JP2000226400A - アポトーシス制御能を有する蛋白質、その遺伝子及びそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アポートシス制御能を有する新規蛋白質、 そ
の遺伝子及びそれらの用途を提供することを目的とす
る。 【解決手段】Fas 依存性のアポトーシスを阻害する機構
に基づき、 アポトーシス制御能に関連する遺伝子、 該遺
伝子のコードする蛋白質を見出し、 かかる知見に基づ
き、 更に該遺伝子又はその一部をプローブとして用いる
該遺伝子のクローニング方法、 該遺伝子のアンチセンス
DNA 及びアンチセンスRNA 、該遺伝子含有組換え体又は
形質転換体、 該転換体を用いたアポートシス制御能を有
する新規蛋白質の製造方法、 該蛋白質に対する抗体、 該
蛋白質又は該遺伝子の検出方法、 該蛋白質又は該形質転
換体を用いる薬剤のスクリーニング方法、 癌、 ならびに
アポートシス実行の異常によって引き起こされる各種疾
患の治療に用いる薬剤が見出された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はアポトーシスを制御
する新規蛋白質、及び該蛋白質をコードする遺伝子に関
する。また、本発明は、これらの蛋白質及び遺伝子の一
連の用途に関する。更に本発明は、該蛋白質に対する抗
体及びその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】アポトーシスは、細胞死の一形態であ
り、細胞質の凝縮、核の断片化、染色体DNA の断片化等
の特徴的な形態を示すことが知られている。また、アポ
トーシスは生体において極めて重要な働きをしており、
この異常が癌、自己免疫疾患をはじめとする多くの病態
に関与していることが分かってきている。近年、アポト
ーシス制御、即ち、誘導又は阻害等の分子機構が活発に
研究され、その一部が明らかになってきた。

【０００３】アポトーシスは様々な刺激に応答して誘導
されるが、その一つとして、Fas 依存性アポトーシスが
知られている。 Fasは細胞膜表面に存在する膜一回貫通
型レセプターであり、腫瘍壊死因子/ 神経成長因子レセ
プター類に分類されている。Fas にそのリガンド（Fas
リガンド）またはFas に対する抗体（抗Fas 抗体）が結
合することによって、細胞死を誘導する刺激が伝えられ
る。この細胞死誘導機構は以下のように考えられてい
る。前述のように、Fas がFas リガンド又は抗Fas 抗体
と結合すると、Fas は三量体を形成するようになる。続
いて、この高次構造を認識して細胞内のアダプター分子
FADDが結合する。さらに、このFADDに対して細胞死関連
プロテアーゼとして知られるCaspase-8 が結合する。Ca
spase-8 は通常不活性型であるが、Fas/FADDと複合体を
形成することによって活性型に変換される。活性型に転
換したCaspase-8 は細胞内の様々なCaspase ファミリー
プロテアーゼを活性化する。Caspase ファミリープロテ
アーゼはアクチン、フォドリンといった細胞骨格蛋白
質、Rbのような細胞周期制御蛋白質を破壊し、さらにCA
D のようなDNase を活性化することによってアポトーシ
スを完遂する。この他にもアポトーシスは、ある種の癌
遺伝子、癌抑制遺伝子、さらには放射線照射や制癌剤投
与などによって誘導されることが分かってきている。

【０００４】近年、癌研究の領域において重要な発見が
二つ成された。一つは癌細胞に制癌剤を投与するとアポ
トーシスが誘導されるが、同時にFas 中和抗体を投与す
るとこのアポトーシスが抑制されるという発見である
（Nature Medicine 第２巻、574-577 頁 (1996) ）。こ
の結果は、制癌剤によるアポトーシスがFas 依存性の経
路を介することを示すものである。逆に言えば、Fas 経
路のシグナル伝達を増強することによって、制癌剤の効
果を高めることができるといえる。もう一つの知見は多
くの癌細胞がFas リガンドを発現しているというもので
ある（Science 274 巻、1363-1366 頁 (1996) ）。つま
り、免疫担当細胞が癌細胞を排除すべく接近しても、癌
細胞のFas リガンドと免疫細胞のFas が反応することに
よって免疫細胞にアポトーシスが誘導されてしまうので
ある。すなわち、癌細胞は、Fas 依存性アポトーシスを
巧妙に用いることによって免疫監視機構から逃れている
と考えられる。しかし、その反面、癌細胞はFas もFas
リガンドも発現している。では、なぜ癌細胞自らはアポ
トーシスを起こさないのだろうか。これは、癌細胞中で
Fas 依存性アポトーシスのシグナル伝達が阻害されてい
るためであると考えられている。Fas 依存性アポトーシ
スの阻害に関わる分子は未だほとんど明らかになってい
ない。しかし、この仮説を支持するデータとして、Fas
依存性のアポトーシスは蛋白質合成阻害剤で増強される
ことが示されていた。なお、アポトーシスを阻害する蛋
白質としては FLAME-1が知られている（J. Biol. Che
m., Vol.272, No.30, p18542-18545 (1997) ）。 FLAME
-1は、 デスエフェクタードメインを有し、 Caspase-8 な
どのCaspase ファミリープロテアーゼと相互作用してア
ポトーシス阻害能を発揮する蛋白質である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、 アポ
トーシスを制御する新規蛋白質をコードする遺伝子を明
らかにし、該遺伝子のクローニング方法、該遺伝子がコ
ードする新規蛋白質を提供すること、さらに該遺伝子の
アンチセンスDNA 及びアンチセンスRNA を提供するこ
と、該遺伝子に基づいて得られる核酸プローブ、及びそ
の核酸プローブを用いた該遺伝子の検出方法を提供する
こと、該遺伝子を用いるアポトーシス制御能を有する新
規蛋白質の製造方法を提供すること、アポトーシス制御
能を有する新規蛋白質の抗体及びその抗体を用いたアポ
トーシス制御能を有する新規蛋白質の検出方法を提供す
ること等である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、先ずCaspas
e-8 に結合する蛋白質中に、Fas 依存性のアポトーシス
を制御する蛋白質を見出すべく、鋭意研究し、アポトー
シス制御能を有しデスエフェクタードメインを持たない
新規蛋白質をはじめとする本発明を完成した。本発明者
は、Caspase-8 蛋白質のN 末端部分アミノ酸配列に相当
するデスエフェクタードメインに結合する蛋白質断片
を、酵母のツーハイブリッドスクリーニング法により検
索し採取した。更に、この蛋白質断片をコードする遺伝
子の一部をプローブとして用いることによって、この蛋
白質全長をコードする遺伝子をヒト脳cDNA ライブラリ
より単離した。さらに、該遺伝子全長を発現するプラス
ミドを構築し、これをヒト細胞株に導入した形質転換体
を作製した。更に、この形質転換体を解析することによ
って、該遺伝子がコードする新規蛋白質にアポトーシス
阻害能があることを見出した。又、この遺伝子発現を阻
害するアンチセンスDNA 、アンチセンスRNA は、Fas 依
存性アポトーシスが関与する疾患の治療薬、例えば制癌
剤となる可能性があることを見出した。更に、このアポ
トーシス阻害能を有する蛋白質と類似の配列を持つ蛋白
質は、アポトーシスの誘導にも関与する可能性があるこ
とを見出した。

【０００７】従って，本発明は、以下の（１）から（３
０）に示す発明に関するものである。 （１）配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする蛋白質。 （２）配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列を含み、かつアポトーシス制御能を
有することを特徴とする蛋白質。 （３）配列表の配列番号：１に示す塩基配列を含むこと
を特徴とする遺伝子。 （４）配列表の配列番号：１に示す塩基配列を含み、か
つアポトーシス制御能を有する蛋白質をコードする遺伝
子。 （５）配列表の配列番号：１に示す塩基配列を含むＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つアポトーシス制御能を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａからなるアポトーシス制御能を有する遺伝子。 （６）配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む
蛋白質をコードする遺伝子。 （７）配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列を含み、かつアポトーシス制御能を
有する蛋白質をコードする遺伝子。 （８）上記（６）の遺伝子で、かつアポトーシス制御能
を有する遺伝子。 （９）アポトーシス制御能がアポトーシス阻害能である
上記（４）から（８）のいずれかに記載の遺伝子。 （１０）配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列を有
する蛋白質。 （１１）配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス阻害能
を有する蛋白質。 （１２）Caspase 8と結合しデスエフェクタードメイン
を持たない蛋白質。 （１３）上記（１）、（２）または（１０）の蛋白質
で、かつアポトーシス制御能を有する蛋白質。 （１４）アポトーシス制御能がアポトーシス阻害能であ
る上記（１３）に記載の蛋白質。 （１５）上記（３）から（９）のいずれかの遺伝子を含
むことを特徴とする組換え体プラスミド。 （１６）上記（１５）の組換え体プラスミドを含む形質
転換体または形質導入体。 （１７）上記（１６）の形質転換体または形質導入体を
培養し、該培養物からアポトーシス制御能を有する蛋白
質を採取することを特徴とするアポトーシス制御能を有
する蛋白質の製造法。 （１８）アポトーシス制御能がアポトーシス阻害能であ
る上記（１７）に記載の蛋白質の製造法。 （１９）上記（３）から（９）のいずれかの遺伝子の塩
基配列の全体または部分からなる核酸プローブ。 （２０）上記（１９）の核酸プローブを用いたハイブリ
ダイゼーションによるアポトーシス制御能を有する蛋白
質をコードする遺伝子の検出方法。 （２１）アポトーシス制御能がアポトーシス阻害能であ
る上記（２０）に記載の遺伝子の検出方法。 （２２）上記（１９）の核酸プローブを用いることを特
徴とするアポトーシス制御能を有する蛋白質をコードす
る遺伝子のクローニング方法。 （２３）アポトーシス制御能がアポトーシス阻害能であ
る上記（２２）に記載の遺伝子のクローニング方法。 （２４）上記（３）から（９）のいずれかの遺伝子の塩
基配列の全体または部分に対してアンチセンスであり、
その遺伝子の発現を阻害できるＤＮＡ配列。 （２５）上記（３）から（９）のいずれかの遺伝子の塩
基配列の全体または部分に対してアンチセンスであり、
その遺伝子の発現を阻害できるＲＮＡ配列。 （２６）上記（１）、（２）または（１０）に記載の蛋
白質に対する抗体。 （２７）上記（２６）の抗体を用いたアポトーシス制御
能を有する蛋白質の検出方法。 （２８）アポトーシス制御能がアポトーシス阻害能であ
る上記（２７）に記載の蛋白質の検出方法。 （２９）上記（１）、（２）または（１０）のいずれか
に記載の蛋白質または上記（１６）の形質転換体または
形質導入体を用いた薬剤のスクリーニング方法。 （３０）上記（２４）のＤＮＡ、上記（２５）のＲＮＡ
または上記（２６）の抗体を含む医薬製剤。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明のアポトーシス制御
能を有する蛋白質に関し、特にアポトーシス阻害能を有
する蛋白質についてより具体的に説明する。 [I] 本発明のアポトーシス阻害能を有する新規蛋白質及
びそれをコードする遺伝子 (1) 本発明のアポトーシス阻害能を有する新規蛋白質を
コードする遺伝子を単離するためには、まずCaspase-8
のデスエフェクタードメインに相当するN 末端183 アミ
ノ酸に結合する蛋白質断片をコードするcDNAを、酵母の
ツーハイブリッドスクリーニング法を用いてヒト胎盤cD
NA ライブラリより単離する。次に、ヒト脳のcDNAライ
ブラリを作製し、このライブラリから、上記cDNAとハイ
ブリダイズするcDNA分子を単離、クローニングすれば、
アポトーシス阻害能を有する新規蛋白質をコードする遺
伝子を単離する事ができる。ライブラリは特にヒト脳の
cDNAライブラリに限定される訳ではない。本発明のアポ
トーシス阻害能を有する新規蛋白質をコードする遺伝子
として、以後の実施例に示すaip-1 (apoptosis inhibito
ry protein)遺伝子が見出された。 本遺伝子の塩基配列
は、配列表の配列番号1 に示した通りである。この塩基
配列において、 開始メチオニンは同配列表の第25番目か
ら第27番目のATG にコードされている。また、オープン
リーディングフレーム(ORF) は同配列表の第25番目から
第5817番目の塩基にコードされている。この遺伝子の塩
基配列から、 本発明のアポトーシス阻害能を有する新規
蛋白質は、配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列を
有することが見出された。配列番号２に示したアミノ酸
配列から、 本発明のアポトーシス阻害能を有する新規蛋
白質はデスエフェクタードメインを持たないことが明ら
かになった。 ここで、 デスエフェクタードメインとは、
公知のFADDのアミノ酸配列（Cell，81巻，505-512 頁(1
995)）においてその４−７６の部分と結合し、かつアミ
ノ酸レベルでその４−７６の部分と２５％以上の相同性
を示すアミノ酸配列と定義する。また、 配列表の配列番
号１に示したaip-1 遺伝子、 及び配列番号２に示したそ
のコードする蛋白質のアミノ酸配列とホモロジーを有す
る遺伝子及び蛋白質をデータベースにより検索したが、
30％以上のホモロジーを有するものは存在しなかった。
更には、 aip-1 の機能を確認する目的で、以後の実施例
に示すように、 aip-1遺伝子全長を含むプラスミドを構
築し、ヒト培養細胞株中で発現させた形質転換体を作製
した。この形質転換体はコントロール群に比べて有意に
Fas 依存性アポトーシスに耐性を示した。これらの結果
より、aip-1 遺伝子がコードする蛋白質がCaspase-8 に
結合し、さらにはFas 依存性アポトーシスを阻害する能
力を持った蛋白質であることが明らかとなった。 (2) 配列番号２に示すアミノ酸配列において、 １若しく
は数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、 かつアポトーシス阻害能を有する蛋白
質も本発明の範囲内のものである。 アミノ酸の欠失、 置
換若しくは付加は、 実質的にその蛋白質全体の構造及び
機能に影響を与えない程度のものであり、 例えばアミノ
酸の置換としては、 同様の疎水性、 大きさ、 電荷及び/
又は芳香性を有するアミノ酸同志の置換が挙げられる。
このような置換としては、 例えばグリシンとプロリン、
チロシンとトリプトフアン、 アスパラギンとセリンとの
置換が挙げられる。 これらのアミノ酸の欠失、 置換、 付
加の程度は、 もとのアミノ酸配列との相同性が30% 以
上、好ましくは60% 以上、更に好ましくは80% 以上のも
のが許容し得る範囲である。

【０００９】また、 本発明においては、 配列番号１に示
すコード遺伝子の他に、 配列番号２に示すアミノ酸配列
において、 １若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し
くは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつアポトーシス
阻害能を有する蛋白質をコードする遺伝子も本発明の範
囲内のものである。更には、 配列表の配列番号１に示す
コード遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、 かつアポトーシス阻害能を有する蛋白質をコー
ドする遺伝子も本発明の範囲内のものである。 このよう
なハイブリダイズするDNA 変異体としては、 部位特異的
変異導入、 変異剤処理によるランダム変異、 制限酵素切
断によるDNA 断片の変異、 欠失、 連結等により、 部分的
にDNA 配列が変化したものが挙げられる。 これらのDNA
変異体が配列番号１に示すコード遺伝子とハイブリダイ
ズする程度としては、 ストリンジェントな条件下、 例え
ば放射性同位体標識したプローブを100 万dpm/mlとなる
ようにハイブリダイゼーション溶液（７％ポリエチレン
グリコール8000，10％SDS ）に添加し、65℃で16時間ハ
イブリダイゼーションを行った後、0.1 ％SDS を含む２
×SSC （300mM NaCl，30mMクエン酸三ナトリウム）中で
60℃、30分間洗浄する、という条件下でハイブリダイズ
するものである。

【００１０】[II] 本発明のアポトーシス阻害能を有す
る新規蛋白質の製造 本発明の蛋白質は、 以下に述べるように、 本発明の蛋白
質をコードする遺伝子を利用したDNA 組換え法によって
製造することができる。 (1) 組換え体プラスミド 本発明のアポトーシス阻害能を有する蛋白質をDNA 組換
え法によって製造するためには、 先ず、 本発明のアポト
ーシス阻害能を有する蛋白質をコードする遺伝子を適当
なベクターに組み込んだ、組換え体プラスミドを構築す
る。組換え体プラスミドは大腸菌等に安定に保持させる
ことが可能であり、この際、ベクターとして使用可能な
ものとして例えば、 pBluescript SK(-) 等がある。以後
に述べる実施例ではaip-1 遺伝子をpBluescript SK(-)
に組み込んだpBS/aip-1 が例示されている。 これらプラ
スミドを必要に応じて適当な制限酵素などで、蛋白質に
翻訳される領域（open reading frame、ORF ）にだけ切
り縮めた後、適当なベクターに接続し、発現用組換え体
プラスミドとすることができる。発現用プラスミドとし
ては、宿主が大腸菌の時は、pTV118 等のプラスミド、
宿主が酵母の時は、pYES2 等のプラスミド、宿主が哺乳
類細胞の時はpcDNA3 等のプラスミドをベクターとして
使用すればよい。

【００１１】(2) 形質転換体又は形質導入体 上記の組換え体プラスミドを、 適当な宿主に導入して形
質転換体又は形質導入体を構築する。宿主としては、大
腸菌、酵母、哺乳類細胞が使用可能である。アポトーシ
ス阻害能を有する蛋白質を発現する形質転換体は、上記
のように発現用ベクターに組み込んだ組換え体プラスミ
ドを適当な宿主に形質転換することにより得られる。例
えば、図１に示すような組換え体プラスミドを哺乳類培
養細胞に導入して形質転換体が得られる。 (3) 形質転換体又は形質導入体の培養 本発明のアポトーシス阻害能を有する蛋白質を製造する
には、 該蛋白質をコードする遺伝子を含む組換え体プラ
スミドを導入した発現用形質転換体又は形質導入体を、
適当な栄養培地で培養し、該蛋白質を発現させ、その細
胞又は培地より該蛋白質を回収、精製すればよい。

【００１２】[III] 核酸プローブ、 それを用いた遺伝子
のクローニング及び検出 (1) 核酸プローブ 本発明では、 上記のようにして得られた本発明のアポト
ーシス阻害能を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部
又は全部を、 以下に述べるような遺伝子のクローニング
等に用いるための核酸プローブとして利用できる。 本発
明遺伝子の一部からなる核酸プローブとしては、 15ヌク
レオチド以上のオリゴヌクレオチドからなる核酸プロー
ブが挙げられる。該核酸プローブは上記本発明遺伝子ま
たはその遺伝子断片を適当なベクターに接続し、細菌に
導入し、複製させ、菌体破砕液からフェノール等により
抽出、そしてベクターと接続した部位を認識する制限酵
素で切断、電気泳動後、ゲルより切り出せば調製でき
る。また、該核酸プローブは配列表の配列番号１の塩基
配列に基づき、DNA 合成機による化学合成や、PCR 法に
よる遺伝子増幅技術によっても調製できる。該核酸プロ
ーブは使用時の検出感度を上げるために放射性同位体
や、蛍光で標識する事もできる。該核酸プローブは、 ア
ポトーシス阻害能を有する上記した以外の蛋白質をコー
ドする遺伝子のクローニング方法に用いることができ
る。 即ち、 該核酸プローブを用いて、ハイブリダイゼー
ション法、又はポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（PCR ）法により、 各種の臓器又は組織由来のcDNAライ
ブラリーを探索すれば、本発明蛋白質と同様の機能を有
する蛋白質をコードする遺伝子を単離する事ができる。
また、 この核酸プローブを用いてアポトーシス阻害能を
有する蛋白質をコードする遺伝子の検出を行う事も出来
る。例として、細胞中の該遺伝子のmRNAの検出が挙げら
れる。例えば、破砕した細胞より核酸を沈殿させ、mRNA
をニトロセルロース膜上で放射性同位体標識した核酸プ
ローブにハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィー
（図２）やシンチレーションカウンターにより結合量を
測定することにより検出することが出来る。更には、 こ
の核酸プローブは、イン・サイチュー（in situ ）ハイ
ブリダイゼーション、アポトーシス阻害能を有する蛋白
質をコードする遺伝子を発現する組織の確認、各種生体
組織における遺伝子やmRNAの存在の確認などにも利用可
能である。

【００１３】[IV] アンチセンスDNA 及びアンチセンス
RNA 本発明では、上記のアポトーシス阻害能を有する蛋白質
の遺伝子のアンチセンスDNA 及びアンチセンスRNA も提
供される。これらのアンチセンスDNA 又はアンチセンス
RNA を細胞に導入することにより、アポトーシス阻害能
を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を抑制するこ
とが可能である。導入するアンチセンスDNA としては、
例えば、配列表の配列番号１の対応するアンチセンスDN
A 又はその一部を用いることができる。該アンチセンス
DNA の例を配列表の配列番号３に示す。これは、配列表
の配列番号１のアポトーシス阻害能を有する蛋白質の遺
伝子のアンチセンスDNA の配列を示すものである。アン
チセンスDNA としては、例えば、これらのアンチセンス
DNA の一部を適当に切断して得た断片を用いても良い
し、これらのアンチセンスDNA 配列に基づいて合成した
DNA を用いても良い。

【００１４】アンチセンスRNA としては、例えば配列表
の配列番号１のアポトーシス阻害能を有する蛋白質の遺
伝子の対応するアンチセンスRNA 又はその一部を用いる
ことができる。該アンチセンスRNA の例を配列表の配列
番号4 に示す。これは、配列表の配列番号１のアポトー
シス阻害能を有する蛋白質の遺伝子のアンチセンスRNA
の配列を示すものである。アンチセンスRNA としては、
例えば、これらのアンチセンスRNA の一部を適当に切断
して得た断片を用いても良いし、これらのアンチセンス
RNA 配列に基づいて合成したRNA を用いても良い。ま
た、例えば配列表の配列番号１のアポトーシス阻害能を
有する蛋白質の遺伝子またはその一部を適当なベクター
に接続し、細菌に導入し、複製させ、菌体破砕液からフ
ェノール等により抽出したものを鋳型として、イン・ビ
トロ（in vitro）転写系でRNA ポリメラーゼを作用させ
て作製したRNA を用いても良い。アンチセンスDNA 及び
アンチセンスRNA は生体内で分解されにくいように、更
に、細胞膜を通過できるように化学的な修飾を施してお
くことができる。mRNAを不活化できるような物質、例え
ばリボザイムを結合させても良い。このようにして調製
したアンチセンスDNA 及びアンチセンスRNA は、悪性腫
瘍をはじめとするアポトーシス阻害蛋白質をコードする
mRNA量が増大している各種疾患の治療に使用することが
できる。

【００１５】[V] 本発明のアポトーシス阻害能を有する
新規蛋白質に対する抗体 本発明では、本発明のアポトーシス阻害能を有する新規
蛋白質に対する抗体も提供される。 この抗体を製造する
ためには、 例えば、配列表の配列番号２のアミノ酸配列
を有する蛋白質やそのアミノ酸配列の一部の領域のペプ
チド断片等を抗原として使用することができる。前者は
前記形質転換体又は形質導入体に発現させ、精製するこ
とにより調製することができ、後者は市販のアミノ酸合
成機などで合成することができる。抗体の作製は常法に
より行われるが、例えば、モノクローナル抗体は、抗原
を免疫して得られた抗体産生B 細胞とミエローマ細胞を
融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、この細胞を培養することによって調製することがで
きる。この抗体は、後述のように、悪性腫瘍を始めとす
る、該蛋白質の関係するヒトや動物の疾患の治療や診断
に使用することができる。

【００１６】[VI] 抗体を用いたアポトーシス阻害能を
有する蛋白質の検出 本発明では、上記の抗体を用いた、アポトーシス阻害能
を有する蛋白質の検出方法が提供される。かかる検出は、
抗体と蛋白質の結合又は結合量を測定することにより
行うことが出来る。例えば、蛍光標識した抗体で処理
後、蛍光顕微鏡で観察すれば、該蛋白質や産生細胞の存
在を検出できる。また、結合した抗体量は公知の種々の
方法で測定することができる。

【００１７】[VII] 薬剤のスクリーニング 本発明では、本発明の形質転換体又は形質導入体、 ある
いは本発明のアポトーシス阻害能を有する蛋白質を用い
た新規薬剤のスクリーニング方法が提供される。例え
ば、該蛋白質とCaspase-8 との結合を阻害する物質を、
酵母の形質転換体を用いたスクリーニング系を用いて発
見することができる。また、該蛋白質を導入した細胞
と、導入しない細胞を用い、両細胞間においてその感受
性に差異を示す薬剤をスクリーニングすることによっ
て、該蛋白質又はそれをコードする遺伝子を阻害する物
質を発見することができる。

【００１８】[VIII] 医薬製剤 上記したアンチセンスDNA 、アンチセンスRNA 、アポト
ーシス阻害能を有する新規蛋白質に対する抗体は、癌を
始めとするアポトーシスの実行異常によって起こると考
えられる各種疾患の治療薬剤となり得る。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。 実施例１アポトーシス阻害能を有する新規蛋白質をコードする遺
伝子aip-1 の単離 1-a. ツーハイブリッドスクリーニング系の構築 Caspase-8 のN 末端側183 アミノ酸に結合する蛋白質を
コードする遺伝子のスクリーニングを行った。その方法
として酵母のツーハイブリッドスクリーニング法を用い
た。以下に示す実験手順はフィールズらの方法（Nature
第340 巻、245-246 頁 (1989) ）に準じて行った。

【００２０】1-a-1. Caspase-8 N 末端183 アミノ酸領
域を含む、ツーハイブリッドスクリーニング用ベクター
の調製 i) Caspase-8 N 末端183 アミノ酸領域コードするcDNA
の調製 ヒト末梢血より、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用い
て、RNA を抽出した。このRNA を用いて、Caspase-8 の
デスエフェクタードメインに相当するアミノ酸第1 番目
から183 番目までの領域（以下Caspase-8(1-183)と記載
する）をコードするcDNA をRT-PCR 法により増幅し
た。 PCRプライマーの末端には制限酵素SalIの認識部位
を付加し、以後に述べるツーハイブリッドベクターであ
るpBTM116を制限酵素SalIで切断したものに接続したと
きに読み枠が合うようデザインした。両プライマーの配
列を配列表の配列番号５及び６に示す。PCR の条件は、
95℃（１分）、55℃（１分）、72℃（２分）を１サイク
ルとし、30サイクル増幅した。 PCR増幅産物はフェノー
ル処理、クロロホルム処理による除蛋白後、エタノール
沈澱した。これらを70％エタノールで洗浄後、滅菌水に
溶解した。次に、この精製DNA を10ユニットの制限酵素
SalI（東洋紡社製）で切断後、0.8 ％アガロース電気泳
動により分画し、抽出、精製した。精製にはEASYTRAP
（宝酒造社製）を用いた。このDNA と、４μg の大腸菌
用ベクターpTZ19Rを10ユニットの制限酵素SalIで切断
し、さらに１ユニットのウシアルカリホスファターゼ
（ベーリンガーマンハイム社製）で脱リン酸化処理した
DNA とをDNA ライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて接続した（以下pTZ19R/caspase-8(1-183) と記載す
る）。

【００２１】ii) ツーハイブリッドスクリーニング用ベ
クターの調製 次に、 11.1 μg のpTZ19R/caspase-8(1-183) を、30ユ
ニットの制限酵素SalIで切断し、ツーハイブリッドスク
リーニング用ベクターであるpBTM116 4.2μgを30ユニ
ットの制限酵素SalIで切断後、さらに１ユニットのウシ
アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理したものと接
続した（以下pBTM116/ caspase-8(1-183) と記す）。な
お、増幅遺伝子に突然変異が無いことを、 pTZ19R/casp
ase-8(1-183)の遺伝子配列を決定することにより、確認
した。遺伝子配列の決定は自動シークエンサー370 （ア
プライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。な
お、ツーハイブリッドスクリーニング用ベクターである
pBTM116 はLexA蛋白質のDNA 結合領域をコードする遺伝
子の下流に目的遺伝子、即ちCaspase-8(1-183)をコード
する遺伝子を接続できるように設計されており、酵母細
胞内でLexA蛋白質のDNA 結合領域と目的遺伝子産物の融
合蛋白質を発現させることができる。また、 pBTM116 は
TRPI遺伝子を発現するように設計されたベクターであ
る。従って、 得られたツーハイブリッドスクリーニング
用ベクターpBTM116/ caspase-8(1-183) は、 LexA 蛋白
質のDNA 結合領域とCaspase-8(1-183)との融合蛋白質を
発現させることができ、 また、 TRPI遺伝子を発現できる
ベクターである。

【００２２】1-a-2. pBTM116/ caspase-8(1-183) の出
芽酵母への導入 次に、pBTM116/caspase-8(1-183)を出芽酵母Saccharomy
ces cerevisiae L40 (MATa his3△200 trp1-901 leu2-
3,112 ade2 LYS2::(lexAop)₄-HIS3 URA3::(lexAop)₈-
lacZ GAL4 gal80)に、導入した。導入実験はCurrent p
rotocols in molecular biology（ワイリーインターサ
イエンス社刊）第2 巻第13章7.1 (1994)記載の手順に準
じて行った。また、 酵母L40 株は、 トリプトファン要求
性株であるため、 トリプトファンを除いたプレート上で
の培養により、 該プラスミドが導入された酵母L40 株の
選択を行った。すなわち、L40 を50mlのYPAD溶液（１％
イーストエクストラクト、２％ペプトン、２％グルコー
ス、0.01％アデニン）中で30℃にて、菌濃度が２×10⁷/
ml に達するまで振盪培養し、集菌後、滅菌水にて洗浄
した。この酵母を２mlの酢酸リチウム溶液-1（10mM ト
リス−塩酸 pH7.5、0.1M 酢酸リチウム、1mM EDTA）に
懸濁し、この懸濁液0.2ml に、１μg のpBTM116/ caspa
se-8(1-183) と、100 μg のウシ胸腺DNA を加え、さら
に1.2ml のポリエチレングリコール/ 酢酸リチウム溶液
（10mM トリス−塩酸 pH7.5、40％（w/w ）ポリエチレ
ングリコール4000、0.1M 酢酸リチウム、1mM EDTA）を
加えて、30℃にて30分間保温した。その後、88μl のジ
メチルスルホキシドを加え、穏やかに混和し、42℃にて
15分間保温した。この菌を12000 回転、１分間の遠心で
沈殿させ、TE溶液（10mM トリス−塩酸 pH 7.5 、1mM
EDTA）に懸濁した後、-UT プレート（0.12％イーストニ
トロジェンベース（アミノ酸、硫酸アンモニウム未添加
品）、0.5 ％硫酸アンモニウム、1 ％コハク酸、0.6 ％
水酸化ナトリウム、2 ％グルコース、0.01％アデニン、
アルギニン、システイン、ロイシン、リジン、スレオニ
ン、0.005 ％アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシ
ン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリ
ン、チロシン、バリンに1.5 ％寒天を加えて寒天培地と
したもの）上に散布し、30℃にて２日間培養した。得ら
れた形質転換体、 即ち、 pBTM116/ caspase-8(1-183) が
導入された酵母をL40/｛pBTM116/ caspase-8(1-183) ｝
と名付けた。

【００２３】1-a-3. Caspase-8 N 末端183 アミノ酸領
域に結合する因子のスクリーニング i) ヒトcDNAライブラリ 続いて、ヒトcDNAライブラリより、Caspase-8(1-183)に
結合する蛋白質のスクリーニングを試みた。このヒトcD
NAライブラリとして、 ヒト胎盤MATCHMAKER cDNA （pACT
2/ヒト胎盤ライブラリ、 クローンテック社製、製品番号
CLHL4025A ）を用いた。このpACT2/ヒト胎盤ライブラリ
はツーハイブリッドスクリーニング用ベクターpACT2 を
用いて作製されている。pACT2 はGAL4の転写活性化領域
をコードする遺伝子の下流に目的遺伝子を接続できるよ
うに設計されており、酵母細胞内でGAL4の転写活性化領
域と目的遺伝子産物の融合蛋白質を発現させることがで
きる。また、pACT2 はLEU2遺伝子を発現するように設計
されたベクターである。

【００２４】ii) pACT2/ヒト胎盤ライブラリのL40/｛pB
TM116/ caspase-8(1-183) ｝への導 入始めに、ライブラ
リプラスミドの調製を行った。このpACT2/ヒト胎盤ライ
ブラ リを保持する大腸菌BNN132 株を各23万個ずつ、140cm²
のLB-Ampプレート（0.5％イーストエクストラクト、1
％ペプトン、0.5 ％塩化ナトリウム、100 μg/mlアンピ
シリンナトリウムに1.5 ％寒天を加えて寒天培地とした
もの）、136 枚に散布した。これを30℃にて18時間培養
し、集菌後、2000mlのLB-Amp溶液中で30℃にて３時間振
盪培養後、プラスミドを調製した。プラスミド調製は、
ラボマニュアル遺伝子工学（丸善刊、村松正寶編）53-5
5 頁 (1990) の手順に従って行った。次にこれらライブ
ラリプラスミドをL40 ｛pBTM116/ caspase-8(1-183) ｝
に導入した。尚、 酵母L40 株は、 ロイシン要求性株であ
るため、 ロイシンを除いた条件下での培養により、 該プ
ラスミドが導入された酵母L40 株の選択を行った。即ち、
1000ml のYPAD 溶液中にL40 ｛pBTM116/ caspase-8
(1-183) ｝を菌濃度が１×10⁷/ml になるように植菌
し、30℃にて３時間振盪培養した。この菌を、3000回
転、５分間の遠心で沈殿させ、400ml のTE溶液にて洗浄
した。続いてこれを、20mlの酢酸リチウム溶液-2（5mM
トリス−塩酸 pH7.5、0.1M 酢酸リチウム、0.5mM EDT
A）に懸濁し、500 μg のライブラリプラスミドと、2mg
のウシ胸腺DNA を加え、さらに140ml のポリエチレン
グリコール/ 酢酸リチウム溶液を加えて、30℃にて30分
間保温した。さらに、これに3.5ml のジメチルスルホキ
シドを加え、穏やかに混和し、42℃にて６分間保温し
た。次に、これを400ml のYPA溶液（１％イーストエク
ストラクト、２％ペプトン、0.01％アデニン）で２度洗
浄後、1000mlのYPAD溶液に懸濁し、30℃にて１時間振盪
培養した。これらを遠心して、菌体を回収し、500ml の
-UTL溶液（-UT 溶液よりロイシンを除いたもの）で洗浄
後、1000mlの-UTL溶液に懸濁して、30℃にて４時間振盪
培養した。このロイシンを除いた条件下での培養によ
り、 L40 ｛pBTM116/ caspase-8(1-183) ｝に、 更にpACT
2/ヒト胎盤ライブラリが導入された形質転換体が得られ
る。

【００２５】iii) Caspase-8 （1-183 ）に結合する因
子を発現する酵母L40 株の選択 かくして得られたL40 にpBTM116/ caspase-8(1-183) 及
びpACT2/ヒト胎盤ライブラリが導入された形質転換体
を、 更にヒスチジン感受性を指標にスクリーニングする
ことによって、 Caspase-8 （1-183 ）に結合する因子を
発現する酵母L40株の選択をすることができる。即ち、 ツ
ーハイブリッドスクリーニング用の酵母L40 株は、 ヒス
チジン要求性株であり、LexAの制御下にHIS3遺伝子を発
現するように改変されている。 また、形質転換体におい
て、 pBTM116/ caspase-8(1-183) から発現されるLexA蛋
白質のDNA 結合領域とCaspase-8(1-183)との融合蛋白質
と、 pACT2/ヒト胎盤ライブラリから発現されるGAL4の転
写活性化領域と各種の遺伝子産物との融合蛋白質の内で
GAL4の転写活性化領域とCaspase-8 （1-183 ）に結合す
る因子との融合蛋白質とは、 該因子を介して互いに結合
する。 結合後、 結合体は、 LexA蛋白質のDNA 結合領域を
介して酵母L40 株のHIS3遺伝子の上流部分に結合し、 次
いで結合体中のGAL4の転写活性化領域によって、 酵母L4
0 株のHIS3遺伝子がoff からonの状態になり、 ヒスチジ
ンが合成される。 従って、 形質転換体を、 更にヒスチジ
ン感受性を指標にスクリーニングすることによって、 Ca
spase-8 （1-183 ）に結合する因子を発現する酵母L40
株を選択することができる。かかる理論に基づいて、 上
記ii) で得られたL40 ｛pBTM116/ caspase-8(1-183) ｝
及びpACT2/ヒト胎盤ライブラリが導入された形質転換体
の培養物を遠心して菌体を回収し、-THULL溶液（-UT 溶
液よりロイシン、リジン、ヒスチジンを除いたもの）で
２度洗浄後、100ml の-THULL溶液に懸濁し、1ml ずつを
140cm²の-THULLプレート（-THULL 溶液に1.5 ％の寒天
を加え、寒天培地としたもの）100 枚に散布した。これ
を30℃にて3 日間培養し、出現したコロニーを単離し
た。かくして、 Caspase-8 （1-183 ）に結合する因子を
発現する酵母L40 株が選択された。

【００２６】1-b. aip-1 の遺伝子クローニング i) Caspase-8 （1-183 ）に結合する因子をコードする
遺伝子を含むプラスミ ドの調製 -THULLプレート上に出現した酵母コロニーより、ライブ
ラリ遺伝子を含むプラスミドを調製した。実験はCurren
t protocols in molecular biology（ワイリーインター
サイエンス社刊）第2 巻第13章11.1 (1994) 記載の手順
に準じて行った。すなわち、5ml のYPAD溶液にコロニー
を植菌し、30℃にて２日間振盪培養した。続いて、3000
回転、５分間の遠心により、菌体を回収し、0.5ml のソ
ルビトール溶液（1M ソルビトール、100mM EDTA pH7.
5）に懸濁、さらに50μl の0.3mg/mlザイモリアーゼ100
T（生化学工業社製）を加えて37℃にて１時間保温し
た。続いて、2500回転、５分間の遠心により、菌体を回
収し、0.5ml の菌体懸濁用緩衝液（50mM トリス−塩酸
（pH 7.5）、20mM EDTA ）に懸濁後、25μl の20％ SDS
を加えて、65℃にて30分間保温した。さらに、250 μl
の4M 酢酸カリウムを加えて、氷上にて1 時間静置し
た。この標品を12000 回転、10分間遠心した後、上清を
回収し、0.5ml の2-プロパノールを加えて、12000 回
転、30秒間遠心することにより、プラスミドを沈殿に回
収した。プラスミドは70％エタノールにて洗浄後、TE
溶液に溶解した。このプラスミドをpACT2/library-1 と
命名した。

【００２７】ii) Caspase-8(1-183) に特異的に結合す
る因子の確認 このライブラリ遺伝子がコードする蛋白質がCaspase-8
のN 末端183 アミノ酸に結合することを確認する目的で
以下の実験を行った。まず、Fas の細胞質領域（Fas ア
ミノ酸第192 番目から335 番目、以下Fas(192-335)と記
載する）をコードする遺伝子を、ヒト末梢血RNA を鋳型
にRT-PCR法を用いて増幅した。同様に、FADDをコードす
る遺伝子を培養細胞株であるPaca-2のRNAを鋳型に増幅
した。 PCRプライマーの末端には制限酵素EcoRI の認識
部位を付加し、ツーハイブリッドベクターであるpBTM11
6 に接続したときに読み枠が合うようデザインした。プ
ライマーの配列を配列表の配列番号7-10に示す。fas(19
2-335)遺伝子の増幅においては配列番号7 と8 に記載し
たプライマーを用い、 PCRの条件は、95℃（１分）、55
℃（１分）、72℃（１分）を１サイクルとし、30サイク
ル増幅した。fadd 遺伝子の増幅においては配列番号９
と10に記載したプライマーを用い、 PCRの条件は、96℃
（２分）、57℃（30秒）、72℃（１分30秒）を１サイク
ルとし、35サイクル増幅した。これらの遺伝子を制限酵
素EcoRI 10ユニットで切断後、0.8 ％アガロース電気泳
動にて分画し、抽出、精製した。精製にはEASYTRAPを用
いた。これらのDNA を、大腸菌用ベクターpTZ19Rの制限
酵素EcoRI 認識部位に正方向に接続した。実験は前述の
方法と同様の手順で行った。これらを、pTZ19R/fas(192
-335) 、pTZ19R/fadd と命名した。

【００２８】次に、各10μg の pTZ19R/fas(192-335)、
pTZ19R/fadd を30ユニット制限酵素EcoRI で切断し、0.
8 ％アガロース電気泳動にて分画後、同様に抽出、精製
したDNA を、ツーハイブリッドベクターであるpBTM116
の制限酵素EcoRI 認識部位に接続した。これらを、pBTM
116/ fas(192-335) 、pBTM116/faddと命名した。なお、
増幅遺伝子に突然変異が無いことを、 pTZ19R/fas(192-
335)、pTZ19R/fadd の遺伝子配列を決定することによ
り、確認した。 遺伝子配列の決定は自動シークエンサー
370 （アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行っ
た。また、 pTZ19R/fas(192-335)を制限酵素EcoRI で切
断し、精製した遺伝子断片は、ツーハイブリッドスクリ
ーニング用ベクターpGAD424 の制限酵素EcoRI 認識部位
にも正方向に接続し、pGAD424/ fas(192-335) と命名し
た。pGAD424 は、 前記したツーハイブリッドスクリーニ
ング用ベクターpACT2 と同様に、GAL4の転写活性化領域
をコードする遺伝子の下流に目的遺伝子を接続できるよ
うに設計されており、酵母細胞内でGAL4の転写活性化領
域と目的遺伝子産物の融合蛋白質を発現させることがで
きる。

【００２９】これらを用いて以下の実験を行った。出芽
酵母L40 に以下の６種類の組み合わせでプラスミドを導
入した。 1）１μg のpACT2/library-1 と１μg pBTM116/fas(192
-335)の混合物; 2）１μg のpACT2/library-1 と１μg のpBTM116/fadd
の混合物; 3）１μg のpACT2/library-1 とpBTM116/caspase-8(1-1
83)の混合物; 4）１μg のpGAD424/fas(192-335)と１μg のpBTM116/f
as(192-335)の混合物; 5）１μg のpGAD424/fas(192-335)と１μg のpBTM116/f
addの混合物; 6）１μg のpGAD424/fas(192-335)と１μg のpBTM116/
caspase-8(1-183)の混合物。 酵母細胞への遺伝子の導入は、前述の手順に準じて行っ
た。これらの酵母はそれぞれ-UTLプレート（-UTL溶液に
1.5 ％寒天を加え、寒天培地としたもの）上に散布し、
30℃にて2 日間培養した。pBTM116 はL40 のトリプトフ
ァン要求性を相補し、pACT2 、pGAD424 はロイシン要求
性を相補するので、トリプトファン、ロイシンを欠損し
た培地上で生育する酵母は両プラスミドが共に導入され
たものである。続いて、これらの酵母を-THULLプレート
上に散布し、その増殖を検討した。その結果、3)、4)、
5)のプラスミド混合物を導入した酵母のみが-THULLプレ
ート上で増殖することがわかった。すなわち、library-
1 産物はCaspase-8(1-183)とは結合するが、Fas(192-33
5)、FADDとは結合しなかった。コントロールとして用い
たFas(192-335)はFas(192-335)自身、 FADDとは結合し
たが、Caspase-8(1-183)とは結合しなかった。これらの
結果は、pACT2/ library-1産物がCaspase-8(1-183)に特
異的に結合する因子であることを示している。

【００３０】iii) Caspase-8(1-183)に特異的に結合す
る因子をコードする遺伝子断片の シークエンシング 続いてlibrary-1 遺伝子をシークエンシング用ベクター
pBluescript SK(-)に接続した。すなわち、５μg のpA
CT2/library-1 を10ユニットの制限酵素EcoRIで切断
し、0.8 ％アガロースゲル電気泳動にて分画し、ライブ
ラリ遺伝子を抽出、精製した。精製にはEASYTRAPを用い
た。このDNA を、pBluescript SK(-) の制限酵素EcoRI
認識部位に接続し、得られたプラスミドをpBS/library-
1 と命名した。続いて、このプラスミドを用いてlibrar
y-1 遺伝子の塩基配列を決定した。遺伝子配列の決定は
自動シークエンサーLONG READIR4200 （ライカ社製）を
用いて行った。上記の方法でライブラリ遺伝子配列を決
定し、これを既知遺伝子ライブラリと比較した。ソフト
としてはBLAST サーチを用いた。これはインターネット
上の米国ＮＩＨのホームページ（アドレス http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ）に存在する遺伝子検索ソフ
トである。この結果、既知遺伝子とホモロジーを示さな
い遺伝子が含まれていることを確認した。この遺伝子断
片の配列は配列表の配列番号11に示す。また、pBS/libr
ary-1 の制限酵素地図を図３に示す。

【００３１】iv) Caspase-8(1-183)に特異的に結合する
因子をコードする全長cDNAの単離 次に、この遺伝子の全長cDNAの単離を試みた。遺伝子ラ
イブラリはヒト脳cDNAライブラリ（感染効率：５×10⁶
pfu (plaque forming unit)/ml ）を用いた。プライマ
ーにNotI- オリゴdTプライマー（プロメガ社製）、アダ
プターにEcoRIアダプター（プロメガ社製）、ベクター
に制限酵素EcoRI で切断したλZAPII ファージベクター
（ストラタジーン社製）を用い、作製されている。プロ
ーブは以下のように調製した。５μg のpBS/library-1
を、制限酵素NotI、XhoI（いずれも東洋紡社製）各20ユ
ニットで切断し、0.8 ％アガロース電気泳動にて分画
後、抽出、精製した。精製にはEASYTRAPを用いた。この
ライブラリ遺伝子断片70ngをPrime-It II （ストラタジ
ーン社製）を用いて放射性同位体標識した。

【００３２】プラークハイブリダイゼーション用のメン
ブランを以下のように調製した。20μl のライブラリ溶
液と80μl のSM緩衝液（50mMトリス−塩酸 (pH 7.5) 、
100mM NaCl 、10mM MgSO₄、0.01% ゼラチン）、200 μ
l の大腸菌溶液（大腸菌株XL-1 Blue を37℃にて16時間
振盪培養し、5000回転、５分間の遠心にて回収後、10mM
MgSO₄に懸濁したもの）を混合し、37℃で15分間保温
し、ファージを感染させた。ここに、融解後47℃に保温
した7ml のLB- ソフトアガー（0.5 ％イーストエクトラ
クト、1 ％ペプトン、0.5 ％塩化ナトリウム、0.7 ％寒
天）を加え、穏やかに混和後、各直径150mm のLB-MgSO₄
プレート12枚（0.5 ％イーストエクトラクト、１％ペプ
トン、0.5 ％塩化ナトリウム、10mM MgSO₄に1.5 ％寒天
を加えて寒天培地としたもの）に散布した。これを37℃
にて６時間培養し、プラークを形成させた。次に、この
プレートを４℃にて、１時間保温した後、ナイロンメン
ブレンにプラークを接着させた。ナイロンメンブランは
NEN 社製のコロニープラークスクリーンを用いた。この
メンブランを乾燥後、500ml のアルカリ液（0.5N NaOH
、1.5M NaCl ）中で、室温にて２分間変性し、続いて5
00ml の中和液（0.5Mトリス−塩酸(pH 7.2)、1.5M NaCl
、1mM EDTA）中で、室温にて２分間中和した。次に、
このメンブランを３×SSC 溶液（450mM NaCl、45mM ク
エン酸三ナトリウム）中、55℃にて１時間保温した後、
乾燥し、プラークハイブリダイゼーション用メンブラン
とした。次にこのメンブランを用いてプラークハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション溶液
（７％ポリエチレングリコール8000、10％SDS ）50ml中
で上記メンブランを65℃にて１時間保温し、プレハイブ
リダイゼーションとした。次に、放射性同位体標識した
library-1 遺伝子断片を放射性量にして100 万dpm/ml
となるように添加し、65℃にて16時間保温することによ
り、ハイブリダイゼーションを行った。続いて、このメ
ンブランを0.1 ％SDS を含む２×SSC （300mM NaCl、30
mM クエン酸三ナトリウム）中で、65℃にて30分間洗浄
した。この洗浄は二度行った。続いてこれらメンブラン
のオートラジオグラフィーを行うことによって、陽性を
示すプラークを検出した。

【００３３】次に、陽性シグナルに対応するプラークを
含むプラーク群を単離し、1ml のSM緩衝液に懸濁した。
この溶液は４℃にて16時間保温し、ファージを溶出した
後、13000 回転、10分間の遠心により、上清にファージ
を回収した。このファージ溶液を出現プラークが10、10
0 、1000個になるようにLB-MgSO₄プレートにまき、上記
と同様の方法で陽性プラークをスクリーニングした。こ
の結果、完全に単離されたプラークとして陽性プラーク
を単離することに成功した。このプラークよりファージ
を単離した。次に、このファージに含まれるライブラリ
DNA の塩基配列を決定する目的で以下の実験を行った。
このライブラリは、λZAPII を用いて作製されているた
め、ヘルパーファージを感染させることによって、ベク
ターからライブラリ遺伝子を含むpBluescript SK(-) を
切り出すことができる。この操作を以下の方法に従って
行った。50μl のファージ溶液を、10μl のR408ヘルパ
ーファージ溶液（感染効率１×10¹¹ pfu (plaque formi
ng unit)/ml ）、40μl の大腸菌溶液と混和し、37℃で
15分間保温した。続いて1ml の２×YT 溶液（1.6 ％ポ
リペプトン、１％イーストエクストラクト、0.5 ％NaC
l）を加え、37℃にて３時間振盪培養した。続いて70
℃、20分間の熱処理後、この溶液２μl をLB培地中で５
時間培養した大腸菌株XL-1Blue 100μl と混和し、37℃
にて15分間保温した。この大腸菌液をLB-Ampプレート上
に散布し、出現したコロニーから目的のプラスミドを調
製した。このプラスミドをpBS/aip-1 と命名した。この
プラスミド中には6.3kb のライブラリ遺伝子が含まれて
いることが確認された。このライブラリ遺伝子配列の決
定は自動シークエンサーLONG READIR4200 （ライカ社
製）を用いて行った。この遺伝子配列を配列表の配列番
号１に示す。予想開始メチオニンは同配列表の第25番目
から第27番目のATG にコードされている。また、予想OR
F は同配列表の第25番目から第5817番目の塩基にコード
されている。さらに、この遺伝子においては予想開始メ
チオニンコドンの上流にインフレームの停止コドンが認
められる。これは同配列表の第１番目から第３番目にわ
たり存在する。このことから、単離した遺伝子は全ORF
を含むcDNAであることが示された。また、予想アミノ酸
配列は配列表の配列番号２に示す。

【００３４】1-c. aip-1 遺伝子の各種組織、癌細胞中
における発現 i) ノーザンハイブリダイゼーション 次にこの遺伝子の各種組織、癌細胞中における発現をノ
ーザンハイブリダイゼーションにより検討した。メンブ
ランとしてはクローンテック社のヒトMTN ブロットを用
いた。これらメンブランを5ml のExpressHyb溶液（クロ
ーンテック社製）中で68℃にて、30分間保温しプレイン
キュベーションとした。続いて、放射性同位体標識した
該遺伝子プローブ（上記1-b 実験中にて用いたもの）を
100 万dpm/mlになるように添加し、さらに68℃にて、１
時間保温することにより、ハイブリダイゼーションを行
った。次にこれらを、0.1 ％SDS を含む２×SSC 中で、
室温にて10分間洗浄した。この洗浄は三度行った。これ
に引き続いて、0.1 ％SDSを含む0.1 ×SSC （15mM NaCl
、1.5mM クエン酸三ナトリウム）中で、50℃にて20分
間洗浄した。これらメンブランは、バイオラッド社のモ
レキュラーイメージャーシステムを用いて解析した。 ii) 結果 この結果を図２に示す。約6.5kb の位置にバンドが認め
られ、単離した遺伝子断片が全長cDNAであることを強く
示唆している。なお、図２においては、レーン１：膵
臓、レーン２：腎臓、レーン３：骨格筋、レーン４：肝
臓、レーン５：肺、レーン６：胎盤、レーン７：脳、レ
ーン８：心臓由来のポリ(A)RNA 各２μg がブロットさ
れている。

【００３５】1-d. aip-1 遺伝子の機能解析 i) aip 発現ベクターの構築 引き続いて、aip-1 遺伝子の機能解析を行った。まず、
哺乳類細胞でaip-1 遺伝子を発現するためのベクターを
調製した。５μg のpBS/aip-1 を、各20ユニットの制限
酵素BamHI 、NotI（いずれも東洋紡社製）で切断後、
0.8％アガロース電気泳動にて分画し、aip-1 遺伝子に
対応する6.3kb の断片を抽出、精製した。精製にはEASY
TRAPを用いた。この精製DNA を、哺乳類細胞発現用ベク
ターpcDNA3の制限酵素BamHI 、NotI認識部位に接続し
た。このプラスミドを、pcDNA3/aip-1と命名した。この
プラスミドの制限酵素地図を図３に示す。このプラスミ
ドを保持する大腸菌株XL-1Blueを1000ml培養し、ラボマ
ニュアル遺伝子工学（丸善刊、村松正寶編）53-55 頁
(1990) の手順に従ってプラスミドの大量調製を行っ
た。このプラスミドは、塩化セシウム密度勾配遠心にて
二回精製した。同様に、pcDNA3にβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子を接続したベクターを作製し、pcDNA3/lacZ と命
名した。

【００３６】ii) aip-1 のアポトーシス抑制能 次に、Chinnaiyanらの方法（Cell 第81巻、505-512 頁
(1995) ）に従ってaip-1 のアポトーシス抑制能を測定
した。ヒト胚腎臓細胞株である293 細胞を50万個ずつ、
直径60mmの細胞培養用ディッシュに散布した。メディウ
ムはD-MEM （日生研製）に最終濃度が10％となるように
ウシ血清（FBS: fetal bovine serum ）を添加したもの
（以下D-MEM/10％FBS と記載する）を用いた。これらを
５％CO₂存在下、37℃にて、48時間培養した後、メディ
ウムをウシ血清を含まないD-MEMに置換した。続いてこ
れら細胞を二群に分け以下のプラスミドを導入した。一
群には0.2 μg のpcDNA3/lacZ と1.8 μg のpcDNA3/aip
-1ベクターの混合物、もう一群には0.2 μg のpcDNA3/l
acZ と1.8 μg のpcDNA3ベクターの混合物を導入した。
プラスミドの導入はギブコ社のリポフェクトアミンプラ
ス試薬を用いた。実験は、以下の手順に従った。すなわ
ち、プラスミド溶液に125 μl のD-MEM と、８μl のプ
ラス溶液を加え、良く撹拌した後、室温にて15分間保温
した。次に、12μl のリポフェクトアミン溶液と125 μ
l のD-MEM を加え、良く撹拌した後、さらに室温にて15
分間保温した。これを上記の手順で培養した293 細胞に
投与し、穏やかに混和後、５％CO₂存在下、37℃にて、
３時間培養し、プラスミドを取り込ませた。続いて、メ
ディウムを、D-MEM/10％FBS に置換し、５％CO₂存在
下、37℃にてさらに21時間培養した。引き続いて、この
二群の細胞に抗Fas 抗体CH11（ファーミンジェン社製）
を最終濃度0 、50、100 、200ng/mlになるように投与
し、さらに5 ％CO₂存在下、37℃にて24時間培養した。
これら細胞について、以下の二点を指標にアポトーシス
阻害活性を評価した。第一の指標は、アポトーシスを起
こし、ディッシュからはがれた細胞数による評価であ
る。これは、細胞培養ディッシュ中のメディウムを回収
し、その中に含まれる細胞数を測定することで行った。
もう一つの指標は、接着細胞をX-gal （5-ブロモ-4- ク
ロロ-3- インドリル- β-D- ガラクトピラノシド）で染
色し、染色された細胞のうちアポトーシス用の形態を示
す細胞の割合による評価である。これは以下の方法に従
って行った。細胞培養ディッシュ中のメディウムを除
去、PBS （phosphate bufferedsaline ）で洗浄した
後、２％ホルムアルデヒドと、0.2 ％のグルタルアルデ
ヒド2ml 中で室温にて、５分間の固定を行った。続い
て、固定液を除去後、PBS で二度洗浄し、染色液（PBS
に20mM フェリシアン化カリウム、20mM フェロシアン
化カリウム、1mM MgCl₂、0.1 ％X-gal を加えたもの）2
ml を加え、37℃にて16時間保温した。染色した細胞は
光学顕微鏡下でその形態の判定を行った。これらの結果
を図４、５に示す。これらの結果より、全ての抗Fas 抗
体濃度において、pcDNA3/aip-1ベクター導入群において
はpcDNA3導入群と比較して、アポトーシスを起こし、デ
ィッシュからはがれた細胞数が有意に減少していた（図
４）。また、全ての抗Fas 抗体濃度において、pcDNA3/a
ip-1ベクター導入群においてはpcDNA3導入群と比較し
て、アポトーシス様の形態を示す染色された細胞数が有
意に減少していた（図５）。これらの結果はaip-1 遺伝
子産物がFas 依存性アポトーシスを阻害する能力を有し
ていることを示している。上記の実験データから、aip-
1 遺伝子産物は、Caspase-8 N 末端領域に結合し、か
つ、Fas 依存性アポトーシスを抑制する能力を有するこ
とが明らかとなった。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、アポトーシス制御能を示
す新規蛋白質、及び該蛋白質をコードする遺伝子が提供
された。これらはアポトーシス制御機構の異常で起こ
る、癌を始めとする疾患の診断、治療に有用である。更
に、本発明により、該遺伝子のアンチセンスDNA 及びア
ンチセンスRNA 、該遺伝子にハイブリダイズ可能な核酸
プローブ、その核酸プローブを用いた該遺伝子の検出方
法、該遺伝子を導入させた形質転換体を用いたアポトー
シス制御能を有する新規蛋白質の製造方法、該蛋白質の
抗体、その抗体を用いた該蛋白質の検出方法等が提供さ
れた。これらも癌等の疾患の診断、治療に有用である。

【００３８】

【配列表フリーテキスト】配列番号：５〜１０の塩基配
列は、PCR プライマーを示す。

【００３９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISYA <120> Protein having inhibition activity on appotosis, gene thereof and use thereof <130> DA-02858 <150> JP 10-345868 <151> 1998-12-4 <160> 11 <210> 1 <211> 6309 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 1 tgactctcaa aaggaaatag gatcatggca gcagatgatg acaatggtga tggaacaagt 60 ttatttgatg tcttttctgc ttctcctctt aagaacaatg atgaaggctc actggacata 120 tacgctgggt tggacagtgc tgtttctgac agcgcttcca aatcctgtgt accatcaaga 180 aattgtttgg acttatatga agagatcctg actgaagaag gaactgcaaa ggaggcaaca 240 tataatgatt tgcaagtaga atatggaaaa tgtcaactac aaatgaaaga gctgatgaaa 300 aaatttaaag aaatacagac acagaatttc agcttaataa acgaaaacca gtctcttaag 360 aagaatattt cagcacttat caaaactgcc agagtggaaa taaaccgcaa ggatgaagaa 420 ataagtaatc ttcaccaaag attgtctgag tttccacatt ttcgaaataa tcataaaact 480 gcaaggacat ttgatacagt taaaacaaaa gatcttaaat ctagatctcc acatttggat 540 gattgttcaa agactgatca cagagctaaa agtgatgttt ctaaagatgt acatcatagc 600 acttcactgc caaatctgga aaaggaagga aaaccacatt ctgataaaag gagtacttca 660 catttaccta catctgttga gaaacactgc actaatggtg tttggtcacg ttctcattat 720 caggttggcg agggtagctc aaatgaggat agtagaagag gaagaaaaga tattagacat 780 agccagttta acagaggaac tgaaagagta cgaaaagact taagtactgg ctgtggtgat 840 ggtgaaccaa ggatattgga ggctagtcaa aggctacaag gacatcctga gaaatatggt 900 aaaggtgaac caaagactga aagcaaaagt tcgaagttta aaagtaactc agattctgac 960 tataaaggtg aacgcattaa ctcttcttgg gagaaagaga cccctggaga aaggtcacac 1020 agtcgagtag actctcaaag tgacaaaaaa ctagaaagac aaagtgaaag atcacaaaat 1080 ataaatagga aagaagttaa atcacaagac aaagaagaaa gaaaagttga tcaaaaacct 1140 aaatcagtag taaaggacca agatcactgg agaagatctg aacgagcatc acttcctcat 1200 tccaagaatg aaataacatt ttctcataat tcaagtaaat accatctaga agagagaaga 1260 ggatgggaag attgtaaaag agacaagagt gtaaacagtc atagttttca agatggaaga 1320 tgtccatctt ctctttcaaa cagtagaact cacaaaaaca ttgactctaa ggaagttgat 1380 gccatgcatc agtgggaaaa tacaccttta aaagcagaaa gacatagaac tgaagataag 1440 aggaaaagag aacaagaaag caaagaagaa aataggcata ttagaaatga aaaaagagta 1500 cctacagaac atttgcagaa gactaataag gaaactaaga aaaccactac tgatttaaag 1560 aaacagaatg aaccaaagac tgataaggga gaagtccttg ataatggtgt ttctgaagga 1620 gcagataata aagagcttgc aatgaaagct gagagtggtc caaatgaaac aaaaaacaag 1680 gacctaaaat tgagttttat gaaaaaattg aacttaactc tttctcctgc taaaaagcaa 1740 cctgtttccc aggataatca gcataaaata actgatattc ccaagtccag tggtgtatgt 1800 gattcagagt cttcaatgca agttaaaaca gtggcatatg ttccctccat aagtgaacat 1860 atcttggggg aagcagctgt cagtgaacat accatggggg aaaccaagtc aacgttattg 1920 gaaccaaagg ttgctcttct agcagtgact gaacccagga tcggtatctc agaaaccaac 1980 aaggaagacg aaaatagttt gttagttagg tctgttgaca atactatgca ttgtgaagag 2040 cccatttgtg gtacagagac ttccttccca tctcctatgg aaatacaaca gacagaatcc 2100 ttgtttccat caacaggaat gaaacaaacc attaataatg gaagggcagc agctcctgtg 2160 gtaatggatg tattacaaac agatgtgtct caaaactttg gcttggaatt ggataccaaa 2220 agaaatgata attcagatta ttgtggtatt tctgaaggta tggagatgaa ggtggcactt 2280 tcaacaacag tgagtgaaac cactgaaagc attttgcagc cttcaattga 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ctgtactgaa 4020 aaaagtgagt gggagttaaa gactccagag aagcagctgc tagagactct taagtgcgag 4080 tctataccag cttgtacaac agaagagcta gtttcagggg tggcttctcc atgtcctaaa 4140 atgattagtg atgataattg gtcattatta tcatctgaaa aaggtccatc tctgtcttca 4200 gggctttcat tgccggttca tcctgatgtg ttggatgaaa gttgtatgtt tgaagtgtct 4260 actaacctac ctttaagtaa agataatgtg tgtagtgtag aaaagagcaa gccctgcgtt 4320 tcttccatac ttcttgaaga tctagcagtc tctttaacag taccatcgcc tctgaagtca 4380 gatggtcatc tcagtttttt aaagcctgat atgtcgtcca gttcaactcc tgaagaagtc 4440 attagtgctc attttagtga agatgcctta cttgaggaag aggatgcatc tgagcaagat 4500 attcatttag ctctggagtc tgataattca agcagtaaat caagttgttc ttcttcctgg 4560 acaagccgat ctgttgctcc aggctttcag taccacccta atctacctat gcatgccgtc 4620 ataatggaaa agtccaatga tcatttcatt gtgaaaatac gacgtgcaac accatctacc 4680 tcttctggcc ttaaacagag tatgatgcct gatgaattat tgacatcttt gcccagacat 5740 ggaaaggaag ctgatgaagg accagagaaa gaatatattt catgtcagaa cacagttttt 4800 aaatctgtgg aggaattgga aaactccaac aaaaatgttg atggcagcaa 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agatccctca 5700 tcattaaagg caaccccagg gattaaggat tcatcagcag cacttgccac ttctacaagt 5760 ctttctgcaa aaaatgttat taaaaagaag ggagaaatta tcattttatg gacaaggtaa 5820 gaatcttgtg agacattgaa atcaccagga aattttgcac tcagaaatct aatctgtctg 5880 gctgggcgca gtggctcatg cctgtaatcc caatactttg ggacgctgag gcaggtggat 5940 cacttgagcc caggagtttg ggaccagctt gagcaacatg gcgaaattct gtctctacaa 6000 aaaaatacaa aaattagggc cgggcgcagt gctcacgcct gtaatcccag cactttggga 6060 ggctgaagcg ggcggatcat gaggtcagga gattgagacc atcctggcta acatggtgaa 6120 acccaatctc taccaaaaat acaaaactta gccagacgtg gtggcatgca cctgaaagtt 6180 ccggctggtt gggaggctga ggcaggagaa tggcatgaac ccggggggca gagcttgcag 6240 tgagccgaga tggcgccact gcattctagc ctgggcaaca gagcgagact gtcttaaaaa 6300 aaaaaaaaa 6309 <210> 2 <211> 1931 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 2 Met Ala Ala Asp Asp Asp Asn Gly Asp Gly Thr Ser Leu Phe Asp Val 1 5 10 15 Phe Ser Ala Ser Pro Leu Lys Asn Asn Asp Glu Gly Ser Leu Asp Ile 20 25 30 Tyr Ala Gly Leu Asp Ser Ala Val Ser Asp Ser Ala Ser Lys Ser Cys 35 40 45 Val Pro Ser Arg Asn Cys Leu Asp Leu Tyr Glu Glu Ile Leu Thr Glu 50 55 60 Glu Gly Thr Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Asn Asp Leu Gln Val Glu Tyr 65 70 75 80 Gly Lys Cys Gln Leu Gln Met Lys Glu Leu Met Lys Lys Phe Lys Glu 85 90 95 Ile Gln Thr Gln Asn Phe Ser Leu Ile Asn Glu Asn Gln Ser Leu Lys 100 105 110 Lys Asn Ile Ser Ala Leu Ile Lys Thr Ala Arg Val Glu Ile Asn Arg 115 120 125 Lys Asp Glu Glu Ile Ser Asn Leu His Gln Arg Leu Ser Glu Phe Pro 130 135 140 His Phe Arg Asn Asn His Lys Thr Ala Arg Thr Phe Asp Thr Val Lys 145 150 155 160 Thr Lys Asp Leu Lys Ser Arg Ser Pro His Leu Asp Asp Cys Ser Lys 165 170 175 Thr Asp His Arg Ala Lys Ser Asp Val Ser Lys Asp Val His His Ser 180 185 190 Thr Ser Leu Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly Lys Pro His Ser Asp Lys 195 200 205 Arg Ser Thr Ser His Leu Pro Thr Ser Val Glu Lys His Cys Thr Asn 210 215 220 Gly Val Trp Ser Arg Ser His Tyr Gln Val Gly Glu Gly Ser Ser Asn 225 230 235 240 Glu Asp Ser Arg Arg Gly Arg Lys Asp Ile Arg His Ser Gln Phe Asn 245 250 255 Arg Gly Thr Glu Arg Val Arg Lys Asp Leu Ser Thr Gly Cys Gly Asp 260 265 270 Gly Glu Pro Arg Ile Leu Glu Ala Ser Gln Arg Leu Gln Gly His Pro 275 280 285 Glu Lys Tyr Gly Lys Gly Glu Pro Lys Thr Glu Ser Lys Ser Ser Lys 290 295 300 Phe Lys Ser Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Lys Gly Glu Arg Ile Asn Ser 305 310 315 320 Ser Trp Glu Lys Glu Thr Pro Gly Glu Arg Ser His Ser Arg Val Asp 325 330 335 Ser Gln Ser Asp Lys Lys Leu Glu Arg Gln Ser Glu Arg Ser Gln Asn 340 345 350 Ile Asn Arg Lys Glu Val Lys Ser Gln Asp Lys Glu Glu Arg Lys Val 355 360 365 Asp Gln Lys Pro Lys Ser Val Val Lys Asp Gln Asp His Trp Arg Arg 370 375 380 Ser Glu Arg Ala Ser Leu Pro His Ser Lys Asn Glu Ile Thr Phe Ser 385 390 395 400 His Asn Ser Ser Lys Tyr His Leu Glu Glu Arg Arg Gly Trp Glu Asp 405 410 415 Cys Lys Arg Asp Lys Ser Val Asn Ser His Ser Phe Gln Asp Gly Arg 420 425 430 Cys Pro Ser Ser Leu Ser Asn Ser Arg Thr His Lys Asn Ile Asp Ser 435 440 445 Lys Glu Val Asp Ala Met His Gln Trp Glu Asn Thr Pro Leu Lys Ala 450 455 460 Glu Arg His Arg Thr Glu Asp Lys Arg Lys Arg Glu Gln Glu Ser Lys 465 470 475 480 Glu Glu Asn Arg His Ile Arg Asn Glu Lys Arg Val Pro Thr Glu His 485 490 495 Leu Gln Lys Thr Asn Lys Glu Thr Lys Lys Thr Thr Thr Asp Leu Lys 500 505 510 Lys Gln Asn Glu Pro Lys Thr Asp Lys Gly Glu Val Leu Asp Asn Gly 515 520 525 Val Ser Glu Gly Ala Asp Asn Lys Glu Leu Ala Met Lys Ala Glu Ser 530 535 540 Gly Pro Asn Glu Thr Lys Asn Lys Asp Leu Lys Leu Ser Phe Met Lys 545 550 555 560 Lys Leu Asn Leu Thr Leu Ser Pro Ala Lys Lys Gln Pro Val Ser Gln 565 570 575 Asp Asn Gln His Lys Ile Thr Asp Ile Pro Lys Ser Ser Gly Val Cys 580 585 590 Asp Ser Glu Ser Ser Met Gln Val Lys Thr Val Ala Tyr Val Pro Ser 595 600 605 Ile Ser Glu His Ile Leu Gly Glu Ala Ala Val Ser Glu His Thr Met 610 615 620 Gly Glu Thr Lys Ser Thr Leu Leu Glu Pro Lys Val Ala Leu Leu Ala 625 630 635 640 Val Thr Glu Pro Arg Ile Gly Ile Ser Glu Thr Asn Lys Glu Asp Glu 645 650 655 Asn Ser Leu Leu Val Arg Ser Val Asp Asn Thr Met His Cys Glu Glu 660 665 670 Pro Ile Cys Gly Thr Glu Thr Ser Phe Pro Ser Pro Met Glu Ile Gln 675 680 685 Gln Thr Glu Ser Leu Phe Pro Ser Thr Gly Met Lys Gln Thr Ile Asn 690 695 700 Asn Gly Arg Ala Ala Ala Pro Val Val Met Asp Val Leu Gln Thr Asp 705 710 715 720 Val Ser Gln Asn Phe Gly Leu Glu Leu Asp Thr Lys Arg Asn Asp Asn 725 730 735 Ser Asp Tyr Cys Gly Ile Ser Glu Gly Met Glu Met Lys Val Ala Leu 740 745 750 Ser Thr Thr Val Ser Glu Thr Thr Glu Ser Ile Leu Gln Pro Ser Ile 755 760 765 Glu Glu Ala Asp Ile Leu Pro Ile Met Leu Ser Glu Asp Asn Asn Pro 770 775 780 Lys Phe Glu Pro Ser Val Ile Val Thr Pro Leu Val Glu Ser Lys Ser 785 790 795 800 Cys His Leu Glu Pro Cys Leu Pro Lys Glu Thr Leu Asp Ser Ser Leu 805 810 815 Gln Gln Thr Glu Leu Met Asp His Arg Met Ala Thr Gly Glu Thr Asn 820 825 830 Ser Val Tyr His Asp Asp Asp Asn Ser Val Leu Ser Ile Asp Leu Asn 835 840 845 His Leu Arg Pro Ile Pro Glu Ala Ile Ser Pro Leu Asn Ser Pro Val 850 855 860 Arg Pro Val Ala Lys Val Leu Arg Asn Glu Ser Pro Pro Gln Val Pro 865 870 875 880 Val Tyr Asn Asn Ser His Lys Asp Val Phe Leu Pro Asn Ser Ala His 885 890 895 Ser Thr Ser Lys Ser Gln Ser Asp Leu Asn Lys Glu Asn Gln Lys Pro 900 905 910 Ile Tyr Lys Ser Asp Lys Cys Thr Glu Ala Asp Thr Cys Lys Asn Ser 915 920 925 Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Gly Glu Ile Arg Ser Asp Ser Glu Thr 930 935 940 Ser Lys Pro Gln Glu Ser Phe Glu Lys Asn Ser Lys Arg Arg Val Ser 945 950 955 960 Ala Asp Val Arg Lys Ser Lys Thr Ile Pro Arg Arg Gly Lys Ser Thr 965 970 975 Val Cys Leu Asp Lys Asp Ser Arg Lys Thr His Val Arg Ile His Gln 980 985 990 Thr Asn Asn Lys Trp Asn Lys Arg Pro Asp Lys Ser Ser Arg Ser Ser 995 1000 1005 Lys Thr Glu Lys Lys Asp Lys Val Met Ser Thr Ser Ser Leu Glu Lys 1010 1015 1020 Ile Val Pro Ile Ile Ala Val Pro Ser Ser Glu Gln Glu Ile Met His 1025 1030 1035 1040 Met Leu Arg Met Ile Arg Lys His Val Arg Lys Asn Tyr Met Lys Phe 1045 1050 1055 Lys Ala Lys Phe Ser Leu Ile Gln Phe His Arg Ile Ile Glu Ser Ala 1060 1065 1070 Ile Leu Ser Phe Thr Ser Leu Ile Lys His Leu Asn Leu His Lys Ile 1075 1080 1085 Ser Lys Ser Val Thr Thr Leu Gln Lys Asn Leu Cys Asp Ile Ile Glu 1090 1095 1100 Ser Lys Leu Lys Gln Val Lys Lys Asn Gly Ile Val Asp Arg Leu Phe 1105 1110 1115 1120 Glu Gln Gln Leu Pro Asp Met Lys Lys Lys Leu Trp Lys Phe Val Asp 1125 1130 1135 Asp Gln Leu Asp Tyr Leu Phe Ala Lys Leu Lys Lys Ile Leu Val Cys 1140 1145 1150 Asp Ser Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ser Asp Glu Gly Lys Leu Glu Lys 1155 1160 1165 Thr Ser Lys Gln Asn Ala Gln Tyr Ser Asn Ser Gln Lys Arg Ser Val 1170 1175 1180 Asp Asn Ser Asn Arg Glu Leu Leu Lys Glu Lys Leu Ser Lys Ser Glu 1185 1190 1195 1200 Asp Pro Val His Tyr Lys Ser Leu Val Gly Cys Lys Lys Ser Glu Glu 1205 1210 1215 Asn Tyr Gln Asp Gln Asn Asn Ser Ser Ile Asn Thr Val Lys His Asp 1220 1225 1230 Ile Lys Lys Asn Phe Asn Ile Cys Phe Asp Asn Ile Lys Asn Ser Gln 1235 1240 1245 Ser Glu Glu Arg Ser Leu Glu Val His Cys Pro Ser Thr Pro Lys Ser 1250 1255 1260 Glu Lys Asn Glu Gly Ser Ser Ile Glu Asp Ala Gln Thr Ser Gln His 1265 1270 1275 1280 Ala Thr Leu Lys 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caggatttgg aagcgctgtc agaaacagca ctgtccaacc cagcgtatat 5700 gtccagtgag ccttcatcat tgttcttaag aggagaagca gaaaagacat caaataaact 5760 tgttccatca ccattgtcat catctgctgc catgatccta tttccttttg agagtca 5817 <210> 4 <211> 5817 <212> RNA <213> Homosapiens <400> 4 ccuuguccau aaaaugauaa uuucucccuu cuuuuuaaua acauuuuuug cagaaagacu 60 uguagaagug gcaagugcug cugaugaauc cuuaaucccu gggguugccu uuaaugauga 120 gggaucuuua gucacaggag gggccuucuu cuuacuggcu uucuuuuggu gagcuucagu 180 auucucacaa gaaucuuggg uagguuucuu ggucuuuucc uuauuaguua agucuguuuc 240 cuuucuuugu uuuuuaugag gaugauuuag aucagaaaug uuucuucucu uuuugugaga 300 auuaugcaaa gucccaggca acuccgaguu aucacaauuu gauccuggcu cugauuuuaa 360 cucaucuuuu uuuacuucac augaacuggg agauucugug gucaagucga uauagguuuc 420 cucaacaaug cauuuuaaag gccuguuugc cacuugugcc uuuucuuccu uacaauuauc 480 uucaucuacc uguaucaccc cacaucccaa gucuuccaca gcuaaugcag gaugauuacc 540 uucacuuuua gccucacuug aagcaucuug ugucaaauca auaaaagcac cuacaguauc 600 agccugcaaa gaauugucua auauuugagc acucugauuu aaauugccuc cagaacaucc 660 caacugauca auauguaaaa cuguuacuuc uaugaauucc cccaaguuuu ugguuucagu 720 gacuggaucu uucguuagau cuacguaugu guuuggaaga uguuccccaa cagaguguga 780 gauuucuucc auugaaggca auucuucaau gcuuucaggc acuuuuguuu cccauacuug 840 augcaauuug aaacauucau cagccacuuc aucacuauga cccaucuuau cugaagcauc 900 uuuaagaaau ucauauauau caggaaccug uguuuguauc auagagcucu guucuucaug 960 aguugacuug cugccaucaa cauuuuuguu ggaguuuucc aauuccucca cagauuuaaa 1020 aacuguguuc ugacaugaaa uauauucuuu cucugguccu ucaucagcuu ccuuuccaug 1080 ucugggcaaa gaugucaaua auucaucagg caucauacuc uguuuaaggc cagaagaggu 1140 agaugguguu gcacgucgua uuuucacaau gaaaugauca uuggacuuuu ccauuaugac 1200 ggcaugcaua gguagauuag ggugguacug aaagccugga gcaacagauc ggcuugucca 1260 ggaagaagaa caacuugauu uacugcuuga auuaucagac uccagagcua aaugaauauc 1320 uugcucagau gcauccucuu ccucaaguaa ggcaucuuca cuaaaaugag cacuaaugac 1380 uucuucagga guugaacugg acgacauauc aggcuuuaaa aaacugagau gaccaucuga 1440 cuucagaggc gaugguacug uuaaagagac ugcuagaucu ucaagaagua uggaagaaac 1500 gcagggcuug cucuuuucua cacuacacac auuaucuuua cuuaaaggua gguuaguaga 1560 cacuucaaac auacaacuuu cauccaacac aucaggauga accggcaaug aaagcccuga 1620 agacagagau ggaccuuuuu cagaugauaa uaaugaccaa uuaucaucac uaaucauuuu 1680 aggacaugga gaagccaccc cugaaacuag cucuucuguu guacaagcug guauagacuc 1740 gcacuuaaga gucucuagca gcugcuucuc uggagucuuu aacucccacu cacuuuuuuc 1800 aguacaguua acacugcugu cuaaaagauc agaaccuugc aacaaacuuu uaaauauuuc 1860 acccauuugu gcaucacuca cuaaauuaaa aguaaggcuc gaugcuugcu guucgguaag 1920 aaucucgaaa cuucguucug gcuucaaagu ugcaugcugg gaugucugug cauccucuau 1980 gcugcuuccu ucguuuuuuu cugacuuugg ggugcuugga caguguacuu ccaaggagcg 2040 cucuucggau ugagaguucu uuauauuauc aaagcagaug uuaaaauuuu uuuuaauguc 2100 augcuuuaca guguuaauac uggaguuauu uuggucuuga uaauuuuccu cagauuuuuu 2160 acaucccacu aaagacuuau aaugaacagg gucuucugau uuugauaauu uuucuuucag 2220 caauucucug uuggaguugu ccacacuccu uuucugacua uuugaauacu gugcauucug 2280 uuuacuuguu uuuucaaguu ugccuucauc acuaucucuu ccaaagcuuu uggaaucaca 2340 uacuaagauu uucuuaagcu uugcaaacaa auaaucaagu uggucaucua caaacuucca 2400 caauuuuuuu uucauaucug guaguugcug uucaaauaaa cgaucaacua ugccauucuu 2460 uuuaacuugc uuaaguuuag acucuauaau aucacagaga uucuucugua agguagucac 2320 ugacuuagag auuuugugua aguugagaug uuuaauuaaa gauguaaaac ucaaaauugc 2380 ugacucaaua auucugugaa auuguauuaa ugaaaauuuu gccuugaauu ucauauaauu 2440 uuuucuuaca uguuuucuua ucauucguaa caugugcaug aucucuuguu cagaagaggg 2700 uacagcaaua auuggaacua uuuuuuccaa gcuggaagug cucaucacuu uaucuuucuu 2760 cucuguuuuu gaagaucugc uagauuuauc aggucuuuua uuccauuugu uauuggucug 2820 auggauucuu acauguguuu uccuacuguc uuuaucuaaa cacacaguac uuuucccacg 2880 ucgugggaua gucuuugacu uccgcacauc agcugacacu cuacguuugg aauuuuuuuc 2940 aaaacuuucu ugugguuuag auguuucacu aucacuucua auuucuccuu cuucuaauuc 3000 aucuaauggu gaauucuuac augugucugc uucuguacau uugucagauu uguaaauugg 3060 cuuuugauuu uccuuauuga gaucagacug acucuuagag guagaaugag cugaauuugg 3120 uaaaaacaca ucuuuaugac uguuauuaua cacuggaacu ugaggugggc uuucauuucu 3180 aagaacuuuu gcuacagguc ucacuggacu auucagagga cugauggcuu cuggaauagg 3240 ucucagguga uuaaggucaa ugcucaaaac cgaguuauca ucaucaugau auacugaguu 3300 uguuucacca guugccauuc ugugguccau uaacucaguc ugcugaagug aagaaucuag 3360 agucucuuua gguaagcaag gcuccagaug acacgacuua cucucaacca gugguguaac 3420 uauaacagaa ggcucaaauu uuggguuauu aucuucugaa agcauuauug gcaaaauauc 3480 agcuuccuca auugaaggcu gcaaaaugcu uucagugguu ucacucacug uuguugaaag 3540 ugccaccuuc aucuccauac cuucagaaau accacaauaa ucugaauuau cauuucuuuu 3600 gguauccaau uccaagccaa aguuuugaga cacaucuguu uguaauacau ccauuaccac 3660 aggagcugcu gcccuuccau uauuaauggu uuguuucauu ccuguugaug gaaacaagga 3720 uucugucugu uguauuucca uaggagaugg gaaggaaguc ucuguaccac aaaugggcuc 3780 uucacaaugc auaguauugu caacagaccu aacuaacaaa cuauuuucgu cuuccuuguu 3840 gguuucugag auaccgaucc uggguucagu cacugcuaga agagcaaccu uugguuccaa 3900 uaacguugac uugguuuccc ccaugguaug uucacugaca gcugcuuccc ccaagauaug 3960 uucacuuaug gagggaacau augccacugu uuuaacuugc auugaagacu cugaaucaca 4020 uacaccacug gacuugggaa uaucaguuau uuuaugcuga uuauccuggg aaacagguug 4080 cuuuuuagca ggagaaagag uuaaguucaa uuuuuucaua aaacucaauu uuagguccuu 4140 guuuuuuguu ucauuuggac cacucucagc uuucauugca agcucuuuau uaucugcucc 4200 uucagaaaca ccauuaucaa ggacuucucc cuuaucaguc uuugguucau ucuguuucuu 4260 uaaaucagua gugguuuucu uaguuuccuu auuagucuuc ugcaaauguu cuguagguac 4320 ucuuuuuuca uuucuaauau gccuauuuuc uucuuugcuu ucuuguucuc uuuuccucuu 4380 aucuucaguu cuaugucuuu cugcuuuuaa agguguauuu ucccacugau gcauggcauc 4440 aacuuccuua gagucaaugu uuuugugagu ucuacuguuu gaaagagaag auggacaucu 4500 uccaucuuga aaacuaugac uguuuacacu cuugucucuu uuacaaucuu cccauccucu 4560 ucucucuucu agaugguauu uacuugaauu augagaaaau guuauuucau ucuuggaaug 4620 aggaagugau gcucguucag aucuucucca gugaucuugg uccuuuacua cugauuuagg 4680 uuuuugauca acuuuucuuu cuucuuuguc uugugauuua acuucuuucc uauuuauauu 4740 uugugaucuu ucacuuuguc uuucuaguuu uuugucacuu ugagagucua cucgacugug 4800 ugaccuuucu ccaggggucu cuuucuccca agaagaguua augcguucac cuuuauaguc 4860 agaaucugag uuacuuuuaa acuucgaacu uuugcuuuca gucuuugguu caccuuuacc 4920 auauuucuca ggauguccuu guagccuuug acuagccucc aauauccuug guucaccauc 4980 accacagcca guacuuaagu cuuuucguac ucuuucaguu ccucuguuaa acuggcuaug 5040 ucuaauaucu uuucuuccuc uucuacuauc cucauuugag cuacccucgc caaccugaua 5100 augagaacgu gaccaaacac cauuagugca guguuucuca acagauguag guaaauguga 5160 aguacuccuu uuaucagaau gugguuuucc uuccuuuucc agauuuggca gugaagugcu 5220 augauguaca ucuuuagaaa caucacuuuu agcucuguga ucagucuuug aacaaucauc 5280 caaaugugga gaucuagauu uaagaucuuu uguuuuaacu guaucaaaug uccuugcagu 5340 uuuaugauua uuucgaaaau guggaaacuc agacaaucuu uggugaagau uacuuauuuc 5400 uucauccuug cgguuuauuu ccacucuggc aguuuugaua agugcugaaa uauucuucuu 5460 aagagacugg uuuucguuua uuaagcugaa auucuguguc uguauuucuu uaaauuuuuu 5520 caucagcucu uucauuugua guugacauuu uccauauucu acuugcaaau cauuauaugu 5580 ugccuccuuu gcaguuccuu cuucagucag gaucucuuca uauaagucca aacaauuucu 5640 ugaugguaca caggauuugg aagcgcuguc agaaacagca cuguccaacc cagcguauau 5700 guccagugag ccuucaucau uguucuuaag aggagaagca gaaaagacau caaauaaacu 5760 uguuccauca ccauugucau caucugcugc caugauccua uuuccuuuug agaguca 5817 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ccgtcgacag atggacttca gcagaaatc 29 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gggtcgactc atttgctgaa ttcttcatag tcg 33 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gggaattcag aaaggaagta cagaaaacat 30 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 gggaattcca ctctagacca agctttgg 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 cggaattcat ggacccgttc ctggtgc 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 gggaattcca tcaggacgct tcggagg 27 <210> 11 <211> 1961 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 11 gaattcgcgg ccgcgtcgac atgaaattca aggcaaaatt ttcattaata caatttcaca 60 gaattattga gtcagcaatt ttgagtttta catctttaat taaacatctc aacttacaca 120 aaatctctaa gtcagtgact accttacaga agaatctctg tgatattata gagtctaaac 180 ttaagcaagt taaaaagaat ggcatagttg atcgtttatt tgaacagcaa ctaccagata 240 tgaaaaaaaa attgtggaag tttgtagatg accaacttga ttatttgttt gcaaagctta 300 agaaaatctt agtatgtgat tccaaaagct ttggaagaga tagtgatgaa ggcaaacttg 360 aaaaaacaag taaacagaat gcacagtatt caaatagtca gaaaaggagt gtggacaact 420 ccaacagaga attgctgaaa gaaaaattat caaaatcaga agaccctgtt cattataagt 480 ctttagtggg atgtaaaaaa tctgaggaaa attatcaaga ccaaaataac tccagtatta 540 acactgtaaa gcatgacatt aaaaaaaatt ttaacatctg ctttgataat ataaagaact 600 ctcaatccga agagcgctcc ttggaagtac actgtccaag caccccaaag tcagaaaaaa 660 acgaaggaag cagcatagag gatgcacaga catcccagca tgcaactttg aagccagaac 720 gaagtttcga gattcttacc gaacagcaag catcgagcct tacttttaat ttagtgagtg 780 atgcacaaat gggtgaaata tttaaaagtt tgttgcaagg ttctgatctt ttagacagca 840 gtgttaactg tactgaaaaa agtgagtggg agttaaagac tccagagaag cagctgctag 900 agactcttaa gtgcgagtct ataccagctt gtacaacaga agagctagtt tcaggggtgg 960 cttctccatg tcctaaaatg attagtgatg ataattggtc attattatca tctgaaaaag 1020 gtccatctct gtcttcaggg ctttcattgc cggttcatcc tgatgtgttg gatgaaagtt 1080 gtatgtttga agtgtctact aacctacctt taagtaaaga taatgtgtgt agtgtagaaa 1140 agagcaagcc ctgcgtttct tccatacttc ttgaagatct agcagtctct ttaacagtac 1200 catcgcctct gaagtcagat ggtcatctca gttttttaaa gcctgatatg tcgtccagtt 1260 caactcctga agaagtcatt agtgctcatt ttagtgaaga tgccttactt gaggaagagg 1320 atgcatctga gcaagatatt catttagctc tggagtctga taattcaagc agtaaatcaa 1380 gttgttcttc ttcctggaca agccgatctg ttgctccagg ctttcagtac caccctaatc 1440 tacctatgca tgccgtcata atggaaaagt ccaatgatca tttcattgtg aaaatacgac 1500 gtgcaacacc atctacctct tctggcctta aacagagtat gatgcctgat gaattattga 1560 catctttgcc cagacatgga aaggaagctg atgaaggacc agagaaagaa tatatttcat 1620 gtcagaacac agtttttaaa tctgtggagg aattggaaaa ctccaacaaa aatgttgatg 1680 gcagcaagtc aactcatgaa gaacagagct ctatgataca aacacaggtt cctgatatat 1740 atgaatttct taaagatgct tcagataaga tgggtcatag tgatgaagtg gctgatgaat 1800 gtttcaaatt gcatcaagta tgggaaacaa aagtgcctga aagcattgaa gaattgcctt 1860 caatggaaga aatctcacac tctgttgggg aacatcttcc aaacacatac gtagatctaa 1940 cgaaagatcc agtcactgaa accaaaaact tgggggaatt c 1961

【図面の簡単な説明】

【図１】pBS/library-1 の制限酵素地図を示す図であ
る。library-1 遺伝子はこのベクターを制限酵素EcoRI
で切断することによって単離することができる。図中の
Amp はアンピシリン耐性遺伝子、ColEI はコリシンEIの
複製開始点を示すものである。

【図２】ヒト各種臓器におけるaip-1 の発現をノーザン
ブロッティングの手法を用いて解析した図である。メン
ブランはクローンテック社のヒトMTN ブロットを用い、
各レーンには、レーン１：膵臓、レーン２：腎臓、レー
ン３：骨格筋、レーン４：肝臓、レーン５：肺、レーン
６：胎盤、レーン７：脳、レーン８：心臓由来のポリ
(A)RNA 各２μg がブロットされている。矢印で示した
位置にaip-1 プローブと反応するバンドが認められる。

【図３】pcDNA3/aip-1の制限酵素地図を示す図である。
aip-1 遺伝子はこのベクターを制限酵素BamHI 及びNotI
で切断することによって単離することができる。図中の
Amp はアンピシリン耐性遺伝子、ColEI はコリシンEIの
複製開始点、Neoはネオマイシン耐性遺伝子、P CMV は
サイトメガロウイルス由来プロモーターを示すものであ
る。

【図４】aip-1 によりコードされる蛋白質の、抗Fas 抗
体依存性アポトーシスに対する阻害効果を解析した。29
3 細胞に、pcDNA3/lacZ 0.2μg とpcDNA3/aip-1 1.8
μg の混合物（レーンaip-1 ）、もしくは、 pcDNA3/la
cZ 0.2 μg とpcDNA31.8 μg の混合物（レーンempty
）を導入し、24時間培養した。続いて50、100、200ng/
mlの抗Fas 抗体 CH11 を投与し、さらに24時間培養した
後、固定、染色した。図は、アポトーシスを起こして、
培養皿からはがれた細胞数を示すものである。

【図５】aip-1 によりコードされる蛋白質の、抗Fas 抗
体依存性アポトーシスに対する阻害効果を解析した。29
3 細胞に、pcDNA3/lacZ 0.2μg とpcDNA3/aip-1 1.8
μg の混合物（レーンaip-1 ）、もしくは、 pcDNA3/la
cZ 0.2 μg とpcDNA31.8 μg の混合物（レーンempty
）を導入し、24時間培養した。続いて50、100、200ng/
mlの抗Fas 抗体 CH11 を投与し、さらに24時間培養した
後、固定、染色した。図は、培養皿上の細胞のうち、青
く染色され、かつアポトーシス様の形態を示す細胞の割
合を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カスパーゼ−８（Caspase-8 ）と結合し
   デスエフェクタードメイン（death effector domain ）
   を持たない蛋白質。
2. 【請求項２】 以下の(a) 又は(b) に示す蛋白質: (a) 配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列を有す
   る蛋白質; (b) 配列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列におい
   て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
   されたアミノ酸配列を含み、 かつアポトーシス制御能を
   有する蛋白質。