JP2000228988A

JP2000228988A - Ｄｎａヘリケース

Info

Publication number: JP2000228988A
Application number: JP11033062A
Authority: JP
Inventors: Takaaki Tamura; 隆明田村
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1999-02-10
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2000-08-22
Also published as: WO2000047731A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＴＩＰ４９の一部分との相同性を有する新規
蛋白質を提供すること。また、前記蛋白質をコードする
遺伝子を提供することを目的とするものである。【解決手段】ＴＩＰ４９の一部と相同性を有する蛋白
質をコードするｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからス
クリーニングして得た。このｃＤＮＡの塩基配列を決定
し、該ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定した。
さらに、このｃＤＮＡがコードする組み換え蛋白質を作
製し、該組み換え蛋白質の分子量が５０ｋＤであること
を確認した。さらに、この蛋白質がＤＮＡヘリケース活
性を有することを確認した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡヘリケース
活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレ
オチド、該ポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリ
ヌクレオチドおよび該蛋白質を認識する抗体に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子転写における中心的な因子として
は、ＴＢＰ（ＴＡＴＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉ
ｎ）が、生物の全遺伝子の転写に関わっていることが知
られている。具体的には、ＤＮＡからｍＲＮＡへの翻訳
が行われるときにＴＢＰが該ＤＮＡのプロモーター領域
に結合することで遺伝子の転写制御が行われている。Ｔ
ＢＰが他の多様な蛋白質と複合体を形成することで、そ
の相手の蛋白質や複合体の構造により、該複合体が、各
遺伝子のそれぞれ異なる転写制御に対応するだけの機能
を持つことになると考えられている。

【０００３】本発明者らは、ＴＢＰと結合する蛋白質と
してＴＩＰ４９蛋白質、それをコードする遺伝子を単離
同定した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３５，６４−６８）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＴＩＰ４９
の一部分との相同性を有する新規蛋白質を提供すること
を目的とする。また、本発明は、前記蛋白質をコードす
るポリヌクレオチドを提供することを目的とするもので
ある。また、本発明は、前記蛋白質を認識する抗体を提
供することを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ＴＩＰ４９
の一部と相同性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡを
単離し、その塩基配列を決定した。そして、該ｃＤＮＡ
がコードするアミノ酸配列を決定した。さらに、本発明
者は、このｃＤＮＡがコードする組み換え蛋白質を作製
し、該組み換え蛋白質の分子量が５０ｋＤであることを
確認した。本発明者は、この蛋白質をＨＥＬ５０と名付
けた。さらに、本発明者は、ＨＥＬ５０がＤＮＡヘリケ
ース活性を有することを確認した。なお、ＨＥＬ５０が
由来する動物を明示する場合は、例えばヒトＨＥＬ５０
のように、ＨＥＬ５０の前に由来する動物名を付けて表
記する。ＨＥＬ５０と表記した場合は、真核生物である
生物に由来するＨＥＬ５０を意味する。

【０００６】また、本発明は、ＨＥＬ５０を認識する抗
体を開示する。

【０００７】具体的には、本発明は、以下の蛋白質を提
供する。１．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる
蛋白質。この蛋白質はＤＮＡヘリケース活性を有する。
この蛋白質がヒトＨＥＬ５０である。２．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において
一または複数のアミノ酸が置換、欠失または付加された
アミノ酸配列からなり、かつＤＮＡヘリケース活性を有
する蛋白質。以下、この蛋白質をヒトＨＥＬ５０変異体
という。配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一
部からなり、かつＤＮＡヘリケース活性を有する蛋白質
は、ヒトＨＥＬ５０変異体の一態様である。３．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と６５％
以上のホモロジーを有し、かつＤＮＡヘリケース活性を
有する蛋白質。この蛋白質は、真核生物のＨＥＬ５０で
ある。４．配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列からな
る蛋白質。この蛋白質は、酵母ＨＥＬ５０であり、前記
第４項に記載の真核生物のＨＥＬ５０の一態様である。

【０００８】また、本発明は、以下のポリヌクレオチド
を提供するものである。なお、本明細書においては、ポ
リヌクレオチドとは、ＤＮＡやＲＮＡ、またはそれらに
塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチドが複数結合した
ものを、天然には存在しないものを含めていう。５．前記第１項ないし第４項のいずれか一項に記載の蛋
白質をコードするポリヌクレオチド。６．配列表の配列番号２に記載の塩基配列の１番目のＡ
から１３８９番目のＣまでの塩基配列を有するＤＮＡ。
配列表の配列番号２に記載の塩基配列の１番目のＡから
１３８９番目のＣまでの塩基配列は、ヒトＨＥＬ５０の
コード領域の塩基配列であり、この塩基配列を有するＤ
ＮＡを、以下ではヒトＨＥＬ５０ＤＮＡという。なお、
ｃＤＮＡはＤＮＡに含まれるが、本明細書では、当該Ｄ
ＮＡがｃＤＮＡであることを特に明示する場合には、ｃ
ＤＮＡと表記する。７．配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮ
Ａ。このＤＮＡは前記第６項に記載のＤＮＡの一態様で
ある。８．配列表の配列番号１２に記載の塩基配列からなるＤ
ＮＡ。このＤＮＡは、酵母ＨＥＬ５０ＤＮＡである。９．前記第６項ないし第８項のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡがコードするＲＮＡ。以下、ヒトＨＥＬ５０ＤＮＡ
がコードするＲＮＡをヒトＨＥＬ５０ＲＮＡという。な
お、ｍＲＮＡはＲＮＡに含まれるが、本明細書では、当
該ＲＮＡがｍＲＮＡであることを特に明示する場合に
は、ｍＲＮＡと表記する。１０．前記第６項ないし第８項のいずれか一項に記載の
ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡ、前記第９項に記載のＲＮ
ＡのアンチセンスＲＮＡまたはそれらの誘導体からなる
アンチセンスポリヌクレオチド。なお、アンチセンスポ
リヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれるが、本
明細書では、当該ポリヌクレオチドがアンチセンス鎖で
あることを特に明示するときには、アンチセンスポリヌ
クレオチドと表記する。１１．前記第５項ないし第１０項のいずれか一項に記載
のポリヌクレオチドうちの一部であって、連続する１２
塩基以上からなるポリヌクレオチド。１２．化学修飾された前記第５項ないし第１１項のいず
れか一項に記載のポリヌクレオチド。

【０００９】また、本発明は、前記第１項ないし第３項
のいずれか一項に記載の蛋白質を認識する抗体およびモ
ノクローナル抗体の活性フラグメントを提供するもので
ある。本明細書では、抗体とは、抗血清、ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体の全てを含み、さらに
抗体の活性フラグメントも含む。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のＨＥＬ５０およびＨＥＬ
５０変異体は、ＤＮＡヘリケース活性を有することを特
徴とするが、これらについては、例えば実施例４で開示
した方法を用いて確認すればよい。ＨＥＬ５０変異体は
公知の方法を使用して作製できる。例えば、ＨＥＬ５０
変異体をコードするＤＮＡを作製して、該ＤＮＡを適当
な宿主に組み込み、得られる形質転換体にＨＥＬ５０を
発現させることができる。ＨＥＬ５０変異体をコードす
るＤＮＡは、例えば、制限酵素を利用して、ＨＥＬ５０
ＤＮＡの所望の部位の塩基を欠失もしくは他の塩基に置
換し、または所望の部位に塩基を挿入して得られる。ま
た、サイトディレクトミュータジェネシスの方法によっ
てもＨＥＬ５０変異体を作製することができる。また、
ハイブリダイズの条件を緩くしたＰＣＲによりランダム
ミュータジェネシスを起こすこともできる。

【００１１】本発明のＨＥＬ５０またはＨＥＬ５０変異
体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、縮重により存在
しうる全ての塩基配列からなるものである。

【００１２】ＤＮＡのセンス鎖またはＲＮＡについて
は、その塩基配列と相補的な塩基配列からなるアンチセ
ンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡがそれぞれ存在す
る。本明細書では、特に断りがない限り、ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡを含む）はセンス鎖とアンチセンス鎖の二本鎖から
なるものを指し、ＲＮＡは一本鎖からなるものを指し、
アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは一本鎖
からなるものを指す。本発明は、アンチセンスポリヌク
レオチドの誘導体を全て含む。誘導体は、例えば、アン
チセンスポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端
に他の物質が結合したものやアンチセンスポリヌクレオ
チドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか一部にお
いて、置換や欠失や付加といった修飾が生じた物質、あ
るいは天然に存在しないような塩基、糖、リン酸を有す
るものや、糖−リン酸骨格以外の骨格を有するものであ
る。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその
誘導体は、ＨＥＬ５０をコードするポリヌクレオチドの
コード領域のいかなる部分にハイブリダイズするもので
あってもよい。ｍＲＮＡの一部に対して相補的な塩基配
列を有し、該ｍＲＮＡにハイブリダイズするものが好ま
しい。

【００１３】アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシン
グ段階、ｍＲＮＡが核膜通過する段階、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳段階のいずれかで、遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡにハ
イブリダイズし、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を
与えて蛋白質の生合成を阻害することにより該蛋白質の
発現を調節すると考えられている。

【００１４】アンチセンスポリヌクレオチドがＲＮＡに
ハイブリダイズし易くするために、一般的には、ＲＮＡ
のループ領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有するア
ンチセンスポリヌクレオチドを設計するとよいとされて
いる。また、ＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム
結合部位、キャッピング部位またはスプライス部位の配
列に相補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌク
レオチドは、一般に生合成を阻害する効果が大きいこと
が期待できる。したがって、本発明のアンチセンスポリ
ヌクレオチドまたはその誘導体であって、ＨＥＬ５０Ｒ
ＮＡのループ領域、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位またはスプライス部位の塩基
配列に相補的な塩基配列を持つものは、生合成を阻害す
る効果が大きいことが期待される。

【００１５】アンチセンスポリヌクレオチドは、特定の
蛋白質の生合成を阻害する点で、特定の遺伝子やＲＮＡ
にハイブリダイズするものが好ましい。このため、１２
以上の塩基からなるものが好ましく、１６以上の塩基か
らなるものが特に好ましい。一方、細胞膜透過性の点で
は３５以下の塩基からなるものが好ましい。

【００１６】アンチセンスポリヌクレオチド誘導体は、
ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞膜透過性または結
合力の少なくとも一つが高められた誘導体であることが
好ましい。当該誘導体が、フォスフォロチオエート結合
を骨格構造として有する誘導体であると特に好ましい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド誘導体について
も、これらの機能または構造を有する誘導体が含まれ
る。

【００１７】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドお
よびその誘導体の製造方法としては、例えば、天然型の
ＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成し
たり、ＨＥＬ５０ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行う
ことが挙げられる。また、メチルフォスフォネート型や
フォスフォロチオエート型等、誘導体の中には、化学合
成機（例えば、ＡＢＩ社製３９４型）を使用して合成で
きるものもある。この場合には、化学合成機に添付され
ている説明書にしたがって操作を行い、得られた合成産
物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法によ
り精製することによっても、目的のアンチセンスポリヌ
クレオチドまたはその誘導体を得ることができる。

【００１８】本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセ
ンスポリヌクレオチドの全長またはその一部はＨＥＬ５
０遺伝子やＨＥＬ５０ｃＤＮＡあるいはＨＥＬ５０ｍＲ
ＮＡを検出するためのプローブまたはＰＣＲのプライマ
ーとして用いることができる。さて、ヒトの蛋白質の種
類は３×１０⁹ 個といわれている。１６塩基のＤＮＡは
４¹⁶種類存在するので、この長さのＤＮＡがあればヒト
の蛋白質を全て識別できる。すなわち、プローブまたは
プライマーとして必要な長さは理論的には１６塩基であ
る。実用上もこの長さ以上であることが望ましいことは
言うまでもないが、実用的には１２塩基以上で用いられ
ることが多い。また、プローブまたはプライマーとして
用いる箇所は、非コード領域、コード領域のいずれも使
用可能である。ＧＣ含有率が３０ないし７０％であるも
のは、ポリヌクレオチドの立体構造の問題が生じにくく
ハイブリダイズし易いので、好ましい。

【００１９】ＨＥＬ５０遺伝子を検出する方法としては
具体的には、ノーザンブロットハイブリダイゼーション
法やＲＴ−ＰＣＲ法（『ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ』
（ＧｒｅｅｕｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−ＪｕｔｅｒＳｃｉｅ
ｎｃｅ）Ｃｈａｐｔｅｒ１５．１．１−１５．１．９お
よび同書１５．４．１−１５．４．６）またはインサイ
チュハイブリダイゼーション法（同書Ｃｈａｐｔｅｒ１
４．３．１−１４．３．１４）が挙げられる。なお、ハ
イブリダイズの条件は、プローブの長さや使用するメン
ブランにより最適な条件が異なる。つまり、ハイブリダ
イズ条件は自ずから或る幅をもつものである。本発明の
実施例では、使用したメンブランの性質とプローブの長
さにおける最適な条件を開示するものであり、メンブラ
ンやプローブの長さが異なれば当然異なるハイブリダイ
ズ条件でもハイブリダイズし得る。

【００２０】ＤＮＡまたはＲＮＡを化学合成するとき
に、標識すること、ビオチン化すること、側鎖をメチル
化することまたはリン酸基部分のＯをＳに置換すること
等の化学修飾することはよく知られている。例えば、配
列表の配列番号２に記載のＤＮＡを化学合成するとき
に、前記の化学修飾をして、配列表に示されたＤＮＡそ
のものと異なるものを合成することが可能である。ま
た、ｃＤＮＡライブラリーから取得されたｃＤＮＡであ
っても放射性同位体で標識することが可能である。した
がって、本発明のＤＮＡおよびＲＮＡは、上記の化学修
飾されたＤＮＡ、ＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレ
オチドをその範囲に含むものである。本発明の化学修飾
されたＤＮＡまたはＲＮＡは、蛋白質をコードする機能
またはプローブとしての機能いずれも発揮可能なもので
あり、本発明の化学修飾されたアンチセンスポリヌクレ
オチドは、蛋白質の生合成を阻害する機能またはプロー
ブとしての機能いずれも発揮可能なものである。

【００２１】本発明は、ＨＥＬ５０をヒト以外の動物に
免疫感作することにより得られる抗体であって、本発明
のＨＥＬ５０を認識することがウェスタンブロット法、
ＥＬＩＳＡ法や免疫染色法（例えばＦＡＣＳでの測定）
等により確認される抗体をその範囲内に含む。なお、免
疫感作する動物は、免疫原として投与するＨＥＬ５０が
由来する動物以外かつヒト以外の動物から選択すること
が好ましい。例えば、ラットＨＥＬ５０であれば、ラッ
ト以外かつヒト以外の動物（例を挙げれば、ウサギやマ
ウス等）に免疫感作することが好ましい。

【００２２】また、免疫原として、蛋白質の一部分をウ
シ血清アルブミンなどの他のキャリアー蛋白質に結合さ
せたものを用いることは、よく用いられる方法である。
蛋白質の一部分は、例えばペプチド合成機を用いて合成
してもよい。なお、蛋白質の一部分は、８以上のアミノ
酸残基からなるものであることが好ましい。免疫感作し
た動物から採血した血液から免疫グロブリンを精製して
抗血清やポリクローナル抗体が得られるならば、該免疫
した動物のリンパ球をミエローマ細胞等と細胞融合させ
て得られたハイブリドーマによりモノクローナル抗体が
産生されることはよく知られている（『Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ』
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８８）、１４１−１４
７）。

【００２３】本発明の抗体は活性フラグメントをも含
む。活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を有する
抗体のフラグメントを意味し、具体的には、Ｆ（ａ
ｂ′）₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖなどを挙げることが
できる。例えば、本発明の抗体をペプシンで分解する
とＦ（ａｂ’）₂が得られ、パパインで分解するとＦａ
ｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）₂を２−メルカプトエタノ
ールなどの試薬で還元して、モノヨード酢酸でアルキル
化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは重鎖可変領域と軽
鎖可変領域とをリンカーで結合させた一価の抗体活性フ
ラグメントである。これらの活性フラグメントを保持
し、その他の部分を他の動物のフラグメントに置換する
ことでキメラ抗体が得られる。

【００２４】ＨＥＬ５０の検出については、抗体を用い
る方法や抗体と酵素反応とを利用する方法が挙げられ
る。抗体を用いる方法としては具体的には、ＨＥＬ５
０を認識する抗体を用いてＨＥＬ５０を検出する方法、
ＨＥＬ５０を認識する抗体および該抗体の標識二次抗
体を用いてＨＥＬ５０を検出する方法が挙げられる。標
識としては、例えば放射性同位元素（ＲＩ）、酵素、ア
ビジンまたはビオチン、もしくは蛍光物質（ＦＩＴＣや
ローダミン等）が利用される。

【００２５】抗体と酵素反応とを利用する方法として
は、例えば、ＥＬＩＳＡが挙げられる。

【００２６】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこの例に限定されるものではない。＜実施例１＞ＨＥＬ５０ｃＤＮＡの単離およびＨＥＬ５
０のアミノ酸配列の決定Ｉ．ＥＳＴデータベースの検索インターネットのＥＳＴデータベース（ｍＲＮＡの断片
の配列を登録してあるデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｄｂＥＳ
Ｔ）に登録された配列（ＥＳＴ）から、ＴＩＰ４９遺伝
子がコードするアミノ酸配列とホモロジーのあるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を、インターネットのゲノ
ムネットＷＷＷサーバー中のＴＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊ
ｐ）を使用して、ｄｂＥＳＴから検索した。その結果、
Ｒ１９０９１の番号で登録されているＥＳＴおよびＡＡ
３７４５８０の番号で登録されているＥＳＴを抽出し
た。

【００２７】ＩＩ．ＨＥＬ５０ＤＮＡの単離および塩基
配列の決定１．プライマーの合成以下のアンカープライマーならびにＲ１９０９１の塩基
配列から以下のプライマーＰ１およびＡＡ３７４５８０
の塩基配列から以下のプライマーＰ２をＤＮＡ合成機
（ＡＢＩ社製、３９２型）を使用して作製した。アンカープライマー：５’−ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣ
ＣＡ−３’（配列表の配列番号３に記載の塩基配列）Ｐ１：５’−ＧＡＧＡＴＣＣＧＴＧＡＴＧＴＡＡＣＡ
ＡＧＧＡＴＴＧＡＧ−３’（配列表の配列番号４に記
載の塩基配列）Ｐ２：５’−ＣＴＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＡＴ
ＡＧＣＧＴＣＧ−３’（配列表の配列番号５に記載の
塩基配列）合成したプライマーは、蒸留水で２０ｐｍｏｌ／μｌに
調製した。これをＰＣＲプライマーとして用いて、以下
のＰＣＲ操作を行った。

【００２８】２．ＰＣＲｃＤＮＡライブラリーには、マラソン（登録商標）ヒト
肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社製）を用
いて、以下の条件でＰＣＲを行った。まず、プライマー
としてアンカープライマーとＰ２プライマーを使用し、
ＴａｋａｒａＴａｑ（登録商標、宝酒造社製）を使
用して以下の条件で行った。９４℃に１分間おいた。次
いで「９４℃で４５秒間、続いて６０℃で２分間、続い
て７２℃で２分間」のサイクルを３０回繰り返した。そ
の後、４℃に置いてＰＣＲ操作を完了した。ＰＣＲの反
応液の組成は下記の通りとした。０．５ｎｇ／μｌＨＥＬ５０１μｌＴａｑｐｏｌ（宝酒造社製）０．１μｌ１０倍濃度ＰＣＲ緩衝液（宝酒造社製）２μｌｄＮＴＰｍｉｘ（宝酒造社製）１．６μｌアンカープライマー２μｌプライマーＰ２２μｌ滅菌蒸留水１１．３μｌ合計２０μｌ

【００２９】その後、前記で得たＰＣＲ産物を鋳型とし
て、Ｐ１プライマーとＰ２プライマーを用いて２度目の
ＰＣＲ操作を行った。２度目のＰＣＲ操作は、前記と同
様に行った。

【００３０】３．ＤＮＡプローブの作製前記のＰＣＲ操作で増幅したＤＮＡ断片（以降、フラグ
メントＡということがある）をミニゲル電気泳動（０．
７５％アガロースゲル）させて、フラグメントＡのバン
ドをゲルから切り出した。ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（バイオ
１０１社製）でフラグメントＡを回収して、ミニゲル電
気泳動でバンドをチェックした。

【００３１】前記で回収したフラグメントＡを、ｐＧＥ
Ｍ−ＴＥａｓｙ（プロメガ社製）を用いてプラスミド
ベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙに入れた。その後、フ
ラグメントＡを入れたｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙを大腸菌
に導入し、該大腸菌を培養し、現れた白色コロニーの大
腸菌からＭｉｄｉキット（キアゲン社製）を用いてプラ
スミドＤＮＡすなわちフラグメントＡを調製した。この
フラグメントＡについて、ダイターミネーター法によ
り、オートシークエンサー（ＡＢＩ社製、３７３Ａ型）
を用いて、ＤＮＡシークエンスを行い、その塩基配列を
確認した。

【００３２】前記白色コロニーを形成した大腸菌から調
製したフラグメントＡをＥｃｏＲＩで切り出し、得られ
たＤＮＡ断片をランダムラベリングキット（ベーリンガ
マンハイム社製）を使用して、下記の組成の液中に３７
℃に３０分間おいた後、６５℃に１０分間おいて標識し
た。フラグメントＡ９μｌｄＡ，Ｇ，ＴＴＰｍｉｘ（ベーリンガーマンハイム社製）３μｌ反応液ｍｉｘ（ベーリンガーマンハイム社製）２μｌｄ−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（ファルマシアアマシャム社製）５μｌクレノウ液（ベーリンガーマンハイム社製）１μｌ合計２０μｌこの液から標識フラグメントＡをＧ−５０マイクロスピ
ンカラムで精製した。スウィングローターでカラムを３
０００ｒｐｍで１分間回転させ、パッキングを行った。
そのカラムに標識フラグメントＡ液を２０μｌ添加し、
３０００ｒｐｍで２分間カラムを回転させ、Ｔ５０Ｅで
溶出して標識フラグメントＡを分離した。

【００３３】４．ハイブリダイゼーションこのＤＮＡプローブを、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー
λｇｔ１０（クローンテック社製）にハイブリダイズ
させ、該ＤＮＡプローブにハイブリダイズするｃＤＮＡ
をスクローニングした。ハイブリダイズ条件は以下のよ
うにした。プレハイブリダイゼーション６倍ＳＳＣ０．０５倍ＢＬＯＴＴＯ（２．５％脱脂粉乳、０．０１
％アジ化ナトリウム）０．１％ＮＰ４０１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ総液量５０ｍｌ反応温度６０℃ 反応時間１時間ハイブリダイゼーション６倍ＳＳＣ０．０５倍ＢＬＯＴＴＯ０．１％ＮＰ４０１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ１×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌＤＮＡプローブ総液量５０ｍｌ反応温度６０℃ 反応時間１２時間

【００３４】ハイブリダイズの終了したニトロセルロー
ス膜を以下の条件で洗浄した。２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄液で室温で５分間
洗浄することを２回０．２％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄液で室音で１
０分間洗浄することを３回Ｘ線フィルム（富士写真フィルム社製）を洗浄したニト
ロセルロース膜に−８０℃で一晩曝し、オートラジオグ
ラフとした。得られたオートラジオグラフから、陽性の
プラークの位置を決定した。「対応するプラークからフ
ァージを回収してＳＭ溶液に懸濁し、続いてＳＭ溶液か
らファージを回収し、常法により再度ＮＺＹ寒天培地上
にプラーク形成を行わせ、ニトロセルロース膜上に固定
すること」を３回繰り返した。その結果、陽性のプラー
クは単一なものとなった。該プラークからファージを回
収し、１００μｌのＳＭ溶液に懸濁し、ファージを安定
化させた。

【００３５】５．塩基配列の決定該ファージからＥｃｏＲＩでｃＤＮＡを切り出し、得ら
れたｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクタ
ー（ストラタジーン社製）に挿入して、クローニングし
た。クローニングの結果得られたｃＤＮＡをダイターミ
ネーター法により、オートシークエンサー（ＡＢＩ社
製、３７３Ａ型および３１０型）を用いて、ＤＮＡシー
クエンスを行い、その塩基配列を決定した。その結果、
コード領域を全て含むｃＤＮＡであることが分かった。
すなわち全長のＨＥＬ５０ｃＤＮＡが単離され、その塩
基配列が決定された。ＨＥＬ５０ｃＤＮＡの塩基配列を
配列表の配列番号２に示す。なお、ＨＥＬ５０ｃＤＮＡ
を挿入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクターをＨ
ＥＬ５０ＳＫ＋と名付けた。

【００３６】６．ＨＥＬ５０のアミノ酸配列の決定前記５の工程で決定した塩基配列から、ＨＥＬ５０ｃＤ
ＮＡがコードする蛋白質であるＨＥＬ５０のアミノ酸配
列を決定した。結果を配列表の配列番号１に示す。ま
た、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の７７番
目のＧｌｙから８４番目のＴｈｒまでの部分および２９
９番目のＡｓｐから３０２番目のＨｉｓまでの部分が、
ＡＴＰａｓｅおよびＤＮＡヘリケースに特徴的な配列の
部位である。

【００３７】＜実施例２＞ノーザンブロッティング１．プローブの作製配列表の配列番号２に塩基配列を示すＨＥＬ５０ｃＤＮ
Ａの３８７番目のＴから７９６番目のＧまでの部分をＰ
ＣＲにより増幅し、標識してノーザンブロッティングの
プローブとした。以下に操作を示す。（１）プライマーの合成ＨＥＬ５０の塩基配列から以下のプライマーＰ３および
プライマーＰ４をＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製、３９２
型）を使用して作製した。Ｐ３：５’−ＴＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣ
−３’（配列表の配列番号６に記載の塩基配列）Ｐ４：５’−ＣＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＧ−
３’（配列表の配列番号７に記載の塩基配列）合成したプライマーは、蒸留水で２０ｐｍｏｌ／μｌに
調製した。これをＰＣＲプライマーとして用いて、以下
のＰＣＲ操作を行った。

【００３８】（２）ＰＣＲＨＥＬ５０ｃＤＮＡが導入されたベクターＨＥＬ５０Ｓ
Ｋ＋をＰＣＲの鋳型とし、プライマーＰ３およびプライ
マーＰ４を使用して、ＴａｋａｒａＴａｑｐｏｌ（登
録商標、宝酒造社製）を使用して以下の条件で行った。
９４℃に１分間おいた。次いで「９４℃で４５秒間、続
いて６０℃で２分間、続いて７２℃で２分間」のサイク
ルを３０回繰り返した。その後、４℃に置いてＰＣＲ操
作を完了した。ＰＣＲの反応液の組成は下記の通りとし
た。０．５ｎｇ／μｌＨＥＬ５０ＳＫ＋１μｌＴａｑｐｏｌ（宝酒造社製）０．１μｌ１０倍濃度ＰＣＲ緩衝液（宝酒造社製）２μｌｄＮＴＰｍｉｘ（宝酒造社製）１．６μｌプライマーＰ３２μｌプライマーＰ４２μｌ滅菌蒸留水１１．３μｌ合計２０μｌＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲル上で電気泳動し
た。ゲルからＰＣＲ産物（以下、フラグメントＢとい
う）を切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（バイオ１０１社
製）でフラグメントＢを回収して、ミニゲル電気泳動で
バンドをチェックした。その結果、フラグメントＢのＤ
ＮＡ液の濃度は、２５ｎｇ／μｌと推定された。

【００３９】（３）標識フラグメントＢのＤＮＡ液５μｌに滅菌蒸留水４μｌを
加えて９８℃に１０分間おいた。その後、氷上で冷却
し、フラグメントＢを変性させた。この変性フラグメン
トＢをランダムラベリングキット（ベーリンガーマンハ
イム社製）を使用して、下記の組成の液中に３７℃に３
０分間おいた後、６５℃に１０分間おいて標識した。変性フラグメントＢ９μｌｄＡ，Ｇ，ＴＴＰｍｉｘ（ベーリンガーマンハイム社製）３μｌ反応液ｍｉｘ（ベーリンガーマンハイム社製）２μｌｄ−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（ファルマシアアマシャム社製）５μｌクレノウ液（ベーリンガーマンハイム社製）１μｌ合計２０μｌこの液から標識フラグメントＢをＧ−５０マイクロスピ
ンカラムで精製した。スウィングローターでカラムを３
０００ｒｐｍで１分間回転させ、パッキングを行った。
そのカラムに標識フラグメントＢ液を２０μｌ添加し、
３０００ｒｐｍで２分間カラムを回転させ、Ｔ５０Ｅで
溶出して標識フラグメントＢを分離した。

【００４０】２．ハイブリダイゼーション（１）プレハイブリダイゼーションｍＲＮＡを固定したメンブラン（ヒトＭＴＮ（登録商
標）ブロットＩＩ（クローンテック社製）、ラットＭＴ
Ｎ（登録商標）Ｎｏ．３（クローンテック社製）および
マウス胎児（クローンテック社製））を、下記組成のハ
イブリダイゼーション液１０ｍｌに入れて、４２℃で１
５０分おき、変性サケ精子ＤＮＡでメンブラン上をブロ
ッキングした。ハイブリダーゼーション液５倍濃度ＳＳＰＥ１０倍濃度Ｄｅｎｈａｒｔｄ’ｓ液２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ

【００４１】（２）ハイブリダイゼーション前記ハイブリダイゼーション液２０ｍｌに標識フラグメ
ントＢ液を７μｌ加え、よくかき混ぜた。角形シャーレ
にハイブリダイゼーション液を５ｍｌずつ加え、上記メ
ンブランをシャーレに１枚ずつ入れ、各メンブランの上
にビニールシートを置き、４２℃で一晩（約１５時間）
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション液を捨
て、洗浄液（２倍濃度ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）をシ
ャーレに加え、室温で５分間洗浄することを４回繰り返
した。

【００４２】（３）オートラジオグラムこのメンブランを放射線感光紙に１６時間さらして、オ
ートラジオグラフを取った。ヒトＭＴＮメンブランにつ
いての結果を図１に示す。ヒト各組織でＨＥＬ５０ｍＲ
ＮＡが発現していたが、精巣での発現が最も多かった。
ラットのｍＲＮＡおよびマウスのｍＲＮＡにもフラグメ
ントＢがハイブリダイズし、ラットについてもヒトと同
様の結果であった。マウス胎児でもＨＥＬ５０ｍＲＮＡ
の発現がみられ、一番多く発現しているのは胎生１１日
目のマウス胎児であることが観察された。

【００４３】＜実施例３＞ＨＥＬ５０の大量調整１．ＨＥＬ５０ｃＤＮＡの大量調整１）組み換えベクターの作製ＨＥＬ５０ｃＤＮＡの第一メチオニン部分をＥｃｏＲＩ
サイトが隣接するようにＰＣＲで改変し、図２に示すｐ
ＥＴＦＬＡＧ−ＨｉｓベクターのＥｃｏＲＩサイトに
組み込んだ。ＨＥＬ５０ｃＤＮＡを組み込んだベクター
をＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）に、取扱
説明書に従って導入し、８００ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地で一晩培養し、回収したＪＭ１０９コンピテ
ントセルからアルカリ法（前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、１．
３３−１．４３ページに記載の方法）によりベクターを
回収した。ベクターの回収のための超遠心分離は３回行
った。

【００４４】２．ＨＥＬ５０の発現１）大量調製したベクターを大腸菌ＢＬ２１ｐＬｙｓ
Ｓ（ノバジェン社製）に導入した。２）得られた大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを
含むＬＢ培地で培養し、分光光度計（ベックマン社製）
で６００ｎｍの波長における濁度が０．６から０．７に
なった時点でＩＰＴＧを０．１ｍＭになるように加え、
ＨＥＬ５０の発現誘導を行った。

【００４５】３．ＨＥＬ５０の精製１）２時間後、大腸菌を回収し、下記組成の溶解液３０
ｍｌで懸濁した。得られた懸濁液を４℃で超音波処理
し、超遠心分離器および４５Ｔｉロータ（いずれもベッ
クマン社製）を使用して５００００ｒｐｍ、４℃で１時
間超遠心分離した。溶解液組成：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９１０％グリセロール０．５ＭＮａＣｌ０．１％ＮＰ４０５ｍＭ２−メルカプトエタノール（ＭＥ）１ｍＭＰＭＳＦ

【００４６】２）得られた上清を取り、１Ｍイミダゾー
ル（ｐＨ７．５）を終濃度１ｍＭになるように加え、Ｎ
ｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン社製）を用いて
非変性条件で取扱説明書に従って精製した。カラムのベ
ッドボリュームは、１ｍｌとした。カラムは、下記組成
の第一洗浄液３０ｍｌで洗浄した後、下記組成の第二洗
浄液５ｍｌで洗浄した。第一洗浄液組成：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９１０％グリセロール０．１ＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ０．５ｍＭＰＭＳＦ２０ｍＭイミダゾール第二洗浄液組成：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９１０％グリセロール０．１ＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ０．５ｍＭＰＭＳＦ４０ｍＭイミダゾール

【００４７】溶出時には、下記組成の溶出液を１ｍｌず
つ５回カラムに流した。溶出液組成：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９１０％グリセロール０．１ＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ０．５ｍＭＰＭＳＦ２００ｍＭイミダゾール

【００４８】３）溶出されたＨＥＬ５０画分を下記組成
のリン酸緩衝液１で透析した後、ＨＡＰ（ハイドロキシ
アパタイト）カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用し
て、ＦＰＬＣシステムを使用して、リン酸緩衝液１およ
び下記組成のリン酸緩衝液２により０．０１−０．３Ｍ
のグラジエントで精製した。ベッドボリュームは２ｍｌ
とした。リン酸緩衝液１組成：１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２５０ｍＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ１０％グリセロールリン酸緩衝液２組成：３００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２５０ｍＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ１０％グリセロール

【００４９】４）溶出されたＨＥＬ５０画分を下記組成
の塩化カリウム緩衝液１で透析した後、イオン交換カラ
ムＭｏｎｏＱ（登録商標、ファルマシアアマシャム社
製）を使用して、ＦＰＬＣシステムを使用して、塩化カ
リウム緩衝液１および下記組成の塩化カリウム緩衝液２
により０．０５−０．５Ｍのグラジエントで精製した。
ベッドボリュームは１ｍｌとした。塩化カリウム緩衝液１組成：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９１０％グリセロール５０ｍＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ０．５ｍＭＰＭＳＦ塩化カリウム緩衝液２組成：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９１０％グリセロール０．５ＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ０．５ｍＭＰＭＳＦ

【００５０】５）溶出されたＨＥＬ５０画分を下記組成
のＢＣ１００で透析して、−８０℃で保存した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９２０％グリセロール０．１ＭＫＣｌ５ｍＭ２−ＭＥ０．５ｍＭＰＭＳＦ精製した蛋白質の電気泳動（クマシー染色）の結果を図
３に示す。いずれの画分にも５０ｋＤの位置にＨＥＬ５
０のバンドが確認された（タグの分だけやや大きめの位
置にバンドが現れている）。

【００５１】＜実施例４＞ヘリケース活性の測定１．基質の作製３０塩基（ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（配列表の配列番号８に記載
の塩基配列））からなる一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ合成機を
使用して合成した。その５’末端をＴａｋａｒａＭＥ
ＧＡＬＡＢＥＬ（登録商標）キット（宝酒造社製）を
使用して、取扱説明書に従って下記の組成の液中に３７
℃で３０分間おいた後、７０℃に５分間おいて標識し
た。５ｐｍｏｌ／μｌ一本鎖ＤＮＡ２μｌ１０倍濃度リン酸化緩衝液（キットに付属のもの）１μｌ γ−³²ＰＡＴＰ（ファルマシアアマシャム社製）５μｌＴ４キナーゼ（宝酒造社製）１μｌ滅菌蒸留水１μｌ合計１０μｌ

【００５２】この標識した一本鎖ＤＮＡに、Ｍ１３ｍｐ
１８ｓｓＤＮＡ（宝酒造社製）を２μｇ加えて、７５
℃に１０分間、続いて３７℃に１時間おいて両者をハイ
ブリダイズさせ、標識ＤＮＡを作製した。ハイブリダイ
ズした標識ＤＮＡをマイクロスピンカラムＳ４００ＨＲ
（ファルマシアアマシャム社製）を使用して精製した。
まず、スウィングローターでカラムを３０００ｒｐｍで
１分間回転させ、パッキングを行った。そのカラムに前
記標識ＤＮＡ液を全量（約１２μｌ）添加し、３０００
ｒｐｍで２分間カラムを回転させ、標識ＤＮＡを分離し
た。得られた標識ＤＮＡを基質として以下の操作に用い
た。

【００５３】２．ヘリケース活性の測定実施例３で得られたＭｏｎｏＱの溶出画分のうち、第３
２、３５、３８、４１、４４、４７、５０番の各画分に
ついて、以下の操作を行い、各画分に含まれるＨＥＬ５
０のヘリケース活性を測定した。前記１の工程で作製し
た基質０．２μｌ（約３０００ｃｐｍに相当）と、各Ｍ
ｏｎｏＱ溶出画分またはＢＣ１００（コントロール）２
μｌとを下記組成の反応液に加え、３７℃に３０分間お
いて反応させた。反応液（滅菌蒸留水で２０μｌに調製した。）２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５２ｍＭＤＴＴ５０μｇ／μｌＢＳＡ１ｍＭＭｇＣｌ₂ ８０ｍＭＫＣｌ１ｍＭＡＴＰその後、５μｌの下記組成の停止液を加え、反応を停止
させた。６０ｍＭＥＤＴＡ０．７５％ＳＤＳ０．１％ＢＰＢ５０％グリセロール

【００５４】反応液を１０％アクリルアミド／０．５倍
濃度ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ／ＥＤＴＡ）ゲル
上に１５μｌずつのせ、１００Ｖの電圧をかけて電気泳
動した。電気泳動終了後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィル
ム（富士写真フィルム社製）を前記ゲルに一晩曝し、オ
ートラジオグラフを取った。

【００５５】結果を図４に示す。レーン１とレーン２は
対照（コントロール）である。レーン１はＭｏｎｏＱ溶
出画分の代わりにＢＣ１００を添加したもの（ネガティ
ブコントロール）であり、レーン２はＢＣ１００を添加
して反応させた後３分間沸騰させたもの（ポジティブコ
ントロール）である。図中、３２ないし５０の数字がふ
られたレーンは当該数字のＭｏｎｏＱ溶出画分である。
各ＭｏｎｏＱ溶出画分はポジティブコントロール（レー
ン２）と同じ位置にバンドが検出された。４１画分およ
び４４画分は特に強くバンドが現れ、これらの画分に含
まれるＨＥＬ５０は特にヘリケース活性が大きいことが
確認された。

【００５６】＜実施例５＞ヘリケース活性の方向性１．方向性基質の調製以下の操作を行い方向性基質を作製した。この概要を図
５に示す。図５中、☆は該部分が標識されていることを
示す。１）５’末端標識プローブの作製５４塩基（ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴ
ＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣ
ＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴ（配列表の配列番号９に
記載の塩基配列））からなる一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ合成
機を使用して合成した。その５’末端をＴａｋａｒａ
ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（登録商標）キット（宝酒造社
製）を使用して、取扱説明書に従って下記の組成の液中
に３７℃で３０分間おいた後、７０℃に５分間おいて標
識した。その後、ＴＥを１０μｌ加えた。５ｐｍｏｌ／μｌ一本鎖ＤＮＡ１μｌ１０倍リン酸化緩衝液（キットに付属のもの）１μｌ γ−³²ＰＡＴＰ（ファルマシアアマシャム社製）５μｌＴ４キナーゼ（宝酒造社製）１μｌ滅菌蒸留水２μｌ合計１０μｌ２）３’末端標識プローブの作製配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなる一本鎖Ｄ
ＮＡをＤＮＡ合成機を使用して合成し、その３’末端を
ＴｄＴキット（和光純薬社製）を使用して、取扱説明書
に従って下記の組成の液中に３７℃で３０分間おいた
後、７０℃に５分間おいて標識した。５ｐｍｏｌ／μｌ一本鎖ＤＮＡ１μｌ５倍ＴｄＴ緩衝液（キットに付属のもの）４μｌ α−³²ＰｄｄＡＴＰ（ファルマシアアマシャム社製）５μｌＴｄＴ１μｌ滅菌蒸留水９μｌ合計２０μｌ

【００５７】３）標識した一本鎖ＤＮＡそれぞれに、Ｍ
１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ（宝酒造社製）を２μｇ加え
て、７５℃に５分間、続いて３７℃に１時間から２時間
おいて両者をハイブリダイズさせ、標識ＤＮＡを作製し
た。４）ハイブリダイズした標識ＤＮＡをマイクロスピンカ
ラムＳ４００ＨＲ（ファルマシアアマシャム社製）を使
用して、実施例４の場合と同様に精製した。５）精製した標識ＤＮＡを以下の組成の反応液中に３７
℃で２時間おきＳｍａＩサイトで標識ＤＮＡ開裂した。標識ＤＮＡ溶液１５μｌ１０倍Ｔ緩衝液（ＳｍａＩ酵素に付属のもの）３μｌＢＳＡ３μｌＳｍａＩ酵素（宝酒造社製）２μｌ滅菌蒸留水７μｌ合計３０μｌ６）開裂した標識ＤＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ₃に溶
かし、エタノール沈殿させた。沈殿物を１０μｌのＴＥ
に溶かし、ヘリケース活性測定の基質として用いた。

【００５８】２．ヘリケース活性測定実施例４と同様の操作で、上記で作製した各基質１μｌ
ずつを、それぞれヒトＨＥＬ５０またはラットＴＩＰ４
９で分解し、反応液を電気泳動した。結果を図６に示
す。レーン１および５はポジティブコントロール、レー
ン２および６はネガティブコントロールである。レーン
３および７がＨＥＬ５０であり、レーン４および８がＴ
ＩＰ４９である。３０ｂの位置にバンドが現れるのは
３’末端から５’末端方向にヘリーケスが作用する場合
であり、２４ｂの位置にバンドが現れるのは５’末端か
ら３’末端方向にヘリケースが作用する場合である。図
６からＨＥＬ５０はヘリケース活性の方向性が５’末端
から３’末端であることが分かる。一方、ＴＩＰ４９の
ヘリケース活性の方向性は３’末端から５’末端であっ
た。

【００５９】＜実施例６＞酵母ＨＥＬ５０のクローニン
グＩ．データベースの検索ＨＥＬ５０とホモロジーを有する酵母のＤＮＡの塩基配
列を、インターネットのゲノムネットＷＷＷサーバー中
のＴＢＬＡＳＴＸ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌａｓ
ｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ）を使用して、検索し
た。その結果、ＹＰＬ２３５ｗの番号で登録されている
塩基配列が抽出された。この塩基配列から以下のプライ
マーをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製、３９２型）を使用し
て作製した。プライマーＹ１（メチオニン側）：５’−ＣＧＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧＴＣＧＡＴＴＣＡＡＡＣＴＡＧＴＧ−
３’（配列表の配列番号１０に記載の塩基配列）プライマーＹ２（３’末端側）：５’−ＣＧＧＡＡＴＴ
ＣＴＴＡＴＴＣＣＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＴＧＧＣ
（配列表の配列番号１１に記載の塩基配列）これをＰＣＲプライマーとして用いて、以下のＰＣＲ操
作を行った。

【００６０】２．ＰＣＲ酵母ゲノム（国立遺伝学研究所から入手）を鋳型として
用いて、ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用し
て、以下の条件でＰＣＲを行った。９５℃に５分間おい
た。次いで「９４℃で３０秒間、続いて５５℃で３０秒
間、続いて７２℃で１分間」のサイクルを４５回繰り返
した。その後、７２℃に５分間おいた後、４℃において
ＰＣＲ操作を完了した。ＰＣＲの反応液の組成は下記の
通りとした。酵母ゲノム５００ｎｇプライマーＹ１１０ｐｍｏｌプライマーＹ２１０ｐｍｏｌＫＯＤｐｏｌ（東洋紡社製）２μｌ１０倍濃度ＰＣＲ緩衝液（東洋紡社製）５μｌ２ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ（東洋紡社製）５μｌ２５ｍＭＭｇＣｌ₂ ２μｌ滅菌蒸留水で５０μｌに調製した。

【００６１】その後、前記で得たＰＣＲ産物を、制限酵
素を使用してＥｃｏＲＩサイトで切断してＤＮＡ断片を
得た。得られたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩ
ＩＳＫ＋のＥｃｏＲＩサイトに挿入してサブクローニン
グした。その結果得られたＤＮＡ断片について、ダイタ
ーミネーター法により、オートシークエンサー（ＡＢＩ
社製、３７３Ａ型）を用いて、ＤＮＡシークエンスを行
い、その塩基配列を決定した。この塩基配列が酵母ＨＥ
Ｌ５０ｃＤＮＡの塩基配列である。この塩基配列を配列
表の配列番号１３に示す。また、この塩基配列から決定
されたアミノ酸配列が酵母ＨＥＬ５０のアミノ酸配列で
ある。このアミノ酸配列を配列表の配列番号１２に示
す。決定された塩基配列は、酵母のゲノムとしてＹＰＬ
２３５ｗの番号でデータベースに登録されている塩基配
列全く同じであった。

【００６２】ヒトＨＥＬ５０と酵母ＨＥＬ５０とのホモ
ロジーは、全体を通じては６５％、ウォーカーＡモチー
フ（配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の７７番
目のＧｌｙから８４番目のＴｈｒまでの部分）では６９
％、ウォーカーＢモチーフ（配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸配列の２９９番目のＡｓｐから３０２番目の
Ｈｉｓまでの部分）では７１％であった。ヒトＴＩＰ４
９とヒトＨＥＬ５０のホモロジーが４１％であるので、
真核生物におけるヒトＨＥＬ５０と酵母ＨＥＬ５０のホ
モロジーは、ヒトＨＥＬ５０とヒトＴＩＰ４９とのホモ
ロジーよりもはっきりと高い。真核生物のＨＥＬ５０は
ヒトＨＥＬ５０とのホモロジーが６５％以上であると考
えられる。他の真核生物のＨＥＬ５０ｃＤＮＡも、目的
とする種の真核生物のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ
により適当なプローブを作製し、そのプローブを使用し
たプラークハイブリダイゼーション法により単離するこ
とができると考えられる。また、酵母ＨＥＬ５０のクロ
ーニングで例示したようにＰＣＲにより完全長のｃＤＮ
Ａを得ることもできる。ＰＣＲやハイブリダイゼーショ
ンの条件は、すでに示した条件を参考に決定できる。

【００６３】

【発明の効果】本発明のＨＥＬ５０およびＨＥＬ５０変
異体はヘリケースとして使用可能である。

【００６４】本発明のＨＥＬ５０ＤＮＡまたはＨＥＬ５
０ｍＲＮＡは、それを適当な宿主に導入し、得られた形
質転換体を培養することによりＨＥＬ５０を製造するこ
とに利用できる。ＨＥＬ５０変異体をコードするＤＮＡ
またはｍＲＮＡについても、同様にＨＥＬ５０変異体を
製造することに利用できる。

【００６５】連続する１２塩基以上からなるＨＥＬ５０
をコードするポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌク
レオチドを含む）は、プローブとしてＨＥＬ５０の発現
を調べるのに利用できる。また、ＰＣＲのプライマーと
して使用できる。アンチセンスポリヌクレオチドは、Ｈ
ＥＬ５０の生合成を阻害することにも利用できる。ＨＥ
Ｌ５０変異体をコードするポリヌクレオチド（アンチセ
ンスポリヌクレオチドを含む）についても同様である。

【００６６】本発明のＨＥＬ５０を認識する抗体は、Ｈ
ＥＬ５０の検出や精製に利用できる。精製のためには、
抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティークロ
マトグラフィーや、免疫沈降法が利用できる

【００６７】本発明のＨＥＬ５０は、その一部において
ＴＩＰ４９との相同性があるので、ＴＢＰとの相互作用
があると考えられる。ＴＢＰは生物の全遺伝子の転写に
関わっているので、本発明のＨＥＬ５０、ＨＥＬ５０を
コードするポリヌクレオチド、ＨＥＬ５０を認識する抗
体によりＴＢＰの転写制御機能の究明の一手段が供せら
れることが強く期待できる。

【００６８】ある種の遺伝病はヘリケースの異常が原因
することが知られている。したがって、本発明のポリヌ
クレオチドはプローブとして、あるいはＰＣＲのプライ
マーとしてそのような遺伝病の診断に利用できることが
期待できる。また、本発明の抗体を遺伝病の診断に利用
できることが期待できる。また、本発明のＨＥＬ５０や
ポリヌクレオチドや抗体を利用して、ヘリケースの異常
を回復すること、すなわち前記遺伝病を治療することが
期待できる。

【００６９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Electric Industries,Ltd. <120> DNA helicase <130> 098Y0518 <160> 13 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 1 Met Ala Thr Val Thr Ala Thr Thr Lys Val Pro Glu Ile Arg Asp Val 1 5 10 15 Thr Arg Ile Glu Arg Ile Gly Ala His Ser His Ile Arg Gly Leu Gly 20 25 30 Leu Asp Asp Ala Leu Glu Pro Arg Gln Ala Ser Gln Gly Met Val Gly 35 40 45 Gln Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ala Gly Val Val Leu Glu Met Ile Arg 50 55 60 Glu Gly Lys Ile Ala Gly Arg Ala Val Leu Ile Ala Gly Gln Pro Gly 65 70 75 80 Thr Gly Lys Thr Ala Ile Ala Met Gly Met Ala Gln Ala Leu Gly Pro 85 90 95 Asp Thr Pro Phe Thr Ala Ile Ala Gly Ser Glu Ile Phe Ser Leu Glu 100 105 110 Met Ser Lys Thr Glu Ala Leu Thr Gln Ala Phe Arg Arg Ser Ile Gly 115 120 125 Val Arg Ile Lys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Glu Gly Glu Val Val Glu 130 135 140 Ile Gln Ile Asp Arg Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ser Lys Val Gly Lys 145 150 155 160 Leu Thr Leu Lys Thr Thr Glu Met Glu Thr Ile Tyr Asp Leu Gly Thr 165 170 175 Lys Met Ile Glu Ser Leu Thr Lys Asp Lys Val Gln Ala Gly Asp Val 180 185 190 Ile Thr Ile Asp Lys Ala Thr Gly Lys Ile Ser Lys Leu Gly Arg Ser 195 200 205 Phe Thr Arg Ala Arg Asp Tyr Asp Ala Met Gly Ser Gln Thr Lys Phe 210 215 220 Val Gln Cys Pro Asp Gly Glu Leu Gln Lys Arg Lys Glu Val Val His 225 230 235 240 Thr Val Ser Leu His Glu Ile Asp Val Ile Asn Ser Arg Thr Gln Gly 245 250 255 Phe Leu Ala Leu Phe Ser Gly Asp Thr Gly Glu Ile Lys Ser Glu Val 260 265 270 Arg Glu Gln Ile Asn Ala Lys Val Ala Glu Trp Arg Glu Glu Gly Lys 275 280 285 Ala Glu Ile Ile Pro Gly Val Leu Phe Ile Asp Glu Val His Met Leu 290 295 300 Asp Ile Glu Ser Phe Ser Phe Leu Asn Arg Ala Leu Glu Ser Asp Met 305 310 315 320 Ala Pro Val Leu Ile Met Ala Thr Asn Arg Gly Ile Thr Arg Ile Arg 325 330 335 Gly Thr Ser Tyr Gln Ser Pro His Gly Ile Pro Ile Asp Leu Leu Asp 340 345 350 Arg Leu Leu Ile Val Ser Thr Thr Pro Tyr Ser Glu Lys Asp Thr Lys 355 360 365 Gln Ile Leu Arg Ile Arg Cys Glu Glu Glu Asp Val Glu Met Ser Glu 370 375 380 Asp Ala Tyr Thr Val Leu Thr Arg Ile Gly Leu Glu Thr Ser Leu Arg 385 390 395 400 Tyr Ala Ile Gln Leu Ile Thr Ala Ala Ser Leu Val Cys Arg Lys Arg 405 410 415 Lys Gly Thr Glu Val Gln Val Asp Asp Ile Lys Arg Val Tyr Ser Leu 420 425 430 Phe Leu Asp Glu Ser Arg Ser Thr Gln Tyr Met Lys Glu Tyr Gln Asp 435 440 445 Ala Phe Leu Phe Asn Glu Leu Lys Gly Glu Thr Met Asp Thr Ser 450 455 460 <210> 2 <211> 1512 <212> DNA <213> Homo sapience <220> <221> CDS <222> (1)...(1389) <400> 2 atg gca acc gtt aca gcc aca acc aaa gtc ccg gag atc cgt gat gta 48 aca agg att gag cga atc ggt gcc cac tcc cac atc cgg gga ctg ggg 96 ctg gac gat gcc ttg gag cct cgg cag gct tcg caa ggc atg gtg ggt 144 cag ctg gcg gca cgg cgg gcg gct ggc gtg gtg ctg gag atg atc cgg 192 gaa ggg aag att gcc ggt cgg gca gtc ctt att gct ggc cag ccg ggc 240 acg ggg aag acg gcc atc gcc atg ggc atg gcg cag gcc ctg ggc cct 288 gac acg cca ttc aca gcc atc gcc ggc agt gaa atc ttc tcc ctg gag 336 atg agc aag acc gag gcg ctg acg cag gcc ttc cgg cgg tcc atc ggc 384 gtt cgc atc aag gag gag acg gag atc atc gaa ggg gag gtg gtg gag 432 atc cag att gat cga cca gca aca ggg acg ggc tcc aag gtg ggc aaa 480 ctg acc ctc aag acc aca gag atg gag acc atc tac gac ctg ggc acc 528 aag atg att gag tcc ctg acc aag gac aag gtc cag gcc ggg gac gtg 576 atc acc atc gac aag gcg acg ggc aag atc tcc aag ctg ggc cgc tcc 624 ttc aca cgc gcc cgc gac tac gac gct atg ggc tcc cag acc aag ttc 672 gtg cag tgc cca gat ggg gag ctc cag aaa cgc aag gag gtg gtg cac 720 acc gtg tcc ctg cac gag atc gac gtc atc aac tct cgc acc cag ggc 768 ttc ctg gcg ctc ttc tca ggt gac aca ggg gag atc aag tca gaa gtc 816 cgt gag cag atc aat gcc aag gtg gct gag tgg cgc gag gag ggc aag 864 gcg gag atc atc cct gga gtg ctg ttc atc gac gag gtc cac atg ctg 912 gac atc gag agc ttc tcc ttc ctc aac cgg gcc ctg gag agt gac atg 960 gcg cct gtc ctg atc atg gcc acc aac cgt ggc atc acg cga atc cgg 1008 ggc acc agc tac cag agc cct cac ggc atc ccc ata gac ctg ctg gac 1056 cgg ctg ctt atc gtc tcc acc acc ccc tac agc gag aaa gac acg aag 1104 cag atc ctc cgc atc cgg tgc gag gaa gaa gat gtg gag atg agt gag 1152 gac gcc tac acg gtg ctg acc cgc atc ggg ctg gag acg tca ctg cgc 1200 tac gcc atc cag ctc atc aca gct gcc agc ttg gtg tgc cgg aaa cgc 1248 aag ggt aca gaa gtg cag gtg gat gac atc aag cgg gtc tac tca ctc 1296 ttc ctg gac gag tcc cgc tcc acg cag tac atg aag gag tac cag gac 1344 gcc ttc ctc ttc aac gaa ctc aaa ggc gag acc atg gac acc tcc tga 1392 gttggatgtc atcccccgac cccaccctgt tttccaccag agttctgaca ctgtgactct 1452 gtataaaatg gttgggaagc tgcaaaaaaa aaaaaaaaaa 1512 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctggttcggc cca 13 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gagatccgtg atgtaacaag gattgag 27 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cttggtctgg gagcccatag cgtcg 25 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tcgcatcaag gaggagac 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ctgagaagag cgccagg 17 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequemce <220> <223> Synthesized DNA <400> 8 cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt 30 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequemce <220> <223> Synthesized DNA <400> 9 ATGCCTGCAG GTCGACTCTA GAGGATCCCC GGGTACCGAG CTCGAATTCG TAAT 54 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 CGGAATTCAT GTCGATTCAA ACTAGTG 27 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 CGGAATTCTT ATTCCGTAGT ATCCATGGC 29 <210> 12 <211> 471 <212> PRT <213> Yeast <400> 12 Met Ser Ile Gln Thr Ser Asp Pro Asn Glu Thr Ser Asp Leu Lys Ser 5 10 15 Leu Ser Leu Ile Ala Ala His Ser His Ile Thr Gly Leu Gly Leu Asp 20 25 30 Glu Asn Leu Gln Pro Arg Pro Thr Ser Glu Gly Met Val Gly Gln Leu 35 40 45 Gln Ala Arg Arg Ala Ala Gly Val Ile Leu Lys Met Val Gln Asn Gly 50 55 60 Thr Ile Ala Gly Arg Ala Val Leu Val Ala Gly Pro Pro Ser Thr Gly 65 70 75 80 Lys Thr Ala Leu Ala Met Gly Val Ser Gln Ser Leu Gly Lys Asp Val 85 90 95 Pro Phe Thr Ala Ile Ala Gly Ser Glu Ile Phe Ser Leu Glu Leu Ser 100 105 110 Lys Thr Glu Ala Leu Thr Gln Ala Phe Arg Lys Ser Ile Gly Ile Lys 115 120 125 Ile Lys Glu Glu Thr Glu Leu Ile Glu Gly Glu Val Val Glu Ile Gln 130 135 140 Ile Asp Arg Ser Ile Thr Gly Gly His Lys Gln Gly Lys Leu Thr Ile 145 150 155 160 Lys Thr Thr Asp Met Glu Thr Ile Tyr Glu Leu Gly Asn Lys Met Ile 165 170 175 Asp Gly Leu Thr Lys Glu Lys Val Leu Ala Gly Asp Val Ile Ser Ile 180 185 190 Asp Lys Ala Ser Gly Lys Ile Thr Lys Leu Gly Arg Ser Phe Ala Arg 195 200 205 Ser Arg Asp Tyr Asp Ala Met Gly Ala Asp Thr Arg Phe Val Gln Cys 210 215 220 Pro Glu Gly Glu Leu Gln Lys Arg Lys Thr Val Val His Thr Val Ser 225 230 235 240 Leu His Glu Ile Asp Val Ile Asn Ser Arg Thr Gln Gly Phe Leu Ala 245 250 255 Leu Phe Thr Gly Asp Thr Gly Glu Ile Arg Ser Glu Val Arg Asp Gln 260 265 270 Ile Asn Thr Lys Val Ala Glu Trp Lys Glu Glu Gly Lys Ala Glu Ile 275 280 285 Val Pro Gly Val Leu Phe Ile Asp Glu Val His Met Leu Asp Ile Glu 290 295 300 Cys Phe Ser Phe Ile Asn Arg Ala Leu Glu Asp Glu Phe Ala Pro Ile 305 310 315 320 Val Met Met Ala Thr Asn Arg Gly Val Ser Lys Thr Arg Gly Thr Asn 325 330 335 Tyr Lys Ser Pro His Gly Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asp Arg Ser Ile 340 345 350 Ile Ile Thr Thr Lys Ser Tyr Asn Glu Gln Glu Ile Lys Thr Ile Leu 355 360 365 Ser Ile Arg Ala Gln Glu Glu Glu Val Glu Leu Ser Ser Asp Ala Leu 370 375 380 Asp Leu Leu Thr Lys Thr Gly Val Glu Thr Ser Leu Arg Tyr Ser Ser 385 390 395 400 Asn Leu Ile Ser Val Ala Gln Gln Ile Ala Met Lys Arg Lys Asn Asn 405 410 415 Thr Val Glu Val Glu Asp Val Lys Arg Ala Tyr Leu Leu Phe Leu Asp 420 425 430 Ser Ala Arg Ser Val Lys Tyr Val Gln Glu Asn Glu Ser Gln Tyr Ile 435 440 445 Asp Asp Gln Gly Asn Val Gln Ile Ser Ile Ala Lys Ser Ala Asp Pro 450 455 460 Asp Ala Met Asp Thr Thr Glu 465 470 <210> 13 <211> 1416 <212> DNA <213> Yeast <220> <221> CDS <222> (1)...(1413) <400> 13 atg tcg att caa act agt gat cca aat gaa aca tca gat tta aag tcg 48 tta tct tta att gct gcc cac tcc cat att aca ggt tta ggt cta gat 96 gaa aac ttg caa cca cgt ccc aca tcc gaa ggt atg gtt ggg caa ttg 144 caa gcc cgt cgt gct gct ggt gtg ata ttg aaa atg gtt caa aat ggc 192 acc ata gca ggt agg gct gtt ttg gta gcg ggc ccc cct tca act ggt 240 aag acc gct ctt gcc atg ggt gtt tcc cag tct ctg ggt aaa gat gta 288 cca ttc act gct att gcg ggc tca gaa atc ttt tct tta gaa ttg agt 336 aaa act gaa gca cta act caa gct ttt agg aaa tcc atc ggt atc aaa 384 atc aag gag gag aca gaa ttg att gaa ggt gaa gtc gtg gaa att caa 432 att gat aga tct att act ggt gga cac aaa caa gga aaa ttg act att 480 aaa act acc gat atg gaa aca att tat gaa tta ggc aat aaa atg att 528 gat ggc cta act aaa gaa aag gta ttg gct ggc gat gtt att tct att 576 gat aaa gct agt ggg aag att acc aag cta ggc aga tcc ttt gct aga 624 tct agg gat tat gat gcc atg ggt gct gat acc aga ttt gtt caa tgt 672 ccg gaa ggc gaa ctg caa aaa agg aaa aca gtg gtt cac acg gtg tca 720 ctg cat gaa att gat gtt att aat tca aga aca caa gga ttt ttg gca 768 tta ttt act ggt gac acc ggt gaa att agg tca gag gta aga gac cag 816 ata aac aca aaa gtg gca gaa tgg aaa gaa gaa ggt aaa gca gaa att 864 gtt cct ggt gta tta ttt atc gac gaa gtc cac atg ttg gat ata gaa 912 tgt ttt tcc ttt ata aat agg gct ttg gaa gat gag ttt gcc cca atc 960 gtc atg atg gct aca aat aga gga gtt tcc aaa acc aga ggg act aat 1008 tac aaa tct cca cat ggg tta cct ctc gat ctt ttg gat agg tca att 1056 att att aca act aaa agt tat aat gag cag gag att aag aca att tta 1104 tct ata aga gca caa gag gag gaa gtt gaa ctg tca tcc gat gcc tta 1152 gat cta ttg acc aaa aca ggt gtg gaa act agt ttg cgt tac agc agt 1200 aat tta atc tct gtt gct cag caa att gca atg aag aga aaa aac aac 1248 act gtt gaa gtg gaa gat gtc aaa agg gct tat ttg cta ttt ttg gac 1296 agc gct aga tct gtt aag tat gtt caa gag aac gag tca caa tat att 1344 gat gat cag ggc aac gtt caa ata tcc att gct aaa tca gca gac cct 1392 gat gcc atg gat act acg gaa taa 1416

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト各組織由来のｍＲＮＡについてＨＥＬ５０
遺伝子の一部をプローブとしてノーザンブロットハイブ
リダイゼーションした結果を示す電気泳動写真である。

【図２】ｐＥＴ−３ａＨｉｓベクターを示す図であ
る。

【図３】ＭｏｎｏＱで精製したＨＥＬ５０の電気泳動の
結果を示す写真である。

【図４】ＭｏｎｏＱで精製したＨＥＬ５０とＤＮＡとを
反応させた反応物を電気泳動した結果を示す電気泳動写
真である。

【図５】方向性基質の作製の概要を示す図である。

【図６】方向性基質とＨＥＬ５０またはＴＩＰ４９とを
反応させた反応物を電気泳動した結果を示す電気泳動写
真である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年２月１５日（１９９９．２．１
５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｈ０４５Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 4B050 CC03 DD11 LL03 4B063 QA12 QA18 QQ21 QR32 QR55 QR62 QS03 QS34 4B064 AG27 CA10 CA20 DA13 4C084 AA13 ZC192 4H045 AA11 CA40 DA76 DA86 DA89 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列からなる蛋白質。
【請求項２】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失または
付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡヘリケー
ス活性を有する蛋白質。
【請求項３】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列と６５％以上のホモロジーを有し、かつＤＮＡヘリケ
ース活性を有する蛋白質。
【請求項４】配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸
配列からなる蛋白質。
【請求項５】請求項１ないし４のいずれか一項に記載
の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】配列表の配列番号２に記載の塩基配列の
１番目のＡから１３８９番目のＣまでの塩基配列を有す
るＤＮＡ。
【請求項７】配列表の配列番号２に記載の塩基配列か
らなる請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】配列表の配列番号１３に記載の塩基配列
からなるＤＮＡ。
【請求項９】請求項６ないし８のいずれか一項に記載
のＤＮＡがコードするＲＮＡ。
【請求項１０】請求項６ないし８のいずれか一項に記
載のＤＮＡのアンチセンスＤＮＡ、請求項９に記載のＲ
ＮＡのアンチセンスＲＮＡまたはそれらの誘導体からな
るアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項１１】請求項５ないし１０のいずれか一項に
記載のポリヌクレオチドの連続する１２以上の塩基から
なる部分からなるポリヌクレオチド。
【請求項１２】化学修飾された請求項５ないし１１の
いずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】請求項１ないし４のいずれか一項に記
載の蛋白質を認識する抗体。