CZ294279B6 - Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektor obsahující DNA sekvenci, Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory a použití vektoru - Google Patents
Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektor obsahující DNA sekvenci, Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory a použití vektoru Download PDFInfo
- Publication number
- CZ294279B6 CZ294279B6 CZ2000214A CZ2000214A CZ294279B6 CZ 294279 B6 CZ294279 B6 CZ 294279B6 CZ 2000214 A CZ2000214 A CZ 2000214A CZ 2000214 A CZ2000214 A CZ 2000214A CZ 294279 B6 CZ294279 B6 CZ 294279B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- vector
- muteins
- escherichia coli
- gene
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 9
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 49
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 102100028220 ABI gene family member 3 Human genes 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 241001194788 Cylicodiscus gabunensis Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101000724234 Homo sapiens ABI gene family member 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, sestávající z operativně spojených elementů ve směru 5' ke 3': regulovatelného promotoru sestávajícího z promotoru fága T5 E. coli a dvou lac operátorových sekvencí, vazebného místa pro ribosom z bakteriofága T7g10 E. coli, iniciačního translačního kodonu, strukturního genu pro IL-4 nebo mutein IL-4 a transkripčního terminátoru za strukturním genem. Do rozsahu řešení náleží rovněž Escherichia coli transformovaná jedním nebo více těchto vektorů a použití tohoto vektoru v metodě přípravy IL-4 a muteinů IL-4.ŕ
Description
Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektor obsahující DNA sekvenci, Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory a použití vektoru
Oblast vynálezu
Vynález se týká vektoru pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektoru obsahujícího DNA sekvenci znázorněnou jako Seq. ID. NO. 2 viz dále, Escherichia coli transformovaného jedním nebo více těmito vektory a použití tohoto vektoru v metodě přípravy IL-4 a muteinů IL-4. Konkrétně se vynález týká konstrukce a použití expresních plazmidů ve výrobě rekombinantního interleukinu-4 (IL-4) a muteinů IL-4.
Dosavadní stav techniky
Zralý lidský interleukin-4 (EL-4) je složen ze 129 aminokyselin a je z 50 % homologní s myším IL-4. IL-4 je jediný známý cytokin, který řídí diferenciaci pomocných T buněk na fenotyp Th2 (Mosmann and Sad. Immimol. Today 17, 138-146, 1996). IL-4 předává signál lymfocytům a dalším buňkám přes heterodimerický aggkomplex dvou receptorů cytokinu. IL-4Rct a běžný γřetězec (yc). V publikacích podle dosavadního stavu techniky byly popsány antagonistické mutanty IL-4 (Kruše a kol., EMBO J. 11, 3237 - 3244, 1992). Tři aminokyseliny blízko C-konce (R121, Y124 a S125) jsou důležité pro vazbu kyc-řetězci. Zavedení Asp (D) do těchto pozic blokuje dimerizaci receptorů a přenos signálů přes membránu.
Dvojitý mutein interleukinu-4 (IL-4 DM) je varianta IL-4 s dvěma změnami aminokyselin v pozicích 121 a 124 nazvaná IL-4 121RD Y124D. IL-4 DM je schopen blokovat obě aktivity IL· 4 a IL-13. Na rozdíl od všech bodových mutantů žádné zbytkové agonistické aktivity nebyly pro tento mutein nikdy nalezeny. Má se za to, že tyto antagonistické vlastnosti IL-4 DM jsou užitečná pro léčbu onemocnění, která zahrnují vývoj TH2 a/nebo produkci IgE (Ryan. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 1-5, 1997).
Jak bylo popsáno v různých publikacích, k produkci rekombinantního IL-4 a muteinů IL-4 mohou být využity prokaryotické organismy. Bohužel, popisované systémy mají řadu nedostatků (nízká hladina exprese, nízká stabilita expresního vektoru), které znemožňují produkci IL-4 a muteinů ve velkém měřítku nebo jsou ekonomicky nerealizovatelné.
Hlavní kritéria pro účinný a bezpečný expresní systém jsou:
- vysoký výtěžek produktu;
- regulovatelná stabilní exprese;
- stabilita expresního vektoru.
Pro tato výše uvedená kriteria jsou důležité některé znaky expesního plazmidu (viz Hannig a kol., TIBTECH. 16, 54-60, 1998). Jsou to:
- promotor;
- ribosomální vazebné místo (rbs);
- využití kodonu příslušného genu;
- transkripční terminátor;
- gen pro rezistenci;
-1 CZ 294279 B6
- regulace exprese;
- počátek replikace (ori).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL4 ve kmeni Escherichia coli, sestávající z operativně spojených elementů ve směru 5' ke 3': regulovatelného promotoru sestávajícího z promotoru fága T5 Escherichia coli a dvou lac operátorových sekvencí, vazebného místa ío pro ribosom z bakteriofága T7gl0 Escherichia coli, iniciačního translačního kodonu, strukturního genu pro IL-4 nebo mutein IL-4 a transkripčního terminátoru za strukturním genem.
Do rozsahu tohoto řešení podle vynálezu rovněž náleží vektor obsahující DNA sekvenci znázorněnou jako Seq. ID. NO. 2, viz dále.
Do rozsahu řešení podle vynálezu rovněž náleží Escherichia coli transformovaná jedním nebo více výše uvedenými vektory podle vynálezu.
Do rozsahu řešení podle vynálezu rovněž náleží použití tohoto vektoru podle vynálezu v metodě 20 přípravy IL-4 a muteinů IL-4.
Podle vynálezu byly vytvořeny expresní plazmidy pro IL-4 a muteiny EL-4 s modifikacemi ve všech příslušných elementech pro účinný a bezpečný expresní systém. Kvalita a vhodnost příslušného expresního systému byla klasifikována zejména podle následujících kritérií:
- výtěžek ID4 a muteinů IL-4;
- stabilita plazmidu; a
- udržení indukční schopnosti.
Cílem předmětného vynálezu bylo proto vytvoření metody pro konstrukci na použití expresního plazmidu pro výrobu rekombinantního interleukinu-4 (IL-4) a muteinů interleukinu-4 ve velkém měřítku. Navíc by měl nově vytvořený systém hostitele/vektoru být vhodný pro expresi dalších proteinů (cytokinů, růstových faktorů, rozpustných receptorů, protilátek atd.). Podle předmětného vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že bakterie transformované plazmidem podle tohoto vyná35 lezu poskytují mnohonásobně větší rychlosti exprese a stabilitu plazmidu a exprese než bylo pozorováno po transformaci stejného hostitele jinými známými plazmidy z dosavadního stavu techniky. Proto je použití plazmidů podle tohoto vynálezu mnohem výhodnější pro produkci rekombinantního interleukinu-4 a muteinů interleukinu-4 ve srovnání se všemi dříve známými plazmidy.
Nově vyvinutý vektorový systém obsahuje následující prvky:
T5 promotor
Promotor bakteriofága T5 E. coli společně se dvěma lac operátorovými sekvencemi je odvozen z plazmidu poE30 (Oiagen), náležícího do skupiny plazmidů pDS (Bujará a kol., Methods Enzymol. 155, 416-433, 1987 aStúber a kol., Immunological Methods, I. Lefkowits and B. Pernis, eds., Academie Press, lne. Vol. IV, 121-152, 1990).
T7 gl0 ribosomální vazebné místo
Vazebné místo ribosomu (rbs) je odvozeno z oblasti před genem 10 bakteriofága T7 (T7gl0 vedoucí sekvence). Gen 10 fága T7 kóduje plášoový protein, který je hlavním proteinem
-2CZ 294279 B6 exprimovaným po infekci fágem T7. T7 glO rbs byl získán z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). T7 glO vedoucí sekvence zahrnuje oblast okolo 100 bp (Olins et al., Gene 227-235, 1988). Ve finálním expresním konstruktu je oblast před Xbal místem odstraněna. T7 glO vedoucí sekvence nyní tedy zahrnuje 42 bp a obsahuje záměnu jedné báze z G na A v pozici 3638 v tomto zde popisovaném plazmidu.
Využití kodonů přirozené sekvence IL-4
Jakožto účinné měřítko využití synonymních kodonů přirozené sekvence může být index adaptace kodonu (codon adaptation index (CAI) použit pro předpovězení hladiny exprese daného genu (Sharp a kol., Nucleic Acids Res. 15, 1281-1295, 1987 and Apeler a kol., Eur. J. Biochem. 247, 890-895, 1997). CAI je počítán jako geometrický střed hodnot relativního využití kodonů (RSCU) odpovídajících každému z kodonů použitých v genu, děleno maximálním možným CAI pro gen pro stejné aminokyselinové složení. RSCU hodnoty jsou pro každý kodon počítány zvelmi vysoce exprimovaných genů určitého organismu, např. E. coli, a reprezentují pozorovanou frekvenci kodonu dělenou frekvencí očekávanou za předpokladu stejného využití synonymních kodonů pro aminokyselinu. Vysoce exprimované geny, například geny kódující ribosomální proteiny, obecně mají vysoké hodnoty CAI > 0, 46. Slabě exprimované geny jako lad a trpR v E. coli mají nízké hodnoty CAI < 0,3.
Vypočítaná hodnota CAI v E. coli je pro přirozenou sekvenci IL-4 0, 733. To znamená, že přirozený gen by měl být vhodný pro vysokou hladinu exprese v E. coli. Nicméně má syntetický gen s optimálním využitím E. coli kodonů (hodnota CAI = 1) potenciál k dalšímu zvýšení hladiny exprese. Proto byly navrženy a klonovány syntetické geny pro IL-4 a muteiny IL-4.
Transkripční terminátor
Fragment z T7 DNA obsahující transkripční terminátor Τφ je odvozen z vektoru c (Studier &Eol., MethodsEnzym&l. 185, 60-89, 1990). Transkripční terminátory urč^mrsta, kde~konrptex mRNA-RNA polymerasa-DNA disociuje a tím končí transkripce. Přítomnost transkripčního terminátoru na konci vysoce exprimovaného genu má několik výhod: minimalizují nedostupnost RNA polymerasy, která by byla zahrnuta v nadbytečné transkripci, omezují délku mRNA na minimální potřebnou délku a tím omezuje výdej energie. Vzhledem k tomu, že silná transkripce by mohla interferovat s počátkem replikace, zvyšuje terminátor transkripce stabilitu plazmidu prostřednictvím udržení počtu kopií (Balbas a Bolivar. Methods Enzymol. 185, 14-37, 1990).
Gen kódující rezistenci
Gen kanamycinové rezistence je odvozen z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). Původně se jedná okan gen Tn903 z vektoru pUC4KISS (Barony, Gene 37, 111-123, 1985). Ve zde popisovaném plazmidu je kan gen v opačné orientaci než geny pro IL-4 a mutein IL-4, takže nedochází ke zvýšení množství produktu kan genu po indukci v důsledku pročtení terminátoru transkripce z T5 promotoru. Kanamycin byl vybrán jako selekční markér nebo je preferovaným antibiotikem pro GMP-ůčely. Navíc jsou vektory založené na rezistenci ke kanamycinu stabilnější než plazmidy s ampicilinovou (bia) rezistencí. Selekce na ampicilinu má tendenci ke ztrátám neboť tato látka je degradována sekretovaným enzymem: β-laktamasou. Způsob bakteriální rezistence ke kanamycinu závisí na aminoglykosidové fosfotranferase, která inaktivuje antibiotikum.
Regulace exprese
Kontrolovaná genová exprese je absolutně nezbytná pro nastavení stabilního plazmidového systému, obzvláště, je-li požadovaný protein zhoubný pro hostitelské buňky. Výhodný plazmid
-3 CZ 294279 B6 podle předmětného vynálezu využívá indukovatelný systém založený na lac systému sestávajícího z genu pro lac represor (lácí) a dvou syntetických sekvencí lac operátoru předcházejících ve fúzi promotor bakteriofága T5 E. coli. Promotor lácí1 a strukturní gen lácí byl izolován z vektoru pTrc99A (Ammán et al., Gene 69,301-315,1988). Iq představuje promotorovou mutaci vedoucí k nadprodukci lácí represoru. Lac represor standardního typu je tetramemí molekula sestávající ze čtyř identických podjednotek, každá o 360 aminokyselinách. Tetramer lac represoru je dimerem dvou funkčních dimerů. Čtyři podjednotky jsou drženy pohromadě svazkem čtyř helixů tvořených zbytky 340-360. Vzhledem k izolaci lácí genu z vektoru pTrc99A pomocí štěpu Narl byly zbytky za aminokyselinou 331 odstraněny a bylo přidáno 10 aminokyselin které nejsou normálně kódovány lácí genem. Je známo, že mutace nebo delece probíhající v C-terminální části lacl, za aminokyselinou 329, poskytují funkční dimery které se jeví jako fenotypově podobné standardnímu represoru (Páce a kol., TIS 22, 334-339, 1997).
Počátek replikace (ori)
Počátek replikace (ori) zde popisovaného výhodného plazmidu je odvozen z vektoru pET-9a, jehož ori pochází z pBR322. Výhodný plazmid podle předmětného vynálezu proto nese pMBI (COIEI) replikon. Plazmidy s tímto replikonem jsou mnohakopiové plazmidy, které se replikují relaxovaným způsobem. Za normálních růstových podmínek je v každé bakteriální buňce udržováno minimálně 15 až 20 kopií plazmidu. Běžný počet pro výhodný plazmid, popisovaný v tomto textu, je v tomto rozmezí. Replikace ori COIEI-typu je iniciována 555-nukleotidovým transkriptem RNA, RNAII, který tvoří stabilní hybrid se svým DNA templátem poblíž ori. Hybrid RNAII-DNA je poté štěpen RNasou H v ori za vzniku volného 3ΌΗ, který slouží jako primer pro DNA polymerasu I. Tato iniciace syntézy DNA je negativně regulována RNA I, což je 108-nukleotidová molekula RNA komplementární k 5' konci RNA Π. Interakce antisense RNA 1 s RNA II způsobuje konformační změnu RNA II, která inhibuje vazbu RNA Π k DNA templátu a následně zabraňuje iniciaci syntézy plazmidové DNA. Vazba mezi RNA I a Π je zvýšena malým proteinem o velikosti 63 aminokyselin (Rop proteinem, Represor of primer), který je kódován genem umístěným 400 nukleotidů po směru transkripce od počátku replikace (SawúrooA a kol., Molecular Cloning, Čolci Spring Harbor, 1989). Delece rop genu vede ke zvýšení počtu kopií a prostřednictvím dávkovacího efektu genu ke zvýšení hladiny exprese heterologních genů kódovaných plazmidem. Toto zjištění bylo rovněž učiněno v případě zkoušených expresních vektorů pro IL-4. Ale ukázalo se, že rop-plazmidy jsou nestabilní a při fermentaci za neselektivních podmínek dochází k jejich ztrátě. Proto obsahuje replikon zde popisovaného plazmidu rop gen pro zajištění vysoké stability plazmidu. V popisu předmětného vynálezu popisovaný plazmid postrádá mob gen, který je nutný pro mobilizaci a proto není schopen řídit svůj vlastní konjugační přenos z jedné bakterie do jiné.
Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu jsou z plazmidu odstraněny všechny prvky, které nejsou nezbytné pro jeho replikaci, rezistenci a regulaci exprese.
V rozsahu předmětného vynálezu nemusí být pro konstrukci expresního plazmidu podle předmětného vynálezu použity všechny výše uvedené znaky. Například místo syntetického genu pro optimalizované využití kodonů v E. coli, může být použit gen pro přirozený interleukin-4 nebo mutein interleukinu-4. Transkripční terminátor je ve výhodném provedení Τφ, ale rovněž je možno použít i další terminátory jako rmB T2 nebo aspA. Podobně je možné použít pro konstrukci výhodného plazmidu podle předmětného vynálezu prvky z jiných než zde popsaných, komerčně dostupných vektorů.
Metody použité během vývoje expresního systému jsou uvedeny níže.
-4CZ 294279 B6
Materiály a metody
Enzymy
Restrikční endonukleasy, alkalická fosfatása z telecího střeva. T4 polynukleotid kinasa aT4 DNA ligása byly získány od firmy Boehringer Mannheim aGIBCO-BRL a byly použity dle doporučení dodavatele.
Metody práce s rekombinantní DNA
Standardní konovací postupy byly popsány v Sambrook a kol., (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Transformace byly provedeny dle M. Scott (Seed and Aruffo, Proč. Nati. Acad. Sci. USa 84, 3365 - 3369, 1987). Kmeny E. coli DH5a (GIBCO BRL) a W3110 (ATCC 27325) byly použity primárně jako hostitelské buňky. Genotyp W3110 je K12, F, [N(rmD-rmE)]lambda.
Pro izolace ve velkém měřítku byly použity špičky Oiagen-tips (Oiagen). Extrakce fragmentů DNA z agarosových gelů byla provedena za použití Jetsorb (Genomed) dle doporučení dodavatele.
Oligonukleotidy pro řízenou mutagenezi, PCR reakce asekvenování pocházely od MWG Biotech, Pharmacia Biotech nebo GIBCO BRL.
Experimenty zaměřené na mutagenezi byla použita metoda Denga aNickoloffa (Deng and Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81 - 88, 1992) používající systém Mutageneze s eliminací unikátního místa od Pharmacia Biotech. Primer používaný pro znovuvytvoření T7gl0 rbs má následující sekvenci:
5'ICAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAAeTTTA AGAA3' (Sekv. 1)
Všechny konstrukty a sekvence DNA byly potvrzeny použitím sekvenování terminační metodou s AmpliTaq DNA polymerasy. FS na ABI3 73A sekvenátoru (Applied Biosystems).
Vynález je detailněji vysvětlen následujícími příklady, obrázky a informacemi o sekvencích.
Přehled obrázků na výkresech
OBR.1 až OBR. 4:
Konstrukce zde popisovaného expresního plazmidu. (Zkratky: DL-4 TM, trojitý mutem IL-4; IL-4 DM, dvojitý mutein IL-4).
OBR.5:
Plazmidová stabilita expresních vektorů muteinu IL-4 pR021.1.0 apRO2.1.O. Vektor pR02.1.0 zůstává zcela stabilní přes 78 generací bez selekce antibiotiky. Na rozdíl od tohoto je expresní vektor pRO21.1.O, kteiý je založen na komerčně dostupném plazmidu pET-30a (Novagen), ztracen velmi rychle. Pouze 16 % kolonií obsahuje plazmid po 78 generacích bez kanamycinové selekce.
-5CZ 294279 B6
0BR.6:
Udržení schopnosti indukce a exprese zde popisovaného expresního vektoru IL-4 a muteinu IL-4. 5
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Test stability plazmidu
Testy stability plazmidu byly vždy startovány kulturou zmraženou v tekutém dusíku. Po roztátí 15 kultury byla stanovena OD6oo a kultura byla zředěna na 1 θ'4 PBS pufrem a poté byla rozetřena na misky s LB médiem ztuženým agarem bez antibiotika.
Při provádění tohoto testu byl 1 mililitr roztáté kultury inokulován do 100 mililitrů peptonového média (30 gramů sojového peptonu, 20 rámů kvasničného extraktu, 5 gramů KH2PO4, 20 rámů 20 glycerolu, 1 miligram MgSO4 x 7 H2O na litr, pH 7, 0) a inkubován při 37 °C za třepání 280 rpm po dobu 24 hodin.
Byla stanovena OD6oo narostlé kultury, kultura byla zředěna až do koncentrace 104 v PBS pufřu a poté byla rozetřena na misky s LB médiem ztuženým agarem bez antibiotika aby byly získány 25 dobře oddělené kolonie.
100 μΐ narostlé kultury bylo inokulováno do 100 mililitrů peptonového média a inkubováno při 37 °C za třepání 280 rpm po dobu 24 hodin. Tento postup byl opakován osmkrát.
100 dobře oddělených kolonií zLB misek bylo očkováno na LB misky skanamycinem (25 pg/ml) a LB misky bez kanamycinu a inkubováno při 37 °C po dobu přes noc. Procentuální zastoupení rezistentních kolonií bylo určováno každý den.
Počty generací za den byly vypočteny podle následujícího vzorce: log [OD60o end/ OD600 35 BEG]/log2.
Pro expresní studie byl 1 mililitr narostlé kultury zředěn 100-krát LB médiem a bylo s ním nakládáno dle popisu (viz příklad 2).
Příklad 2
Exprese
Pro expresi interleukinu-4 a muteinu interleukinu-4 v malém měřítku byly buňky kultivovány v LB médiu (10 gramů Bacto tryptonu, 5 gramů kvasničného extraktu, 10 gramů NaCl na litr, pH 7,5) dokud OD6oo nedosáhla 0,8 až 1,0. Exprese byla indukována přídavkem IPTG do finální koncentrace 0,5 mM a inkubace pokračovala po dobu 5 hodin. Buňky byly z média získány centrifugací.
Pro SDS-PAGE analýzu byly buněčné pelety resuspendovány ve vzorkovém pufru pro SDSPAGE do koncentrace 1 jednotka OD6oo/100 μΐ.
-6CZ 294279 B6
SEKVENCE <110> Bayer AG <120> PLASM1DY, JEJICH KONSTRUKCE A JEJICH UŽITÍ PŘI VÝROBĚ INTERLEUKINU-4 A MUTEINÚINTERLEUKINU-4 < 130> Plasmidy pro muteinv IL-4 <160> 2 < 170> Patent In Ver. 2.0 <210=* 1 <211> 60 <212> DNA <213> neznámý <220>
<223> Popis neznámého organismu: primer <400> l tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaáta átttgttta actttaagaa 60 <210> 2 <211> 4202 <212> DNA <213> Neznámý <220 <223>Popis neznámého organismu: Člověk <400 2 ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaaCtta ttcatatcag gartatcaat60 accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagthcca120 taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caacacaacc180 tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac240 tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca300 gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaa.a ccgrtattca ttcgtgattg360 cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga420 atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata480 ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcate540 atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt600 tagtctgacc atctcatctg taacatcatt gacaacgcta cctttgccat gtcccagaaa660 caactctggc gcaccgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac720 attatcgcga gcccatctat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg780 cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat840 gtaagcagac agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact900 gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg960 taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc1020 aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ccggcttcag cagagcgcag ataccaaata1080 ctgtccttct agtgtagccg taattaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta1140 catacctcgc tctgctaatc ccgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgcc1200 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg1260 gaggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaaccaccca caccgaactg agatacctac1320 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg1380 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggc1440 atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 1500 cgteaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggcettttta cggttcctgg 1560 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 1620 accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 1680 gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgacgcg gtattttctc cttacgcatc 1740 tgtgcggtat ttcacaccgc aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 1800 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 1860 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 1920 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 1980 cgcgcgaggc agctgcggtá aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 2040 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 2100 ataaagcggg ccatgttaag ggcggtfrttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa 2160 gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata 2220 cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg 2280 gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg ctcatgagcc 2340 cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 2400 cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatccatt 2460 tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgccčggaa 2520 gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat 2580 gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg 2640 aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg 2700 gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc -cagtctggcc 2760 ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc 2820 agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac 2880 aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggccg atcattaact atccgctgga tgaccaggat 2940 gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat cttccgacgt tatttcttga tgtctctgac 3000 cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag 3060 catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc 3120 tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg 3180 atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgzccggtt ttcaacaaac catgcaaatg 3240 ctgaatgagg gcatcgctcc cactgcgatg ctcgttgcca acgatcagat gacgctgggc 3300 gcaatgcgcg ccattaccga gtccggcctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga 3360 tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat aCcacgccgt taaccaccat caaacaggat 3420 tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg 3480 gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggrgaaaa gaaaaaccac cctggctcga 3540 gaaatcataa aaaatttatt tgctttgtga gcggataaca attataataq attcaattgt 3600 gagcggataa caatttcaca catctagaaa taattctatt taactttaag aaggaaatat 3660 acatatgcac aaatgcgata tcaccctgca ggaaatcatc aaaaccctga attctctcac 3720 cgaacagaaa accctgtgca ccgaactgac cgttaccgac atcttcgctc cttcgaaaaa 3780 caccaccgaa aaagaaacct tctgccgtgc tgcíaccgtt ctgcgtcagt tctactctca 3840 ccacgaaaaa gacacccgtt gcctgggtgc taccgctcag cagttccacc gtcacaaaca 3900 gctgatccgt ttcctgaaac gtctgaaccg taacctgtgg ggtctggctg grctgaacag 3960 ctgcccggtt aaagaagcca accagtctac cctggaaaac tecctggaac gtctgaaaac 4020 catcatggac gaaaaagact ctaaatgctc ttcttaataa ggatccggct cctaacaaaa 4080 cccgaaagca agctgagttg gctgctgcca ccgctgaaca ataactagca taaccccttg 4140 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggataat 4200 fn 4202
Claims (4)
1. Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, sestávající z operativně spojených elementů ve směru 5' ke 3': regulovatelného promotoru sestávajícího z promotoru fága T5 E. coli a dvou lac operátorových sekvencí, vazebného místa pro ribosom z bakteriofága T7gl0 E. coli, iniciačního translačního kodonu, strukturního genu pro IL-4 nebo mutein IL-4 a transkripčního terminátoru za strukturním genem.
2. Vektor obsahující DNA sekvenci znázorněnou jako Seq. ID. NO. 2.
3. Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory podle nároku 1 nebo 2.
4. Použití vektoru podle nároku 1 nebo 2 v metodě přípravy ILr4 a muteinů IV4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99100967A EP1022339B1 (en) | 1999-01-20 | 1999-01-20 | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000214A3 CZ2000214A3 (cs) | 2000-08-16 |
| CZ294279B6 true CZ294279B6 (cs) | 2004-11-10 |
Family
ID=8237378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000214A CZ294279B6 (cs) | 1999-01-20 | 2000-01-19 | Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektor obsahující DNA sekvenci, Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory a použití vektoru |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6506590B1 (cs) |
| EP (1) | EP1022339B1 (cs) |
| JP (2) | JP2000210091A (cs) |
| KR (1) | KR100665148B1 (cs) |
| AT (1) | ATE334202T1 (cs) |
| AU (1) | AU772897B2 (cs) |
| CA (1) | CA2294575C (cs) |
| CZ (1) | CZ294279B6 (cs) |
| DE (1) | DE69929638T2 (cs) |
| DK (1) | DK1022337T3 (cs) |
| ES (1) | ES2269027T3 (cs) |
| HU (1) | HU224491B1 (cs) |
| NO (1) | NO327317B1 (cs) |
| PT (1) | PT1022337E (cs) |
| SK (1) | SK285603B6 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
| KR100443570B1 (ko) * | 2001-07-31 | 2004-08-09 | 크레아젠 주식회사 | 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법 |
| EP1314739A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
| JP2006055082A (ja) * | 2004-08-20 | 2006-03-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 発光甲虫由来赤色発光酵素安定体の生産及び精製法 |
| CN118440969B (zh) * | 2024-07-08 | 2024-10-15 | 天津凯莱英生物科技有限公司 | 可溶性表达质粒突变体库的构建方法及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4689406A (en) * | 1983-08-10 | 1987-08-25 | Amgen | Enhancement of microbial expression of polypeptides |
| HUT43625A (en) * | 1986-03-27 | 1987-11-30 | Monsanto Co | Process for increasing yield of proteins with applying new ribosomal binding positions in bacteria |
| EP0303925B1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Hochreprimierbare Expressionskontrollsequenzen |
| FR2724665B1 (fr) * | 1994-09-16 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
| MY124565A (en) * | 1996-07-19 | 2006-06-30 | Bayer Corp | High-affinity interleukin-4-muteins |
-
1999
- 1999-01-20 DE DE69929638T patent/DE69929638T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-20 EP EP99100967A patent/EP1022339B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-07 ES ES00100129T patent/ES2269027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-07 PT PT00100129T patent/PT1022337E/pt unknown
- 2000-01-07 AT AT00100129T patent/ATE334202T1/de active
- 2000-01-07 DK DK00100129T patent/DK1022337T3/da active
- 2000-01-14 JP JP2000006477A patent/JP2000210091A/ja active Pending
- 2000-01-14 US US09/483,419 patent/US6506590B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-17 CA CA002294575A patent/CA2294575C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-19 CZ CZ2000214A patent/CZ294279B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 KR KR1020000002310A patent/KR100665148B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-19 SK SK76-2000A patent/SK285603B6/sk unknown
- 2000-01-19 NO NO20000262A patent/NO327317B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-01-20 HU HU0000185A patent/HU224491B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-01-20 AU AU12507/00A patent/AU772897B2/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-08-27 JP JP2010190917A patent/JP2010284174A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK285603B6 (sk) | 2007-04-05 |
| DE69929638D1 (de) | 2006-04-13 |
| KR100665148B1 (ko) | 2007-01-09 |
| EP1022339B1 (en) | 2006-02-01 |
| JP2000210091A (ja) | 2000-08-02 |
| CA2294575A1 (en) | 2000-07-20 |
| AU772897B2 (en) | 2004-05-13 |
| AU1250700A (en) | 2000-07-27 |
| PT1022337E (pt) | 2006-11-30 |
| CZ2000214A3 (cs) | 2000-08-16 |
| ATE334202T1 (de) | 2006-08-15 |
| DE69929638T2 (de) | 2006-09-21 |
| ES2269027T3 (es) | 2007-04-01 |
| KR20000053523A (ko) | 2000-08-25 |
| NO20000262D0 (no) | 2000-01-19 |
| HUP0000185A2 (en) | 2002-09-28 |
| NO20000262L (no) | 2000-07-21 |
| JP2010284174A (ja) | 2010-12-24 |
| EP1022339A1 (en) | 2000-07-26 |
| NO327317B1 (no) | 2009-06-08 |
| HU224491B1 (hu) | 2005-09-28 |
| HU0000185D0 (en) | 2000-04-28 |
| DK1022337T3 (da) | 2006-11-06 |
| CA2294575C (en) | 2009-04-07 |
| US6506590B1 (en) | 2003-01-14 |
| SK762000A3 (en) | 2000-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6117651A (en) | Expression vectors | |
| US6537779B1 (en) | T7 promoter-based expression system | |
| ZA200404737B (en) | Nano-composite martensitic steels | |
| JPS6054685A (ja) | 改良発現ベクタ−およびその利用 | |
| PT97081B (pt) | Processo para a preparacao de vectores bacterianos | |
| CZ294279B6 (cs) | Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektor obsahující DNA sekvenci, Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory a použití vektoru | |
| CN114317576A (zh) | 一种人生长激素重组表达载体、表达人生长激素的工程菌、其构建方法及其应用 | |
| US7070989B2 (en) | Escherichia coli strain secreting human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) | |
| CN110195070B (zh) | 大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp及应用 | |
| JP2551746B2 (ja) | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 | |
| Stieglitz et al. | Cloning, sequencing, and expression in Ficoll-generated minicells of an Escherichia coli heat-stable enterotoxin gene | |
| US7235385B2 (en) | Methods for enhancing expression of recombinant proteins | |
| EP1461437B1 (en) | Expression vectors and promoters for heterologous gene expression | |
| KR100652784B1 (ko) | 씨1 억제제가 결합하는 글루코스 제어의 신규 프로모터,전기 프로모터를 함유하는 발현용 벡터, 전기 벡터를함유하는 호스트 및 전기 호스트를 이용한 단백질의생산방법 | |
| RU2422512C1 (ru) | ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА С 404 ПО 609 АМИНОКИСЛОТУ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| CN118272338A (zh) | 突变蛋白、核酸分子、融合标签及其应用 | |
| JP2020031550A (ja) | 発現システム及び組換え細胞 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130119 |