcDN
AはShozoYamamoto博士（Tokushima University School
of Medicine）より提供された。図9Aに示したように、
構成的に発現することが知られているCOX-1遺伝子では
なくCOX-2遺伝子の発現は、テレピン油処理後の脳内で3
倍誘導され、12時間の時点でのIL-1発現のピークと一致
した。この誘導は、野生型マウスよりも若干低いもの
の、IL-1αのKOマウスにおいても観察された。対照的
に、テレピン油処理後の脳内COX-2発現の誘導は、IL-1
βのKOマウスにおいては観察されなかった。このことか
ら、IL-1βがCOX-2誘導の主要なメディエーターである
ことが示された（図9A）。

【０１０１】IL-1raのKOマウスにおけるCOX-2の発現
は、野生型マウスと比較して、12時間の時点で1.5倍高
く、このデータはこれらのマウスにおけるIL-1βの発現
増大と相関していた（図9B）。これらの結果から、COX-
2の発現レベルはIL-1とIL-1raのバランスにより調節さ
れていることが示唆される。

【０１０２】間脳におけるCOX-2の発現は、テレピン油
処理後のIL-1βのKOマウスにおいては誘導されなかった
が、一方でIL-1αのKOマウスにおける間脳COX-2の発現
は野生型マウスと同様に誘導された（図10A）。IL-1ra
のKOマウスにおけるCOX-2発現は、野生型マウスのCOX-2
発現と比べて2.5倍高かった。これらのKOマウスにおい
て、脳内における発熱のメディエーター候補であるTNF-
α mRNAの発現レベルは、影響を受けなかった（図9
A）。これらのデータから、COX-2は主としてIL-1βによ
り誘導され、この誘導はIL-1raにより拮抗されることが
示される。

【０１０３】IL-1のKOマウスにおける、HPA軸活性化の
抑制急性炎症刺激は、HPA軸の活性化を介して、循環血中コ
ルチコステロン濃度を上昇させることが知られている。
神経-免疫-内分泌系におけるIL-1の機能をさらにはっき
りさせるために、本発明者はIL-1欠損およびIL-1ra欠損
がテレピン油処置後の血清コルチコステロン濃度に対し
て与える影響について調べた。

【０１０４】テレピン油誘導HPA軸活性化のために、各
実験群5匹のマウスに対して、塩類溶液または100μlの
テレピン油をs.c.に注射し、そして投与後2時間および8
時間の時点で断頭させ、採血を行った。20μlの血清を
蒸留水で1 mlに希釈し、そして4 mlのジエチルエーテル
で抽出した。以前に記載されたように、コルチコステロ
ンに対する特異抗体を用いて、抽出物についてラジオイ
ムノアッセイを行った。テストステロン、プロゲステロ
ンおよびデオキシコルチコステロンに対する抗体の比交
差反応性は、それぞれ0.1％未満、4％そして10％であっ
た。血清中での検出下方限界は、10 ng/mlであった。

【０１０５】マウスをテレピン油で処置すると、血清コ
ルチコステロン濃度が注射後2時間で2-4倍に増加した。
この時点で、誘導レベルはIL-1α/βのKOマウスおよび
野生型マウスの間で相違はなかった（図11A）。しかし
ながら二次的増加が起こるテレピン油注射後8時間の時
点で、野生型マウスの誘導レベルが3-5倍に増加したの
に対して、IL-1α/βのKOマウスにおいては顕著に低か
った（図11B、p<0.01）。

【０１０６】次いで、IL-1と関連する分子種を区別する
ために、IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウスにテ
レピン油を注射し、8時間後の血清コルチコステロン濃
度を測定した。図12Aおよび図12Bにおいて示したよう
に、IL-1βのKOマウスにおいては、血清コルチコステロ
ン濃度は増加しなかった（p<0.001）。これに対して、I
L-1αのKOマウスにおけるコルチコステロン濃度は、対
照マウスと同様に増加した。これらのデータから明らか
に示されるように、IL-1はテレピン油によるHPA軸の初
期の活性化には関与していないが、しかしコルチコステ
ロンの二次的増加は関与しており、IL-1αではなくIL-1
βがこの活性化の主要なメディエーターである。

【０１０７】IL-1ra欠損の効果もまた調べた。図12Cに
おいて示されるように、IL-1raのKOマウスにおけるテレ
ピン油注射後8時間のコルチコステロン濃度は、ヘテロ
接合体の対照マウスにおけるコルチコステロン濃度と同
様に増加した。従って、IL-1raは、テレピン油処置後の
血清コルチコステロン濃度の調節には関与していないこ
とがわかった。

【０１０８】実施例５：細菌感染に対する宿主防御にお
けるIL-1の機能 L. monocytogenes感染および解析 L. monocytogenes 1b 1684細胞は、Akio Nakane博士（H
irosaki Universityof Medicine）より提供を受けた。
感染のための生存したL. monocytogenesを、0.01 Mのリ
ン酸緩衝化塩類溶液（PBS）により希釈し、感染のため
の様々な濃度にした。

【０１０９】感染に使用したIL-1α/βのKOマウスおよ
びIL-1raのKOマウスは、129×C57BL/6ランダム雑種系統
であった。齢が2-4ヶ月齢の間で適合したメスマウスを
使用し、マウスはSPF条件下において飼育した。

【０１１０】マウスに10⁴CFU（IL-1のKOマウス）または
2×10⁵CFU（IL-1raのKOマウス）の生存したL. monocyt
ogenesを静脈内（i.v.）注射した。細菌の平板培養のた
めに、動物から注射後2または5日後に肝臓および脾臓を
無菌的に摘出し、重量を測定し、そして1％の3-（（コ
ラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）-1-プロパンス
ルホネート（CHAPS）を含むRPMI-1640培地中で、Dounce
グラインダーを用いて10％のホモジネートを調製した。
組織溶解液は、Triptic大豆アガー（Difco Laboratorie
s, Detroit, Mich.）上で、連続10倍希釈をして平板培
養し、37℃で一晩インキュベートしそしてコロニー数を
計測した。

【０１１１】死亡曲線のために、マウスのそれぞれの群
に、2×10⁵CFU（IL-1α/βのKOマウス）または2×10⁶
CFU（IL-1raのKOマウス）の生存したL. monocytogenes
を含む0.2 mlの溶液をi.v.投与した。感染したマウス
は、生存について毎日モニターした。

【０１１２】脾臓および肝臓における、L. monocytogen
esの複製 IL-1α/βのKOマウスおよびIL-1raのKOマウスに、L. mo
nocytogenesをi.v.感染させた。非致死量（10⁴CFU）の
L. monocytogenesをIL-1α/βのKOマウスに対して感染
させた場合、図13Aに示されるように、IL-1α/βのKOマ
ウスは、対照群よりも感染に対してより感受性が高かっ
た。2日目および5日目の時点でのIL-1α/βのKOマウス
脾臓および肝臓における菌数は、対照マウスにおける菌
数よりも高かった。このことから、非特異的（2日目）
および特異的（5日目）の免疫応答が、これらのマウス
においては欠損していたことが示唆される。

【０１１３】対照的に、IL-1raのKOマウスには細菌をよ
り高い濃度で感染させた（2×10⁵ CFU）にもかかわら
ず、対照マウスよりも菌数が少なかった。このことか
ら、2日目および5日目の両方において対照マウスよりも
IL-1raのKOマウスの方がより効率的に細菌を排除してい
ることが示唆される（図13B）。

【０１１４】L. monocytogenesに対する欠損マウスの感
受性 L. monocytogenesに対する致死性を調べるため、動物を
多量の細菌に感染させた。感染させたマウスは、通常、
感染後4日目および7日目の間に死亡する。図14Aに示す
ように、2×10⁵の細菌を感染させた場合、IL-1α/βのK
Oマウスでは生存率がわずか20-30％を示すのみであるの
に対して、野生型の動物では同量の細菌感染で80％が生
存する。これに対して、IL-1raのKOマウスは、IL-1α/
βのKOマウスを使用した実験よりも10倍量のL. monocyt
ogenesに対してさえも死亡しなかった（図14B）。その
ヘテロ接合体の産仔では、その菌数で50％の死亡率であ
った。これらのデータから、L. monocytogenes感染に対
する宿主防御においてIL-1α、IL-1βおよびIL-1raのバ
ランスがその機能に対して中心的であることが示唆され
る。

【０１１５】実施例６：自己免疫疾患におけるIL-1 マウス IL-1raのKOマウスは、実施例１に記載したように作製し
た。IL-1ra遺伝子欠損129×C57BL/6雑種マウスは、IL-1
ra遺伝子の欠損を原因として、C57BL/6またはBALB/cマ
ウスの遺伝的背景のもとでどのような表現系を示すかを
調べる目的で、C57BL/6またはBALB/cのいずれかの系統
に5世代にわたって戻し交配した。戻し交配にかかる時
間を節約するために、人工授精を以下の様に行った。そ
れぞれの世代においておよそ5週齢のヘテロ接合体メス
マウスに、過排卵処理のために、ろ胞刺激ホルモン（FS
H）および性腺刺激ホルモン（黄体形成ホルモンとし
て、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；hCG）を投与し、野
生型オスマウスと交配した。交配後2日目に、8細胞期胚
を回収し、一晩インキュベートし、そして胞胚を偽妊娠
マウスに移植した。次いで、F₅ヘテロ接合体マウスを兄
妹交配させてホモ接合体変異マウスを得た。

【０１１６】臨床評価関節炎の発生率は、肉眼的に判断する。それぞれの関節
は、腫脹と発赤の程度について毎週調べ、そして重症度
をそれぞれの足について以下のように0から3まで等級づ
ける。等級0＝腫脹なし、赤みなし。等級1＝関節の軽度
の腫脹および／または肉趾の発赤。等級2＝関節の明ら
かな腫脹。等級3＝関節の重度の腫脹および固定。重症
度のスコアは、四肢に対して測定する（個々のマウスに
対して最大12ポイントである）。

【０１１７】組織学踵関節を10％リン酸緩衝化ホルマリン中で固定し、10％
EDTA-4Na中で脱灰し、そしてパラフィンに包埋した。切
片はヘマトキシリン／エオジンで染色した。

【０１１８】抗体力価血清中のIgGおよびIgMの濃度は、酵素結合イムノソルベ
ントアッセイ（ELISA）により以前に報告されたように
決定した。簡単に述べると、ポリビニル製のマイクロタ
イタープレートを、PBS中50μlのモノクローナルラット
抗IgG抗体（γ鎖特異的、0.5μg/ml、Zymed）または抗I
gM抗体（2μg/ml、Zymed）で、4℃で一晩コートした。
血清中のIgGに対する自己抗体（リウマチ因子：RF）の
力価測定には、プレートをTBS（25 mM Tris-HCl、140 m
M NaCl、pH 7.4）中50μlの熱変性ウサギIgGで、4℃で
一晩コートした。プレートをTBSで洗浄した後、プレー
トを1％のスキムミルク（Coop）-5 mM EDTA-0.02％NaN₃
-TBS（ブロッキング緩衝液）で、室温で1時間ブロッキ
ングした。次いで50μlのブロッキング緩衝液希釈マウ
ス血清をそれぞれのウェルに添加し、そして室温で1時
間インキュベートした後、0.05％Tween 20-TBSで洗浄し
た。ブロッキング緩衝液中50μlのアルカリフォスファ
ターゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Zymed, San Francisc
o, CA）または抗マウスIgM抗体（Zymed、1/250希釈）を
二次抗体として添加し、そして室温で1時間インキュベ
ートした。Tween 20-TBSで洗浄した後、50 mM NaHCO₃-5
mM MgCl₂（pH 9.5）中1 mg/ml p-ニトロフェニルリン
酸（Sigma Chemical Co.）100μlを添加し、そして室温
で1時間インキュベートした後、415 nmでの吸光度をELI
SAマイクロリーダー（Colona, MTP-120）により測定し
た。

【０１１９】加齢IL-1raのKOマウスにおける、リンパ組
織の拡張 IL-1raのKOマウスの体重増加が不十分であるため、それ
らマウスを6ヶ月まで飼育し、その身体的状態を観察し
た。IL-1raのKOマウスは、そのヘテロ接合体産仔と比べ
て6ヶ月齢の時点でかなり痩せていた（p<0.02）。129×
C57BL/6の背景を有するIL-1raのKOマウスのほとんどす
べてにおいて、巨脾腫症（splenomegaly）が観察された
（図15A）。脾臓細胞数は、脾臓重量にしたがって増加
した（表4）。IL-1raのKOマウスがそのヘテロ接合体産
仔より小型であるため、脾臓重量／体重比はIL-1raのKO
マウスにおいてより顕著に増加した（p<0.05、オスマウ
スおよびメスマウスの両方において）。これらマウスの
脾臓細胞の全数は増加したが、FACS解析ではT細胞およ
びB細胞、そして脾臓中のCD4⁺細胞およびCD8⁺細胞の集
団中に明らかな変化はないことが示された（図15C）。
これと対照的に、リンパ節細胞集団は若干影響を受ける
ようであった。B220⁺細胞の比率はヘテロ接合体産仔と
比較して3.5倍に増加した（図15D）。IL-1raのKOマウス
の巨脾腫症と比べてそれほど顕著ではなかったが、IL-1
raのKOマウスのリンパ節腫脹も観察された（図15B）。

【０１２０】

【表４】ｎ；実験で用いたマウスの数^* 平均±SDを示した。 § p<0.05IL-1raのKO BALB/cマウスにおける関節炎の発症本発明者は、異常リンパ組織および異常免疫応答が129
×C57BL/6の背景を有するIL-1raのKOマウスにおいて観
察されたことを示した。近交系IL-1raのKOマウスにおい
て免疫応答を研究するために、これらのマウスをC57BL/
6およびBALB/cの背景を有するマウスと戻し交配を行っ
た。興味深いことに、BALB/c系統と戻し交配したIL-1ra
のKOマウスにおいては、関節炎に似た関節の腫脹および
赤みが観察された。関節腫脹は後跂において顕著であっ
た（図16A）。これらの表現型は、5週齢で早くもあらわ
れ始め、そして発症率はマウスが13週齢を迎える頃まで
徐々に増加した（図18A）。13週齢までにすべてのIL-1r
aのKOマウスは関節炎を発症したが、野生型またはヘテ
ロ接合体産仔では全く起こらなかった。

【０１２１】関節炎スコアはまた、IL-1raのKO BALB/c
マウスにおいて徐々に増加し（図18B）、そして患った
マウスのほとんどすべてにおいて、13週齢時に重度の腫
脹と赤みが両側の足関節にみられた（6ポイント）。関
節炎の発生率およびスコアは、オスとメスとで顕著な相
違はなかった（図18）。

【０１２２】組織学的解析により、IL-1raのKO BALB/c
マウスにおいて、肉芽組織の侵襲により引き起こされる
関節のびらんを伴う顕著な滑膜炎症および関節周囲炎が
示された（図16BおよびC）。滑膜細胞の増殖および好中
球の侵襲、そしてフィブリンの沈着が、関節腔内で観察
された（図16Cおよび図17D）。関節のびらんは顕著であ
り、そして破骨細胞が観察された（図17E）。これらの
炎症性像は足根骨関節および中足骨関節において、そし
てさらにいくつかのケースでは、距骨および脛骨中でみ
られた。足関節の病変はヒトの関節リウマチの病変と類
似した。この結果から、これらのマウスは関節リウマチ
の病態モデルとして利用できることが分かった。

【０１２３】一方、C57BL/6系統と戻し交配したIL-1ra
のKOマウスは、6ヶ月齢時点でも関節炎を発症しなかっ
た。このことから、疾患に対する遺伝的背景の影響が示
唆された。

【０１２４】IL-1raのKO BALB/cマウス血清におけるIg
濃度 RAの発症において自己免疫の関与が示唆されるため、本
発明者は関節炎を起こしているIL-1raのKOマウスにおけ
る血清中自己抗体濃度を測定した。これらKOマウスの血
清中IgM濃度は、その対照産仔と比較して上昇していな
かった（図19A）。

【０１２５】次いで本発明者は、IgGクラスRFの血清濃
度を測定した。図19Bに示されるように、マウス間の変
化は比較的大きいものの、血清中RF濃度はこれらのKOマ
ウス中で増加した。RF濃度は、必ずしも関節炎の重症度
スコアとは相関しなかった。関節炎を発症しなかった野
生型産仔およびIL-1raのKOマウスのヘテロ接合体産仔中
では、RF濃度の上昇はみられなかった。この結果、これ
らのマウスでは自己抗体価が上昇しており、自己免疫疾
患のモデルとして利用できることが示された。

【０１２６】

【配列表】 <110> Oriental Yeast Industry Co. Ltd. Yoichiro, IWAKURA <120> Knockout model animal for Interleukin-1 associated diseases. <130> 981207 <160> 14 <210> 1 <211> 1974 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 alpha gene. <400> 1 aagtctccag ggcagagagg gagtcaactc attggcgctt gagtcggcaa agaaatcaag 60 atggccaaag ttcctgactt gtttgaagac ctaaagaact gttacagtga aaacgaagac 120 tacagttctg ccattgacca tctctctctg aatcagaaat ccttctatga tgcaagctat 180 ggctcacttc atgagacttg cacagatcag tttgtatctc tgagaacctc tgaaacgtca 240 aagatgtcca acttcacctt caaggagagc cgggtgacag tatcagcaac gtcaagcaac 300 gggaagattc tgaagaagag acggctgagt ttcagtgaga ccttcactga agatgacctg 360 cagtccataa cccatgatct ggaagagacc atccaaccca gatcagcacc ttacacctac 420 cagagtgatt tgagatacaa actgatgaag ctcgtcaggc agaagtttgt catgaatgat 480 tccctcaacc aaactatata tcaggatgtg gacaaacact atctcagcac cacttggtta 540 aatgacctgc aacaggaagt aaaatttgac atgtatgcct actcgtcggg aggagacgac 600 tctaaatatc ctgttactct aaaaatctca gattcacaac tgttcgtgag cgctcaagga 660 gaagaccagc ccgtgttgct gaaggagttg ccagaaacac caaaactcat cacaggtagt 720 gagaccgacc tcattttctt ctggaaaagt atcaactcta agaactactt cacatcagct 780 gcttatccag agctgtttat tgccaccaaa gaacaaagtc gggtgcacct ggcacgggga 840 ctgccctcta tgacagactt ccagatatca taaaagcagc cttatttcgg gagtctattc 900 acttgggaag tgctgacagt ctgtatgtac catgtacagg aaccttcctc accctgagtc 960 acttgcacag catgtgctga gtctctgtaa ttctaaatga atgtttaccc tctttgtaag 1020 agaagagcaa accctagtgg agccaccccg acatatgata ctatctgtta ttttaaagag 1080 taccctatag tttgctcagt actaatcatt ttaattacta ttctgcatgg cattcttagg 1140 aggatcaaaa agactctaca catattacag atgggttaac aaagggataa aacaactgaa 1200 aagcacactc aatgcatttg gaatataaat tcacagacca atctcactgt gcaccttcgg 1260 cttcaaaatg ccagttgagt aggataaagg tataagaact taatgctgtc attttcaaaa 1320 ggaaggggac aatagctaca tctttcctac ctcagtgggt tttactccag tgagatcatt 1380 tggatgaaat cctcctgtaa cagacctcaa gaaggagaca gactgttgaa tgttattttt 1440 aagttatttt atatatgtat ttataaatat atttatgata attatattat ttatggaaca 1500 tccttaaatc ctctgagctt gacaggcatc ctcacagcag gattttctag gtggtcagtt 1560 agatatagtt tcctctagag caccatgcta cagactttac actttttcca cagccacgaa 1620 gctctctgta cattcctgta cttgggagcc ctttcatcat gatcttaatc tgtactgttt 1680 actttgttca tctaaaatga taattgagtc agtctttttc cctcccatcc ttaaagctgt 1740 ctgggtattc ttacatcatt cagtctcacc tgtaactaac accaaccatc taaagatgga 1800 aagagcttaa ctgtgacaac cacatcactg ttacctgaag tttcttttct agaatgtaat 1860 cagtgtttcc cctggattcc aatttttttt tcaaaccaca gtatcatgta actatcaaca 1920 ataacaatca actcattatt attaatcata attaaataaa acaagtttga gctg 1974 <210> 2 <211> 1339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 beta gene. <400> 2 tgcagggttc gaggcctaat aggctcatct gggatcctct ccagccaagc ttccttgtgc 60 aagtgtctga agcagctatg gcaactgttc ctgaactcaa ctgtgaaatg ccaccttttg 120 acagtgatga gaatgacctg ttctttgaag ttgacggacc ccaaaagatg aagggctgct 180 tccaaacctt tgacctgggc tgtccagatg agagcatcca gcttcaaatc tcacagcagc 240 acatcaacaa gagcttcagg caggcagtat cactcattgt ggctgtggag aagctgtggc 300 agctacctgt gtctttcccg tggaccttcc aggatgagga catgagcacc ttcttttcct 360 tcatctttga agaagagccc atcctctgtg actcatggga tgatgatgat aacctgctgg 420 tgtgtgacgt tcccattaga cagctgcact acaggctccg agatgaacaa caaaaaagcc 480 tcgtgctgtc ggacccatat gagctgaaag ctctccacct caatggacag aatatcaacc 540 aacaagtgat attctccatg agctttgtac aaggagaacc aagcaacgac aaaatacctg 600 tggccttggg cctcaaagga aagaatctat acctgtcctg tgtaatgaaa gacggcacac 660 ccaccctgca gctggagagt gtggatccca agcaataccc aaagaagaag atggaaaagc 720 ggtttgtctt caacaagata gaagtcaaga gcaaagtgga gtttgagtct gcagagttcc 780 ccaactggta catcagcacc tcacaagcag agcacaagcc tgtcttcctg ggaaacaaca 840 gtggtcagga cataattgac ttcaccatgg aatctgtgtc ttcctaaagt atgggctgga 900 ctgtttctaa tgccttcccc agggcatgtg aaggagctcc cttgtcatga atgagcagac 960 agctcaatct ctaggacact ccttagtcct cggccaagac aggtcgctca gggtcacaag 1020 aaaccatggc acattctgtt caaagagagc ctgtgtttcc tccttgcctc tgatgggcaa 1080 ccacttacct atttatttat gtatttattg attggttgat ctatttaagt tgattcaagg 1140 ggacattagg cagcactctc tagaacagaa cctagctgtc aacgtgtggg ggatgaattg 1200 gtcatagcct tgcacttgag gtctttcatt gaagctgaga ataaataggt tcctataata 1260 tggatgagaa tttttatgaa tgaagcatta gcacattgct ttgatgagta tgaaataaat 1320 ttcattaaac aaacaaaca 1339 <210> 3 <211> 1877 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> cDNA to mRNA for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 3 ccctgaaatg gcagtcgcta gtctctattg ccttgctgtg gcctcgggat ggaaatctgc 60 tggggaccct acagtcacct aatctctctc cttctcatcc ttctgtttca ttcagaggca 120 gcctgccgcc cttctgggaa aagaccctgc aagatgcaag ccttcagaat ctgggatact 180 aaccagaaga ccttttacct gagaaacaac cagctcattg ctgggtactt acaaggacca 240 aatatcaaac tagaagaaaa gatagacatg gtgcctattg accttcatag tgtgttcttg 300 ggcatccacg ggggcaagct gtgcctgtct tgtgccaagt ctggagatga tatcaagctc 360 cagctggagg aagttaacat cactgatctg agcaagaaca aagaagaaga caagcgcttt 420 accttcatcc gctctgagaa aggccccacc accagctttg agtcagctgc ctgtccagga 480 tggttcctct gcacaacact agaggctgac cgtcctgtga gcctcaccaa cacaccggaa 540 gagcccctta tagtcacgaa gttctacttc caggaagacc aatagtactg ccgaggcctg 600 taataatcac caactgcctg atcactctgg ccatcattgg ggcctgagga acaacttttg 660 cagggtgtat gtacagtaga aggagacaga agagttctga tgatagatct ctgcctcagt 720 ctgttggctg gcctaatccc catgatgatt ccagaataat cttgcaaatt ggatcatggc 780 aggtgcttgt tcaaagccct ttcttgttgc ctctgccatc tgggtgaagt ctagaccact 840 tgcttggcct aggtgtcttc tgctctacca cccaccctac ccctgccaca aacacacact 900 ttttttgttt ttgttttttc cattgttctg cacttccaca gtccagacca atcaagtcac 960 ttgacaatat gccccaagtg actcccttac cctgttttat aaacctgtgc ctgtctatgg 1020 agaaggtttt aattctcctt gttattcatt ttgggctttt tgatgaaacc accagggcat 1080 cacatatact aagcatgtgc tctaccatca tgctatgctt ccagctcagg ggggcacttt 1140 taaggatcta gaaaacagaa attaaggatc tcatagttat tttattaggc cagccttatt 1200 ccatgtcggc aagaggtttc ttgtggaaat tatgtccttt ctgagaggag ctggggatta 1260 gatgctcctg catttgtgaa atggttataa gcatagaaaa ataggtggta agctttcctt 1320 ctttccttat tttgtgtgat gccttaaact gaaaagttaa aaattgatgg attgtagcat 1380 tcccataatc tcccccttct ttttttttcc tttggaaatg tccaatagtc tatattcctc 1440 tgtcccgccc aaacaccatc ttcactccaa gcctaccaca gatgcctgaa gaagttcctc 1500 actatctgca aatgtggctc tcaggccctt cctgatgtga tgaatgaatc tactaatcat 1560 ttcttgacca ttcattttat cacttctaac cttgaaacat gtggaagtag ctatgttcct 1620 gactgtttcc tctgccagac aatgaactct ggagatcagg gagcttcgtg tgtgtgtgtg 1680 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgcg tgcgcgcgca cgtgcatgca catgctatgt 1740 attgggtccc tccaaggatg aaccctctct ttggcttaga aggcactcag agaatatgtg 1800 ttattcgtgc tcacggaaag tttcttactc atccctgtga ctttggcttt attttacaat 1860 aaaacactga aaatgtc 1877 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 alpha. <400> 4 cttggccata ctgcaaaggt catg 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence in lacZ-pA cassette. <400> 5 gaggtgctgt ttctggtctt cacc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 beta. <400> 6 gcgaatgtgt cactatctgc cacc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence of genomic region of IL-1 receptor antagonist. <400> 7 gctgtgatag caacagtttg tacc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide for amplifying sequence in neo cassette. <400> 8 gactgccttg ggaaaagcgc ctcc 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying cDNA sequence for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 9 cctcgggatg gaaatctgct g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying cDNA sequence for IL-1 receptor antagonist gene. <400> 10 aggcctcggc agtactattg g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying genomic sequence of IL-1 receptor antagonis t gene. <400> 11 gactcggagt acctgtcatg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for amplifying genomic sequence of IL-1 receptor antagonis t gene. <400> 12 gctctggaca tatggcatgt g 21 <210> 13 <211> <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> Genome sequence of mouse IL-1 beta gene <400> 13 aagtgcgtgt ctctccagaa gcccctgcta acacagttga tggagagcac agaagcacca 60 tccagttacc aaactccaac tgcaaagctc cctcagctta agcacaagga ggcgagagag 120 gtgacacact tctgggtgtg catctacgtg cctacctttg ttccgcacat cctgacttaa 180 aatgtacagc taacccagga aaacccaata tttttaatat tgacaccatc tgcacaattg 240 tccaggggga aataatgccc atttccacca cgatgacaca cttgcgaatg tgtcactatc 300 tgccacccct tgacttccag ggattagaaa ttatttcagg gtagcaatag cctcttcccc 360 taagaattcc catcaagctt ctcccccctc ccccaccctt cagttttgtt gtgaaatcag 420 ttaacccaag ggaaaatttc acagctcttc acttctgctt tttaggacta taaaacaagg 480 gagggaaaac aagttggaca acaaaccctg cagtggttcg aggcctaata ggctcatctg 540 ggatcctctc cagccaagct tccttgtgca agtaagtctc tctctctctc tgtctctctc 600 tctctctgtc tctctctatc tctctctctc tgtctctctc tctctgtctc tgtctgtctc 660 tctctctgtc tctgtctgtc tatctctctc tctctctgtc tgtctctgtc tctctctgtc 720 tgtctctctc tgtctctctg tctctctctc tgtctctctc tgtctctctc tctctctctc 780 tttccccccc ccccactgat ggactttggg ctttttattt ataaaaagta gctgtacctc 840 catggtttgt gaagtactct ggaaatgagt actgtctgta tagccgctga catctaaaag 900 gcagctcctg tcttgtagga aagcttcttt attagggttt ggctctgctg ttgcttcctt 960 ccagagcatc ttcctaatgc tgttccccat gttgtagtga ccccccacac accctaaaat 1020 tattttcatt gctacttcat aactataatt ttgctactgt tatgaagtgt aaatatctgt 1080 gttatccaat ggtcttaggt gacccctgtg aaagggccac ttgactccaa aagggccact 1140 ggtctagacc tatacaacgg ctcctccgtt ccttcattcc tcagagacca gtttagcatg 1200 cctgccctga actagagcta agagaaacac atatgaagga cgcccctcgg ggagctaacg 1260 ctggatgccc acccactttc tttcttcaca caggtgtctg aagcagctat ggcaactgtt 1320 cctgaactca actgtgaaat gccacctttt gacaggtcag tgggtactgg agagtggtca 1380 catatccagc actctgcttt caggaatgga gggctatcta ctttcagagg ccagagagtt 1440 ccccaactca tctccttcag tggctataga gttcaagcaa cctagcttaa agactgacct 1500 cttcactccc aagcccaacc tagggactta ggtgctgtca ctacagggac tcctacagat 1560 gcaatggtaa gaaaaacttc cacatggaca ggataagaga ctcttttgca aagtctggct 1620 tggaagcaaa aggcagagag ctcagacttt agctaactct gctagtctag aatttaggtg 1680 tcagaagtca acagagagca accagagcac ccacttacct ggcccagaat ctgcttctag 1740 actgttactt acgtagcact gtagaacttc ccagaagtct ttgggaagct ttaagagtca 1800 tggtaggtgt ggttttatga acaatggaag tctgtctgct cagtattgat aaggagctat 1860 cacttgacca catctgtttt cattacagtg atgagaatga cctgttcttt gaagttgacg 1920 gaccccaaaa gatgaaggtg agactctgag cttggctcct aacctgtgga gggactgtgg 1980 catgggaaaa aaaaacccaa acgggaaggg atatgggact gccttgctcc caggctattt 2040 tgtgatggga ttattttgcc tctttcagtg acatagataa ggcaacccac acactgacct 2100 ggctcccaca caggtttcat ttaccacagc cacagaccaa ggcttgctga tggcaatcat 2160 ggtcttttat gctaagaaga cagtatggtc ttcaacatac atttagtccc cccttgagag 2220 agatggagct taatctgacc acttaaatcg aactctggat ctagagagca tgaccttcag 2280 aattagcatc tcttccttct ctgccaaaga ccagtttcgc atgttcctgg ggagattaag 2340 ataataagaa ataagtgata taaacaaaaa gttagttagg atttttaaaa ataacctgtg 2400 gccttagaca agacctttca ttgctgtgtg atcatagaca gtccccactg tgtcctttgg 2460 gaaacacagg tcagaagatc tctgaaatgt tggcgatctg tcacaacctt ccattctgaa 2520 gtgttttaag tgctggccaa gtccatccta gcacaagggc acctttccag acttgctctc 2580 atgaagagcc atgttgcatc ccagcttgcc cttcctatga tgactgagaa cgctctaatg 2640 ccacatggcg tcagtccagc cacgtcactg cccactcagg aggcagctgt ttctctcaga 2700 cctcttccca atccctcaac agtctccccc agctacagaa tctagtcctt agcttacatg 2760 aatgtatttt aagaccactc taactagtta gttcagcctt gggtgacgcc tctcactttc 2820 cagccaggct ctgtccccac tgcctgctcc agaacatggc tttccctgga gcctctactc 2880 tggacagaaa cttctctccc aatcaacctt tcctttacac tattgaaatg atctatcgct 2940 gtccttcaag ctttgaaact gttatcatgc ctcaaggcaa ctgtgtttag gccttaatgt 3000 ggtgtttctc caaagaacag aaaagtggtg acatatttta caaacaaaag ctatgcttat 3060 agtgtctgct aaatattcct atgagaaaaa gaatgtatgg gaagccattg agagcctgtt 3120 gggtgatctc cgttgaatag aagacaacat gacatactga catgagaaat taaataacat 3180 gatgtttgag cagcaaggat accaaaagat gaaacgttta agtaggtcta attatacagt 3240 gaggcaaggt ctgtacaaga aagataaagt agaaatgagg tttactatag agaatgccag 3300 gaagcctgtg tctggttgcc atgtacccct gggtaggcca attaaattct ctgggctcca 3360 catagacagg gattgtggtt aagaacttat ctcccgggcc cttggtgttc tctggggttg 3420 atgtaggagt cctctggtct gatgacttga tgtgctcact gcctggtttc tccacagggc 3480 tgcttccaaa cctttgacct gggctgtcct gatgagagca tccagcttca aatctcgcag 3540 cagcacatca acaagagctt caggcaggca gtatcactca ttgtggctgt ggagaagctg 3600 tggcagctac ctgtgtcttt cccgtggacc ttccaggatg aggacatgag caccttcttt 3660 tccttcatct ttgaagaagg tacttaatga ggactgagag cagacagcag accttcgctc 3720 tggtccttct cagcccacct cttagaactc acacgcccct caagtgcaag acccttagtg 3780 ctagacattc caaccattag aagaaaatga ggaaacctcc aaacaaatca gttctatctt 3840 gagctgatta acttataaaa aggctttaat gatgcttaca cttgcaactc aaccattgac 3900 ttgccaagta ctttggctta tactagaggt tgtgaatctc acaatttccc agttaagctg 3960 gtcttattac tggcatcgtt tcatgcaagg accactactg ctagtcccta gtgactggtt 4020 ataacactgc agcttatctc acgatgccaa atccaatgtt gttgcccagc ccactcccag 4080 tgtttttata cccccactaa aattagaata gaatcttgac tgcacatgct taggtgttgc 4140 tcaataagcc aaattctgct gcttcacttc acagtgcttg catttctaat tatctgccta 4200 aacaacatct gctcttgaac tttcagagcc catcctctgt gactcatggg atgatgatga 4260 taacctgctg gtgtgtgacg ttcccattag acaactgcac tacaggctcc gagatgaaca 4320 acaaaaaagc ctcgtgctgt cggacccata tgagctgaaa gctctccacc tcaatggaca 4380 gaatatcaac caacaaggta agtaggagca tcttggtttc cctttctggc ctcctggcag 4440 cctactgggt ccctgtgttt taaaatggaa cactatggtc attatacaaa aaaagaaaag 4500 gaaaaagaaa gggaaaggaa agaaggaagg aaggagagag agacagagac agagacagag 4560 acagaacgaa aaaggaccat ttttccagcc cagtcatata gggataacac attagtgtga 4620 agtcatttga tggacatgca ataactgcct gtgggttctt tttccctcat ttgaggctga 4680 aatgtagatg gtagagaatt gatatgtcca tttttgttcc cagtcctatc cctcgtgctg 4740 atatccttcc caccaatacc acacacacag ttccttgaag ggaggtttgc tgactatcag 4800 gagcatacat ctctcttcca taataacaag cattccaagc gcggtcaggg cctctttaga 4860 tgatggtgtg gacctggcac cacaccacca cagctgaggg gacaagagct aacagcagca 4920 gtgtgtgctg tctcctttta gcttctgatc ttagaagctt tggagggagc tgtctactct 4980 ggtccaggtg aaaagaatct tattgcttta taccttttaa aaagaataat tcttatttct 5040 tgataaagtc ataaaagcag ccaggggcct ccaattgagg tactgtggct aagatcaaag 5100 tggggggggt ctcttttttg gagccactct ccccagctaa tagagttcta cctgcctcct 5160 gctctatttt cctcaaaacg tgctggcccc taggtccttt taggagcaca gctttgtttt 5220 catagcgacc aaactgtact tctcacgtag acggacacac agcctgccag ccacataaca 5280 gctttagccc ttagagctta acagttagac acctttcgtt cttcattgct gctcctaaga 5340 ggtcctgagg gaatcctgga tcggcctact gaccttgcta ctgtctatga ctatgactgt 5400 atagccctgc tagtccatat cttgtgtctg aggaggctca ttctgggttc acacggggga 5460 ctgcataggc tttgcctgtc acgtctaatg cttgagcccc accctgcatt gctgttccct 5520 tgacccagac tactctcctt tctccagtga tattctccat gagctttgta caaggagaac 5580 caagcaacga caaaatacct gtggccttgg gcctcaaagg aaagaatcta tacctgtcct 5640 gtgtaatgaa agacggcaca cccaccctgc agctggaggt gagtccatca gtagagaagc 5700 ctcccccact gctcaccgaa gactctgcct ttacttactt cccagacatc cacctgcctg 5760 acccgccaga aaacattaga ggtcttcttg acgatttaca taaatataga ataaaattag 5820 cataactttt aagtgcacat aaacctcact gccaccatgg gaaatcaatc ctttttgatg 5880 ctgttgtcat gtcaggccac cgttatcacc cccaacagaa gtcgtagcat caaggatgaa 5940 agagttgtat atggtgacag tttttcctcc tttgacagag aacagtttgg gagaatgcag 6000 tgaaaggttc aaccaacgat cctcagacct gtactggcac ttgtgacatt cctaacaaaa 6060 gcttcatttc caagctgatg ccactctatc cagggattta gggggaactg tgacaaaaat 6120 gcctggaaac tgggtaccct tgggagcttt aatataattc tcacccatat ggtaggattc 6180 agaaaaaata tatatataac aaaggttcct tcagtgatta tagaaagatg gggttcagca 6240 gtaaagaatg aggcctcaag ttccacaacc ttctttttca ttctcttctc cagcagccct 6300 gagaatatgt ctaccgtggt agctttatcc tttctgtcat acatgcaaca tgcacacgga 6360 cacagacgtt aacacaattc tttttctact ttctgcagag tgtggatccc aagcaatacc 6420 caaagaagaa gatggaaaaa cggtttgtct tcaacaagat agaagtcaag agcaaagtgg 6480 agtttgagtc tgcagagttc cccaactggt acatcagcac ctcacaagca gagcacaagc 6540 ctgtcttcct gggaaacaac agtggtcagg acataattga cttcaccatg gaatccgtgt 6600 cttcctaaag tatgggctgg actgtttcta atgccttccc agggccattg ttaaggagct 6660 cccttttcgg tgaatgagca gacagctcaa tctccagggg actccttagt cctcggccaa 6720 gactggtcgc tcagggtcac aagaaaccat ggcacattct gttcaaagag agcctgtgtt 6780 ttcctccttg cctctgatgg gcaaccactt acctatttat ttatgtattt attgattggt 6840 tgatctattt aagttgattc aaggggacat taggcagcac tctctagaca gaacctagct 6900 gtcaacgtgt ggggatgaat tggtcatagc ccgcactgag gtctttcatt gaagctgaga 6960 ataaataggt tcctataata tggatgagac tttttatgaa tgaagcacca gcacattgct 7020 ttgatgagta tgaaataaat ttcattaaaa caaacaaaca aaaaaaagtt ctgcctggct 7080 attgacttct cttagagttt <210> 14 <211> 6350 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> Genome sequence of mouse IL-1 receptor antagonist gene <400> 14 ggatctggtt tttttttggg ggggaggggg atcgggacag ggggatcagc aaatagactc 60 ggagtacctg tcatgcaaat gagggagtct ggttttcatt gtgctcttct tcccaggaac 120 accatgaagg ggaaacagag aacttaattt tggggaaatt acacagggta agggggagga 180 gatcagttac aacacaccat tgcgacactt tcagggttga cagcgacagc agtaaaggtt 240 tctctttttg gaaatatgag ggtttttccg cttctgacag tggaacggaa tgacagcagc 300 acaggctggt gaatgactac tttctttata agcaaccacc ttgagcctga aatggcagtc 360 gctagtctct attgccttgc tgtggcctcg ggatggaaat ctgctgggga ccctacagtc 420 acctaatctc tctccttctc atccttctgt ttcattcaga ggcagcctgc cgcccttctg 480 ggaaaagacc ctgcaagatg caagccttca ggtaagtctt ccaaagacac aggattgcat 540 agaccaagga ccagagacac atgccatatg tccagagcat atgcaggaat aggagatata 600 tatacatgta taatatatat aatgcgtgtg tgtatgtgtg tatacacata tgtatgtatg 660 tatgtgtata tatatatata tatatataat gtgtgtgtat acacatatgt atgtatgtgt 720 atatatatat atatatatat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatcc ttgattcaag 780 aacagcatgc taaatgcagt ctttaagtct tatgttttaa aatattccat gcatggacaa 840 caagacagtt aactgtgctc actttctcag acacctagat gttcagtaag tgatggacag 900 gcatccggga ataatgctag ctttgggatc gagcaaagag gaatacttca gcaggacaca 960 gtcaaaggct cagaccaaca gtctacactc tgtatctgtg ttgacttgga agatatctct 1020 cgttggagtc cccagtttcc ttatctgtaa catgatactg ctctgatgat aaccccttgt 1080 gtgccttaca gggtgaacac taaatacatg agtgatactg taaccatgtt ctgagaccta 1140 tgctctgaga actgtaaagt gcctgaaaaa taacctgagt tttaaaaatt ggatcaaaag 1200 ccttgggaga tgccatcaac cttatagtaa aaatggcagg cctcgatttt gattttaaaa 1260 tgaataaaga gattgttggt gcatatgatc tgttcttgat ccttcctgag agtgaagtct 1320 gtgttgagtc acttcccctt tgaccctgtc tgctttggat ccacagctgg aggctgggac 1380 tctaactgtg attctataca tctatcccaa ggcaagtctg tcccacagat ccagtaactg 1440 cttcgtgaga tttaccatca tcacatcctc ttagcagcct caagagaggt ccctggagtc 1500 ctgttagcaa gactattgag tcccttgagt ttgaagctca ccagagatat agacaccagt 1560 cacaaaggca caaatactct ttcacgtgca gagtacttgg tttgtcctcc acccatccct 1620 gagctcctag gctgctccaa gctactcaaa aagtcctgtc agctctgctg accaggtaaa 1680 gagataaggg acagatccaa ggtcatatca tcaggcctct taccacacct cacaggtgcc 1740 tgcctctctg gaagccagag ggcctttcac caagaagtca gagagtaaca aacaggccct 1800 ggctgagcta gacaggaagc tgacttattt ccaaggacag ctgtccctgt caggcccaga 1860 gcagatggtc ccacaagagg ttttagttgt agacttgcag gtctaagtag agtagcttga 1920 ggtaggagta gtgaagccag actagcttgg ctacaataca ttctaaccct tgaacctgta 1980 acactatgat gtggtggcca cgagctacaa gtggccatct aaatttacac ataaacgcat 2040 gaaagcagaa gaaagtcctg tacctggcaa ctctatttag tggagtgact ataggatgtg 2100 cttgcatcgc ctaagtttct atcagatgct gacgctctat agaaaattct gctaaagtca 2160 tggatgtcca tgctgggatt ctgaggtgag gaacaagaaa aagaggtttt ctgttcacca 2220 gatgtgagag atgggctcat ttcttacatg gtatttgctt aaatcttccc atttgtgtta 2280 tgaacttggt aagtacgaca cttccagcaa gtctagatgt aaattaggtg actctgagga 2340 agctggaaag ggctctgtac tgcctactcc agctaggcca ttttgctttt cagaatctgg 2400 gatactaacc agaagacctt ttacctgaga aacaaccagc tcattgctgg gtacttacaa 2460 ggaccaaata tcaaactaga aggtgagtgg ataacaggga agctggtgta atatggacat 2520 agagtccttt gccctgctcc tctgcctgga ggtgggatgt cctcatttct gttgagttgg 2580 aaatgagaga tttgaccacc aggggacata tgggagtggc ctcaagagag cagaaaagat 2640 aaagactggg tcacaatgct ccagggacac agctgagagg aacagaggcc agaaggcacc 2700 cgggcacctc cttagtcctt ctgtgctggt agtccactat accccagtgt tattcgaact 2760 ctacccttgc cctaggctaa tataacatgt atgtgggctg ggtagcattt ttactgtgga 2820 caccaccctc atcatgtacc ctctaaacta ggacaaagcc acatgaactt ggaggagcat 2880 tacccacaga ttcttcagtt tttcttagtt caggcactta gttgacagaa tctctgtttg 2940 tgagggaacg aagcattact tgtatctcct caggatcccc caagccttct gctttcctgt 3000 atcactcagc agttatgcaa ctggcttttc ctgtctttct agtaattctc ccatgaacac 3060 actcaagcat agaaggtgct ggctttctat tgctacccag taacaggatg gaaaggtgaa 3120 ctgtgtggaa cctattcatg ggccttgtga gcttttgtgc ctctgtctac taacagcaaa 3180 tctgttgact tggaggtctg gttcactgta gaaagtaaag gaaagttggg agcagtgtag 3240 aatctaggaa gctggtcctt acatagagtg tgctcatttg gatcttttgc ttggaggcag 3300 actagaaaga tagagccttc ttgaccttct tgaccttcta gttttataaa aaggaagaca 3360 gaaaatacac acagacgctc ccctaccctt gcctcctctt ctctctttct gacaccatcc 3420 tctactcttc tccagaaaag atagacatgg tgcctattga ccttcatagt gtgttcttgg 3480 gcatccacgg gggcaagctg tgcctgtctt gtgccaagtc tggagatgat atcaagctcc 3540 agctggaggt aagaatctgg tttagctatc aaatccttct aaaacccaat ggttatgaca 3600 acctcaggtg tttctcataa ccctgagcat gcaaagatga gggaggcttt tccttcttca 3660 cagagtacta ttttgaggtc actccttaag cagtttccac aatgttcttg gttgatattg 3720 ggtgtccaag gtggtttctc attctctcaa ctacccttta cgtaacttct ttgcattcag 3780 tcaacactct gagcttcctt aagcgtggtg accaactttt atgagagatt gttccagaaa 3840 gatgagcctc aatgtgaaag tgcttattaa gcttgggctt atgtaagtct attggcagaa 3900 gcctgtgacg tggttgatat ggactcattg tagaaaggta ctgcacaagg atctaaactt 3960 taggaggaga catggtcatt agaggagcac gacctgaacc accatgggtc ttgtgcctcc 4020 taaaccagtt gagcctacct tcttctagca aggtcaattc tcaagactat acactcccaa 4080 gcatcatcta tgctatttat tatctacgct cctaatttac atcccacaca gacctgtgtc 4140 acttactcct ttacctagtc agtagtaatg ggctgttcaa acattatctt gagggattag 4200 ctggacaaac ttttaatcca actgcaaata gccacaagca tgagtttgtt gataactctt 4260 accaatggac aggaacacct tttagaggac tttctcagcc ctcggcaatt acctgaccat 4320 ttcttgactt ccaggaagtt aacatcactg atctgagcaa gaacaaagaa gaagacaagc 4380 gctttacctt catccgctct gagaaaggcc ccaccaccag ctttgagtca gctgcctgtc 4440 caggatggtt cctctgcaca acactagagg ctgaccgtcc tgtgagcctc accaacacac 4500 cggaagagcc ccttatagtc acgaagttct acttccagga agaccaatag tactgccgag 4560 gcctgtaata atcaccaact gcctgatcac tctggccatc attggggcct gaggaacaac 4620 ttttgcaggg tgtacagtag aaggagacag aagagttctg atgatagatc tctgcctcag 4680 tctgttggct ggcctaatcc ccatgatgat tccagaataa tcttgcaaat tggatcatgg 4740 caggtgcttg ttcaaagccc tttcttgttg cctctgccat ctgggtgaag tctagaccac 4800 ttgcttggcc taggtgtctt ctgctctacc acccacccta cccctgccac aaacacacac 4860 tttttttgtt tttgtttttt ccattgttct gcacttccac agtccagacc aatcaagtca 4920 cttgacaata tgccccaagt gactccctta ccctgtttta taaacctgtg cctgtctatg 4980 gagaaggttt taattctcct tgttattcat tttgggcttt ttgatgaaac caccagggca 5040 tcacatatac taagcatgtg ctctaccatc atgttatgct tccagctcag gggggcactt 5100 ttaaggatct agaaaacaga aattaaggat ctcatagtta ttttattagg ccagccttat 5160 tccatgtcgg caagaggttt cttgtggaaa ttatgtcctt tctgagagga gctggggatt 5220 agatgctcct gcatttgtga aatggttata agcatagaaa 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acacaatgac aaagatagca 6120 aatgagccac agacggctcc acccaaccca atagatgaac acttggttca aaatcactaa 6180 agctcaaata ctcccaggtc aaacaccagg taacaagtta atactcaaca aaggggggaa 6240 acaaatgttc cactgaatcc tgtgaccctg tggcgtggtt cacctcctgt gttgtttgcc 6300 atgtgtgctc aggatgagct gattaaagct cttctcaggg gttcagtttt 6350

【図面の簡単な説明】

【図１】 IL-1α遺伝子のターゲティングストラテジー
を示した図である。

【図２】 IL-1β遺伝子のターゲティングストラテジー
を示した図である。

【図３】 IL-1ra遺伝子のターゲティングストラテジー
を示した図である。

【図４】クローン化ES細胞およびヘテロ接合体種間交
配により交配した遺伝子欠損マウスの尾から採取したDN
Aのサザンブロットハイブリダイゼーション解析を示す
写真である。ハイブリダイゼーションは、IL-1α欠損ES
細胞由来のDNAをEcoRIにより制限酵素消化したもの（上
パネル）、IL-1ra欠損産仔由来のDNAをBamHIにより制限
酵素消化したもの（下パネル）のそれぞれに対して、5'
プローブを用いて行った。

【図５】 IL-1αのKOマウス（パネルA）、IL-1βのKO
マウス（パネルB）、IL-1raのKOマウス（パネルC）、IL
-1α／βのKOマウス（パネルD）から採取したマクロフ
ァージ由来のRNAを用いたノザンブロット解析の結果を
表す写真である。

【図６】致死量のLPSを投与した場合のIL-1αのKOマ
ウス（パネルA）、IL-1βのKOマウス（パネルB）および
IL-1raのKOマウス（パネルC）の感受性を示す図であ
る。

【図７】 IL-1αのKOマウスおよびIL-1βのKOマウスか
ら採取した腹腔マクロファージにおける炎症性サイトカ
インの発現について示す図である。

【図８】テレピン油投与後の発熱について示す図であ
る。

【図９】 IL-1αのKOマウス、IL-1βのKOマウス、IL-1
raのKOマウスおよびIL-1α／βのKOマウスにおける、テ
レピン油投与後の脳全体におけるIL-1α、IL-1β、COX-
1およびCOX2のmRNAの経時的発現について示す写真であ
る。

【図１０】 IL-1αのKOマウス、IL-1βのKOマウス、IL
-1raのKOマウスおよびIL-1α／βのKOマウスにおける、
テレピン油投与後の脳内においてmRNA発現の領域特異性
について示す写真である。このうち、レーン1は大脳皮
質、レーン2は間脳、レーン3は海馬およびレーン4は小
脳における発現を示している。

【図１１】 IL-1α／βのKOマウスにおけるテレピン油
誘導2時間後および8時間後の血清コルチコステロン濃度
を示す図である。

【図１２】 IL-1αのKOマウス（パネルA）、IL-1βのK
Oマウス（パネルB）、IL-1raのKOマウス（パネルC）に
おけるテレピン油誘導8時間後の血清コルチコステロン
濃度を示す図である。

【図１３】 L. monocytogenes感染に対する、IL-1α／
βのKOマウス（パネルA）およびIL-1raのKOマウス（パ
ネルB）の脾臓および肝臓における菌数を示す図であ
る。

【図１４】 L. monocytogenes感染後のIL-1α／βのKO
マウス（パネルA）およびIL-1raのKOマウス（パネルB）
の生存率を示す図である。

【図１５】 5〜6ヶ月齢のIL-1raのKOマウスにおけるリ
ンパ組織異常について示す図面であり、巨脾症について
（パネルA）、リンパ節腫脹について（パネルB）、脾臓
細胞のFACS解析について（パネルC）そしてリンパ節細
胞のFACS解析について（パネルD）それぞれ示す図であ
る。

【図１６】 BALB/C背景のIL-1raのKOマウス足関節の組
織学的所見を示す写真である。

【図１７】 BALB/C背景のIL-1raのKOマウス足関節の組
織学的所見を示す写真である。パネルAは、関節腫脹を
起こした後跂の肉眼所見である。パネルBおよびパネルC
は、関節腔内の顕微鏡所見である。

【図１８】 BALB/C背景のIL-1raのKOマウスにおける関
節炎の発生率を示す図である。パネルDおよびEは、関節
腔内の顕微鏡所見である。

【図１９】 IL-1ra欠損BALB/CマウスにおけるIgMおよ
びIgG型リウマチ因子産生について示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者浅野雅秀東京都品川区大崎１−３−21−205

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲノム中のインターロイキン１受容体ア
ンタゴニスト（IL-1ra）遺伝子のDNA領域の一部または
全部を改変することにより、IL-1ra遺伝子を機能不能に
した非ヒト哺乳動物よりなる、自己免疫疾患モデル動
物。
【請求項２】ゲノム中のIL-1ra遺伝子の少なくとも一
部のDNA領域が、外来のIL-1ra遺伝子の対応する領域で
置換されており、その際置換された領域中の一部が改変
されていることにより、ゲノム中のIL-1ra遺伝子が機能
不能にされている、請求項１に記載の疾患モデル動物。
【請求項３】哺乳動物がマウスである、請求項１また
は２に記載の疾患モデル動物。
【請求項４】外来のIL-1ra遺伝子の対応する領域が、
改変したマウスIL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域である、
請求項３に記載の疾患モデル動物。
【請求項５】 IL-1ra遺伝子を機能不能にしたマウス
が、BALB/cマウス系統の遺伝的背景を有する、請求項３
または４に記載の疾患モデル動物。
【請求項６】自己免疫疾患を約13週齢までに自然発症
する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の疾患モデル
動物。
【請求項７】自己免疫疾患が慢性リウマチ性関節炎で
ある、請求項６に記載の疾患モデル動物。
【請求項８】血中IgG濃度が正常動物に比べて増加す
ることを特徴とする、請求項６または７に記載の疾患モ
デル動物。
【請求項９】 IgGのFc部分に対する血中IgG抗体（リウ
マチ因子）濃度が正常動物に比べて増加する、請求項８
に記載の疾患モデル動物。
【請求項１０】自己免疫疾患治療薬をスクリーニング
するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の疾患
モデル動物の使用。
【請求項１１】リウマチ治療薬をスクリーニングする
ための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の疾患モデ
ル動物の使用。
【請求項１２】ａ）IL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域を
クローニングすること；ｂ）IL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域の一部をIL-1ra遺伝
子とは関連しない配列を有するDNAにより置換、または
突然変異を導入することにより改変することを特徴とす
るターゲティングベクターを作製すること；ｃ）胚性幹細胞を前記ターゲティングベクターにより相
同組換えして、IL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域の一部ま
たは全部を改変して、IL-1ra遺伝子を機能不能にしたタ
ーゲティングされた胚性幹細胞を作製すること；ｄ）IL-1ra遺伝子をターゲティングされた前記胚性幹細
胞を胚盤胞内に注入、または8細胞期胚と凝集させるこ
とにより、キメラ動物を作製すること；ｅ）前記キメラ動物のうち、ターゲティングされた胚性
幹細胞が生殖細胞に導入された動物を選択すること；そ
してｆ）前記選択されたキメラ動物を交配し、IL-1ra遺伝子
を欠損した動物を作製すること；の工程を含む、自己免
疫疾患モデル動物の作製方法。
【請求項１３】ｇ）BALB/c系統マウスと少なくとも5
世代の戻し交配をして、BALB/cの遺伝的背景を有するIL
-1raのKOマウスを作製すること；の工程をさらに含む、
請求項１２に記載の自己免疫疾患モデル動物の作製方
法。
【請求項１４】前記IL-1ra遺伝子のゲノムDNA領域
が、SEQ ID No:14の配列を有するDNAである、請求項１
２または１３に記載の自己免疫疾患モデル動物の作製方
法。
【請求項１５】前記ターゲティングベクターが、マウ
ス由来のIL-1ra遺伝子ゲノムDNA領域のうち、エクソン1
のAva I部位からエクソン4のSph I部位までの5.2kbのDN
A領域をIL-1ra遺伝子とは関連しない配列を有するDNAに
より置換することを特徴とする、請求項１２〜１４のい
ずれか１項に記載の自己免疫疾患モデル動物の作製方
法。
【請求項１６】前記胚性幹細胞がマウス由来である、
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の自己免疫疾患
モデル動物の作製方法。
【請求項１７】前記胚盤胞がマウス由来である、請求
項１２〜１６のいずれか１項に記載の自己免疫疾患モデ
ル動物の作製方法。