JP2000210091A - プラスミド、それらの構築およびそれらのインタ―ロイキン―４およびインタ―ロイキン―４ムテインの製造における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組み換えインターロイキン−４（ＩＬ−４）
およびインターロイキン−４ムテインの大量生産を可能
にする発現プラスミドの構築および使用方法の提供。 【解決手段】 ５′から３′への順序で下記の要素を操
作可能に結合して大腸菌の菌株におけるＩＬ−４および
ＩＬ−４の製造のためのオペロンを構築する：大腸菌フ
ァージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオペレータ
ー配列からなる調節可能なプロモーターと、大腸菌ファ
ージＴ７ｇ１０からのリボソーム結合部位と、翻訳開始
コドンと、ＩＬ−４のための構造遺伝子またはＩＬ−４
ムテインと、この構造遺伝子の下流の一つの転写ターミ
ネーター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は組み換えインターロ
イキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−４ム
テインの製造における発現プラスミドの構築および使用
に関する。

【０００２】

【従来の技術】成熟ヒトインターロイキン−４（ＩＬ−
４）は１２９個のアミノ酸から成り、マウスＩＬ−４に
対する相同性が５０％である。ＩＬ−４はＴヘルパー細
胞の分化をＴ_H2表現型（Ｍｏｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｓａ
ｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７，１３８−１４
６，１９９６）に向けることが知られている唯一のサイ
トカインである。ＩＬ−４はリンパ細胞および他の細胞
に２種のサイトカインレセプタ、ＩＬ−４αおよび共通
のγ−鎖（γｃ）、のヘテロ二量体複合体を介してシグ
ナルを送る。拮抗的ＩＬ−４ミュータントが文献に記載
されている（Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．
１１，３２３７−３２４４，１９９２）。Ｃ−末端に近
い３個のアミノ酸（Ｒ１２１，Ｙ１２４およびＳ１２
５）がγｃ−鎖に結合するために重要である。Ａｓｐ
（Ｄ）をこれらの位置へ導入するとレセプタの二量化と
膜を通しての（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）シグナリ
ング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とをブロックする。

【０００３】インターロイキン−４ダブルムテイン（ｉ
ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔｅｉｎ）
（ＩＬ−４ ＤＭ）は位置１２１および１２４で２個の
アミノ酸が変化したＩＬ−４変異体であり、ＩＬ−４
Ｒ１２１Ｄ Ｙ１２４Ｄと呼ばれる。ＩＬ−４ ＤＭは
ＩＬ−４活性およびＩＬ−１３活性の両方をブロックす
ることができる。すべての単一部位ミュータント（ｓｉ
ｎｇｌｅ ｓｉｔｅｍｕｔａｎｔｓ）とは対照的に、こ
のムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）については拮抗的活性はな
んら残留していない。ＩＬ−４ＤＭのこれらの拮抗的性
質はＴ_H2発現および／またはＩｇＥ産性が関係する疾病
の治療に有効であると考えられる（Ｒｙａｎ，Ｊ．Ａｌ
ｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９，１−
５，１９９７）。

【０００４】種々の刊行物に記載されているように、原
核生物を用いて組み換えＩＬ−４およびＩＬ−４ムテイ
ンを産性することができる。残念ながら、記載されてい
るシステムは多くの欠点（低発現レベル、発現ベクター
の低安定性）を持つためＩＬ−４およびＩＬ−４ムテイ
ンの大量生産が不可能であるかあるいは経済的に実施で
きない。

【０００５】効率的かつ安全な発現系の主な基準として
は下記がある： ・高産性収率 ・調節可能な安定的発現 ・発現ベクターの安定性 発現プラスミドのいくつかの特長が上記リストの基準に
重要である（Ｈａｎｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥ
ＣＨ．１６，５４−６０，１９９８）。これらは： ・プロモーター ・リボソーム結合部位（ｒｂｓ） ・相当する遺伝子のコドン使用頻度 ・転写ターミネーター ・耐性遺伝子 ・発現の調節 ・複製起点（ｏｒｉ） である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】インターロイキン−４
（ＩＬ−４）および効率的かつ安全な発現系に関連する
要素のすべてにおける改変を伴うインターロイキン−４
ムテインに対する発現プラスミドを創製した。相当する
発現系の品質と適合性を主に下記の基準に従って分類し
た。 ・ＩＬ−４およびＩＬ−４ムテインの収率 ・プラスミドの安定性 ・誘導能力の維持 従って、本発明の目的は組み換えインターロイキン−４
（ＩＬ−４）およびインターロイキン−４ムテインの大
量生産における発現プラスミドの構築および使用方法を
利用し得るようにすることである。さらに、新規に開発
されたホスト／ベクター系は他のタンパク（サイトカイ
ン、成長因子、可溶性レセプタ、抗体等）の発現によく
適している必要がある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】意外にも、本発明に係る
プラスミドで形質転換したバクテリアは同じ宿主を当該
技術分野において知られたプラスミドで形質転換した後
に観察されるものよりも幾倍も高い発現率（ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ ｒａｔｅｓ）、プラスミドおよび発現安定
性値を与える。従って、本発明のプラスミドは組み換え
インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイ
キン−４ムテインの調製に対して従来知られているすべ
てのプラスミドよりもはるかに有効である。

【０００８】すなわち、本発明に従えば、５′から３′
への順序で下記の操作可能に結合された要素：大腸菌フ
ァージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオペレータ
ー配列からなる調節可能なプロモーターと、大腸菌ファ
ージＴ７ｇ１０からのリボソーム結合部位と、翻訳開始
コドンと、ＩＬ−４のための構造遺伝子またはＩＬ−４
ムテインと、この構造遺伝子の下流の一つの転写ターミ
ネーターとを含む大腸菌の菌株におけるＩＬ−４および
ＩＬ−４の製造のためのオペロンが提供される。

【０００９】

【発明の実施の形態】新規に開発されたベクター系は下
記の要素を含む。 Ｔ５プロモーター ２つのｌａｃオペレーター配列を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ファージＴ５プロモーターは、プラスミドのｐＤ
Ｓファミリーに属するｐＱＥ３０プラスミド（Ｑｉａｇ
ｅｎ）から導かれる（Ｂｕｊａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５５，４１６−４３
３，１９８７およびＳｔｕｅ対してて１５２ｃｓｉｃａ
ｌxpression vector) w of IL-4 and IL-4 muteins imp
ossibleor economically unfeasible.lity of the expr
ession vector) wｂｅｒ ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔ
ｓ ａｎｄ Ｂ．Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｏｌ．ＩＶ，１２１
−１５２，１９９０）。

【００１０】Ｔ７ｇ１０リボソーム結合部位 リボソーム結合部位（ｒｂｓ）はファージＴ７（Ｔ７ｇ
１０リーダー）の遺伝子１０の上流領域から導かれる。
ファージＴ７の遺伝子１０はコートタンパクをコードし
ており、このコートタンパクはＴ７感染後発現される主
要タンパクである。Ｔ７ｇ１０ ｒｂｓはベクターｐＥ
Ｔ−９ａから得られた（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔ ａｌ．，
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，６０−８
９，１９９０）。Ｔ７ｇ１０リーダーは約１００ｂｐの
領域の長さにわたっている（Ｏｌｉｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ ２２７−２３５，１９８８）。最終発
現構築物において、ＸｂａＩ部位の上流領域が削除され
ている。Ｔ７ｇ１０リーダー配列はいまや４２ｂｐの長
さにわたっており、好適なプラスミドの３６３８位置で
ＧからＡへの一塩基交換を有している。

【００１１】天然ＩＬ−４配列のコドン使用頻度 同義コドン使用頻度バイアスの有効な測定法として、コ
ドン適応指数（ＣＡＩ）は所与の遺伝子の発現レベルを
予言するのに有用であり得る（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５，１
２８１−１２９５，１９８７およびＡｐｅｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７，８９
０−８９５，１９９７）。ＣＡＩは、遺伝子に用いられ
ているコドンのそれぞれに対応する相対的同義コドン使
用頻度（ＲＳＣＵ）の幾何学的意味を、同じアミノ酸組
成の遺伝子の最大可能ＣＡＩで除したものとして計算さ
れる。各コドンに対するＲＳＣＵ値は特定の生物、例え
ば大腸菌の非常に高度に発現された遺伝子から計算さ
れ、コドンの観察された頻度をアミノ酸の同義コドンは
等しい使用頻度であるという仮定の下に期待される頻度
で除したものを表す。高度に発現された遺伝子、例えば
リボソームタンパクをコードする遺伝子は一般に高いＣ
ＡＩ値＞０．４６を有する。大腸菌のｌａｃ１およびｔ
ｒｐＲのように発現の悪い遺伝子は低いＣＡＩ値＜０．
３を有する。

【００１２】天然ＩＬ−４配列に対して計算された大腸
菌ＣＡＩ値は０．７３３である。これは、天然遺伝子は
大腸菌における高レベル発現によく適合していなければ
ならないことを意味する。それにもかかわらず、最適の
大腸菌コドン使用頻度（ＣＡＩ値＝１）を有する合成遺
伝子は発現レベルをさらに増加させる可能性を有する。
従って、合成ＩＬ−４およびＩＬ−４ムテイン遺伝子を
設計しクローニングした。

【００１３】転写ターミネーター 転写ターミネーターＴφを含むＴ７ＤＮＡフラグメント
はベクターｐＥＴ−９ａから導かれる（Ｓｔｕｄｉｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｌｍｏｌ．
１８５，６０−８９，１９９０）。転写ターミネーター
はｍＲＮＡ−ＲＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体が解離
し、それにより転写を終了する点を決定する。転写ター
ミネーターが高度に発現された遺伝子の端部に存在する
ことはいくつかの利点を有する：不必要な転写に関与し
ているかもしれないＲＮＡポリメラーゼの封鎖を最低限
にし、ｍＲＮＡ長を最低限に制限してエネルギー消費を
制限するが、これは強い転写は複製起点に干渉するの
で、転写ターミネーターがコピー数の維持によりプラス
ミド安定性を向上するからである（Ｂａｌｂａｓ ａｎ
ｄ Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１８５，１４−３７，１９９０）。

【００１４】耐性遺伝子 ｋａｎ耐性遺伝子はベクターｐＥＴ−９ａから導かれる
（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｌｍｏｌ．１８５，６０−８９，１９９０）。起
源的には、これはベクターｐＵＣ４ＫＩＳＳ（Ｂａｒａ
ｎｙ，Ｇｅｎｅ３７，１１１−１２３，１９８５）から
のＴｎ９０３のｋａｎ遺伝子である。好適なプラスミド
においては、ｋａｎ遺伝子とＩＬ−４およびＩＬ−４ム
テイン遺伝子とは反対の配向をしており、そのためＴ５
プロモーターからのリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏ
ｕｇｈ）転写により誘導後ｋａｎ遺伝子産物の増加が起
きないようにしている。カナマイシンを選択マーカーと
して選択したが、これはＧＭＰ−目的に好適な抗生物質
であるからである。さらに、ｋａｎ遺伝子に基づくベク
ターはアンピシリン耐性（ｂｌａ）プラスミドよりも安
定である。アンピシリン選択はこの薬剤が分泌されるβ
−ラクタマーゼ酵素により分解されるので培養中に失わ
れがちである。カナマイシンに対するバクテリアの耐性
の態様はこの抗生物質を不活性化するアミノグリコシド
ホスホトランスフェラーゼに依存している。

【００１５】発現の調節 制御された遺伝子発現は、安定なプラスミド系の確立の
ために、特に注目しているタンパクがホスト細胞にとっ
て有害であるならば、絶対必要である。好適なプラスミ
ドは、ｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）および２
つの合成ｌａｃオペレーター配列を大腸菌ファージＴ５
プロモーターの下流に融合したものからなるｌａｃに基
づいた誘導可能系を用いる。ｌａｃＩ^qプロモーターお
よびｌａｃＩ構造遺伝子はベクターｐＴｒｃ９９Ａから
単離された（Ａｍａｎｎ ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ ６
９，３０１−３１５，１９８８）。Ｉ^qはｌａｃＩリプ
レッサーの過剰産性に導くプロモーター突然変異であ
る。野生型ｌａｃリプレッサーはそれぞれ３６０アミノ
酸の同一のサブユニット４個を含む４量体分子である。
ｌａｃリプレッサーテトラマーは２つの機能的ダイマー
のダイマーである。４つのサブユニットは残基３４０−
３６０から形成される４−ヘリックスバンドルにより相
互に保持されている。ＮａｒＩ切断によりベクターｐＴ
ｒｃ９９ＡからｌａｃＩ遺伝子が単離することにより、
アミノ酸３３１を越える残基が削除され、正常ではｌａ
ｃＩ遺伝子にコードされていない１０アミノ酸が付加さ
れる。アミノ酸３２９を越える、ｌａｃＩのＣ−末端部
分に起きる突然変異または欠失の結果、表現型が野生型
リプレッサーに類似するように見える機能的ダイマーが
得られる（Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ ２２，
３３４−３３９，１９９７）。

【００１６】複製起点（ｏｒｉ） 好適なプラスミドの複製起点（ｏｒｉ）はベクターｐＥ
Ｔ−９ａ、ｐＢＲ３２２に由来するｏｒｉ、から導かれ
る。好適なプラスミドは従ってｐＭＢ１（Ｃｏ１Ｅ１）
レプリコンを担持する。このレプリコンを持つプラスミ
ドは「緩和された」様式で複製する多コピープラスミド
である。正常な成長条件下では各バクテリア細胞内に最
低１５−２０コピーのプラスミドが維持される。好適な
プラスミドの実際の数はこの範囲内にある。Ｃｏ１Ｅ１
−型ｏｒｉの複製は５５５−ヌクレオチドＲＮＡ転写産
物、ＲＮＡＩＩ、により開始され、ｏｒｉ近傍にあるそ
のテンプレートＤＮＡと永続型ハイブリッドを形成す
る。ＲＮＡＩＩ−ＤＮＡハイブリッドはついでＲＮａｓ
ｅＨによりｏｒｉで切断して、ＤＮＡポリメラーゼＩの
プライマーとして役立つ遊離３′ＯＨを生じる。このＤ
ＮＡ合成のプライミングはＲＮＡＩ、すなわちＲＮＡＩ
Ｉの５′末端に相補的な１０８−ヌクレオチドＲＮＡ分
子、により負の調節を受ける。アンチセンスＲＮＡＩと
ＲＮＡＩＩの相互作用はＲＮＡＩＩの立体配座の変化を
引き起こしてＲＮＡＩＩのテンプレートＤＮＡへの結合
を阻害し、その結果プラスミドＤＮＡ合成の開始を妨げ
る。ＲＮＡＩとＲＮＡＩＩとの間の結合は６３アミノ酸
の小さいタンパク（Ｒｏｐタンパク、Ｒｅｐｒｅｓｓｏ
ｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ）により増強されるが、このタ
ンパクは複製起点から４００ヌクレオチド下流に位置す
る遺伝子によってコードされている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８
９）。ｒｏｐ遺伝子の欠失はコピー数の増加を導き、遺
伝子量効果によりそのプラスミドをコードする異種遺伝
子の発現レベルを向上させる。この観察は試験したＩＬ
−４発現ベクターについてもなされた。しかし、ｒｏｐ
^-−プラスミドは不安定であり非選択的条件下での発酵
中に非常に急速に失われた。従って、好適なプラスミド
のレプリコンはｒｏｐ遺伝子を含有して高いプラスミド
安定性を確保している。好適なプラスミドは動態化に必
要とされるｍｏｂ遺伝子を欠いているため、一つの細菌
から他の細菌への独自の接合移入（ｃｏｎｊｕｇａｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒ）を誘導することができない。

【００１７】好適なプラスミドでは、プラスミド複製、
耐性および調節可能な発現に不必要な要素はすべて削除
されている。

【００１８】本発明の範囲内にあるためには、上述の特
長のすべてを好適な発現プラスミドの構築において取り
込む必要はない。例えば、天然のインターロイキン−４
またはインターロイキン−４ムテイン遺伝子を、最適化
された大腸菌コドン使用頻度をもつ合成のものの代わり
に使用することができる。好適な転写ターミネーターは
Ｔφであるが、ｒｒｎＢＴ２またはａｓｐＡのような他
のターミネーターも使用できる。同様に、好適なプラス
ミドの構築用の要素をここに記載した市販のベクター以
外から採用することも可能である。

【００１９】発現系確立の過程で用いた方法を以下に記
載する。

【００２０】材料と方法 酵素 制限エンドヌクレアーゼ、ウシ腸アルカリホスファター
ゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、およびＴ４ＤＮＡ
リガーゼをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍお
よびＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから購入して供給元の推奨に従
って使用した。

【００２１】組み換えＤＮＡ法 標準クローニング手順がＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）に記載され
ている。形質転換はＭ．Ｓｃｏｔｔ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ
Ａｒｕｆｆｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４，３３６５−３３６９，１９８７）に
従って行った。形質転換の宿主として、大腸菌菌株ＤＨ
５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）およびＷ３１１０（ＡＴＣ
Ｃ ２７３２５）を主として用いた。Ｗ３１１０の遺伝
子型はＫ１２，Ｆ^-、［Ｎ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）］λ^-
である。

【００２２】プラスミドＤＮＡの大量単離はＱｉａｇｅ
ｎ−チップ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。アガロー
スゲルからのＤＮＡフラグメントの抽出はＪｅｔｓｏｒ
ｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を供給元の推奨に従って用いて行
った。

【００２３】部位指定突然変異誘発、ＰＣＲ反応および
配列決定のためのオリゴヌクレオチドはＭＷＧ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈまたは
ＧＩＢＣＯ ＢＲＬから得た。

【００２４】突然変異誘発実験はＤｅｎｇ ａｎｄ Ｎ
ｉｃｋｏｌｏｆｆの方法（Ｄｅｎｇａｎｄ Ｎｉｃｋｏ
ｌｏｆｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００，８１−
８８，１９９２）によりＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈからの「ユニーク部位除去突然変異誘発（Ｕｎｉ
ｑｕｅ Ｓｉｔｅ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）」系を用いて行った。Ｔ７ｇ１０ ｒ
ｂｓの改造に用いたプライマーは下記の配列を有する： ５′ＴＣＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ
ＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴ
ＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡ３′（配列１） すべての構築物およびＤＮＡ配列はＡＢＩ ３７３Ａシ
ーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
でＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを用いた
ダイターミネーターサイクルシーケンシング（Ｄｙｅ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ）を使用して確認した。

【００２５】

【実施例】本発明を以下の実施例、図面および配列情報
によりさらに詳細に説明する。

【００２６】（実施例１） プラスミド安定性試験 プラスミド安定性試験は常に液体窒素中で凍結した培養
物を用いて開始した。融解した培養物のＯＤ₆₀₀を決定
し、この培養物をＰＢＳバッファーに１０^-4まで希釈
し、抗生物質無添加ＬＢ寒天培地上にプレーティングし
た。

【００２７】融解培養物１ｍｌをペプトン培地（１リッ
トル当り、大豆ペプトン３０ｇ、イーストエキス２０
ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄５ｇ、グリセロール２０ｇ、ＭｇＳＯ₄
ｘ７Ｈ₂Ｏ １ｇ、ｐＨ７.０）１００ｍｌに移植し、３
７℃、２８０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。

【００２８】成長した培養物のＯＤ₆₀₀を決定し、この
培養物をＰＢＳバッファーに１０^-6まで希釈し、抗生物
質無添加ＬＢ寒天培地上にプレーティングしてよく分離
したコロニーを得た。

【００２９】成長した培養物１００μｍをペプトン培地
１００ｍｌに移植し、３７℃、２８０ｒｐｍで２４時間
インキュベートした。この手順を８回繰り返した。

【００３０】ＬＢ培地からのよく分離したコロニー１０
０個をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）添加ＬＢプレー
トおよびカナマイシン無添加ＬＢプレート上に碁盤の目
状に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。耐性コ
ロニーのパーセンテージを毎日決定した。

【００３１】一日当たりの世代数を次式： 世代数／日＝ｌｏｇ［ＯＤ_600END／ＯＤ_600BEG］／ｌｏ
ｇ２ に従って計算した。

【００３２】発現検討のため、成長した培養物１ｍｌを
ＬＢ培地に１００倍希釈し下記（実施例２参照）のよう
に取り扱った。

【００３３】（実施例２） 発現 小規模発現のために、インターロイキン−４およびイン
ターロイキン−４ムテイン細胞をＬＢ培地（バクトトリ
プトン（Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ）１０ｇ、イー
ストエキス５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ、ｐＨ７．５）
中でＯＤ₆₀₀が０．８−１．０に達するまで成長した。
ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭまで添加することにより発
現を誘導し、インキュベーションを５時間継続した。細
胞を遠心により収穫した。

【００３４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために細胞をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ装填バッファーに１ＯＤ_{60 0}ユニット／１００
μｌの濃度になるように懸濁した。

【００３５】本発明の主な特徴および態様を示せば以下
のとおりである。

【００３６】１．５′から３′への順序で下記の操作可
能に結合された要素：大腸菌ファージＴ５プロモーター
および２つのｌａｃオペレーター配列からなる調節可能
なプロモーターと、大腸菌ファージＴ７ｇ１０からのリ
ボソーム結合部位と、翻訳開始コドンと、ＩＬ−４のた
めの構造遺伝子またはＩＬ−４ムテインと、この構造遺
伝子の下流の一つの転写ターミネーターとを含む大腸菌
の菌株におけるＩＬ−４およびＩＬ−４の製造のための
オペロン。

【００３７】２．大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ。

【００３８】３．上記１または２のプラスミドの１種以
上で形質転換された大腸菌。

【００３９】４．ＩＬ−４およびＩＬ−４ムテインの調
製方法における上記１または２によるプラスミドの使
用。

【００４０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Bayer AG <120> PLASMIDS, THEIR CONSTRUCTION AND THEIR USE IN THE MANUFACTURE OF INTERLEUKIN-4 AND INTERLEUKIN-4 MUTEINS <130> 9912044 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: primer <400> 1 tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaata attttgttta actttaagaa 60 <210> 2 <211> 4202 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: Human <400> 2 ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60 accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120 taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 180 tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240 tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300 gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 360 cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420 atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480 ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc 540 atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 600 tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660 caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720 attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 780 cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat 840 gtaagcagac agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 900 gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 960 taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1020 aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1080 ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1140 catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1200 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 1260 ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 1320 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 1380 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 1440 atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 1500 cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 1560 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 1620 accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 1680 gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 1740 tgtgcggtat ttcacaccgc aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 1800 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 1860 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 1920 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 1980 cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 2040 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 2100 ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa 2160 gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata 2220 cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg 2280 gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg ctcatgagcc 2340 cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 2400 cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatccatt 2460 tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa 2520 gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat 2580 gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg 2640 aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg 2700 gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc 2760 ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc 2820 agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac 2880 aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat 2940 gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac 3000 cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag 3060 catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc 3120 tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg 3180 atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg 3240 ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc 3300 gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga 3360 tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat 3420 tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg 3480 gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggctcga 3540 gaaatcataa aaaatttatt tgctttgtga gcggataaca attataatag attcaattgt 3600 gagcggataa caatttcaca catctagaaa taattttatt taactttaag aaggagatat 3660 acatatgcac aaatgcgata tcaccctgca ggaaatcatc aaaaccctga attctctgac 3720 cgaacagaaa accctgtgca ccgaactgac cgttaccgac atcttcgctg cttcgaaaaa 3780 caccaccgaa aaagaaacct tctgccgtgc tgctaccgtt ctgcgtcagt tctactctca 3840 ccacgaaaaa gacacccgtt gcctgggtgc taccgctcag cagttccacc gtcacaaaca 3900 gctgatccgt ttcctgaaac gtctggaccg taacctgtgg ggtctggctg gtctgaacag 3960 ctgcccggtt aaagaagcta accagtctac cctggaaaac ttcctggaac gtctgaaaac 4020 catcatggac gaaaaagact ctaaatgctc ttcttaataa ggatccggct gctaacaaag 4080 cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg 4140 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggataat 4200 tc 4202

【図面の簡単な説明】

【図１】好適な発現プラスミドの構築物を示す図であ
る。（略語：ＩＬ−４ ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイ
ン；ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）

【図２】好適な発現プラスミドの構築を示す図である。
（略語：ＩＬ−４ ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイン；
ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）

【図３】好適な発現プラスミドの構築を示す図である。
（略語：ＩＬ−４ ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイン；
ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）

【図４】好適な発現プラスミドの構築を示す図である。
（略語：ＩＬ−４ ＴＭ、ＩＬ−４トリプルムテイン；
ＩＬ−４ＤＭ、ＩＬ−４ダブルムテイン）

【図５】ＩＬ−４発現ベクターｐＲＯ２１．１．Ｏおよ
びｐＲＯ２．１．Ｏのプラスミド安定性を示す図であ
る。ベクターｐＲＯ２．１．Ｏは抗生物質選択なしでは
７８世代を超えて十分に安定である。これに対して発現
ベクターｐＲＯ２１．１．Ｏ（これは市販のプラスミド
ｐＥＴ−３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づいている）は
非常に急速に失われる。カナマイシン選択なしではコロ
ニーの１６％だけがプラスミドを含有している。

【図６】好適なＩＬ−４およびＩＬ−４ムテイン発現ベ
クターの誘導および発現能力の維持を示す図に代わるド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果を示す写真である。より具体的には、抗生物質
選択なしに異なる世代数成長した大腸菌／ｐＲＯ２．
１．Ｏからの全抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）分
析結果を示す写真である。再懸濁細胞ペレット１０μｌ
を各スロットに適用した。ゲルを還元条件下で流し込
み、クマシーブリリアントブルーで染色した。 レーン１： 分子量マーカー（ローレインジ（Ｌｏｗ
Ｒａｎｇｅ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） レーン２： ＩＬ−４ムテイン（５μｇ） レーン３： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（８世代）誘導
前 レーン４： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（８世代）誘導
後 レーン５： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（１８世代）誘
導後 レーン６： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（２８世代）誘
導後 レーン７： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（３８世代）誘
導後 レーン８： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（４８世代）誘
導後 レーン９： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（５８世代）誘
導後 レーン１０： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（６８世代）
誘導後 レーン１１： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（７８世代）
誘導前 レーン１２： 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ（７８世代）
誘導後 レーン１３： 分子量マーカー（ローレインジ（Ｌｏｗ
Ｒａｎｇｅ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） レーン１４： 分子量マーカー（ハイレインジ（Ｈｉｇ
ｈ Ｒａｎｇｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５′から３′への順序で下記の操作可能
   に結合された要素：大腸菌ファージＴ５プロモーターお
   よび２つのｌａｃオペレーター配列からなる調節可能な
   プロモーターと、大腸菌ファージＴ７ｇ１０からのリボ
   ソーム結合部位と、翻訳開始コドンと、ＩＬ−４のため
   の構造遺伝子またはＩＬ−４ムテインと、この構造遺伝
   子の下流の一つの転写ターミネーターとを含む大腸菌の
   菌株におけるＩＬ−４およびＩＬ−４の製造のためのオ
   ペロン。
2. 【請求項２】 大腸菌／ｐＲＯ２．１．Ｏ。