JPH10215859A

JPH10215859A - 細菌捕集用ろ過具、細菌数測定キットおよび細菌数の測定方法

Info

Publication number: JPH10215859A
Application number: JP2013497A
Authority: JP
Inventors: Mikio Sato; 幹夫佐藤; Asami Ito; 朝美伊藤; Akihiko Kadota; 明彦門田
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 1997-02-03
Filing date: 1997-02-03
Publication date: 1998-08-18

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中に動植物細胞等が混在していても細菌
のみが簡便かつ迅速に捕集でき、細菌数測定キットや測
定方法に利用できる細菌捕集用ろ過具を提供すること。
特別な設備や専門的な知識を必要とせず、１段階の濾過
操作で迅速かつ簡便に、試料中の細菌数を測定する測定
キットおよび測定方法を提供すること。【解決手段】孔径３０〜７０μｍの第一フィルター
と、孔径０．４５〜４μｍの第二フィルターを有するろ
過具の提供。孔径３０〜７０μｍの第一フィルターと、
疎水性材料からなる孔径０．４５〜４μｍの第二フィル
ターを有する細菌捕集，検出用ろ過具、色素液組成物、
比色手段からなる細菌数測定キットの提供。孔径３０〜
７０μｍの第一フィルターと、疎水性材料からなる孔径
０．４５〜４μｍの第二フィルターを有する細菌捕集，
検出用ろ過具、第一フィルターから先に接触するように
着色された試料を導入して細菌の捕集をおこない、第二
フィルターの着色度から試料中の細菌数を検出する細菌
数測定方法の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
動植物細胞等の除去と細菌の捕集が同時にできる細菌捕
集用ろ過具、このようなろ過具を要素として用いる細菌
数測定キット、並びにこのような細菌数測定キットを用
いて細胞数を迅速に測定する測定方法に関する。

【０００２】本発明の細菌捕集用ろ過具は、細菌のみを
簡便かつ迅速に捕集できるため、本発明の細菌数検査キ
ットや細菌数の測定方法に利用できる。本発明の細菌数
測定キットおよび細菌数の測定方法は、高度な技術や専
門的な知識を必要とすることなく、しかも簡単な１段階
のろ過操作で試料中の細菌数を迅速、かつ、簡便に測定
しうる。このため、本発明は、尿中の細菌が問題となる
診断分野をはじめ、食品分野などの広汎な分野において
有効に利用することができる。

【０００３】

【従来の技術】従来より、尿検査分野などでは、炎症の
発見や病状を推定するために、尿等の試料中の細菌数等
の測定が行なわれている。例えば、尿中の細菌が増殖し
た場合、細菌尿症と診断され、尿路感染症が暗示され
る。従って、早期治療や薬投与のため、細菌数の測定を
行なっている。

【０００４】また、食品分野などでは、食品が腐敗して
いないかどうかを判断するために食品中の細菌数等の測
定が行なわれており、さらに発酵乳や乳酸菌飲料などで
は食品中の乳酸菌数管理のために食品中の乳酸菌数の測
定が行なわれている。このような場合の細菌数の測定
は、寒天平板培養法により行なわれるのが主流である。

【０００５】しかしながら、この培養法では、専門技術
と恒温槽という機器が必要であり、また結果が出るのに
２４〜４８時間を要する。例えば、尿検査では、外来患
者の尿試料は細菌検査室か、または検査センターで培養
検査が行なわれるため、結果が医者に分かるのは数日後
である。精度の高い診断を行なうために、迅速な細菌測
定法が求められている。

【０００６】一方、食品の場合、大腸菌検査と一般細菌
検査とがあり、大腸菌検査は１８時間培養で結果が出る
ものの、一般細菌検査では２４時間以上の培養が必要で
あり、多くの食品の場合、製品出荷後に結果が出るのが
通常である。特に発酵乳等における乳酸菌数の測定の場
合には、通常の培養法では７２時間程度かかるため、商
品出荷後であって、しかも多くの場合、消費者が既にそ
の商品を飲食し終わった後に、ようやく乳酸菌の菌数が
分かるという具合であり、菌数管理の面から改善が求め
られていた。

【０００７】本出願人は、このような従来の欠点を解消
するものとして、試料中の細菌数を測定するにあたり、
細菌を染色した後に疎水性フィルターに捕集し、細菌の
着色度から試料中の細菌数を測定する方法を既に提案し
ている（特開平８−１４０６９８号公報) 。この方法に
よれば、熟練した技術や専門的な知識、特別な設備など
を必要とせず、しかも迅速、かつ、簡便に試料中の細菌
数を測定することができる。

【０００８】しかしながら、この方法の場合、試料中に
動植物細胞等が存在する場合には、これらも染色されて
しまい、試料中の細菌数を正確に測定するのが難しいと
いう問題があった。この公報には、プレフィルターを用
いて動物細胞を捕集する技術も開示されているが、開示
されたプレフィルターは細菌捕集用のフィルターより若
干ろ過孔径の大きい程度のものであるため、試料中の動
物細胞数が多い場合には、目詰まりを起こしてろ過が困
難となるという問題があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来の欠点を解消し、試料中に動植物細胞等が混在して
いても、細菌のみが簡便かつ迅速に捕集でき、細菌数測
定キットや測定方法に利用できる細菌捕集用ろ過具を提
供することを目的とするものである。本発明はまた、特
別な設備や専門的な知識を必要とすることなく、しかも
試料中に動植物細胞等が存在していても、簡単な１段階
のろ過操作で迅速、簡便、かつ正確にに、試料中の細菌
数を測定し得る方法とその測定キットとを提供すること
を目的とするものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、細菌と動
植物細胞等の大きさ及び大きさの違いに着目し、特定の
ろ過孔径を有するフィルターを組み合わせることによっ
て、動植物細胞等が効率よく除去され、細菌のみが捕集
されることに着目し、本発明を完成するにいたった。

【００１１】すなわち、本発明の要旨は以下のとおりで
ある。（１）．孔径３０〜７０μｍの第一フィルターと、孔径
０．４５〜４μｍの第二フィルターを有する細菌捕集用
ろ過具。（２）．第一フィルターの厚さが１．５〜７ｍｍである
前記（１）記載の細菌捕集用ろ過具。（３）．第一フィルターがポリビニルアルコール製フィ
ルターである前記（１）または（２）記載の細菌捕集用
ろ過具。（４）．第一フィルターが動植物細胞除去用フィルター
であり、第二フィルターが細菌捕集用フィルターである
前記（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌捕集用ろ過
具。（５）．第二フィルターが疎水性材料からなるフィルタ
ーである前記（１）〜（４）のいずれかに記載の細菌捕
集用ろ過具。（６）．孔径３０〜７０μｍの第一フィルターと、疎水
性材料からなる孔径０．４５〜４μｍの第二フィルター
を有する細菌捕集、検出用ろ過具、色素液組成物、およ
び比色手段からなる細菌数測定キット。（７）．孔径３０〜７０μｍの第一フィルターと、疎水
性材料からなる孔径０．４５〜４μｍの第二フィルター
を有する細菌捕集、検出用ろ過具に、第一フィルターか
ら先に接触するように着色された試料を導入して細菌の
捕集を行い、第二フィルターの着色度から試料中の細菌
数を検出することを特徴とする細菌数の測定方法。

【００１２】

【発明の実施の形態】まず、本発明の細菌捕集用ろ過具
について説明する。本発明の細菌捕集用ろ過具は、特定
の孔径を有する２種類のフィルター（第一フィルターお
よび第二フィルター）を有する。本発明において、フィ
ルターの孔径とは、バブルポイント法（ＪＩＳＫ３８
３２）などの物理的測定法、あるいは一定粒径の粉末を
用いて測定するＪＩＳＺ８９０１などの粒子保留性測
定法により得た孔径である。また、本発明のろ過具は、
孔径の大きい第一フィルターが、細菌を含む試料と先に
接する態様で使用する。

【００１３】第一フィルターは、細菌以外の動植物細胞
等を捕集して除去する機能を有する。ここで、動植物細
胞等とは、白血球や上皮細胞などの動物細胞、藻類など
の植物細胞等、細菌より形態が大きい細胞等を指す。動
植物細胞の大きさは、その種類により異なるが、白血球
は８〜１５μｍ、上皮細胞では２０〜４０μｍ、植物細
胞に該当する緑藻類のクロレラで３〜１０μｍ程度であ
る。

【００１４】細菌以外の動植物細胞等を捕集して除去す
る機能を発揮するためには、孔径を３０〜７０μｍとす
る必要がある。更に、ろ過速度と動植物細胞等の捕集能
力の点で、３０〜６０μｍとするのが好適である。孔径
が３０μｍ未満では、動植物細胞等に起因する目詰まり
を起こしやすく、７０μｍを超えると、白血球等の捕集
が不完全となる。この場合、本発明の後記第二フィルタ
ーの孔径は小さいため、第二フィルターの目詰まりによ
るろ過性の低下が生じる可能性がある。また、本発明の
細菌数測定キットの要素に使用した場合には、細菌数測
定の精度が低下する可能性がある。

【００１５】フィルターの厚さは１．５〜７ｍｍとする
のが好適であり、３〜６ｍｍとするのがより好適であ
る。１．５ｍｍ未満では、動植物細胞等の捕集が不完全
となるなる可能性があり、７ｍｍを越えると、細菌の通
過が不完全となり、第一フィルターでの細菌の捕集率が
高くなる可能性がある。この場合、細菌の捕集性能は低
下しないが、本発明の細菌数測定キットの要素に使用し
た場合には、細菌数測定の精度が低下する可能性があ
る。

【００１６】フィルターの材質は、特に限定されない
が、細菌が吸着しにくい点で、ポリプロピレン製等のポ
リオレフィン製のものやポリビニルアルコール製のもの
が好ましい。ポリビニルアルコール製フィルターは、多
孔性で捕集能力が大きいため、特に好ましい。中でも、
ホルマール処理したポリビニルアルコール製フィルター
が好ましい。

【００１７】第二フィルターは、細菌を捕集する機能を
有し、その孔径は０．４５〜４μｍとする必要がある。
一方、細菌の大きさは、概ね１〜２μｍである。即ち、
本発明の第二のフィルターは、細菌よりも大きな孔径で
あっても、これを捕集することができる。しかし、４μ
ｍを越えると、細菌の捕集が難しくなり、０．４５μｍ
より小さいと、ろ過が困難となる。

【００１８】フィルターの材質は特に限定されず、セル
ロースアセテート等の親水性材料からなるフィルターで
あってもよい。しかし、色素により細菌を染色して、そ
の数を求める方法を採用する場合においては、親水性材
料からなるフィルターを使用すると、フィルター自身も
染色され、過剰色素の除去が難しい。このため、この方
法を採用する場合には、疎水性材料からなるフィルター
（以下、疎水性フィルターと略記する。）を採用するこ
とが好ましい。

【００１９】このような疎水性フィルターとしては、例
えばナイロン系、ポリテトラフルオロエチレン（四フッ
化エチレン樹脂）等のフッ素系、ポリプロピレンなどの
ポリオレフィン系、ポリカーボネート系、或いはガラス
系などの疎水性フィルターが挙げられる。これらのフィ
ルターの中でも特にポリテトラフルオロエチレンやポリ
プロピレンを材料とする疎水性フィルターが、過剰の色
素の除去が容易であるため好ましい。

【００２０】また、親水性の材料、例えばニトロセルロ
ース系フィルターを表面処理により疎水性にすれば、疎
水性フィルターとして使用することができる。ここで表
面処理としてはコーティングなどであり、コーティング
に用いる材料として、前記ナイロン系，フッ素系，ポリ
オレフィン系の材料などを用いることができる。本発明
の細菌捕集用ろ過具は、前記のような２種類のフィルタ
ーを有するものであるが、細菌の捕集に際しては、前記
のごとく細菌を含む試料が第一フィルターを先に通過す
る態様で使用する必要がある。また、疎水性材料からな
る第二フィルターを使用すれば、本発明の細菌捕集用ろ
過具は、本発明の細菌数測定キットにおける、細菌捕
集、検出用ろ過具として好適に使用でき、本発明の細菌
数測定方法に好適に使用できる。

【００２１】本発明のろ過具は、前記した第一フィルタ
ーと第二フィルターを用いる物であればよいが、フィル
ターを格納するためのろ過容器を用いると、細菌による
汚染がなく好都合である。このろ過容器は、チューブ
状、即ち筒状或いは管状をなしており、塩化ビニルなど
のプラスチック製とガラス製とのいずれをも使用するこ
とができる。さらに、その容量は、使用する試料等の量
に応じて適宜選択すればよい。

【００２２】また、ろ過容器は、接続可能な２の要素か
らなるものであってもよく、この場合、一方のろ過容器
に第二フィルターを格納し、他方のろ過容器に第一フィ
ルターを格納する態様が採用される。そして、第一フィ
ルターを格納するろ過容器をを、試料の採取に適する先
細の形状とすることもでき、第一フィルターの格納部分
より先の部分に試料計量用の目盛りを付してもよい。

【００２３】前記の態様において第二フィルターを格納
するろ過容器は、第二フィルターの支持体を予め配した
ものであってもよい。フィルター支持体としては、第二
フィルターを支持しうるものであれば、その材質、形状
等は問わない。通常はシリコーン樹脂などで作製された
ものである。このようなろ過容器を使用した細菌捕集用
ろ過具としては、図１に符号Ａとして記載されたものを
好適に用いることができる。

【００２４】次に、本発明の細菌数測定キットについて
説明する。本発明の細菌数測定キットは、細菌捕集、検
出用ろ過具と、色素液組成物および比色手段からなって
いる。細菌捕集、検出用ろ過具は、孔径３０〜７０μｍ
の第一フィルターと、疎水性材料からなる孔径０．４５
〜４μｍの第二フィルターを有するものであり、基本的
には、前記した細菌捕集用ろ過具と同様の構成のもので
ある。ただし、本発明のキットは、色素液組成物を使用
するものであるため、前記の理由より疎水性材料からな
る第二フィルターを用いる必要がある。また、本キット
における第二フィルターは、細菌捕集用フィルターとし
ての機能とともに、細菌検出用フィルターとしての機能
を有する。具体的には、捕集された細菌数と着色の程度
に相関性が認められる検出機能を有する。

【００２５】第一フィルターおよび第二フィルターにつ
いての説明は、前記と同様であり、第一フィルターとし
ては、厚さ１．５〜７ｍｍのフィルターあるいはポリビ
ニルアルコール製フィルターを好適に使用できる。ま
た、ろ過容器等ついての説明も前記と同様である。本発
明の細菌数測定キットにおいては、第一フィルターを格
納するろ過容器と第二フィルターを格納するろ過容器が
別体である態様が、捕集された細菌の検出の簡便性の点
で好適である。

【００２６】色素液組成物としては、染色と洗浄とを兼
ねることのできる組成物が用いられ、具体的には細菌の
染色に使用可能な色素と、水又は各種緩衝液、さらに必
要に応じて加える界面活性剤とからなるものである。細
菌の染色に使用可能な色素としては、例えばサフラニ
ン，フクシン，メチレンブルー，メチルグリーン，クリ
スタルバイオレット，ゲンチアナバイオレット，ビクト
リアブルーＢなどが挙げられ、特に判定のし易さの点よ
り、サフラニン，フクシン，メチレンブルー，メチルグ
リーンが好ましい。

【００２７】また、緩衝液の使用可能ｐＨは３〜９であ
り、色素の安定性の点から好ましくはｐＨ４〜７であ
る。必要に応じて、エタノールなどの防腐剤や界面活性
剤等を添加することもできる。使用可能な色素濃度は、
フクシンの場合、通常、０．００００５〜０．０００６
％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００２〜０．０００４
５％（ｗ／ｖ）である。ここで色素の濃度が、０．００
００５％未満であると着色が不充分となり、一方、色素
液の濃度が０．０００６％を超えると過剰の色素の除去
が困難となるため、いずれも好ましくない。

【００２８】なお、必要に応じて、エタノールなどの防
腐剤を添加する場合には 0.1〜 15％（ｖ／ｖ）添加す
ればよい。また、界面活性剤を添加する場合には、界面
活性剤を０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）の割合で添加
すればよい。

【００２９】本発明の細菌数測定キットにおいて比色手
段とは、細菌によるフィルターの染色の程度から、その
数を定量するための手段である。細菌数の測定は、
（１）色の対照表を用いて目視により比較するのが一番
簡便であるが、（２）光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定による
比色定量法により行なうこともできる。目視判定の場合
には、第二フィルターの表側の面（第一フィルターと相
対する面）のみならず、裏側の面の着色度より、測定す
ることもできる。これらの場合には、それぞれの側用の
色対照表や、吸光度と細菌数の検量線を作成すればよ
い。

【００３０】次に、本発明の細菌数測定方法について説
明する。本発明の測定方法においては、孔径３０〜７０
μｍの第一フィルターと、疎水性材料からなる孔径０．
４５〜４μｍの第二フィルターを有する細菌捕集、検出
用ろ過具に、第一フィルターから先に接触するように着
色された試料を導入して細菌の捕集を行い、第二フィル
ターの着色度から試料中の細菌数を検出する。本発明の
測定方法に用いる細菌捕集、検出用ろ過具としては、前
記の細菌数測定キットにおける細菌捕集、検出用ろ過具
が好適に使用できる。

【００３１】測定方法としては、具体的には、次の態様
を採用することができる。試料を着色するための色素液
組成物を２００〜８００マイクロリットル入れた容器
に、試料を７０〜１４０マイクロリットル添加し（試料
を入れた容器に色素液組成物を添加してもよい。）て試
料を着色する。次に、細菌捕集、検出用ろ過具の第二フ
ィルター側に注射器を装着し、ピストンを引いて試料を
吸引ろ過する。吸引が難しい場合には、ピストンにロッ
ク器具を装着することによりピストンの逆行を防ぐこと
ができる。試料が通過したら、注射器からろ過具を取り
外し、第二フィルター表面を乾燥し、第二フィルターの
着色度を色対照表と比較して、細菌数を求める。

【００３２】以下、図面により本発明の細菌数測定キッ
トおよび細菌数の測定方法について更に詳しく説明す
る。図１は、本発明の細菌数測定キットの１態様を示す
説明図である。また、図２は、本発明の細菌数測定キッ
トを市販の注射器と組み合わせて、細菌数測定の準備を
した状態を示す説明図である。

【００３３】図１においてろ過容器Ａは、第二フィルタ
ー１、第一フィルター３およびフィルター支持体２を内
部に有するものである。このろ過容器Ａは、２の要素か
らなっており、第二フィルター１およびフィルター支持
体２を内蔵した円筒状のろ過容器Ａ１と第一フィルター
３を内蔵した、先端が細くなっているろ過容器Ａ２から
なっている。

【００３４】細菌捕集、検出用のフィルターとして、本
発明の方法では第二フィルター（疎水性フィルター）１
を用いる。疎水性フィルターは極性が弱いか、或いは極
性がなく、過剰の色素の除去が容易であるため細菌捕集
用のフィルターとして好適である。この第二フィルター
１の孔径は、前記のように０．４５〜４μｍの範囲とす
る必要がある。

【００３５】第二フィルター１の吸引ろ過面積（着色域
の面積）の大きさは、見やすければ特に制限はない。こ
の着色域の形は特に問わないが、見やすさの点で円形が
望ましく、その直径は１〜３mm程度のものが好ましい。
第二フィルター全体の大きさは特に制限はないが、少な
くとも着色域の大きさは最低必要である。第二フィルタ
ー１の色としては、用いる色素を考慮して、判定容易な
色を定めればよい。着色の程度を容易に判定するために
は、白色が好ましい。また、透明，半透明の疎水性フィ
ルターも用いることができ、フィルター支持体２を白色
にすると、判定が容易となる。

【００３６】一方、ろ過容器Ａ１の他端は、注射器Ｂの
先端が装着可能であって、注射器Ｂによる吸引を可能に
している。なお、必要に応じて、本発明の細菌数測定キ
ットの中に注射器Ｂ自体を含めても良い。更に、ピスト
ンのロック器具（図示せず）を含めても良い。そして、
このろ過容器Ａ１の先端（第二フィルター１を備えた
側）には、図１に示したように、内部に第一フィルター
３を装着した（すなわち、第一フィルター３を内装し
た）ろ過容器Ａ２（試料採取用要素）が、取外し自在に
組み合わせられる。通常は、図１，図２に示すように、
ろ過容器Ａ２の内部に、一部ろ過容器Ａ１の先端が入り
込むような形で嵌合しうるように作製しておき、嵌合し
た際に、ろ過容器Ａ２の内部に装着された第一フィルタ
ー３と、ろ過容器Ａ１の一端に装着された第二フィルタ
ー１とが接するようにしておく。

【００３７】ろ過容器Ａ２は、一端が先細状をなしたチ
ューブ状、即ち筒状或いは管状のものであり、その先細
状の一端から試料を採取しうるように、そこに試料採取
口４が設けられている。さらに、このろ過容器Ａ２に
は、計量目盛りを付しておくことができる。この場合、
通常使用する試料の量である５０〜２００マイクロリッ
トルの範囲に目盛りをふっておくと良い。

【００３８】なお、ろ過容器Ａ２の内部に装着される第
一フィルター３は、動植物細胞等除去用のものであっ
て、細菌試料中に細菌より大型の動物細胞、例えば白血
球などが共存する場合に、細菌は通過させるが、そのよ
うな大型の動物細胞を通過させず、捕集するためのもの
である。

【００３９】本発明の細菌数測定方法の好ましい態様で
は、試料中の細菌数を測定するにあたり、先ずろ過容器
Ａに、細菌試料を吸引操作により導入するわけである
が、この吸引操作を行なう手順について説明する。すな
わち、まず、ろ過容器Ａ１の先端（第二フィルター１を
備えた側）に、内部に第一フィルター３を装着したろ過
容器Ａ２を取付ける（嵌合する。）。このとき、第一フ
ィルター３と第二フィルター１とが当接するようにして
おく。次いで、ろ過容器Ａ１の他端（第二フィルター１
を備えた側と反対側）に注射器Ｂを取付けて、吸引操作
の準備をする。但し、以上の操作は、順序を逆に行なっ
ても差支えない。このようにして吸引操作の準備をした
段階の様子が図２に示されている。

【００４０】ここで色素液組成物Ｄは、図１に示すよう
に適当な容器（例えば、点眼ビン５など）に入れられて
キットとされており、さらに、約１回分の吸引ろ過操作
に使用する量の色素液組成物Ｄを入れることのできる適
当な容器Ｅ、例えば０．５〜１．５ミリリットル容程度
のマイクロチューブが組み合わせられ、この中に色素液
組成物Ｄが入れられて細菌数の測定に供せられることと
なる。

【００４１】このような色素液組成物を入れる容器Ｅ
（マイクロチューブなど）を組み合わせて使用し、この
中に色素液組成物Ｄを予め少量添加しておき、次いでス
ポイト（図示せず）を用いて細菌試料を採取して容器Ｅ
に加え、良く混和する。この結果、細菌試料が色素液組
成物Ｄにより染色される。なお、１試料当りの色素液組
成物量は、試料の２〜５倍量が適当である。一方、試料
の量は、通常、５０〜２００マイクロリットルである。
従って、例えば試料の量が１００マイクロリットルの場
合、色素液組成物は２００〜５００マイクロリットル必
要である。但し、試料の５倍を超える量は必要ない。色
素液組成物の使用量は、色の対照表や検量線を作成する
際の使用量と、細菌数未知試料への使用量とを等量にす
ることが、誤差を抑える意味で好ましい。

【００４２】上記のように混和後、直ちに注射器Ｂの先
端に取付けられているろ過容器（試料採取用要素）Ａ２
の先端に設けられている試料採取口４から、容器Ｅに入
れられている色素液組成物と細菌試料の混合物を、注射
器Ｂのピストン６を引いて吸引ろ過する。

【００４３】この吸引ろ過操作により、第二フィルター
１への染色された細菌の捕集が行なわれる。同時に、過
剰色素の除去が行なわれる。即ち、注射器Ｂのピストン
６を引っ張って吸引すると、染色された細菌試料を含む
液（細菌試料液と色素液組成物Ｄとの混合物）が第二フ
ィルターに捕集され、これと同時に過剰色素が除去され
る。

【００４４】試料採取の他の態様として、次の方法を採
用することもできる。この場合、ろ過容器Ａ２には、計
量目盛りを付しておく。図２に示すように吸引操作の準
備をした後、ろ過容器Ａ２の先端に設けられている試料
採取口４から細菌試料を注射器Ｂの吸引操作により所定
量導入する。細菌試料の導入量は、ろ過容器Ａ２に設け
た計量目盛りを目安にすれば良い。次に、上記のように
して細菌試料を注射器Ｂの吸引操作により導入した後、
容器Ｅに入った色素液組成物Ｄに一旦押し出して注入す
る。この操作により、細菌試料と色素液組成物が混和さ
れ、細菌が染色される。その後、上記と同様にして注射
器Ｂのピストン６を引いて吸引ろ過し、第二フィルター
に細菌を捕集する。

【００４５】本発明の方法によれば、このように染色さ
れた細菌の第二フィルターへの捕集と過剰色素の除去と
を同時に行なうことができ、操作工程が簡便となる。本
発明の測定方法においては、このようにして細菌捕集、
検出用の第二フィルター１への染色された細菌の捕集と
過剰色素の除去とを同時に行ない、第二フィルター１の
着色度から試料中の細菌数を測定する。

【００４６】すなわち、このようにして第二フィルター
１への染色された細菌の捕集を行なった後、注射器Ｂの
先端に取付けられているろ過容器Ａ２を取外すと、ろ過
容器Ａ１の先端が露出した形となる。このろ過容器Ａ１
の先端に備えられている第二フィルター１上に存在する
細菌の着色度、即ち色の強度を、例えば既知量の細菌数
の試料を用いて予め作成しておいた色の対照表Ｆと比較
することにより、試料中の細菌数を測定する。なお、図
１，図２に示す色対照表Ｆは、色対照表の一例を示した
ものであって、この色対照表中に記載されている記号
（−，＋，＋＋）は、細菌の存在の程度を示している。
図１，図２において、色対照表Ｆは３分割して着色の程
度（すなわち、細菌数）を比較しているが、より細かく
区分して比較することもできる。

【００４７】本発明の測定方法においては、このように
して細菌捕集、検出用の第二フィルターへの染色された
細菌の捕集と過剰色素の除去とを同時に行ない、細菌検
出用の疎水性フィルターの着色度から試料中の細菌数を
検出する。色対照表による細菌数の測定は、具体的に
は、第二フィルター上に存在する細菌の着色度、即ち色
の強度を、既知量の細菌数の試料を用いて予め作成して
おいた色の対照表と比較することにより行なえばよい。

【００４８】色の対照表は、細菌数が既知の試料を用
い、本発明の測定方法で染色，洗浄した第二フィルター
をカラー写真に撮ることにより、又は、この染色された
第二フィルターと同程度にろ紙等を着色したり、或いは
同程度の色を紙に印刷することにより、作成することが
できる。例えば、尿中の細菌数を測定する場合には、次
のようにして色の対照表を作成する。すなわち、尿中細
菌は健常人の尿にも低濃度〔多い場合でも１ｍｌ（ミリ
リットル）当り１万個程度〕存在するが、総数で１ｍｌ
当り１０万個以上存在した場合には細菌尿症の疑いあり
と判断され、１ｍｌ当り１００万個以上の場合には細菌
感染（細菌尿症）が確定的である。従って、この値の前
後で検出できる色対照表を作成すれば良い。通常、下記
の程度の標準色対照表を作成すれば充分であるが、勿
論、これに限定されるものではない。 −：陰性（細菌数１０³個／ｍｌ未満）＋：陽性（細菌数１０⁴〜１０⁵個／ｍｌ程度）＋＋：強い陽性（細菌数１０⁶〜１０⁷個／ｍｌ程度）

【００４９】また、光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定による比
色定量は、細菌捕集、検出用の第二フィルター上に存在
する細菌を着色した色素を、有機溶剤を用いて溶出さ
せ、溶出液の着色度を吸光度により測定し、予め作成し
た光学密度（Ｏ．Ｄ．）と細菌数との検量線と照合して
定量すればよい。吸光度測定時の波長は、用いる色素に
より、適宜定めればよい。ここで有機溶剤としては、各
種アルコール類を使用することができるが、特にエタノ
ールが好ましい。

【００５０】なお、検量線の作成は、例えば次のように
して行なえばよい。即ち、色素としてフクシンを用いた
場合には、各種の濃度に希釈した試料の着色度を、マイ
クロプレートリーダーを用いて、着色度を４９２ｎｍの
光学密度（Ｏ．Ｄ．）により測定しておき、一方、各種
の濃度に希釈した試料と同一試料の試料溶液中の細菌数
を、寒天平板培養法のコロニー数の計数により算出して
おき、両者の結果から細菌数と光学密度の検量線を作成
すればよい。

【００５１】ここで本発明を適用することができる試料
は、特に制限はなく、例えば尿を初めとして、液体調味
料（醤油，ソースなど），液体飲食品（例えば発酵乳・
乳酸菌飲料など），酒類（例えばワイン，清酒など）な
どの液状食品、粉末や固形食品（例えば野菜，魚肉な
ど）の場合には洗浄した試料、水溶性塗料等、さらには
河川水，池水，温泉水，水槽水，生活廃水，クーリング
タワー水などの水等にも幅広く適用することができる。
なお、試料は必要に応じて、適宜、希釈したり、或いは
例えば固形食品などの場合には破砕した後に、希釈した
りするなどして測定用試料とするとよい。本発明の測定
方法は、このような試料中に存在する細菌、例えば大腸
菌（ Escherichia Coli ），黄色ブドウ球菌（ Staphyl
ococcus aureus )，緑膿菌（ Pseudomonas aeruginosa
) などについて、その総数を迅速に測定しようとする
ものである。

【００５２】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。〔実施例１〕黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureum
，IFO 3183株）、大腸菌（E. coli,ATCC 113O3 株）を
肉汁ブイヨン液体培地で、３０℃、４８時間培養して培
養液を調製した。その後、滅菌水で希釈して試料を作製
した。試料中の細菌数は、寒天平板培地（ＣＬＥＤ培
地）で培養してコロニー数より求めた。ろ過は、直径１
３ｍｍの円に切断した細菌捕集材をフィルターハウジン
グに装着し、試料１ミリリットルをろ過して捕集率を算
出した。フィルターとしては、ポリテトラフルオロエチ
レン（ＰＴＦＥ）製のものとセルロースアセテート製の
ものを使用した。ろ液中に存在する細菌数についても、
寒天平板培地（ＣＬＥＤ培地）で培養してコロニー数よ
り求めた。結果を第１表に示す。

【００５３】

【表１】第１表より、孔径０．４５〜４μｍの細菌捕集材を使用
することにより、高い捕集率が得られることが確認され
た。

【００５４】〔実施例２〕実施例１で用いたものと同種
の菌株の大腸菌を実施例１と同様の方法で培養、希釈し
て試料を作製した。また、試料中の細菌数及びろ液中の
細菌数も実施例１と同様の方法により求めた。

【００５５】動物細胞としては、ハイブリドーマＳＨＭ
−Ｄ３３（ＡＴＣＣ１６６８）株使用し、ＧＩＴ培地
（大五栄養化学社製）で３日間培養し、ＰＢＳ緩衝液
（ｐＨ７）で希釈して試料とした。動物細胞数は、顕微
鏡により計数した。各捕集材は、内径３ｍｍのストロー
に装着し、注射器により試料１ミリリットルを吸引ろ過
し、捕集率を求めた。フィルターとしては、ホルマール
処理したポリビニルアルコール製、厚さ３ｍｍのものを
用いた。捕集率は、ろ過前の試料中の動物細胞数・細菌
数と同様の方法により求めた、ろ過後の値と比較して求
めた。また、ろ過性を評価し、スムーズにろ過できた場
合を○、ろ過に時間がかかったが、全量ろ過できた場合
を△、時間をかけても全量はろ過できなかった場合を×
とした。結果を第２表に示す。

【００５６】

【表２】第２表より、孔径を３０〜７０μｍとしたときに、動物
細胞の高い捕集率と細菌の高い通過率が得られるととも
に、良好なろ過性が得られることが確認された。

【００５７】〔実施例３〕実施例２において、動物細胞
の高い捕集率、細菌の高い通過率及び良好なろ過性が確
認された孔径６０μｍのフィルターについて、厚さの影
響を検討した。試料及び試験方法は、実施例２と同様に
して実施した。結果を第３表に示す。

【００５８】

【表３】第３表より、孔径と比較して厚さの影響は小さいもの
の、１．５ｍｍ未満では、ハイブリドーマの捕集率の低
下が示唆され、９．０ｍｍでは大腸菌の捕集率の増加が
認められた。

【００５９】〔実施例４〕（１）尿中細菌数測定用色対照表の作成細菌として、大腸菌（ Escherichia coli )( ATCC 11
303 株) および黄色ブドウ球菌（ Staphylococcus au
reus )（ IFO 3183 株) を用いて、以下の実験を行なっ
た。

【００６０】肉汁ブイヨン培地に菌種を接種し、３７℃
で２４時間の静置培養を行ない、培養液を標準試料用菌
懸濁液とした。一方、健常人男子の放出尿を採取して、
細菌希釈用液をとした。上記標準試料用菌懸濁液に所定
量のこの細菌希釈用液およびハイブリドーマＳＨＭ−Ｄ
３３（ＡＴＣＣ１６６８）株のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ
７）懸濁液を添加して、各細菌数が１千個／ｍｌ程
度、１万個／ｍｌ程度、１０万個／ｍｌ程度、１
００万個／ｍｌ程度、１０００万個／ｍｌ程度の濃度
となるように、またハイブリドーマＳＨＭ−Ｄ３３株は
共通して１０万個／ｍｌ程度となるように５種の標準試
料を調製した。また、比較のため、ハイブリドーマＳＨ
Ｍ−Ｄ３３株のみの試料も調製した。なお、培養法によ
る細菌数はＣＬＥＤ寒天平板培地で、３７℃、２４時間
培養した際のコロニー数により計数した。ハイブリドー
マＳＨＭ−Ｄ３３株の数は、顕微鏡を用いて計数した。

【００６１】図１，図２に示す細菌数測定キットを実験
に使用した。寸法及び色素液組成物は以下の通りであっ
た。・色素液組成物Ｄ：フクシンを０．０００４％（ｗ／
ｖ）、食塩を０．８５％（ｗ／ｖ）、ツィーン２０（関
東化学社製）を０．１５％（ｗ／ｖ）の割合で含むｐＨ
が４．９の液・ろ過容器Ａ１：外径４．６ｍｍ、内径４ｍｍ、長さ２
０ｍｍ、ポリプロピレン製のチューブ・ろ過容器Ａ２：広口側の内径５ｍｍ（米国クオリティ
ー社製）のチップ・マイクロチューブ（色素液組成物を入れる容器Ｅ）：
１．５ミリリットル容、ポリプロピレン製（米国クオリ
ティー社製）・細菌検出用疎水性フィルター（第二フィルター）１：
ポリテトラフルオロエチレン製メンブレンフィルター
（孔径３μｍ、着色面積直径２．０ｍｍ）・フィルター支持体２：シリコーンチューブ（外径４ｍ
ｍ、内径２．０ｍｍ）を長さ７．５ｍｍに切断したもの・点眼ビン５：１０ミリリットル容、ポリプロピレン製・第一フィルター３：直径４ｍｍ、厚さ４ｍｍ、ホルマ
ール処理したポリビニルアルコール製、孔径＝６０μ
ｍ、・ロック器具（図示せず）：長さ５５ｍｍ、ポリプロピ
レン製

【００６２】図２に示したように、ろ過容器Ａ１の一端
に、３ｍｌ容の注射器Ｂを装着し、一方、ろ過容器Ａ１
の他端（第二フィルター１を備えた側）に、内部に第一
フィルター３を装着したろ過容器（試料採取用要素）Ａ
２を取外し自在に嵌合した。次に、スポイト（図示せ
ず）を用いて細菌試料を採取し、３５０μｌ（７〜８
滴）の色素液組成物Ｄを前もって入れた容器Ｅ（マイク
ロチューブ）に２滴（８０〜１００μリットル）を滴下
し、混和した。その後、直ちに注射器Ｂの先端に取付け
られているろ過容器Ａ２の先端に設けられている試料採
取口４から、容器Ｅに入れられている色素液組成物と細
菌試料との混合物を、注射器のピストン６を引いて吸引
ろ過した。吸引は、ロック器具によりピストンの逆行を
防止して行った。

【００６３】この吸引ろ過操作により、第二フィルター
１への染色された細菌の捕集が行なわれると同時に、過
剰色素の除去が行なわれた。このようにして第二フィル
ター１への染色された細菌の捕集を行なった後、ろ過容
器Ａ２を取外し、ろ過容器Ａ１の先端を露出させ、この
ろ過容器Ａ１の先端に備えられている第二フィルター１
上に存在する細菌の着色度を目視により観察した結果、
下記の第４表の通りであった。

【００６４】

【表４】

【００６５】第４表より、第一フィルターがない場合に
は、ハイブリドーマが第二フィルターで捕集されてしま
い、細菌数の多少にかかわらず、強い着色が認められ
た。一方、第一フィルターを設置した場合には、細菌数
の増加に伴い着色が強くなっており、本発明の効果が確
認された。第二フィルターの着色度を参考にして、３段
階の色対照表を作製した。作製に際し、我が国のＵＴＩ
基準（１ｍｌ当たりの細菌数が１０⁴個未満を尿路感染
症陰性、１０⁴個以上を陽性とする基準）にしたがっ
て、１０⁴個未満を−（陰性）、１０⁴個以上を＋（陽
性）とし、１０⁶個以上を＋＋（強陽性）とした。

【００６６】（２）尿中細菌数の測定健常人の放出尿と各種患者の放出尿とを試料として、上
記（１）の尿中細菌測定用色対照表の作成に示したと同
様の操作を行ない、上記（１）で作成した色対照表と比
較して、目視による判定により、尿中細菌数を測定し
た。結果を第５表に示す。なお、比較のために、ＣＬＥ
Ｄ寒天平板培地で、３７℃、２４時間培養して測定した
細菌数も併せて表示した。第５表において、ろ過不能と
は、目詰まりのため、全くろ過できなかった状態を示
す。

【００６７】

【表５】

【００６８】第５表より、第一フィルターを使用しない
場合には、ろ過不能となったり、健常人であっても陽性
と判断されたりするという欠陥が認められた。一方、第
一フィルターを設置した場合には、正確な判断がなされ
ることが確認された。

【００６９】

【発明の効果】本発明の細菌捕集用ろ過具によれば、試
料中に動植物細胞等が混在していても、細菌のみが簡便
かつ迅速に捕集でき、細菌数測定キットや測定方法に利
用できる。この場合、細菌数が簡便かつ正確に検出でき
る。また、本発明の細菌捕集用ろ過具は、本発明の細菌
数測定キットや測定方法に好適に利用できる。

【００７０】本発明の細菌数測定キットによれば、注射
器による１段階のろ過操作で済むので、操作が極めて簡
便である。また、熟練を必要とせず、設備が不要である
ので、測定に場所を選ばない。また、本発明の細菌数測
定キットは、極めて簡単、かつ、安価なものであって、
特別な機器を必要としないので、どのような現場におい
ても使用することができるという利点がある。特に、一
般の素人も使用することができるため、簡単に河川水，
池水，海水，温泉水などの身の回りの水質の検査が可能
となり、環境保全に貢献することができるばかりか、液
状食品や固形食品などの食品における細菌数の検査等が
可能となるという特質がある。

【００７１】本発明の細菌数測定キットによれば、測定
終了後、細菌の同定が必要な試料は、吸引により採取す
ることができ、細管を加熱処理などによって封印すれ
ば、検査室への輸送容器ともなる。従って、本発明は、
尿検査分野（診断領域）をはじめ、各種検査に広く利用
することができる。

【００７２】本発明の測定方法によれば、注射器による
１段階の吸引ろ過操作で疎水性フィルターへの染色され
た細菌の捕集と過剰色素の除去を同時に行なうことがで
き、試料中の細菌数を迅速、かつ、簡便に測定すること
ができる。この方法によれば、通常、５分以内で判定可
能である。また、この方法によれば、専門的な技術や知
識を必要とせずに、試料中の細菌数を測定することがで
きる。

【００７３】しかも本発明の方法によれば、細菌の培養
なしに、細菌の有無が分かるので、病院の細菌検査の検
体スクリーニングに活用することができ、患者及び病院
の経費軽減に貢献することができる。また、本発明の方
法においては、特別な機器を必要としないので、小規模
な病院や診療所、或いは一般の人でも測定することがで
きる。

【００７４】さらに、本発明の方法は、第二フィルター
のろ過孔径を選択することにより、細菌以外の、例えば
酵母などにも適用できるので、応用範囲も極めて広い。
本発明の方法によれば、食品（ヨーグルトなど）の出荷
前に細菌数が分かるので、食品の品質管理に貢献するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の細菌数測定キットの１態様を
示す説明図である。

【図２】図２は、本発明の細菌数測定キットを市販の注
射器と組み合わせて、細菌数測定の準備をした状態を示
す説明図である。

【符合の説明】

Ａろ過容器（ろ過容器Ａ１とろ過容器Ａ２とからな
る）Ａ１ろ過容器（第二フィルターを格納したろ過容器）Ａ２ろ過容器（試料採取用要素）Ｂ注射器Ｄ色素液組成物Ｅ色素液組成物を分取して入れる容器Ｆ色対照表１第二フィルター２フィルター支持体３第一フィルター４試料採取口５点眼ビン６ピストン

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】孔径３０〜７０μｍの第一フィルター
と、孔径０．４５〜４μｍの第二フィルターを有する細
菌捕集用ろ過具。
【請求項２】第一フィルターの厚さが１．５〜７ｍｍ
である請求項１記載の細菌捕集用ろ過具。
【請求項３】第一フィルターがポリビニルアルコール
製フィルターである請求項１または２記載の細菌捕集用
ろ過具。
【請求項４】第一フィルターが動植物細胞除去用フィ
ルターであり、第二フィルターが細菌捕集用フィルター
である請求項１〜３のいずれかに記載の細菌捕集用ろ過
具。
【請求項５】第二フィルターが疎水性材料からなるフ
ィルターである請求項１〜４のいずれかに記載の細菌捕
集用ろ過具。
【請求項６】孔径３０〜７０μｍの第一フィルター
と、疎水性材料からなる孔径０．４５〜４μｍの第二フ
ィルターを有する細菌捕集、検出用ろ過具、色素液組成
物、および比色手段からなる細菌数測定キット。
【請求項７】孔径３０〜７０μｍの第一フィルター
と、疎水性材料からなる孔径０．４５〜４μｍの第二フ
ィルターを有する細菌捕集、検出用ろ過具に、第一フィ
ルターから先に接触するように着色された試料を導入し
て細菌の捕集を行い、第二フィルターの着色度から試料
中の細菌数を検出することを特徴とする細菌数の測定方
法。