JP2000505652A

JP2000505652A - 新規ＣＲＥＢａイソフォーム

Info

Publication number: JP2000505652A
Application number: JP10515936A
Authority: JP
Inventors: キーガン，キャスリーン，エス．
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2000-05-16
Also published as: US20020197712A1; WO1998012910A3; US5854016A; EP0876485A2; AU4652497A; US6248532B1; US5959079A; CA2236154A1; CN1209840A; AU733874B2; WO1998012910A2

Abstract

(57)【要約】本発明は概して、新規CREBaポリペプチドイソフォーム、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現構築体、当該ポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、当該ポリペプチドを生産するための方法、及び当該CREBaと他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の結合の阻害剤を同定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規ＣＲＥＢａイソフォーム発明の分野本発明は、cAMP調節DNA配列に結合するポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドに関する。発明の背景特異的な遺伝子発現へと導く、細胞外シグナルトランスダクションは多くの場合、最終的に核の転写因子の活性をモジュレートする一連の酵素反応によって行われる。その一例として、細胞外シグナリングは、アデノシン3',5'-モノホスフェート（cAMP）の細胞質レベルを変化させ、次に活性cAMP-依存性プロテインキナーゼ（PKA）のレベルをモジュレートする。ひとたび活性化されれば、PKAは核内に移動し、cAMPシグナリング経路によって調節される遺伝子に共通なDNA配列を認識する転写因子をリン酸化する。遺伝子発現のcAMP調節を許容する、かかる共通DNA配列は、cAMP調節エレメント（CRE）と命名されており、そしてCREを認識してCREに結合する転写因子は、CRE-結合（CREB）タンパク質として知られている。CREBタンパク質は、大抵CRE DNA配列に会合して見出されるものであり、当該タンパク質が会合遺伝子の転写を誘導することができる程度は、CREBのリン酸化状態によって決定されると考えられている。ひとたびリン酸化されれば、CR EBはCREB-結合タンパク質（CBP）に結合することができ、CBPは、その複合体と転写因子TF II Bとの相互作用を許容する。従って、CREBのリン酸化状態の調節は、cAMPによる特異的な遺伝子発現の中枢となることが明らかである。しかしながら、CREBのリン酸化状態は、PKAのみによって調節されるわけではない。これに対し、CREBリン酸化の程度は、ホスファターゼや、PKA以外のキナーゼの活性の間で平衡を保った状態にある。かように、CREBはcAMP遺伝子発現の調整に主として関与しているのであるが、一方でCREB活性は、他の、cAMP非関連経路の酵素による共作用の（concur rent）制御を受けやすい。 CREBファミリーのタンパク質のメンバーは、転写活性化に関連する特異的な機能を遂行する保存領域を含んでいる。すべてのCREBタンパク質は、他のCREBタンパク質または他の異種転写因子サブユニットとCREBが二量体形成することを許容するロイシンジッパー領域をカルボキシ末端に有している。CREBタンパク質は、例えば、プロテインキナーゼC（PKC）カゼインキナーゼI（CKI）及びカゼインキナーゼII（CKII）、ならびにおそらくはカルシウムーカルモジュリン依存性キナーゼI及びIIを包含する、PKA以外の複数のキナーゼによってリン酸化を受ける、キナーゼ誘導可能ドメイン（KID）と称される、前記ロイシンジッパー領域に隣接する領域によって特徴付けられる。CREBタンパク質は各々、塩基性アミノ酸に富むDNA結合ドメインをアミノ末端に含んでいる。ファミリーに含まれるタンパク質間の把握し難いと思われる相違があるものの、遺伝子発現における多様性の報告から、これらのタンパク質が独特の生理学的役割を有していることが示されている。発明の要約本発明の一つの特徴において、新規マウスcAMP調節エレメント結合（mCREBaと命名）ポリペプチド、さらには、１以上のDNAもしくはタンパク質結合活性、１以上の特異的遺伝子転写モジュレーション活性、及び／またはmCREBaに特異的な免疫学的特性を呈するそのポリペプチド変異体（断片ならびに欠失、置換及び付加類似体を包含）をコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA配列、そのRNA転写物及びそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチド）が提供される。DNA結合特性には、かかる結合を通じてmCREBaが特異的な遺伝子発現をモジュレートすることができる、特定のDNA配列の認識が包含され、一方タンパク質結合特性には、数多くのプロテインキナーゼの種々のものを包含するmCREBa活性の様々な調節因子との相互作用、さらには特異的及び非特異的転写因子との相互作用が含まれる。本発明の好ましいDNA配列には、ゲノミック及びcDNA配列、さらに全体的または部分的に化学合成されたDNA配列が包含される。現在のところ好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：１に示される。本発明の好ましいcDNAを大腸菌株DH5αF’内に含むプラスミドpBSmb3は、1996年9月18日に、20852メリーランド州、ロックビル(Rockville)、パークロウンドライブ(Parklawn Drive）12301に所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託され、98171の受託番号を与えられた。本発明のDNA配列の生物学的複製物（すなわち、in vivoまたはin Vit roで製造される単離されたDNA配列のコピー）が企図される。さらに提供されるのは、mCREBa配列を組み込んでいるプラスミド及びウイルスDNAベクターなどの、自己複製する組換え発現構築体、特にmCREBaまたはmCREBa変異体をコードする DNAが内在性または外来性発現制御DNA配列に作動可能に連結されているベクターである。本発明の別の特徴において、宿主細胞、特に原核生物細胞及び真核生物細胞などの単細胞性宿主細胞が、当該細胞内における所望のポリペプチドの発現を許容するように、本発明のDNA配列で安定に形質転換される。本発明の宿主細胞は、mCREBa及びmCREBa変異体の大規模生産のための方法において極めて有用であり、かかる方法において、該細胞が好適な培地にて生育され、そして所望のポリペプチド産物が、該細胞または該細胞が生育された培地から単離される。本発明の新規mCREBaポリペプチドは、天然細胞の供給源からの単離物として得ることができるが、mCREBa変異体産物も併せて、好ましくは、本発明の宿主細胞を用いる組換え法によって生産される。mCREBaポリペプチドに対する現在のところ好ましいアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。組換え発現のために選択された細胞及び／または単離後のプロセッシングによっては、組換え産物を、完全にまたは部分的にリン酸化または脱リン酸化されたフォームにて得ることができる。本発明のmCREBa変異体には、例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド結合パートナーに結合するmCREBaの能力及び／または天然の結合パートナーへの mCREBaの結合を阻害する能力を包含する、mCREBaの生物学的または免疫学的特性を有する１以上のドメイン領域のすべてまたは一部を含むmCREBa断片が含まれうる。本発明のmCREBa変異体はさらに、（１）mCREBaに対して特異的な１以上の生物学的活性もしくは免疫学的特徴を喪失することなく、そして好ましくはかかる特徴の増強を伴い、または（２）特定のポリペプチド／ポリペプチドもしくはポリペプチド／ポリヌクレオチド結合機能の特異的な無力化を伴って、１以上の明確化された(specified)（すなわち、天然にコードされる）アミノ酸が欠失または置換されたポリペプチド類似体を含んでもよい。多量体形成を容易ならしめる付加的なアミノ酸（例えば、リジンまたはシステイン）残基を含む類似体ポリペプチドも企図される。変異体mCREBaポリペプチドはさらに融合ポリペプチドを包含し、これは、mCREBaのすべてまたは一部が外来性のポリペプチド配列と合わせて発現されるものであり、例えば、ポリ−ヒスチジンタグ、ビオチニレーションタグ、β−ガラクトシダーゼキメラ、または様々な転写因子由来の１以上のDN A結合もしくはトランス活性化ドメインを含むキメラポリペプチドを包含するが、これらに限定されることはない。さらに本発明によって企図されるのは、mCREBaまたはmCREBa変異体に対して特異性を有する（すなわち、mCREBaと構造的関連性がある、これまでに同定された CREBaイソフォームとは非反応性である）抗体物質（例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、抗体断片、単鎖抗体、キメラ抗体、CDR-移植抗体等）ならびに他の結合タンパク質（例えば、ポリペプチド及びペプチド）である。抗体物質は、単離された天然のmCREBaもしくは組換えmCREBaまたはmCREBa変異体を使用して作成することができる。本発明の結合タンパク質は、DNAまたはポリペプチド結合部位構造（１以上）（例えば、エピトープ及び／またはmCREBaアミノ酸配列の修飾に対する結合特性の感度）の特徴付けのために、さらなる有用性を備えている。結合タンパク質はさらに、免疫付与のための組成物に有用であり、そして本発明のポリペプチドを精製するため、及び表面上に当該ポリペプチドを発現している細胞を同定するためにも有用である。かかる結合タンパク質は、mCREBaに関わる、DNA及び／またはポリペプチド結合の生物学的活性、特に特異的及び非特異的遺伝子発現に関わるそれらmCREBaのエフェクター機能をモジュレート（すなわち、ブロッキング、阻害または刺激）する際に極めて有用である。抗−mCREBa抗体物質に対して特異的な抗イディオタイプ抗体、及び遺伝子発現をモジュレートする際のかかる抗イディオタイプ抗体物質の使用もまた、企図される。血清または脳脊髄液などの体液中のmCREBaの検出及び定量のためのアッセイには、例えば、単一抗体物質または「サンドイッチ」アッセイ形式における複数の抗体物質が関わる。本発明のDNA及びアミノ酸配列の開示によって寄与される情報の科学的価値は明瞭である。一例として、mCREBaに対するcDNA配列の知見により、mCREBaをコードするゲノミックDNA配列のDNA／DNAハイブリダイゼーションによる単離や、プロモーター、オペレーター等のmCREBa発現制御調節配列の特定が可能となる。本発明のDNA配列を用いてストリンジェントな条件下で行われるDNA／DNAハイブリダイゼーション法は、さらに、mCREBaの対立変異体、mCREBaに特異的な１以上の生物学的及び／または免疫学的特性を保有する他の構造的関連タンパク質、ならびに他の種由来のmCREBaに相同なタンパク質をコードするDNAの単離を許容すると考えられる。本発明のDNAは、mCREBaを発現する細胞の能力を検出するためのD NA／RNAハイブリダイゼーションアッセイに有用である。さらに本発明によって得られるのは、通常mCREBaを発現している細胞によるmCREBaの発現調節に関わる、アンチセンスポリヌクレオチドである。他の例としては、mCREBaのDNA及びアミノ酸配列の知見により、様々な外来性ポリペプチド配列に会合したmCREBaタンパク質配列の存在によって特徴付けられる、ハイブリッド融合タンパク質などの mCREBa変異体の組換え法による作製が可能となる。本発明のDNAはまた、例えば、ジ−ハイブリッドスクリーニング及びゲルオーバーレイアッセイを包含する、数多くの熟知された技術のいずれかにて、mCREBa に対する結合パートナーポリペプチドをコードする新規遺伝子の同定を許容する。本発明によって提供されるDNA及びアミノ酸配列情報によって、mCREBaの構造及び機能の系統的な分析ならびにmCREBaと相互作用する分子の同定も可能となる。本発明の抗−mCREBaモノクローナル抗体のイディオタイプは、かかる分子の代表的なものであり、天然の結合タンパク質（ペプチド及びポリペプチド）を模することができ、これによって、mCREBaの生物学的活性がモジュレートされたり、またはこれによりmCREBaが細胞内の事象がモジュレートされうる。あるいは、それらは、mCREBa活性のモジュレーターの新しいクラスに相当するかもしれない。抗イディオタイプ抗体はさらに、生物学的に活性を有する mCREBaの等価物の新しいクラスに相当するかもしれない。mCREBaの活性をモジュレートする抗体または他の化合物を同定するためのin vitroアッセイには、例えば、mCREBaまたはmCREBaに結合する天然の結合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを固定化し、固定化されなかった方の結合パートナーを検出可能にラベルし、これら結合パートナーを一緒にインキュベートし、そして結合されたラベルの量に対する被検化合物の効果を判定する工程が含まれ、被検化合物の非存在下に結合したラベルの量に比較して被検化合物の存在下に結合したラベルの量が低減していれば、その被検剤はmCREBa結合の阻害剤であることが示唆される。別の特徴においては、本発明のDNAによって、スプリット・ハイブリッド・アッセイの利用により、他の天然結合パートナーへのmCREBaの結合の阻害剤を同定することが許容され、かかるアッセイにおいて、mCREBa、またはそのタンパク質結合ドメイン断片が、１以上の転写因子のDNA結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのいずれかと組み合わせられた融合タンパク質として宿主細胞にて発現される。mCREBaの天然結合パートナーもまた、転写因子のDNA結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのいずれか（mCREBa融合タンパク質に組み込まれていないいずれかのもの）と組み合わせられた融合タンパク質として同じ宿主細胞にて発現される。この２つの融合タンパク質の発現、及びそれに続く結合パートナーの会合により、DNA結合ドメインとトランス活性化ドメインとの会合が許容され、しかして、リプレッサータンパク質の発現へと導く、活性な転写因子が形成される。次に、発現されたリプレッサー遺伝子は、レポーター遺伝子の発現を妨げ、しかして宿主細胞の生存率が有意に低下する。このように形質転換された宿主細胞は、次いでmCREBa／結合パートナーの相互作用の阻害剤と推定される物質、及びmCREBaのパートナータンパク質へのmCREBaの結合を妨げるものとして同定されている事実上の阻害剤と接触せしめられ、かくしてリプレッサータンパク質の発現を妨げ、従って、レポーター遺伝子の発現が阻害できなくなる。従って、阻害剤は、特定のレポーター遺伝子産物の発現及び検出によって作製される陽性シグナルを間接的に提供するのである。小分子のモジュレーターを同定するために使用されるライブラリーには、少なくとも３つの相違するタイプがある。これらに含まれるのは、（１）化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、及び（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子を含んでなる組合せライブラリーである。化学ライブラリーは、既知化合物または、天然産物のスクリーニングによって阻害的であると同定される化合物の構造類似体からなるものである。天然産物ライブラリーは、（１）土壌、植物もしくは海洋微生物由来の培養液の発酵及び抽出または（２）植物もしくは海洋生物の抽出、によるスクリーニング用の混合物を創出すべく使用される、微生物、動物、植物、または海洋生物を集めたものである。組合せライブラリーは、混合物として、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物から構成される。これらは、旧来の自動化合成方法、PCRクローニング、または所有権のある合成方法によって、比較的容易に調製される。特に重要なのは、ペプチド及びオリゴヌクレオチドの組合せライブラリーである。さらに別の重要なライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド擬似物、多数平行合成収集品（multiparalle l synthetic collection）、再組合せのポリペプチドライブラリーが包含される。本発明によって提供されるDNA配列情報によって、さらに、相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［例えば、Kapecchi、Science、244巻、1288〜1292頁(198 9)］による、機能性を有するmCREBaタンパク質を発現しないか、または変異体mC REBaを発現する、齧歯類またはウサギの開発が可能となる。かかる齧歯類は、in vivoにてmCREBa及びmCREBaモジュレーターの活性を研究するためのモデルとして有用である。発明の詳細な説明下記の実施例により本発明を説明する。実施例１には、CKIδとの相互作用に基づく、新規タンパク質をコードする部分的なcDNAの単離を記載する。実施例２は、この新規タンパク質とCKIδとの間の相互作用のさらなる特徴付けについて述べる。実施例３は、新規mCREBaポリペプチドの組織分布の実験に関する。実施例４には、mCREBaをコードする全長のcDNAの単離を述べる。実施例５には、mC REBaに対して免疫特異性を有する抗体の作製を記載する。実施例６は、mCREBaの組換え発現に関する。実施例７には、mCREBaに対するDNA結合部位の同定を記載する。実施例８は、mCREBa／DNA結合活性のモジュレーターの同定のための高処理量スクリーニングアッセイの作製に関する。実施例９には、mCREBa／タンパク質相互作用の阻害剤を同定するスプリット・ハイブリッド・アッセイにおけるmC REBaの使用について述べる。実施例１ CKIδと相互作用するタンパク質をコードするcDNAの単離 CKIδと相互作用するタンパク質をコードするcDNAを単離するために、LexA-CK Iδ融合タンパク質をコードする発現ベクターを探針（bait）として使用して、２−ハイブリッドスクリーニングを行った。以下の方法により、CKIδをコードするDNAを、pBTM116［Bartelら、Cellular Interactions in Development:a Pra ctical Approach 、Hartley（編）IRL Press; Oxford、153〜179頁(1993)を参照のこと］のBamHI切断部位へとサブクローニングした。CKIδHUのコーディング領域は、先ず、1.3kbpのDNA断片を作製する、プライマーEC 40（配列番号：３）及びEC141（配列番号：４）を用いたPCRを使用し、BamHI制限酵素切断部位に組み込むように修飾した。 CGCGGATCCTAATGGAGCTGAGAGTCGGG （配列番号：３） CGCGGATCCGCTCATCGGTGCACGACAGA （配列番号：４）増幅反応には、300ngのCKIδHU鋳型DNA、１X PCR緩衝液（Perkin Elmer-Cetus社）、1.5mM MgCl₂、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、それぞれ10n g/mlのプライマーならびに1単位のAmpliTaq（Perkin Elmer-Cetus社）を含んでいた。反応は、最初に94℃にて４分間インキュベートし、次いで94℃にて１分間、50℃にて２分間、そして72℃にて４分間のインキュベーションの３０サイクルで行った。この結果得られたPCR産物は、BamHIで消化してプラスミドpAS1［Durf eeら、Genes and Development、7巻、555〜569頁(1993)］に、コードされたタンパク質がインフルエンザヘマグルチニン（HA）エピトープタグを含んで発現されるように連結された。こうして得られたプラスミドを、標準法によって大腸菌へと形質転換し、そしてCKIδ融合タンパク質の発現は、HAエピトープに対して免疫特異性を有するモノクローナル抗体12CA7（Boehringer Mannheim社）を使用したイムノブロットによって確認した。CKIδをコードするBamHI断片は、続いて、pB TM116のBamHI切断部位へとサブクローニングされ、プラスミドpBTMCKIδが得られ、これをサッカロミセス・セレビシエ株L40（MATa his3Δ200 trpl-901 leu2- 3,112 ade2 LYS2::(lexAop)₄HIS3 URA3::(lexAop)₈-lacZ GAL4）に形質転換して、CKIδ/L40株を作製した。CKIδ/L40は第9.5日から10.5日のステージのマウス胚より製造されたcDNAライブラリーで形質転換された。このcDNAライブラリーは、Hollenbergら[Mol．Cell．Bjol.、15巻、3813〜3822頁(1995)］の方法に従い、ベクターpVP16にて調製されたものであった。ロイシン及びトリプトファンを欠く培地での生存によって調べたところ、およそ4000万の形質転換体が得られた。ロイシン、トリプトファン、及びヒスチジンを欠く選択培地に播種することにより、タンパク質／タンパク質の相互作用について、8800万の形質転換体をアッセイした。ヒスチジンの非存在下での酵母菌の生育能から、ライブラリー配列によってコードされるタンパク質とCKIδとの間の相互作用が示唆された。ヒスチジンを欠く培地で生長することができるコロニーは、さらにLexAオペレーターの転写制御下の遺伝子によってコードされるβ−ガラクトシダーゼを発現する能力につき、標準法によってスクリーニングされた。青変した酵母コロニーのうち10 0が、ロイシン及びトリプトファンを欠く液体培地中で最も速やかに生育し、標準法によって総酵母DNAを調製した。総酵母DNAを使用して、ロイシンを発現しているプラスミドが存在しなければロイシンを欠く培地にて生育する能力のない大腸菌株C600を形質転換した。細菌を、カルベニシリン（アンピシリン誘導体）を含有し、ロイシンを欠く寒天上に播種した。これらの条件下で生長した個々のコロニーを生育し、そしてプラスミドDNAを調製した。多くの偽陽性が生じる可能性があるので、陽性のプラスミドをLexA-CKIδ融合タンパク質との相互作用、さらに陰性の対照としてLexA-ラミン融合タンパク質との相互作用について再試験した。概略説明すると、単離されたcDNAライブラリープラスミドは、LexA-CKIδまたはLexA-ラミンをコードするプラスミドのいずれかと共にL40へと共形質転換され、各形質転換由来の３つの酵母コロニーを拾い、標準β−ガラクトシダーゼ青／白アッセイにて試験した。LexA-CKIδで青変するがLexA-ラミンでは青変しない細胞を生育し、そのプラスミドDNAを単離し、標準法によって配列を決定した。ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォーメーションデータベースの検索により、３つのクラスのcDNA が得られたことが示唆された。かかるDNAによってコードされているタンパク質を、まとめてCKIδ-デルタ-相互作用タンパク質（CKIδ-delta-interacting pro teins）またはDIPSと命名した。 DIP25と命名されたクローンによってタイプ分けされるcDNAの１つのクラスは、キイロショウジョウバエの転写因子dCREBaに関連しているが同一ではないcDNA の一部を含んでいた。従って、全長のクローンをmCREBaと命名したが、これはCR EBタンパク質に特徴的な２つの異なるアミノ酸モチーフを含んでいる。おそらくはDNA結合領域であろうと考えられる塩基性アミノ酸に富む領域は、アミノ末端に位置しており、一方ロイシンジッパードメインはカルボキシル末端に見出される。DNAの第２のクラスは、ESTクローンT8 1950とほぼ同じであったが、第３のクラスはデータベースのいずれの配列とも相同性を示さなかった。実施例２ mCREBa DIP25クローンとCKIδとの間の相互作用の特徴付け CKIδとmCREBa DIP25断片との間の相互作用をさらに特徴付けするために、下記のようにマウスクローンをGST融合タンパク質として大腸菌にて発現した。 DIP25をコードするDNAをBamHI及びEcoRIで消化し、およそ500bpの断片を単離して、前もってBamHI及びEcoRIで消化しておいたプラスミドpGEX3T（Pharmacia 社）に連結した。こうして得られたプラスミドを大腸菌に形質転換した。タンパク質発現は、培地に0.2mM IPTGを添加して誘導し、およそ45 kDaのGST-DIP25タンパク質を発現した。タンパク質は、グルタチオンアガロース（Pharmacia社）に吸収させることによって精製し、以下の通りにin vitroでのCKIδに対するDIP 25の結合を評価するために使用した。組換えCKIδは、ヒスチジンタグ付けした融合タンパク質として、大腸菌［Aus ubelら、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1993)10. 11.8〜10.11.22頁］において製造した。概略説明すると、CKIδを、発現ベクターpET15b（Novagen社）へとクローニングした。部位特異的変異誘発によってCKI δの5'端にNdeI制限酵素切断部位をつくり、NdeI/BamHI CKIδ断片を、前もって同じ２つの酵素で消化しておいたpET15bへと連結した。部位特異的変異誘発は、 Mutagene Phagemid In Vitro Mutagenesis Kit，Version 2（BioRad社）を使用し、製造元により示されたプロトコルに従って、KME18と命名されたオリゴヌクレオチド（配列番号：１０）で行った。 GAATCGGGCCGCCGAGATCTCATATGGAGCTGAGAGTC （配列番号：１０）得られたプラスミドを、細菌株BL21DE3へと形質転換し、その細胞を0.6の吸光度（A₆₀₀）にまで生育した。細胞を1mM IPTGで18時間、25℃にて誘導し、回収して、破壊用緩衝液（20mM NaPO₄、pH8、300mM NaCl、mM PMSF、1μMアプロテイン、 1μMロイペプチンを含有）に再懸濁し、フレンチプレス（French Press）にて溶解した。溶解液を、100,000 X gにて60分間遠心分離し、その上清をNi-NTA-アガロースカラム（QIAGEN社、ドイツ）に付した。カラムは破壊用緩衝液で洗浄し、 0から200mMのイミダゾールの勾配を用いてタンパク質を溶出した。CKI活性は、5 0から80mMの間の濃度のイミダゾールで溶出されるCKIδに伴っていた。ヒスチジンでタグ付けした融合タンパク質は、グルタチオン・アガロースビーズに固定化したDIP25-GST融合タンパク質と共に、結合緩衝液（50mM NaCl、10mM Tris、pH7 .5、10％グリセロール、0.1％Triton）中で4℃にてインキュベートした。１時間インキュベートした後に、ビーズを結合緩衝液にて３回洗浄し、2％SDS、20mM T ris、pH6.8、20％グリセロール、及び0.001％ブロモフェノールブルーを含有するSDS試料用緩衝液中で煮沸することによって、結合したタンパク質を溶出した。DIP25-GST融合タンパク質の少量の画分がヒスチジンでタグ付けしたCKIδに結合したが、GSTのみが固定化された陰性対照には、CKIδはまったく結合しなかった。低効率の結合は、GST融合タンパク質の折畳みが不適切であったことを反映しているか、または大腸菌が行うことのできなDIP25の何らかの翻訳後修飾が必要であることを示唆しているのかもしれない。実施例３ mCREBaの組織分布 mCREBa mRNAの組織発現パターンを調べるために、様々なマウスの組織から、ならびに妊娠７、１１、１５、及び１７日目のマウス全胚より単離されたポリA⁺ RNAを含む市販の膜（Clontech社、Palo Alto、カリホルニア州）を使用して、ノザンブロット分析を行った。プライマーmCR-1（配列番号：５）及びmCR-2（配列番号：６）を使用する、mCREBaクローンからのPCRによって作製したDNAを用いて、製造元の示したプロトコルに従って、膜をプローブ探針した。 GGAATTCGCTCAAGGAGAGTCCTATTGG （配列番号：６） CGGGATCCTCACAGCTCCACATAAGCTGC （配列番号：５） PCRには、鋳型として50ng DIP25、1 X PCR緩衝液（Perkin-Elmer Cetus社）、1. 5mM MgCl₂、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、1μM dCTP、50μCiα³²P -dCTP、10ng/ml各プライマー、及び1単位AmpliTaq（Perkin-Elmer Cetus社）が含まれていた。反応は、Perkin-ElmerCetus Thermocyclerodel 480にて、以下のように行った：94℃にて4分間の初発変性サイクル、続いて、94℃にて15秒間、6 0℃にて15秒間、そして72℃にて30秒間の２０サイクル。取り込まれなかったヌクレオチドは、Nuc-trap Push Co1umn（Stratagene社）を使用して除去した。２つのmRNAが検出され、１つは約8kbに、いま１つは約3.75kbに移動するものであった。この２つのmRNAは、常に一緒に検出され、２つのスプライス変異体であることが示唆された。組織RNA膜において、最高の発現レベルは、腎臓、肺、及び心臓にて認められ、骨格筋、肝臓、脳及び精巣では、これらよりも低いレベルで検出された。このブロットでは、脾臓RNAに極めて低いレベルの発現が検出された。マウス胚試料において、8kb及び3.75kbの双方のmRNAの発現は、第７日目に最高であり、第１１日目には最低であった。第１１日より後には、第１５及び１７日まで、漸増的な発現の増加が検出された。いずれの胚組織がmCREBaのmRNAを発現しているか調べるために、マウス胚のin situハイブリダイゼーションを実施した。正常のBalb/cマウス胚を採収し、至適温度化合物（Tissue Tech社、Elkhart、インディアナ州）に埋設し、そして胚全体を６ミクロンの厚みに切片化した。組織切片を、Superfrost Plis（登録商標、VWR Scientific、Seattle、ワシントン）上に載置し、室温にて終夜風乾させた。その後直ちに使用しない切片は、-70℃に保存した。乾燥後、切片は4％パラホルムアルデヒド（Sigma社）を含むPBSで室温にて20分間固定化し、エタノール濃度を増加させて用いる（70％、95％及び最後は100％）ことで脱水し（各濃度につき４℃にて１分間）、室温にて風乾した。切片を、70％ホルムアミドを含有する2 X SSC溶液中で70℃にて２分間変性させた。2 X SSCで4℃にて切片を濯ぎ、再度、前記のごとくに脱水して乾燥させた。³⁵S-dUTP（アマーシャム社）を使用したin vitro転写によりネズミDIP25 DNAから作製した、³⁵S-ラベル単鎖mRN Aを使用してハイブリダイゼーションを行った。ラべルしたプローブ及びジエチルピロカーボネート（DEPC）-処理水を、50％ホルムアミド、0.3M NaCl、20mM T ris、pH7.5、10％デキストラン硫酸、1 Xデンハーツ、100mMジチオスレイトール（DTT）及び５mM EDTAのハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。添加に先駆けて、プローブを変性させるためにプローブ溶液を95℃にて３分間加熱して、各組織切片に20μlの緩衝液を付し、次いで滅菌済のRNAse不含カバースリップで被覆した。ハイブリダイゼーションは、50℃にて終夜行った。ハイブリダイゼーションの後、室温にて１時間、10mM DTTを含む4 X SSCで切片を洗浄し、続いて50％脱イオン化ホルムアミド、2 X SSC、及び10mM DTTを含有する緩衝液で60℃にて４０分間、そして0.1 X SSC緩衝液で室温にて３０分間、さらに洗浄した。前記の通りに切片を脱水及び風乾して、0.6M酢酸ナトリウムで1：1に希釈したKodak（Rochester、ニューヨーク州）NTB2核感光乳剤中に45℃ にて浸漬した。スライドを暗所で１〜２時間風乾し、乾燥剤の存在下に暗所で4℃にて露光した。１０日間露光した後、スライドをKodak Dektol現像剤にて現像し、脱イオン水で洗浄して、室温にて４分間、Kodak定着剤に浸した。次いで切片をヘマトキシリン及びエオシン（Sigma社、St.Louis、ミズーリ州）で対比染色した。この分析による結果を表１に示す。実施例４全長のmCREBaをコードするcDNAの単離 mCREBaをコードする全長のcDNAを得るために、前記したmCR-1及びmCR-2のオリゴを使用したmCREBa DIP25クローンからのPCRによって作製したプローブを用いて、マウス脳UniZAP XR cDNAライブラリー（Stratagene社）由来の5.4 x 10⁶のクローンをハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、3 X SSC、5 X デンハーツ、0.1％サルコシル、20mM NaPO₄、pH6. 8、100μg/ml単鎖サケ精子DNAで、ニトロセルロースフィルターを65℃にて１８時間インキュベートする条件下に行った。１つのクローンが、プローブにハイブリダイズした。pBSmb3と命名したcDNAを、製造元が示したプロトコルに従って、 in vivo切断によって単離し、ミクロ配列決定に付した。cDNAの配列分析から、およそ57kDaと予測される分子量を持つ、ヌクレオチド304で始まりヌクレオチド1866で終止する読み取り枠を含む3190bpのクローンが明示された。このクローンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１及び２に示す。DIP25クローンは、全長のmCREBaクローンpBSmb3のヌクレオチド1010から1514まで（このタンパク質の塩基性DNA結合ドメイン及びロイシンジッパードメインの双方を示す、アミノ酸237から405までをコードする）に対応している。dCREBaにおけるロイシンジッパー領域のアミノ酸406〜508を、mCREBaの対応する領域におけるアミノ酸260〜361と比較すると、78％の同一性が明らかになり、ヌクレオチドレベルでこれらの領域を比較すると、dCREBaのヌクレオチド2202〜2511とmCREBaのヌクレオチド1081〜1386の間に68％の相同性が示される。TNTキット（Promega社、Madison、ウィスコンシン州）を用いたクローンのin vitro転写及び翻訳により、予測された分子量（約75kDa）よりもわずかに移動度の遅いタンパク質産物が製造され、これはおそらく高度に荷電した塩基性DNA結合ドメインまたはロイシンジッパードメインにて形成される二次構造によって惹起されたものである。加うるに、pBSmb3のサブクローンは、プラスミドをEcoRI及びXhoIで消化することによって作製され、1.8kb断片が製造されて、同様の２つの酵素で予め消化されたpBluescript sk^-へと連結された。その結果得られたプラスミドは、pBSmb3E/Xと命名された。コード遺伝子のin vitro転写及び翻訳の結果、およそ75kDのポリペプチドが生産され、このタンパク質に対する全コード配列はかかる1.8kb断片に含まれていることが示唆された。さらにアミノ酸配列分析より、他のCREBイソフォームと同様に、mCREBaは、CKIδ以外のキナーゼ（他のCKIイソフォーム、CKII、cdc2、MAPキナーゼ、及びS6キナーゼを含むが、これらに限定されることはない）によってリン酸化される潜在的可能性があることが示唆されている。実施例５ mCREBa抗体の製造及び特徴付け前記のプラスミドpGEX3T-DIP25のDIP25-GST発現産物を使用して、mCREBaに対して特異性を有するポリクローナル抗体を作製した。概略説明すると、このプラスミドで形質転換されたC600細菌を、600nmでの吸光度が1.8となるまで生育し、この時点で、内在性tacプロモーターに作用する0.1mM IPTGを添加することにより、５時間のあいだDIP25-GSTの発現を誘導した。誘導に続いて、遠心分離によって細菌を回収し、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、1μg/m lロイペプチド、及び1μg/mlペプスタチンを含有するリン酸緩衝性生理食塩水（ PBS）中に再懸濁した。細胞をフレンチプレスにて溶解させ、12,000ｘgで２０分間遠心分離した。上清をグルタチオンーセファロース4B（Pharmacia社）の50％スラリー3mlと共に１時間インキュベートして、その後樹脂をペレット化し、PBS で３回洗浄した。50mMグルタチオンを含む10mM Tris、pH8.0を使用して樹脂からタンパク質を溶出させた。雌性ニュージーランド白色ウサギを、フロインド完全アジュバントと混合した 200μgのDIP25-GSTを複数の部位に皮下注射して、最初の免疫付与を行った。続く追加免疫は、先ずSDS試料用緩衝液にて煮沸し、SDSポリアクリルアミドゲルに付し、そしてゲルスライスから電気溶出されたタンパク質を用いて行った。追加免疫抗原調製物は、フロインド不完全アジュバントと混合して、最初の免疫付与に続いておよそ２１日間隔で投与した。第３、４及び５回の免疫後に、試験用血液を採取した。免疫付与によって、6179及び6144と命名された２種のポリクローナル抗血清が得られた。この抗血清がmCREBaを認識するか否かを調べるために、³⁵S-メチオニンの存在下にTNTキット（Promega社）を使用して、pBSmb3をin vitroで転写及び翻訳した。翻訳後の抽出物を、NP40 IBP（1％Nonidet P40、50mM Tris、pH7.5、 100mM NaCl、1mM EDTAを含有）で0.5mlにまで希釈し、５μlのウサギ抗血清と共に氷上で１時間インキュベートした。インキュベートの後に、プロテインAアガロース（Repligen）の50％スラリー20μlを添加して、さらに２０分間氷上でインキュベーションを続けた。遠心分離によって免疫複合体を集め、NP40 IPBにて３回洗浄した。SDS試料用緩衝液中で煮沸することにより複合体からタンパク質を溶出し、そしてSDSポリアクリルアミドゲルに付した。分離後に、ゲルを酢酸及びメタノール中で固定し、fluor Amp1ify（Amersham社）で処理して、乾燥し、Ｘ-線フィルムに露光した。オートラジオグラフィーによると、双方の血清が、前記したpBSmb3E/Xからの79 kDａの発見産物と反応していた。抗血清が哺乳動物細胞にて発現されたmCREBaと反応するか否かを調べるために、哺乳動物CREBをコードする発現プラスミドを以下のように構築した。親のプラスミドpcDNA 3（Invitorogen社）を、制限酵素EcoRI及びXhoIで消化し、前記した通りであって完全なmCREBaタンパク質をコードするpBSmb3E/Xからの1.8kbpのE coRI/XhoI断片に連結した。得られたプラスミドを、Chen及びOkayamaの方法［Bj otechnjques、6巻、632〜638頁(1988)］によってヒト胎児腎細胞系293Tを一過性に形質転換するために使用した。形質転換から４８時間後に、1％Triton X-100 、10mM Tris、pH7.6、５mM EDTA、50mM NaCl、30mM Na₄P₂O₇、50mM NaF、100μM Na₃VO₄、1mM PMSF、1μg/mlアプロテイン、及び1μg/mlロイペプチンを含有する緩衝液で細胞溶解液を作製し、その溶解液を10,000x gで遠心分離した。100μgの清澄化された溶解液を、10％SDSポリアクリルアミドゲルに付し、標準手法によってイムノブロットを作製した。1：1000 に希釈された双方の抗血清とも、mCREBa配列を含むpcDNA3でトランスフェクトされた細胞からの溶解液中のおよそ79kDaのタンパク質に反応した。実施例６組換えmCREBaの発現宿主細胞がビオチンの存在下に生育される場合にビオチン化タンパク質の発現が許容される、修飾型Pinpoint発現ベクター（Promega社）を使用して、タンパク質との融合体として組換えmCREBaを大腸菌にて発現させた。概略説明すると、 pBSmb3から1.8kbのNcoI/XhoI断片を切り出し、予めNcoI及びXhoIで消化しておいた発現プラスミドaraBCへとサブクローニングした。得られた中間体プラスミドは、アラビノースプロモーターの制御下にある、mCREBaコード配列を含んでいた。mCREBにビオチンタグを融合するために、発現プラスミドarabiolbからのEcoRI /NcoIプロモーター断片を、mCREBaコード配列がビオチンタグと共にフレーム内にあってなお且つアラビノースプロモーターの制御下にあるように、中間体プラスミドに挿入した。得られたプラスミドは、arabiomCREBと命名された。細菌を、標準技術によってarabiomCREBで形質転換し、2μMのビオチンを含有するLuria Brothにて中間対数増殖期まで生育した。ビオチン−mCREBaの発現を1％アラビノースで誘導し、遠心分離によって細菌を回収し、ペレットを50mM Tris、pH8.0 、100mM NaCl、1mM EDTA、5mM EGTA、及び1mM DTTに再懸濁した。細胞をフレンチプレスにて溶解し、不溶性物質を遠心分離によって除去して、その上清を150mM NaCl、 5％グリセロール、0.1％Tween 20、4mM DTTに調整した。ビオチン化されたmCREB aは、ストレプトアビジン−アガロース（Pharmacia社）を添加し、振盪しながら 4℃にて４時間インキュベートすることによって精製した。結合したタンパク質は、50mM Tris、pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、5mM EGTA、及び1mM DTTを含有する緩衝液で３回洗浄した。グリセロールを最終濃度10％になるように添加し、ストレプトアビジン−アガロースに結合したビオチン−mCREBaタンパク質を-70 ℃で保存した。実施例７ mCREBaのDNA結合部位の判定 DNA配列に対するmCREBaの結合特異性を、ランダムオリゴヌクレオチド由来のタンパク質のDNA結合部位の迅速な同定を許容するBinding Site Selection（Pol lock及びTreismanにより報告されている［Nuclelc Acids Res.、18巻、6197〜62 04頁(1990)］）を使用して判定する。mCREBa部位の結合部位選択を実施するためには、PCR反応におけるオリゴヌクレオチドプライマーにアニールする特異的なヌクレオチドと隣合う26ヌクレオチドのランダムオリゴマーと共に、前記のように調製したビオチン−mCREBaタンパク質をインキュベートする。ランダムオリゴヌクレオチド（配列番号：７） 5'CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCG- (A/G/C/T)₂₆GAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC-3' 塩感受性である結合反応に対する妨害を回避するために、結合反応は低イオン強度の条件下で行われる。Dignam緩衝液D［Digmanら、Nucl．Aci ds Res.、11巻、1475〜1489頁(1983)］とプロテアーゼ阻害剤、0.1％Nonidet P- 40、1mg/mlアヤチル化ウシ血清アルブミン（Promega社）を含有する結合緩衝液を、200ngのPoly(dIdC)-Poly(dIdC)（Pharmacia社）、1pgビオチン−mCREBa、及び0.4ngのランダムオリゴヌクレオチドに配合し、タンパク質／DNA複合体形成が許容されるように、氷上で３０分間、インキュベーションを行う。結合反応液にストレプトアビジンを添加し、次いで振盪しながら4℃にて終夜インキュベーションを行なって、形成されたmCREBa/DNA複合体を遠心分離によって集める。前記結合緩衝液で複合体を３回洗浄し、200μlの5mM EDTA、0.5％SDS、100mM酢酸ナトリウム、50mM Tris、pH8.0を含む緩衝液で45℃にてインキュベートすることにより複合体からDNAを溶出する。DNAをフェノール抽出し、担体としてのウサギ筋肉グリコーゲン（Boehringer Mannheim社）10μｇと混合してエタノール沈殿する。DNAの回収は、チエレンコフ（Cerenkov）計数によって定量する。回収されたDNAは、各々150μgのプライマーF及びR（それぞれ、配列番号：８及び９）、5μCi³²P-dCTP、20μM dCTP、各50μのdATP、dGTP、dTTP、1mg/mlのウシ血清アルブミン、1 X PCR緩衝液（Perkin Elmer-Cetus社）、1.5mM MgCl₂、ならびに1単位のAmpliTaq（Perkin Elmer-Cetus社）を含む10μlのPCR反応液中で増幅する。プライマーF （配列番号：８） 5'-CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCG-3' プライマーR （配列番号：９） 5'-GCTGCAGTTGCACTGAATTCGCCTC-3' 増幅は、94℃にて４分間の初発変性インキュベーション、次いで94℃にて１分間、62℃にて１分間、そして72℃にて１分間の１５サイクルで行った。このPCR反応の産物は、8％非変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した後にゲル精製され、そして前記のごときDNA結合配列の再選択のために（ランダムオリゴヌクレオチドの代わりに）使用される。これを、３回から４回繰り返すとよい。最終 DNA産物は、特定されたDNA結合部位に隣合う、BamHI及びEcoRIで消化し、そしてベクターpGL2-プロモーター（Promega社）のポリリンカー領域内のBamHI及びEco RI部位にクローニングする。プラスミドpGL2プロモーターは、SV40初期プロモーターの制御下にあるホタル・ルシフェラーゼを発現するベクターであり、潜在性調節配列の挿入を許容するポリリンカー領域をプロモーターより上流に有している。この結果得られるプラスミドは、DNA配列分析に付され、mCREBaに対するDNA 結合部位のコンセンサスヌクレオチド配列が判定される。特定された配列へのmCREBaのDNA結合は、ゲル移動度シフトアッセイを使用して確認される。概略説明すると、50mM Tris、pH8.0、50mM NaCl、50μM DTT、1m M EDTA、10％グリセロール、５mM MgCl₂、5mMスペルミジン、0.05％Nonidet P-4 0、3μgウシ血清アルブミン、及び1μgのpoly(dIdC)-poly(dIdC)（Pharmacia社）を含有する緩衝液中で、前記のごとくに同定されたDNA結合部位を含む³²-Pラベルされたオリゴヌクレオチド0.1pmol/μ1と共に、23℃にて１５分間、精製されたビオチン−mCREBaをインキュベートする。適切にインキュベーションした後、かかる結合混液を4％非変性ポリアクリルアミドゲルに付し、mCREBaタンパク質がない場合の対照DNAに比較して、DNAの高分子量側への分子量シフトによって、放射活性ラベルしたDNA配列へのmCREBa結合を判定する。先に同定されたDNA配列へのmCREBa結合のさらなる特徴付けとして、mCREBa DN A結合部位を含むpGL2構築体を、pcDNA3-mCREBと共に293T細胞にコトランスフェクトし、発現されたmCREBaがレポーター構築体の転写を活性化または抑制のいずれかを行う能力について判定する。Chen及びOkayama［前出］の方法によって細胞をトランスフェクトし、４８時間後に回収して、Luciferase Assay Kit（Prom ega社）を使用して製造元の標準プロトコルに従い、ルシフェラーゼ活性についてアッセイする。実施例８ mCREBa／DNA結合活性のモジュレーターのための高処理量スクリーニング小分子阻害剤の高処理量スクリーニング（組合せライブラリー天然産物ライブラリー、及び／または化学ライブラリー）のためのアッセイを、前記の判定により特定されたmCREBaのDNA結合部位に基づいて確立する。³²-pラベルされたDNA配列に組換えmCREBaが結合する能力が、ニトロセルロースフィルター上に固定化されたタンパク質に結合する放射活性を定量することによってモニターされるものである、フィルター結合アッセイを設計する。³²-PラベルされたDNA配列は、予め固定化されるmCREBaタンパク質がない状態でニトロセルロースに結合することがないよう、充分小さくなるように設計される。モジュレーターの候補となる物質は、固定化されたタンパク質と共にインキュベートされ、そしてこのタンパク質へのDNAの結合能の増加または減少をもたらすものとして、DNA結合活性のモジュレーターが同定される。別に選択可能なアッセイとして、組換えビオチン化mCREBaがストレプトアビジン被覆プレート（Pierce社）に結合され、小分子のモジュレーター候補物質と共にインキュベートされ、そして³²-PラベルされたDNA配列が添加されるものが確立される。モジュレーターは、ラベルされたDNA配列へのmCREB aの結合を増加または減少させる分子として同定される。第二次アッセイには、pGL2-プロモーター/DNA結合部位構築体がトランスフェクトされた細胞を、特定されたモジュレーターで処理する工程が含まれ、続いてレポーター遺伝子産物の活性のアッセイが行われる。実施例９他のタンパク質へのmCREBa結合のモジュレーターの同定係属中の米国特許出願（代理人事件番号27866/33487、本出願と同時に出願）に、特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を妨げる分子を同定するための「スプリット・ハイブリッド・アッセイ」技術が詳細に記載されている。参照することによって、当該出願の明細書の内容を本明細書に組み入れることとする。 CKIδと相互作用するタンパク質をコードするcDNAを単離するために、LexA-CK Iδ融合タンパク質を探針として用いて、２−ハイブリッドアッセイを実施した。CKIδのコード領域を、pBTM116のBamHI切断部位へとサブクローニングし、そしてCKIδ/L40と命名された酵母株（MATa his3Δ200 trpl-901 leu2-3 112 ade2 LYS2::(lexAop)₄HIS3 URA3::(lexAop)₈-lacZ GAL4）に形質転換した。CKIδ/L4 0は、第9.5日から10.5日のステージのマウス胚より製造されたcDNAライブラリーでの大量形質転換に付された。およそ4000万の形質転換体が得られた。ロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを欠く選択培地に8800万個を播種した。ヒスチジンの非存在下での酵母形質転換体の生育能から、何らかのライブラリータンパク質とCKIδとの間の相互作用があることが示唆された。第２のスクリーニングにおいて、相互作用がβ−ガラクトシダーゼの転写を活性化する能力によって２つのタンパク質の相互作用をアッセイした。X-galの存在下に青変したコロニーを、ロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを欠く培地に画線（streak）し、液体培地中で生育して、総DNAの単離のためにプールした。単離されたDNAを使用して、ロイシンを欠く培地での生育能を有しない大腸菌株600を形質転換した。生育したコロニーをプラスミド調製のために使用し、３つのクラスのcDNAを同定した。１つのクラスは、キイロショウジョウバエの転写因子であるdCREBaに密接に関連していた。 CKIδ/CREB相互作用をスプリット・ハイブリッド・アッセイで調べると、細胞はヒスチジンを含有する培地で生育することが示されたが、ヒスチジンがないと生育は阻止された。細胞培養液に少量のテトラサイクリンを添加すると、細胞の生育能が復旧し、CKIδとCREBaとの間の相互作用が非常に弱いことが示唆された。 mCREBaとCKIδHUとの間の結合相互作用を妨げることができる分子を同定するために、例えば、化学ライブラリー、天然産物ライブラリー、及び組合せライブラリーなどから選択される阻害剤と推定される物質の存在下に、スプリット・ハイブリッド・アッセイを行う。同様に、他の相互作用性キナーゼ、さらには他のタンパク質との間のmCREBaの相互作用の阻害剤もまた、同じ技術にて同定される。mCREBaと相互作用する他のタンパク質に対する発現プラスミドは、CKIδHU発現プラスミドの構築にて使用したと同様の技術を使用して構築される。次いで、様々な結合阻害剤と推定される物質の存在下にスプリット・ハイブリッド・アッセイを実施し、栄養要素を欠く培地での宿主細胞の生育能によって阻害を判定する。スプリット・ハイブリッド・アッセイにおいて、mCREBa、またはそのタンパク質結合ドメイン断片は、１以上の転写因子のDNA結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのいずれかと組み合わせて、融合タンパク質として宿主細胞で発現される。mCREBa結合パートナーの例には、cdc2［Hall及びPeters、Adv.Cancer R es.、68巻、67〜108頁(1996)の総説を参照されたい］、CKI及びCKIIイソフォーム［Ahmed、Cell.Mol.Biol.Res.、40巻、1〜11頁(1994)の総説を参照されたい］、MAPキナーゼ［Marshall、Ann.Oncol.、6巻、追補1、63〜67頁(1995)の総説を参照されたい］、及びS6キナーゼ［Chou及びBlenis、Curr.Opin.Cell.Bjol.、7 巻、806〜814頁(1995)の総説を参照されたい］が包含される。mCREBaの天然結合パートナーも、転写因子のDNA結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのいずれか（mCREBa融合タンパク質に組み込まれていないいずれかのもの）と組み合わせて、融合タンパク質として同じ宿主細胞で発現される。２種の融合タンパク質の発現、及びそれに続く結合パートナーとの会合によって、DNA結合ドメインとトランス活性化ドメインの会合が許容されて、リプレッサータンパク質の発現へと導く活性な転写因子が形成される。発現されたリプレッサータンパク質は、次に、レポーター遺伝子の発現を阻止し、しかして宿主細胞の生存率が有意に減少せしめられる。かように形質転換された宿主細胞は、次いでmCREBa／結合パートナーの阻害剤と推定される物質、及びmCREBaのパートナータンパク質へのmCRE Baの結合を妨げることが同定されている事実上の阻害剤と接触され、こうしてリプレッサータンパク質の発現が妨げられ、従って、レポーター遺伝子の発現を阻止できなくなる。阻害剤は従って、特定のレポーター遺伝子産物の発現及び検出によって作製される陽性シグナルを間接的にもたらすのである。このタイプのアッセイに適用可能な阻害剤候補物質の供給源は、化学的化合物ライブラリー、微生物、動物、植物、及び／もしくは海洋生物より単離された天然産物のライブラリー、多数平行合成収集品、ならびに／または組合せ、再組合せ、ペプチド擬似物、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質ライブラリーに見出すことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３Ｂ // Ａ６１Ｐ 43/00 39/395 ＤＡ６１Ｋ 38/00 Ｎ 39/395 45/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 45/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ０７Ｋ 19/00 9/12 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２で示されるmCREBaアミノ酸配列を含むポリペプチド。２．請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。３．配列番号：１で示される配列を含む請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチド。４．DNA分子である請求の範囲第２または３項記載のポリヌクレオチド。５．DNA分子がcDNA分子である請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド。６．DNA分子がゲノミックDNA分子である請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド。７．全体的または部分的に化学合成されたDNA分子である請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド。８．請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド。９．請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチドを含む発現構築体。１０．請求の範囲第２または９項記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１１．mCREBaポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程すなわち、ａ）請求の範囲第５項記載の宿主細胞を、mCREBaポリペプチドの発現のために適切な条件下で生育し、ｂ）該宿主細胞またはその生育培地からmCREBaポリペプチドを単離する工程を含む方法。１２．請求の範囲第１項記載のポリペプチドと特異的に免疫反応性を有する抗体。１３．モノクローナル抗体である請求の範囲第１２項記載の抗体。１４．請求の範囲第１３項記載の抗体を分泌するハイブリドーマ。１５．請求の範囲第１２項記載の抗体と特異的に免疫反応性を有する抗イディオタイプ抗体。１６．DNAへのmCREBa結合のモジュレーターを同定する方法であって、以下の工程すなわち、ａ）mCREBaと特異的に結合することが知られているDNA配列とmCREBaとをインキュベートし、ｂ）mCREBaと該DNA配列との間の結合の程度を定量し、ｃ）該DNA配列へのmCREBaの結合のモジュレーターと推定される物質の存在下に工程（ａ）を繰り返し、及びｄ）工程（ｂ）で定量された相互作用性と、モジュレーターと推定される物質の存在下での前記DNA配列とmCREBaの結合とを比較する工程を含み、モジュレーターと推定される物質の存在下での結合の増大が結合エンハンサーの指標となり、そしてモジュレーターと推定される物質の存在下での結合の低減が結合リプレッサーの指標となる方法。１７．mCREBaまたはその結合断片と、mCREBa−結合タンパク質またはその結合断片との間の結合の阻害剤を同定する方法であって、以下の工程すなわち、ａ）リプレッサータンパク質をコードするリプレッサー遺伝子（該リプレッサー遺伝子はプロモーターの転写制御下にある）；選択可能なマーカータンパク質をコードする選択可能マーカー遺伝子（該選択可能マーカー遺伝子は、オペレーターの転写制御下にあり、該オペレーターは前記リプレッサータンパク質との相互作用によって調節される）；フレーム内のmCREBaまたはその結合断片と共に、転写活性化タンパク質の DNA結合ドメインまたは転写活性化タンパク質のトランス活性化ドメインのいずれかをコードする第１組換え融合タンパク質遺伝子；ならびにフレーム内のmCREBa−結合タンパク質またはその結合断片と共に、転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインまたは転写活性化タンパク質のトランス活性化ドメインのいずれかをコードする第２組換え融合タンパク質遺伝子（該ドメインは第１融合タンパク質遺伝子によってコードされていないいずれかのものであり、該第２結合タンパク質またはその結合断片は、前記第１結合タンパク質またはその結合断片と相互作用することができ、該第２結合タンパク質またはその結合断片と該第１結合タンパク質またはその結合断片との相互作用によってDN A結合ドメインとトランス活性化ドメインとの近接がもたらされて、機能性を有する転写活性化タンパク質が形成され；機能性を有する該転写活性化タンパク質が前記プロモーターに作用し、前記レプレッサー遺伝子の発現を増加させる）を含むDNAで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を生産し、ｂ）前記mCREBaまたはその結合断片と前記mCREBa結合タンパク質またはその結合断片とが相互作用して前記DNA結合ドメインと前記トランス活性化ドメインとの近接がもたらされて、機能性を有する転写活性化タンパク質が形成されるような、該mCREBaまたはその結合断片と、該mCREBa−結合タンパク質またはその結合断片の発現を許容する条件下に、被検化合物の非存在下で宿主細胞を生育し；該転写活性化タンパク質が、前記プロモーターに作用して前記リプレッサータンパク質の発現を増加させ；前記選択可能マーカータンパク質が発現されないように、該リプレッサータンパク質が前記オペレーターと相互作用し；ｃ）前記宿主細胞において前記選択可能マーカータンパク質が発現していないことを確認し；ｄ）被検化合物の存在下に該宿主細胞を生育し；ならびにｅ）該被検化合物の存在下と非存在下における前記選択可能マーカータンパク質の発現を比較する工程を含み、該選択可能マーカータンパク質の発現の増加が、該被検化合物は、前記第１結合タンパク質またはその結合断片と前記第２結合タンパク質またはその結合断片との間の結合の阻害剤であることの指標となる方法。１８．前記DNA結合ドメイン及び前記トランス活性化ドメインが、共通の転写活性化タンパク質に由来する、請求の範囲第１７項記載の方法。１９．前記リプレッサー遺伝子、選択可能マーカー遺伝子、第１組換え融合タンパク質遺伝子、及び第２組換え融合タンパク質遺伝子のうちの１以上が、別個の DNA発現構築体にてコードされている請求の範囲第１７項記載の方法。２０．前記選択可能マーカータンパク質が、前記宿主細胞に対する栄養要素合成のための経路内の酵素であり、該選択可能マーカータンパク質の発現が、該栄養要素を欠く培地での該宿主細胞の生育のために必要である請求の範囲第１７項記載の方法。２１．前記宿主細胞が酵母細胞または哺乳動物細胞である請求の範囲第１７項記載の方法。２２．前記選択可能マーカー遺伝子が、HIS3をコードする請求の範囲第１８項記載の方法。２３．前記リプレッサータンパク質遺伝子が、テトラサイクリン耐性タンパク質をコードする請求の範囲第１８項記載の方法。２４．前記オペレーターがtetオペレーターである請求の範囲第１８項記載の方法。２５．前記プロモーターが、LexAプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、Gal4プロモーターよりなる群から選択される請求の範囲第１８項記載の方法。２６．前記DNA結合ドメインが、LexA及びGa14よりなる群から選択されるタンパク質に由来する請求の範囲第１８項記載の方法。２７．前記トランス活性化ドメインが、VP16及びGa14よりなる群から選択されるタンパク質に由来する請求の範囲第１８項記載の方法。２８．前記mCREBa−結合タンパク質が、CKI、CKII、cdc2、MAPキナーゼ、及びS6 キナーゼよりなる群から選択される請求の範囲第１８項記載の方法。