JP2000210099A - 微生物の計測方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の微生物の数を迅速かつ高感度で測定
する。 【解決手段】 微生物を含む液体や気相の試料を、下記
の工程（ａ）〜（ｆ）を順次行って、試料中の微生物数
を計測する。 （ａ）試料をメンブランフィルタ上に吸引濾過し微生物
をフィルタに固定化する。 （ｂ）そのメンブランフィルタを適当な栄養培地上に置
き、微生物を増殖させる。 （ｃ）増殖した微生物をメンブランフィルタと共に乾燥
固化させる。 （ｄ）メンブランフィルタをアルコール性水溶液に溶解
した色素で染色する。 （ｅ）アルコール性水溶液でメンブランフィルタを脱色
し乾燥させる。 （ｆ）メンブランフィルタを顕微鏡で観察し、微生物の
コロニーの数を計測する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の染色法に
もとづく微生物計測法に関するもので、試料中の微生物
数の迅速かつ高感度な測定に利用できる。

【０００２】

【従来の技術】上水や放流下水中における大腸菌数の測
定、食品分野における食品中の細菌検査、乳製品中の大
腸菌・乳酸菌測定、医療用無菌室やクリーンルームにお
ける気相の細菌検査など、広い分野で細菌数の測定が行
なわれている。このような場合の細菌数の測定は、従
来、寒天平板培養法（２４〜４８時間）により行なわれ
てきた。２０年ほど前からこの方法の改良法として、メ
ンブランフィルタ法が普及している。試料をメンブラン
フィルタを通して吸引濾過するため、上水や室内空気な
どの比較的低濃度の微生物の濃縮も可能であり、また、
メンブランフィルタを色々な選択培地上で培養すること
により微生物の種類を大まかに特定することができる。
しかし、その結果が出るには従来の寒天平板培養法と同
様に２４〜４８時間を要する。この理由により、たとえ
ば下水放流水中の大腸菌数の管理や食品検査に迅速かつ
適切な処置がとれないという問題点があった。

【０００３】細菌を迅速に検出する方法としては、試料
をあらかじめフクシンなどの色素で染色後、スライドグ
ラス上に載せ、顕微鏡で観察したり、メンブランフィル
タで捕集して顕微鏡で観察する方法がある。本方法は培
養する必要がないため、迅速（約１時間）に細菌数を計
測できるが、以下の欠点があった。（ｉ）１０００倍以
上の高倍率位相差顕微鏡が必要、（ii）多量の細菌数が
存在することが必要である、（iii）ゴミとの区別が付
きにくい、（iv）微生物の種類が特定しにくい、（ｖ）
時間と共に退色し、試料の保存性がない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の問題点を解決し、新規な微生物染色法により試料中の
微生物を迅速、高感度かつ簡便に測定できるのみなら
ず、微生物染色後の着色度がほとんど変化せず、長期の
保存が可能な微生物の計測方法を提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の請求項１にかか
わる微生物の計測方法は、微生物を含む液体や気相の試
料を、下記の工程（ａ）〜（ｆ）を順次行なうことによ
ってその試料中の微生物数を計測するものである。

【０００６】（ａ）試料をメンブランフィルタ上に吸引
濾過し微生物をフィルタに固定化する。

【０００７】（ｂ）そのメンブランフィルタを栄養培地
上に置き、微生物を増殖させる。

【０００８】（ｃ）増殖した微生物をメンブランフィル
タと共に乾燥固化させる。

【０００９】（ｄ）メンブランフィルタをアルコール性
水溶液に溶解した色素で染色する。

【００１０】（ｅ）アルコール性水溶液でメンブランフ
ィルタを脱色し乾燥させる。

【００１１】（ｆ）メンブランフィルタを顕微鏡で観察
し、微生物のコロニーの数を計測する。

【００１２】また、本発明の請求項２にかかわる微生物
の計測方法は、請求項１記載の微生物の計測方法におい
てメンブランフィルタに０．１〜５０μｍの孔径を用い
るようにしたものである。

【００１３】さらに、本発明の請求項３にかかわる微生
物の計測方法は、請求項１記載の微生物計測方法におい
て、染色色素にアミドブラックを用いるものである。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の微生物の計測方法は上下
水や河川などの環境分野、飲料などの食品分野、化粧品
分野、糞弁や血液中などの医療分野、室内や冷蔵庫、ク
リーンルームなどの細菌検査、工場の微生物管理試験分
野など、広範な分野で利用できる。

【００１５】発明者は、上記課題を解決するため鋭意研
究を重ねた結果、メンブランフィルタ上に成育した微生
物コロニーをメンブランフィルタと共に乾燥し、その
後、アルコール性の色素溶液で染色・脱色することによ
り、上記の課題が解決されることを見出した。とくに、
アルコール性水溶液として１０〜８０％濃度のエタノー
ルまたはメタノールを用い、色素として０．０１〜２％
濃度のアミドブラックを用いた場合、メンブランフィル
タ上に微生物を保有し、４〜６時間の培養後にはメンブ
ランフィルタ上の細菌数（コロニー数）を計測できるこ
とがわかった。さらに、数カ月以前にメンブランフィル
タ上に乾燥固定した微生物でも染色できること、また、
染色後は長期保存が可能なことも判明した。本発明はか
かる知見によって完成されたものである。以下に本発明
の微生物の計測方法を説明する。

【００１６】本発明に用いるメンブランフィルタは、最
も一般的で、価格も安いセルロースエステル系のメンブ
ランフィルタで充分な効果が得られる。親水性、疎水性
いずれでもよいが、ポリカーボネート製のメンブランフ
ィルタでは、フィルタ上の微生物コロニーが脱落するこ
とがあった。この点に関しては、セルロースエステル系
のメンブランフィルタが望ましい。フィルタの孔径は対
象とする微生物によって０．１〜５０μｍの範囲で選択
する。大腸菌の場合は０．４５μｍを用いた。メンブラ
ンフィルタの色は白色を用いた。

【００１７】微生物を含む液体や気相の試料は適当に希
釈、または吸引速度を変化させてメンブランフィルタ上
に捕集する。微生物が捕集されたメンブランフィルタは
乾燥させずにそのまま寒天培地上にのせて一定時間培養
する。寒天培地の代わりに培養液をしみこませた濾紙上
に載せてもよい。一定時間培養後、メンブランフィルタ
を乾燥させ、培養された微生物コロニーをメンブランフ
ィルタ上に固定する。この乾燥に１０〜３０分必要であ
るが、３０〜４０℃の恒温槽を用いれば乾燥時間をさら
に短縮できる。乾燥後、メンブランフィルタがまるくな
ることがあるが、染色液に浸せば元に戻る。

【００１８】従来法では乾燥させずにそのまま染色する
が、この方法では微生物のコロニーがメンブランフィル
タからはがれ易く、また微小なコロニーが染色液に溶け
出してしまうおそれがあった。本発明では、染色前にメ
ンブランフィルタ上に成育した微生物コロニーを、まず
乾燥させる。ただし、酵母などのように微生物によって
は乾燥させるとフィルタから剥れやすい種類もある。一
方、大腸菌や枯草菌、カビなどは剥れることはなく、乾
燥法に適している。最適なコロニーの大きさは約１ｍ
ｍ、またはそれ以下であった。

【００１９】微生物の培地は目的の微生物がよく成育す
る培地、または特定の微生物しか成育しない選択培地を
用いる。大腸菌や酵母の選択培地を用いれば、試料中の
目的の微生物のみを計測することができる。本発明で
は、大腸菌、酵母、枯草菌の培地として、一般細菌用培
地である日本薬局方無菌試験法のＳＣＤＢ（Soybean-Ca
sein Digest Broth）を用いた。また大腸菌の選択培地
には厚生省薬発第２９７号のデオキシコレート寒天培地
を用いた。この寒天培地では、大腸菌のコロニーは淡紅
色〜紅色に染色されるが、着色が弱いため計測は容易で
なく、本発明の方法でさらに強く染色することにより、
容易に計測できる。培養時間は、大腸菌の場合ＳＣＤＢ
で４〜６時間以上である。その後メンブランフィルタを
乾燥させ、微生物をメンブランフィルタ上に固定化させ
る。

【００２０】微生物や蛋白質を染色する色素としては、
メチレンブルー、フクシン、マラカイトグリーン、ビク
トリアブルー、クーマシーブリリアントブルー、エオシ
ン、アミドブラックなどが候補としてあげられる。この
なかでメチレンブルー、マラカイトグリーン、ビクトリ
アブルー、フクシンは微生物の検出によく使われてお
り、本発明にも使用できるが、セルロース系のメンブラ
ンフィルタをも染色するため、バックグラウンドが上昇
した。エオシンは染色性は悪いが、微生物を蛍光で観察
することができるため高感度検出が可能であった。しか
し、このためには蛍光顕微鏡が必要であり、コロニーが
非常に小さいときにはゴミとの区別が難しい。一方、ア
ミドブラックは従来法の微生物染色にはほとんど使用さ
れないが、本発明におけるメンブランフィルタ上に固定
化された微生物コロニーの検出には最適であった。メン
ブランフィルタはアミドブラックにより他の色素と同様
に染色されるが、脱色されやすいためバックグラウンド
は上がらず、さらに乾燥した細菌（主に大腸菌）を迅速
に染色し、コントラストも高かった。

【００２１】染色剤を溶解する溶液としては、水１００
％からアルコール１００％までの希釈アルコールが使用
可能である。しかし水の量が多くなると乾燥に時間を要
し、アルコール濃度が増えると乾燥固定されたコロニー
が剥がれ易くなり、また脱色のコントロールが困難にな
る。そのため、実施例としては５０％アルコール水溶液
を用いた。溶液のｐＨは中性であればよいが、ｐＨ４〜
９のあいだではとくに染色性に問題はなかった。

【００２２】アルコールはエタノールおよびメタノール
を用いたが、どちらも同様な結果が得られた。染色剤を
よく溶かし、水に可溶で、かつメンブランフィルタを溶
かしたり、収縮などの影響を及ぼさない溶媒であれば他
の溶媒や混合溶媒でも使用可能である。

【００２３】アミドブラックの濃度は、０．０１％から
数％までメンブランフィルタ上の微生物を染色可能であ
ったが、染色時間１〜３０秒、脱色１分以内の条件で
は、０．２〜１％が最適であった。染色は薄ければ何回
でもやり直しが可能である。また、長期間メンブランフ
ィルタ上に固定されていた微生物（保存微生物）も同様
に染色可能である。このことから、試料から微生物をサ
ンプリング後、メンブランフィルタ上で培養と乾燥固定
だけを行ない、計測の必要性が発生した時点で染色して
微生物数を観察・計測することが可能である。

【００２４】メンブランフィルタ上に固定化された微生
物の染色時間は数秒〜数十秒で充分である。１％のアミ
ドブラックの場合は、５秒ほど染色液に浸せば微生物コ
ロニーが選択的に（とくに大腸菌の場合）染色される。
一方、６時間以内の培養では微生物コロニーが肉眼では
見えないので、１０秒を目安に染色を行なう。脱色は染
色液と同じ濃度のアルコール溶液を用いる。濃度が異な
れば脱色液がメンブランフィルタに浸透せず、うまく脱
色できない場合があるので注意を要する。すすぎ用の脱
色液を別にしておけば、５０ｍｌの脱色液で５０〜１０
０枚ほどのメンブランフィルタを脱色処理できる。脱色
時間は１分以内で完了する。アミドブラックの場合は見
た目にはかなりバックグラウンドが高く見えるが、乾燥
すれば色が薄くなるので問題はない。乾燥時間は、室温
２５℃で約３０分、３７℃の恒温槽では１０〜１５分で
顕微鏡観察が可能である。

【００２５】観察および菌数測定は微生物コロニーが
０．５ｍｍ以上あれば肉眼でも可能である。４７ｍｍ直
径のメンブランフィルタは、０．５ｍｍ以下のコロニー
でも拡大コピーにより容易に染色後の微生物コロニーの
計測が可能である。一方、６時間以内の培養では微生物
コロニーが肉眼では見えない（５０μｍ以下）ので、実
体顕微鏡や生物顕微鏡を用いる。透過光では観察しにく
いので上部からの落射光（反射光）で観察する。倍率は
１０〜５０倍程度で充分なので、実体顕微鏡が最も使い
やすい。

【００２６】寒天平板法と、本染色法での微生物計測数
を比較した結果、相関係数は０．９８６であり、比例関
係が認められるので、検量線は必要ない。

【００２７】

【実施例】つぎに、本発明を実施例により詳しく説明す
る。

【００２８】細菌として、大腸菌(Escherichia coli, I
FO3301)、枯草菌(Bacillus subtilis,IFO13719)、酵
母、白カビを用いた。培地としては日本薬局方無菌試験
法のＳＣＤＢ（Soybean-Casein Digest Broth）液体お
よび１．５％寒天培地、大腸菌の選択培地には厚生省薬
発第２９７号のデオキシコレート寒天培地（ニッセイ）
を用いた。実際の操作手順を以下に示す。

【００２９】（１）大腸菌培養液を生理食塩水で菌数が
１０〜３００個／ｍｌになるように希釈する。

【００３０】（２）メンブランフィルタのホルダーに４
７ｍｍ径のメンブランフィルタを無菌的に装着し、大腸
菌希釈液（約１０ｍｌ）をメンブランフィルタ上に注
ぐ。

【００３１】（３）アスピレータにより大腸菌希釈液を
吸引濾過し大腸菌をフィルタに固定化する（気相の場合
は汚染空気をそのまま吸引する）。

【００３２】（４）メンブランフィルタを寒天培地上に
無菌的に載せて、３７℃で４〜２４時間培養する。

【００３３】（５）所定時間後、メンブランフィルタを
３７℃の恒温槽で１５分間乾燥する。

【００３４】（６）メンブランフィルタを５０％エタノ
ール水溶液に溶解した色素（１％アミドブラック）で数
秒〜１０秒間染色する。

【００３５】（７）メンブランフィルタを５０％エタノ
ール水溶液で数十秒脱色する。

【００３６】（８）メンブランフィルタを３７℃の恒温
槽で１５分間乾燥する。

【００３７】（９）顕微鏡で観察し、微生物コロニー数
を計測する。

【００３８】本実施例においては、１．０％アミドブラ
ックを５０％エタノール水溶液に溶解し、０．４５μｍ
のメンブランフィルタで濾過したものをメンブランフィ
ルタ染色液とし、脱色液は５０％エタノール水溶液を用
いた。メンブランフィルタは直径４７ｍｍ、孔径０．４
５μｍ、滅菌済みのセルロースアセテートエステル（ア
ドバンテック、東洋濾紙 Ａ０８０Ｈ０４７Ｗ）を用い
た。顕微鏡観察にはＮｉｋｏｎ生物顕微鏡（ＯＰＴＩＰ
ＨＯＴ）を用いた。

【００３９】ＳＣＤＢ培養液に、大腸菌を接種し３７℃
で一昼夜（１５時間）振盪培養した。ＯＤ（optical de
nsity）６００ｎｍが１．０付近の培養液を標準試験用
大腸菌懸濁液とした。この懸濁液を滅菌した生理食塩水
で希釈し、１０〜３００個大腸菌／ｍｌの試料液とし
た。この大腸菌希釈液約１０ｍｌをメンブランフィルタ
で濾過し、すばやくＳＣＤＢ寒天培地または、デオキシ
コレート寒天培地上に載せ、４〜２４時間、３７℃で静
置培養した。同様にこの大腸菌希釈液をそれぞれの寒天
培地に接種し、１５〜２５時間後の菌数を測定して、メ
ンブランフィルタ法と比較した。

【００４０】気相中の浮遊微生物の検出には、前記のメ
ンブランフィルタを装着した吸引ポンプにより、１０〜
１００リットルの汚染空気を吸引し（３〜５リットル／
分）その後メンブランフィルタを寒天培地上で４〜２４
時間、３７℃で静置培養した。

【００４１】メンブランフィルタ上に生育した微生物コ
ロニーを恒温槽で３７℃、１５分乾燥させ、１％アミド
ブラック染色液に５〜１０秒間浸して染色し、直ちに脱
色液（５０％エタノール）でバックグラウンドが薄くな
るまで脱色した。脱色時間は１〜２分以内でよい。その
後、恒温槽３７℃で１５分間乾燥させ、顕微鏡で観察し
た。

【００４２】図１〜３にデオキシコレート寒天培地（ニ
ッセイ）で、それぞれ６，９，１５時間培養後のメンブ
ランフィルタの写真を示す（染色なし）。図中の黒線
は、メンブランフィルタに印刷された目盛線である。図
２の矢印Ａは９時間培養後、図３の矢印Ｂは１５時間培
養後の大腸菌のコロニーを示すが、検出は困難である。
図１の６時間培養では検出が不可能であった。

【００４３】図４〜６にＳＣＤＢ培地で、それぞれ６，
９，１５時間培養後、アミドブラックで染色したメンブ
ランフィルタの写真を示す。図４の矢印Ｃは６時間培養
後、図５の矢印Ｄは９時間培養後、図６の矢印Ｅは１５
時間培養後の大腸菌のコロニーを示す。

【００４４】代表的な大腸菌選択培地で、かつ大腸菌コ
ロニーが紅色に発色するデオキシコレート寒天培地を用
いても、６〜１５時間培養後に顕微鏡下でコロニーを観
察することは困難であった（図１〜３）。しかし、図４
〜６のように、一般的なＳＣＤＢ寒天培地（大腸菌は発
色しない）で生育した場合でも、アミドブラックで染色
すれば容易に大腸菌コロニーを計測することができた。
とくに６時間での検出は本染色法でのみ大腸菌が検出さ
れた。

【００４５】本発明の計測法により、大腸菌希釈試料を
メンブランフィルタで濾過し、６時間寒天培地上で培養
後、メンブランフィルタをアミドブラックで染色して、
大腸菌コロニーを計測した数と、従来法により大腸菌希
釈試料をそのままＳＣＤＢ寒天培地で２４時間培養し
て、出現した大腸菌コロニーを計測した値の比較を図７
に示す。このように、相関係数は０．９８６であり、標
準法の寒天平板法とほとんど同一であった。このこと
は、本発明の計測法を用いれば、従来２４時間必要であ
った大腸菌の検出を、寒天平板法と同様な正確さで６時
間以内に行なえることを示している。

【００４６】メンブランフィルタ上で培養した大腸菌だ
けでなく、枯草菌、カビなどでも同様にアミドブラック
で高感度に染色できた。図８〜１０にそれぞれ大腸菌、
枯草菌、白カビのコロニーのメンブランフィルタ上での
アミドブラック染色結果を示す。図１０の白カビのケー
スは他の図８、９より高倍率で撮影してあり、試料が白
カビであるため菌糸が見えているが、検出が容易である
点は他と同様である。

【００４７】図１１には、本染色法で染色したメンブラ
ンフィルタの２カ月後の写真を示す。このように、染色
後、長期間保存が可能である。また、図１２は、大腸菌
をメンブランフィルタ上で培養、乾燥後、２カ月間保存
し、その後に本方法で染色したものである。このよう
に、長時間保存したメンブランフィルタでも、大腸菌コ
ロニーが染色可能であった。

【００４８】

【発明の効果】本発明のメンブランフィルタとアミドブ
ラックを用いた染色法により、試料中の微生物、とくに
大腸菌の有無や数を迅速（６時間以内）、高感度かつ簡
便に測定しうる。また、着色度が時間と共に変化せず、
本発明の方法で染色した試料は長期保存安定性に優れ
る。また、微生物をメンブランフィルタ上で培養後乾燥
したものは、長期間保存した後でも染色が可能である。
このような本発明の染色法を用いることにより、原料や
製品の生菌数試験、工程微生物管理試験、研究開発分野
の微生物試験に利用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 デオキシコレート寒天培地（ニッセイ）で、
メンブランフィルタ上の大腸菌を６時間培養後のメンブ
ランフィルタ上のコロニーを示す図である。

【図２】 デオキシコレート寒天培地（ニッセイ）で、
メンブランフィルタ上の大腸菌を９時間培養後のメンブ
ランフィルタ上のコロニーを示す図である。

【図３】 デオキシコレート寒天培地（ニッセイ）で、
メンブランフィルタ上の大腸菌を１５時間培養後のメン
ブランフィルタ上のコロニーを示す図である。

【図４】 ＳＣＤＢ培地で、メンブランフィルタ上の大
腸菌を６時間培養後、アミドブラックで染色したメンブ
ランフィルタ上のコロニーを示す図である。

【図５】 ＳＣＤＢ培地で、メンブランフィルタ上の大
腸菌を９時間培養後、アミドブラックで染色したメンブ
ランフィルタ上のコロニーを示す図である。

【図６】 ＳＣＤＢ培地で、メンブランフィルタ上の大
腸菌を１５時間培養後、アミドブラックで染色したメン
ブランフィルタ上のコロニーを示す図である。

【図７】 本発明の方法と寒天平板法による大腸菌計測
数の比較および相関係数を示す図である。

【図８】 大腸菌のコロニーのメンブランフィルタ上で
の本発明の方法によるアミドブラック染色結果を示す図
である。

【図９】 枯草菌のコロニーのメンブランフィルタ上で
の本発明の方法によるアミドブラック染色結果を示す図
である。

【図１０】 白カビのコロニーのメンブランフィルタ上
での本発明の方法によるアミドブラック染色結果を示す
図である。

【図１１】 本発明の染色法で染色したメンブランフィ
ルタの２カ月後の状態を示す図である。

【図１２】 大腸菌をメンブランフィルタ上で培養後、
２か月後に本発明の方法で染色したものを示す図であ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物を含む液体や気相の試料を、下記
   の工程（ａ）〜（ｆ）を順次行なうことによってその試
   料中の微生物数を計測する微生物の計測方法。 （ａ）試料をメンブランフィルタ上に吸引濾過し微生物
   をフィルタに固定化する。 （ｂ）そのメンブランフィルタを適当な栄養培地上に置
   き、微生物を増殖させる。 （ｃ）増殖した微生物をメンブランフィルタと共に乾燥
   固化させる。 （ｄ）メンブランフィルタをアルコール性水溶液に溶解
   した色素で染色する。 （ｅ）アルコール性水溶液でメンブランフィルタを脱色
   し乾燥させる。 （ｆ）メンブランフィルタを顕微鏡で観察し、微生物の
   コロニーの数を計測する。
2. 【請求項２】 メンブランフィルタに０．１〜５０μｍ
   の孔径を用いる請求項１記載の微生物の計測方法。
3. 【請求項３】 色素にアミドブラックを用いる請求項１
   記載の微生物の計測方法。