JPH11137257A - ニューラライズド蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび該蛋白質を認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 １０番染色体の中で欠失の頻度が多い箇所を
同定し、その部分に位置する神経変異原因遺伝子を同定
し、該遺伝子を提供すること。また、該遺伝子がコード
する蛋白質（神経変異因子）を提供すること、さらに該
蛋白質に対する抗体を提供すること。 【解決手段】 ヒト１０番染色体の中で欠失の頻度が多
い箇所に存在するヒト神経変異原因遺伝子を提供する。
該ヒト神経変異原因遺伝子はショウジョウバエのニュー
ラライズド遺伝子とホモロジーが高く、ニューラライズ
ド遺伝子のヒトホモログである。また、マウスにおける
ニューラライズド遺伝子も提供する。また、該遺伝子が
コードする蛋白質、さらに該蛋白質に対する抗体を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ショウジョウバエ
のニューラライズド蛋白質のホモログ蛋白質および該ホ
モログ蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。
また、前記ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレ
オチドに関する。また、前記ホモログ蛋白質を認識する
抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】脊椎動物の中でもヒトは最も高度に分化
した神経系を持つ生物である。しかし、それについての
解析はその複雑な機構のため遅れている。特に脳神経系
に発生する腫瘍については、他の腫瘍に比べその解析が
遅れている。脳神経系においては、悪性腫瘍はもちろん
のこと、良性腫瘍であっても発生部位によっては患者の
生命を脅かすことがあり、脳神経腫瘍の発生機序の解明
の進展が待たれている。

【０００３】現在まで、脳神経系での腫瘍、とりわけ悪
性グリオーマの異常は、１０番染色体の異常に由来する
ことが知られている。しかし、具体的な１０番染色体の
欠失等の異常と臨床症状の関連は明らかになっていな
い。

【０００４】一方、ショウジョウバエでは、神経発生の
解析の過程で多くの突然変異体が得られており、その遺
伝学的解析が進んでいる。その結果、これまでにノッチ
（Ｎｏｔｃｈ）、デルタ（Ｄｅｌｔａ）、ビッグブレイ
ン（ｂｉｇ ｂｒａｉｎ）、ニューラライズド（ｎｅｕ
ｒａｌｉｚｅｄ）、マスターマインド（ｍａｓｔｅｒｍ
ｉｎｄ）、アーモンデックス（ａｌｍｏｎｎｄｅｘ）、
エンハンサーオブスプリット（Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ
ｓｐｌｉｔ）等が、突然変異の原因遺伝子でないかと
されている。上記遺伝子のうちで、ノッチ、デルタおよ
びエンハンサーオブスプリットについてはヒトのホモロ
グが取れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、脳神経系で
の腫瘍と１０番染色体の異常を明らかにするため、１０
番染色体の中で欠失の頻度が多い箇所を同定し、その部
分に位置する神経変異原因遺伝子を同定し、該遺伝子を
提供することを課題とする。また、該遺伝子がコードす
る蛋白質（神経変異因子）を提供すること、さらに該蛋
白質に対する抗体を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒト１０番染
色体の中で欠失の頻度が多い箇所に存在するヒト神経変
異原因遺伝子を提供する。また、該ヒト神経変異原因遺
伝子とホモロジーのあるマウス神経変異原因遺伝子を提
供する。これらの遺伝子はショウジョウバエのニューラ
ライズド遺伝子とホモロジーが高く、それぞれニューラ
ライズド遺伝子のヒトホモログおよびマウスホモログで
ある。本発明により、従来ショウジョウバエで知られて
いたニューラライズド遺伝子がヒトやマウスといった脊
椎動物、より具体的には哺乳類動物にも存在することが
明らかとされた。

【０００７】また、本発明は、前記塩基配列の相補塩基
配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドをも提供す
る。

【０００８】また、本出願において、ニューラライズド
蛋白質の作製方法が開示される。具体的には、ニューラ
ライズドｃＤＮＡを導入した形質転換体にニューラライ
ズド蛋白質を作製させる方法が開示される。また、その
作製方法により作製したニューラライズド蛋白質が開示
される。また、ニューラライズド蛋白質のアミノ酸配列
のうち１または複数のアミノ酸を置換、欠失または付加
したニューラライズド蛋白質の変異体の作製方法および
該作製方法により作製されたニューラライズド蛋白質の
変異体が開示される。

【０００９】また、本発明は、前記ニューラライズド蛋
白質をコードするポリヌクレオチドまたはニューラライ
ズド蛋白質変異体をコードするポリヌクレオチドの塩基
配列の相補塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオ
チドをも開示するものである。アンチセンスポリヌクレ
オチドはポリヌクレオチドに含まれるものであるが、本
明細書において、特にアンチセンス鎖の塩基配列からな
るポリヌクレオチドであることを明示する場合にアンチ
センスポリヌクレオチドという。アンチセンスポリヌク
レオチドは、代表的なものとしてアンチセンスＤＮＡと
アンチセンスＲＮＡがある。

【００１０】また、本発明は、ニューラライズド蛋白質
もしくはニューラライズド蛋白質変異体をコードするポ
リヌクレオチドの全部または１２塩基以上からなる一部
であるポリヌクレオチドを開示するものである。このポ
リヌクレオチドは、コード領域の部分のものについて
は、それぞれニューラライズド蛋白質またはニューララ
イズド蛋白質変異体の部分長蛋白質を作製するために使
用可能である。また、プローブとしても使用可能であ
る。

【００１１】また、本発明は、ニューラライズド蛋白質
またはニューラライズド蛋白質変異体のアンチセンスポ
リヌクレオチドの全部または１２塩基以上からなる一部
であるアンチセンスポリヌクレオチドを開示するもので
ある。このアンチセンスポリヌクレオチドは、それぞれ
ニューラライズド蛋白質またはニューラライズド蛋白質
変異体の生合成を阻害することが可能である。また、プ
ローブとしても使用可能である。

【００１２】また、本発明は、前記のポリヌクレオチド
（アンチセンスポリヌクレオチドを含む）を化学修飾し
たポリヌクレオチドを開示するものである。

【００１３】また、本発明は、ＤＮＡプローブを用いた
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法による解析
により、ヒトおよびマウスの各組織や各細胞株からニュ
ーラライズドのｍＲＮＡを検出できることおよびこれら
の動物で天然にニューラライズドのｍＲＮＡが発現して
いることを開示するものである。

【００１４】また、本発明は、前記ヒトニューラライズ
ド遺伝子のホモログ遺伝子がコードするヒトニューララ
イズド蛋白質のホモログ蛋白質（ショウジョウバエニュ
ーラライズド蛋白質のホモログ蛋白質でもある）を開示
するものである。なお、本明細書において、由来する動
物名を示さない場合は、各脊椎動物におけるニューララ
イズド蛋白質を集合的に指す。前記のニューラライズド
蛋白質は、ニューラライズド遺伝子を導入した形質転換
体に作製させることが可能である。

【００１５】本発明は、ヒトニューラライズドをコード
するポリヌクレオチド、マウスニューラライズドをコー
ドするポリヌクレオチドまたは１２塩基以上からなるそ
れらの一部（コード領域の部分）をプローブとして用い
て、他の脊椎動物、好ましくは哺乳類動物のｃＤＮＡラ
イブラリーからもニューラライズドｃＤＮＡを取得する
方法およびその方法により得られた哺乳類のニューララ
イズドｃＤＮＡをも含むものである。

【００１６】なお、プローブには、ヒトニューラライズ
ドｃＤＮＡの塩基配列とマウスニューラライズドｃＤＮ
Ａの塩基配列との間でホモロジーが高い部分の塩基配列
からなるｃＤＮＡフラグメントまたは該ｃＤＮＡフラグ
メントの塩基配列より得られるポリヌクレオチド（一本
鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖を含む）、ｃＤＮＡに対する
ＲＮＡまたはそれらが化学修飾されたものを含む）を用
いることができる。そして、前記プローブを他の動物の
ｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによ
り当該動物におけるニューラライズドｃＤＮＡを取得す
ることが可能である。

【００１７】また、本発明は、前記ｃＤＮＡ（ヒトニュ
ーラライズドｃＤＮＡおよびマウスニューラライズドｃ
ＤＮＡ）がコードするヒトニューラライズド蛋白質やマ
ウスニューラライズド蛋白質のホモログ蛋白質であるニ
ューララズド蛋白質を提供する。

【００１８】また、本発明は、前記ニューラライズド蛋
白質およびニューラライズド蛋白質の変異体を認識する
抗体を提供する。本出願において、ニューラライズド蛋
白質の抗原性、すなわち、ニューラライズド蛋白質から
抗体を作製することが可能であることが開示される。

【００１９】また、本発明は、ヒトニューラライズド遺
伝子について染色体上の位置を開示するものである。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明のショウジョウバエニュー
ラライズド蛋白質のホモログ蛋白質は、配列表の配列番
号１または３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に限
定されることはなく、これらの蛋白質をコードするポリ
ヌクレオチドまたはそのコード領域の一部、特には配列
表の配列番号２または４に記載の塩基配列またはそのコ
ード領域の一部の塩基配列からなるポリヌクレオチドを
プローブとして、各動物のｃＤＮＡライブラリーから得
られるｃＤＮＡがコードする蛋白質も本発明に含まれ
る。

【００２１】ヒトニューラライズド遺伝子とマウスニュ
ーラライズド遺伝子との間で、よく保存されている塩基
配列は、例えば、配列表の配列番号２に記載のヒトニュ
ーラライズドｃＤＮＡの塩基配列の５７６位のＧから９
３８位のＣまでの配列であり、配列表の配列番号４に記
載のマウスニューラライズドｃＤＮＡの塩基配列の８２
位から４４４位に相当する。この塩基配列からなるＤＮ
Ａをプローブとして用いて、以下の操作により、目的と
する動物のｃＤＮＡライブラリーから全長のニューララ
イズド遺伝子を得ることができる。

【００２２】１）プローブとするＤＮＡをＴａｋａｒａ
ＭＥＧＡ ＬＡＢＥＬキット（登録商標、宝酒造社
製）を用いて取扱説明書の通りに標識する。 ２）次に、下記の組成のＤＮＡ反応液を調製し、この液
を３７℃で３０分間インキュベートした後、７０℃で１
０分間熱処理し、酵素を失活させる。 ＤＮＡプローブ（２ｐｍｏｌ／μｌ） ２μｌ １０倍ホスホライレイション緩衝液 ２μｌ 〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（３７０ＭＢｑ／ｍｌ）（アマシャム製） ５μｌ Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ １μｌ 合計１０μｌ

【００２３】３）ＴＥ５０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化されたＳ
ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（登録商標、ファルマシア社
製）を１．５ｍｌポリプレップカラム（バイオラッド社
製）にベッドボリュームが１ｍｌになるように詰め、
２）で熱処理をしたＤＮＡ反応液を該カラムに載せる。 ４）その後、２００μｌＴＥ５０をカラムに４回流し、
２回目の２００μｌで溶出した画分から標識化ＤＮＡプ
ローブを得る。

【００２４】５）上記で得られた標識化ＤＮＡプローブ
画分のうち１５０μｌを、ニトロセルロース膜上に固定
したプラークのｃＤＮＡプローブ（ｃＤＮＡライブラリ
ーのニトロセルロース膜上への固定は、、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）９．３８−９．４０
ページに記載の方法にしたがって行える。）と以下の条
件でハイブリダイズさせる。

【００２５】プレハイブリダイゼーション ６×ＳＳＣ ５×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．０５％ ピロリン酸ナトリウム １００μｇ／ｍｌ 変性ニシン精子（ｄｅｎａｔｕｒｅ
ｄ ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ） ０．５％ＳＤＳ 総液量 ５０ｍｌ 反応温度３７℃ 反応時間１時間

【００２６】ハイブリダイゼーション ６×ＳＳＣ １×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．０５％ ピロリン酸ナトリウム １００μｇ／ｍｌ 変性ニシン精子（ｄｅｎａｔｕｒｅ
ｄ ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ） １×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌ ｃＤＮＡプローブ 総液量５０ｍｌ 反応温度４２℃ 反応時間１８時間

【００２７】６）ハイブリダイズの終了したニトロセル
ロース膜を以下の条件で１回ずつ洗浄する。 ６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ５００ｍｌ 温度４０℃ 時間２０分間 ３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ５００ｍｌ 時間４２℃ 時間２０分間

【００２８】７）洗浄したニトロセルロース膜をＸ線フ
ィルム（例えば、コダック社製ＸＡＲ５フィルム）に−
８０℃で一晩露光し、オートラジオグラフを撮影する。 ８）得られたオートラジオグラフから、陽性のプラーク
の位置を決定し、対応する寒天上のプラークをＳＭ溶液
に回収する。 ９）回収したプラークは、常法により再度ＮＺＹ寒天培
地上にプラーク形成を行わせ、ニトロセルロース膜上に
固定する。 １０）５）〜９）の過程を３回繰り返し、陽性のプラー
クは単一なものにする。該プラークを回収し、１００μ
ｌのＳＭ溶液に懸濁し、ファージを安定化させる。該プ
ラークから単離したｃＤＮＡがニューラライズドｃＤＮ
Ａである。

【００２９】３．ニューラライズドｃＤＮＡの大量調製 １）ＳＭ溶液に懸濁したプラークのファージ５０μｌと
Ｙ１０９０ｒ−大腸菌２０μｌを混合し、３７℃、１５
分間放置する。 ２）その後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１０
ｍｌＮＺＹ培地に１）で混合した溶液を移し、３７℃で
６時間培養する。 ３）８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を回収す
る。 ４）該上清に、５Ｍ ＮａＣｌを１ｍｌ、ポリエチレン
グリコール６０００を１．１ｇを加え、溶かす。 ５）該溶液を氷上に１時間置き、その後１００００ｒｐ
ｍ、４℃で２０分間遠心分離を行う。 ６）沈殿を回収し、７００μｌのＳＭ溶液に懸濁する。 ７）クロロホルムを５００μｌ加えて撹拌し、残った大
腸菌を溶かす。 ８）５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、水層を回収
する。

【００３０】９）これに、１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ
Ａ、５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（共にシグマ製）を各
１μｌずつ加え、３７℃で１時間放置したのち、２０％
ポリエチレングリコール６０００（０．８Ｍ ＮａＣ
ｌ）を６００μｌ加え、氷上に３０分間放置する。 １０）４℃で、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し
た後、沈殿を回収する。 １１）この沈殿に５００μｌのＳＭ溶液、５０μｌの５
Ｍ ＮａＣｌ、５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加え、
更に、４００μｌのフェノールを加えて撹拌し、ファー
ジを溶かしてｃＤＮＡを遊離させる。 １２）該溶液を室温で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分
離した後、水層を回収する。これに１ｍｌのエタノール
を加え、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、液層
を捨てる。 １３）７０％エタノール１ｍｌで沈殿を洗浄し、１００
μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に沈殿を溶かし、ＤＮＡ
溶液を得る。

【００３１】４．ニューラライズドｃＤＮＡの塩基配列
の決定 オートシンクエンサーを用いたダイターミネーター法に
よりニューラライズドｃＤＮＡの全塩基配列を決定す
る。

【００３２】５．アミノ酸配列の決定 ４．で決定した塩基配列から、ニューラライズドｃＤＮ
Ａのアミノ酸配列を決定する。

【００３３】６．形質転換体の作製 実施例１の９．と同様にして上記で得たニューラライズ
ドｃＤＮＡを適当なベクター（例えば、ＴＡクローニン
グベクター）に挿入した後、宿主（例えば、大腸菌）に
導入することで形質転換体を作製することができる。

【００３４】自然の変異によりまたは人工の変異（例え
ば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ １５．１−１５．１１３ページに記載の
方法）により、ポリヌクレオチドがコードするポリペプ
チドの主たる機能に変化を与えることなく、該ポリヌク
レオチド変化させることが可能である。この方法によ
り、本発明のニューラライズドについても配列表の配列
番号１または３に記載のアミノ酸配列における一または
複数のアミノ酸を置換、欠失または付加したアミノ酸配
列からなる蛋白質、すなわちニューラライズド蛋白質の
変異体を作製することが可能である。また、ニューララ
イズド蛋白質とその変異体との間のホモロジーは、アミ
ノ酸レベルで、７５％以上１００％未満であることが好
ましい。

【００３５】本発明のニューラライズド蛋白質の変異体
のアミノ酸配列は、該変異体をコードする遺伝子の塩基
配列から決定することが可能である。例えば、市販のプ
ログラム（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｘ−Ｍａｃ（登録商
標、ソフトウェアディベロプメント社製）を用いて可能
である。

【００３６】遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチド
から生産されたポリペプチドのアミノ酸配列を変えるこ
となく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一
部の塩基を他の種類の塩基に置換することができる。し
たがって、本発明のニューラライズド蛋白質をコードす
るポリヌクレオチドとは、縮重の全てのパターンを含む
ものである。

【００３７】配列表の配列番号２に記載の塩基配列から
なるＤＮＡは、天然に存在するヒトニューラライズドｃ
ＤＮＡであり、配列表の配列番号４に記載の塩基配列か
らなるＤＮＡは、天然に存在するマウスニューラライズ
ド遺伝子である。

【００３８】本発明は、前記ニューラライズド蛋白質を
コードするポリヌクレオチドのコード領域のアンチセン
ス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチド
およびその誘導体を含むものである。該アンチセンスポ
リヌクレオチドは、ニューラライズドをコードするポリ
ヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なもので
あり、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドがコ
ード領域のポリヌクレオチドであれば該ポリヌクレオチ
ドがコードするポリペプチドの生合成を阻害することが
可能である。ポリペプチドの生合成を阻害するためのア
ンチセンスポリヌクレオチドは、１５塩基以上からなる
ことが好ましい。一方、細胞内に全長のアンチセンスポ
リヌクレオチドを取り込ませるのは、あまりに長くても
不適である。細胞内にアンチセンスポリヌクレオチドを
取り込ませ、ニューラライズド蛋白質の生合成を阻害さ
せる場合、１２塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５
塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２
２塩基以下の塩基からなるアンチセンスポリヌクレオチ
ドを用いるのがよい。

【００３９】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその一部分は、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオ
チドが複数結合したものが、天然には存在しないものを
含めて全て含まれる。代表的なものは、アンチセンスＤ
ＮＡとアンチセンスＲＮＡである。

【００４０】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに
ついて、公知のアンチセンス技術を用いて、目的のＤＮ
ＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択制、細胞透過性、ヌ
クレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なアンチセン
スポリヌクレオチド誘導体が得られる。

【００４１】ハイブリダイズのし易さの点では、一般的
には、ステムループを形成している領域の塩基配列に相
補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその誘導体を設計するとよいとされている。本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体は、
必要に応じ、ステムループを形成することが可能であ
る。

【００４２】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがっ
て、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその
誘導体であって、ニューラライズドをコードする遺伝子
またはｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合
部位、キャッピング部位、スプライス部位の相補的な配
列を含むものは、高い発現抑制効果が期待される。

【００４３】現在一般的に知られている誘導体は、ヌク
レアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少な
くとも一つが高められた誘導体であることが好ましい。
特に好ましくは、フォスフォロチオエート結合を骨格構
造として有する誘導体である。本発明のポリヌクレオチ
ドおよびその誘導体についても、これらの機能または構
造を有する誘導体が含まれる。

【００４４】天然型のアンチセンスポリヌクレオチドで
あれば、化学合成機を使用して合成したり、ニューララ
イズドをコードする遺伝子を鋳型とするＰＣＲ法により
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを作製すること
ができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフ
ォロチオエート型等、誘導体の中には、化学合成できる
ものもある。この場合には、化学合成機に添付されてい
る説明書にしたがって操作を行い、得られた合成産物を
逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精
製することによっても、目的のアンチセンスポリヌクレ
オチドまたはその誘導体を得ることができる。

【００４５】本発明のニューラライズドをコードするポ
リヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドま
たはそれらの一部（連続する１２塩基以上の塩基配列か
らなるポリヌクレオチド）であるポリヌクレオチドは、
ｃＤＮＡライブラリー等からニューラライズド遺伝子を
スクリーニングするためのプローブとして使用可能であ
る。対象とする動物の種がプローブとするポリヌクレオ
チドが由来する動物の種と同じ場合は、非コード領域の
部分であっても使用可能である。このときＧＣ含有率が
３０ないし７０％のものが好適に使用可能である。ま
た、連続する１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌク
レオチドが特に好ましい。プローブとして用いる該ポリ
ヌクレオチドは誘導体であってもよい。通常、上記の塩
基数以上の配列は特異性のある配列であると認識されて
いる。該プローブを用いたスクリーニングにおいて使用
するｃＤＮＡライブラリーとしては、ｍＲＮＡから作製
されたものが好ましく使用できる。これらのｃＤＮＡラ
イブラリーからランダムサンプリングにより選択された
一群のｃＤＮＡを検索の試料とすることができる。ま
た、市販のものでも使用可能である。

【００４６】例えば、配列表の配列番号２または４に記
載の塩基配列のうちの連続する１２塩基以上の塩基配列
からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡにハイブリダイズするポ
リヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）、ｃ
ＤＮＡライブラリー等からニューラライズド遺伝子をス
クリーニングするためのプローブとして使用可能であ
る。

【００４７】また、本発明のニューラライズドをコード
するポリヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオ
チドまたはそれらの一部であるポリヌクレオチドをプロ
ーブとして、各組織由来のｍＲＮＡについてノーザンブ
ロットハイブリダイゼーションを行うことにより、ニュ
ーラライズド遺伝子由来のｍＲＮＡが発現している組織
を見出すことが可能である。

【００４８】ＤＮＡ又はＲＮＡを化学合成するときに、
側鎖をメチル化すること、あるいはビオチン化するこ
と、またはリン酸基部分のＯをＳ置換すること等の化学
的に修飾することはよく知られている。例えば、配列表
の配列番号２に記載のＤＮＡを化学合成するときに、該
化学修飾を行い、配列表に示されたＤＮＡそのものと異
なるものを合成することが可能である。また、ｃＤＮＡ
ライブラリーから取得されたｃＤＮＡであっても放射性
同位体で標識することも可能である。したがって、本発
明のＤＮＡ及びＲＮＡは、上記の化学修飾されたＤＮ
Ａ、ＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドをその
範囲に含むものである。化学修飾されたＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、蛋白質をコードする機能またはプローブとして
の機能をいずれも発揮可能なものであり、化学修飾され
たアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブまたは蛋
白質の生合成を阻害する機能またはプローブとしての機
能をいずれも発揮可能なものである。

【００４９】プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入
して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能で
ある。本発明のニューラライズド遺伝子を導入した形質
転換体を培養して遺伝子の増幅または蛋白質の発現を行
わせ、ニューラライズド蛋白質またはニューラライズド
蛋白質の変異体を作製させることが可能である。次に作
製物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種
クロマトグラフィー等の操作を行うことにより、本発明
のニューラライズド蛋白質またはニューラライズド蛋白
質の変異体を精製することが可能である。

【００５０】形質転換体の培養については、各種の教科
書があり、本発明に記載の塩基配列に基づいてニューラ
ライズド蛋白質またはニューラライズド蛋白質の変異体
を作製させることは、公知の方法により可能である。こ
のとき、宿主としては、大腸菌等の細菌、酵母、動物細
胞のいずれも使用可能であるが、特には動物細胞が好ま
しい。細胞に遺伝子を導入するには、リボソーム法、エ
レクトロポーレーション法等を用いることができる。特
に、核内微量注入法を用いることが好ましい。

【００５１】得られた培養物からニューラライズド蛋白
質またはニューラライズド蛋白質の変異体を精製する精
製方法には、免疫沈降法、塩析法、限外濾過法、等電点
沈殿法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマト
グラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法や抗体クロ
マトグラフィー法等の各種アフィニティークロマトグラ
フィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラ
フィー法および逆相クロマトグラフィー法等があり、適
宜選択して行えばよい。

【００５２】また、製造段階において、製造するニュー
ラライズド蛋白質またはニューラライズド蛋白質の変異
体は、他のポリペプチドとの融合ペプチドとして形質転
換体に作製させてもよい。この場合は、精製工程におい
て、ブロムシアン等の化学物質やプロテーゼ等の酵素で
処理して、ニューラライズド蛋白質またはニューラライ
ズド蛋白質の変異体を切り出す操作が必要になる。

【００５３】本発明は、ニューラライズド蛋白質の抗原
性について、実施例３に例示するように、前記方法によ
り得られたニューラライズド蛋白質またはニューラライ
ズド蛋白質に特異的なアミノ酸配列からなるオリゴペプ
チドをニューラライズド蛋白質が由来する動物およびヒ
ト以外の動物に免疫することで容易に抗体が得られるも
のであることを明らかにするものである。したがって、
本発明のニューラライズド蛋白質を認識する抗体（以
降、ニューラライズド抗体ということがある）は、ニュ
ーラライズド蛋白質を該ニューラライズド蛋白質が由来
する動物およびヒト以外の動物に免疫感作することによ
り得られる抗体であって、該抗体が該ニューラライズド
蛋白質を認識することがウェスタンブロット法、ＥＬＩ
ＳＡ法や免疫染色法（例えば、凍結標本やパラフィン標
本の組織染色）等により確認される抗体をその範囲内に
含む。

【００５４】また、免疫原として、蛋白質の一部であっ
ても該蛋白質の一部をウシ血清アルブミンなどの他のキ
ャリアー蛋白質に結合させたものを用いることは、よく
用いられる方法である。該蛋白質の一部は、例えばペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。なお、蛋白質の一
部としては、８アミノ酸残基以上であることが好まし
い。抗原性が明らかとなった物質については、免疫感作
によってポリクローナル抗体が得られるならば、該免疫
した動物のリンパ球を用いたハイブリドーマによりモノ
クローナル抗体が産生されることはよく知られている
（『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）Ｃ
ｈａｐｔｅｒ６）。したがって本発明のニューラライズ
ド抗体はモノクローナル抗体もその範囲内に含むもので
ある。

【００５５】本発明においては、抗体は活性フラグメン
トをも包含するものである。活性フラグメントとは、抗
原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、
具体的には、Ｆ（ａｂ′）₂ 、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ
などを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をペ
プシンで分解するとＦ（ａｂ’）₂ が得られ、パパイン
で分解するとＦａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）₂ を２−
メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノヨー
ド酢酸でアルキル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた
一価の抗体活性フラグメントである。これらの活性フラ
グメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメ
ントに置換することでキメラ抗体が得られる。

【００５６】本発明の抗体は、ニューラライズドの発現
等の機能の解明や悪性腫瘍の形成機構の解明のために使
用可能である。

【００５７】ニューラライズドの検出については、抗体
を用いる方法、酵素反応を利用する方法が挙げられる。
抗体を用いる方法としては具体的には、標識されたニ
ューラライズド抗体を用いてニューラライズドを検出す
る方法、ニューラライズド抗体および該抗体の標識二
次抗体を用いてニューラライズドを検出する方法が挙げ
られる。標識としては、例えば放射性同位元素（Ｒ
Ｉ）、酵素、アビジン又はビオチン、もしくは蛍光物質
（ＦＩＴＣやローダミン等）が利用される。

【００５８】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法、ウェスタンブロット法
を用いた免疫反応分子の同定方法又はそれらに類似する
方法が挙げられる。

【００５９】

【実施例】以下に実施例を挙げて、より詳細に本発明を
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ Ｉ．悪性グリオーマにおける１０番染色体の欠失位置の
同定 （１）細胞の調製 ４６例の悪性グリオーマのヒト組織および悪性グリオー
マ患者の末梢血を採血した。末梢血はＥＤＴＡ添加採血
管に５ｃｃ採血し、ファイコール・ペーク（ファルマシ
ア社製）を用いた比重遠心分離法にて、白血球有核細胞
を回収した。組織は、手術で除去した組織片５ｍｍ角ま
たはバイオプシーでのサンプルについてコラゲナーゼお
よびトリプシン処理を行い細胞浮遊液を調製した。

【００６０】（２）ＤＮＡの調製 得られた細胞浮遊液からキアゲン・ブラッドアンドセル
カルチャーＤＮＡキット（キアゲン社製）を用いて、添
付プロトコールにしたがいＤＮＡを抽出した。

【００６１】（３）マイクロサテライト解析 得られたＤＮＡについて、１０染色体長腕上の１６箇所
のマイクロサテライトマーカーを色素標識したプライマ
ーを用いて解析した。その結果、グレードＩＩＩおよび
グレードＩＶの悪性グリオーマにおいて、１０番染色体
長腕上のマイクロサテライトマーカーのうちのＤ１０Ｓ
５４０とＤ１０Ｓ５６６を含む領域の遺伝子のヘテロ性
消失（ＬＨＯ）を高頻度に認めた。

【００６２】（４）ＳＴＳマッピング その後、ホールゲノムラディエイションハイブリッドの
パネルおよびＹＡＣクローンを用いて、Ｄ１０Ｓ５６６
周辺のＳＴＳマッピングを行った。その結果、Ｄ１０Ｓ
５６６が１０ｑ２５に存在することおよびその周辺のＳ
ＴＳマーカーの位置関係を明らかにした。

【００６３】ＩＩ．ニューラライズド遺伝子の同定 １．ＥＳＴデータベースの検索 インターネットのＥＳＴデータベース（ｍＲＮＡの断片
の配列を登録してあるデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｉ ｈｔ
ｍｌ）に登録された配列（ＥＳＴ）から１０ｑ２４ない
し２５付近に存在するＥＳＴ選別したところ、Ｈ８２６
３４が選別された。このＥＳＴの局在を、さらに、前記
ラディエイションハイブリッドのパネルおよびＹＡＣク
ローンのＰＣＲにより決定したところ、Ｈ８２６３４が
ヒト１０番染色体上のＤ１０Ｓ５４０とＤ１０Ｓ５６６
の間に位置することが判明し、Ｈ８２６３４を含む遺伝
子が悪性グリオーマの原因遺伝子である可能性が生じ
た。

【００６４】２．ＴＩＧＲデータベースの検索 インターネットのＴＩＧＲデータベース（ｍＲＮＡの断
片の配列を登録してあるデータベース、ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｉ ｈ
ｔｍｌ）に登録された配列からＨ８２６３４とホモロジ
ーのある配列を検索した。その結果、Ｈ８２６３５がＨ
８２６３４の相補鎖の配列であることが分かった。この
二つの配列から以下の塩基配列Ａを定めた。 塩基配列Ａ： CAGCTGGACG CCCCGNTGNA GGCCGTAGAC GTCCACCAGG GCCCAGAGCG GGTCGGCCGT GCGGACCCGC TGAAGAACAG CATAACAGCC GAGTCGTTGA TGCGGTGGAA GACACGGCCC TTCTTGTCCA CCCAGAATGC GATGATGTTG CCCTCATTGC CAAACTCCTC AGGCAGCGCT NTGGCCCAGA AGCCACTCTG GGACACCAGG TTCGGGGCAG GCGTACTTGG GCAGCGAGTC AGGGTGGATG CGGGACGGGT CCTTGCTGGT GAAGCCAGCC GCAGGCCCCG CTCCAGCACT GCTTCTTGGT GATCTTCAGC CTGACTTGCT CGTAGATGAG GACCGGGCGG TTGCTGAAGG TGATGNCGTT GCAGAAGCTG GCCTGCCTCT TGNACAGCCT TGTGGCTGAG GTCCATGAGG ATCTGGGAGC CCTTGGTGTG CGGGTGGAAG AGCAGCGGCG TGGCTGGGAG CCCCCGCTGG GCAGCACTGC CGGACAGTGC TTCTGCTTGT GGTGGCATCG GTGAGAAGTG ACGGGGAAGG GGCCCCCGAT AGAGTCGTGG AGAGTGCTCC GGGTGAT

【００６５】３．プライマーの合成 ヒトｃＤＮＡライブラリーから、上記の塩基配列ＡのＤ
ＮＡフラグメントを取得するために以下のプライマーを
合成した。５’プライマーとしてＰ１プライマー 5'-TA
GACGTCCA CCAGGGCCCA GAC-3'（配列表の配列番号５に記
載の塩基配列）、３’プライマーとしてＰ２プライマー
5'-CGGAGCACTC TCCACGACTC TAT-3'（配列表の配列番号
６に記載の塩基配列）を設計し、ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ
社製、モデル３９２）にて合成した。合成したプライマ
ーは、蒸留水で２０ｐｍｏｌ／μｌに調製した（以降の
プライマーの合成も同様に行った。）。

【００６６】４．ＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリーには、ヒト胎児脳のｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社製）を用い、以下の条件で
ＰＣＲを行った。 ｃＤＮＡ ０．８μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ（各２．５ｍＭ） ０．６μｌ Ｐ１プライマー ０．６μｌ Ｐ２プライマー ０．６μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ４．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．７２μｌ 蒸留水 ６．６８μｌ 合計 １４．５μｌ

【００６７】上記組成の液にミネラルオイル１５μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１分間」のサイクルを３５回繰り返し反応させた。最
後に７２℃で１０分間断片の伸長反応を行いＰＣＲを完
了した。

【００６８】反応後、ＰＣＲ産物についてミニゲル電気
泳動を１．５％アガロースゲルで行った。約０．６ｋｂ
のニューラライズド蛋白質断片をコードする遺伝子と考
えられるバンドを切り出しＰＣＲ産物を回収した。さら
に、前記回収物の一部について前記ミニゲル電気泳動を
再度行い、約０．６ｋｂにバンドが現れることを確認し
た。以下、このＤＮＡ断片を、以降、フラグメントＡと
いう。

【００６９】４．ベクターへの組み込み フラグメントＡをｐＣＲＩＩＴＡクローニングベクター
キット（インビトロゲン社製）を用いて、下記条件でサ
ブクローニングした。 滅菌蒸留水 ５μｌ １０×ライゲーション緩衝液 １μｌ ｐＣＲＩＩベクター ２μｌ ＤＮＡ断片 １μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ １μｌ 合計 １０μｌ １４℃で一晩反応を行い、ライゲーション混合物を得
た。

【００７０】５．形質転換 ＴＡクローニングキットを用いて形質転換を行った。 氷上で大腸菌５０μｌに０．５Ｍの２−メルカプトエ
タノール２μｌおよび前記４．で調製したライゲーショ
ン混合物を添加し３０分間放置した後、４２℃の湯浴中
で２２５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。 次いで、アンピシリン、Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを
添加したＬＢ寒天プレートに、前記大腸菌を拡散した。
３７℃で１８時間インキュベートしたところ、白と青の
コロニーが出現した。

【００７１】６．ミニ培養 前記のプレートから白いコロニーを４個選択し、それぞ
れ１コロニーにつき３ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン添
加）が入ったチューブに入れ、これを一晩３７℃で振盪
培養した。

【００７２】７．ミニ調製 アルカリ法（例えば、前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎの１．２５−１．２
８ページに記載の方法）でプラスミドを調製した。

【００７３】８．ＤＮＡシークエンス 前記７．で調製したプラスミドについて１μｌを取り、
９９μｌのＴＥにて希釈した。２６０ｎｍでの吸光度
（Ａ２６０）を測定し、ＤＮＡ値を計算した（Ａ２６０
の値１．０を５０μｇ／ｍｌとして算出した）。Ａ２６
０値よりＤＮＡが１μｇ／ｍｌとなるようにプラスミド
をＴＥにて希釈した。ＡＢＩ社製のオートシンクエンサ
ーモデル３７３Ｓを使用してダイターミネーター法によ
り、フラグメントＡの塩基配列を決定した。

【００７４】９． ５’伸長反応 フラグメントＡの塩基配列からＰ３プライマー5'-AGCAC
TGCCG GACAGTGCTT CTG-3' （配列表の配列番号７に記載
の塩基配列）を合成した。このプライマーを用いて、ヒ
ト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてシングルＰ
ＣＲを下記の条件で行った。 ｃＤＮＡ １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ ０．６μｌ Ｐ３プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ４．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．７２μｌ 蒸留水 ６．６８μｌ 合計 １４．５μｌ

【００７５】前記組成の液にミネラルオイル１５μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間」のサイクルを５０回繰り返し反応させ
た。続いて５５℃で２分間、最後に７２℃で１０分間断
片の伸長反応を行いＰＣＲを完了した。

【００７６】このＰＣＲ産物を鋳型として２度目のＰＣ
Ｒを実施した。Ｐ４プライマー5'-GTGGTGGCAT CGGTGAGA
AG TGA-3' （配列表の配列番号８に記載の塩基配列）を
合成した。このプライマーと、５’のプライマーとして
Ｔ３プライマー5'-ATTAACCCTC ACTAAAG-3'（配列表の配
列番号９に記載の塩基配列）を用いて、下記の条件でＰ
ＣＲを行った。 ＰＣＲ産物 １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ Ｐ４プライマー １μｌ Ｔ３プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ７．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．２μｌ 蒸留水 １１．８μｌ 合計 ２４．５μｌ

【００７７】前記組成の液にミネラルオイル２０μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１分間」のサイクルを４０回繰り返し反応させた。続
いて５５℃で２分間、最後に７２℃で１０分間断片の伸
長反応を行いＰＣＲを完了した。このＤＮＡ断片を、以
降、フラグメントＢという。

【００７８】１０． ３’伸長反応 フラグメントＡの塩基配列からＰ５プライマー5'-GGCCG
TGTCT TCCACCGCAT CAA-3' （配列表の配列番号１０に記
載の塩基配列）を合成した。このプライマーを用いて、
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてシングル
ＰＣＲを下記の条件で行った。 ｃＤＮＡ １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ ０．６μｌ Ｐ５プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ４．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．７２μｌ 蒸留水 ６．６８μｌ 合計 １４．５μｌ

【００７９】前記組成の液にミネラルオイル１５μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間」のサイクルを５０回繰り返し反応させ
た。最後に７２℃で１０分間断片の伸長反応を行いＰＣ
Ｒを完了した。

【００８０】このＰＣＲ産物を鋳型として２度目のＰＣ
Ｒを実施した。Ｐ６プライマー5'-CTCGGCTGTT ATGCTGTT
CT TCA-3' （配列表の配列番号１１に記載の塩基配列）
を合成した。このプライマーと、５’のプライマーとし
てＴ７プライマー5'-AATACGACTC ACTATAG-3'（配列表の
配列番号１２に記載の塩基配列）を用いて、下記の条件
でＰＣＲを行った。 ＰＣＲ産物 １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ Ｐ６プライマー １μｌ Ｔ７プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ７．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．２μｌ 蒸留水 １１．８μｌ 合計 ２４．５μｌ

【００８１】前記組成の液にミネラルオイル２０μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１分間」のサイクルを４０回繰り返し反応させた。最
後に７２℃で１０分間断片の伸長反応を行いＰＣＲを完
了した。これより得られたＤＮＡ断片を、以降、フラグ
メントＣという。

【００８２】１１．ＤＮＡシークエンス フラグメントＢとフラグメントＣについて、Ｐ４プライ
マーあるいはＰ６プライマーをもとにダイターミネータ
ー法でダイレクトシークエンスを行った。

【００８３】１２． ３’伸長反応 フラグメントＣの塩基配列をもとに、Ｐ７プライマー5'
-GTGGACGCCT CGCAGCCGCT TTG-3' （配列表の配列番号１
３に記載の塩基配列）とＰ８プライマー5'-CGATGAGTGC
ACCATTTGCT ATG-3' （配列表の配列番号１４に記載の塩
基配列）を合成した。まずＰ７プライマーを用いて、ヒ
ト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、下記の条
件でシングルＰＣＲを行った。 ｃＤＮＡ １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ ０．６μｌ Ｐ７プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ４．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．７２μｌ 蒸留水 ６．６８μｌ 合計 １４．５μｌ

【００８４】前記組成の液にミネラルオイル１５μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間」のサイクルを５０回繰り返し反応させ
た。最後に７２℃で１０分間断片の伸長反応を行いＰＣ
Ｒを完了した。

【００８５】このＰＣＲ産物を鋳型として２度目のＰＣ
Ｒを実施した。Ｐ８とＴ３プライマーを用いて、下記の
条件でＰＣＲを行った。 ＰＣＲ産物 １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ Ｐ８プライマー １μｌ Ｔ３プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ７．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．２μｌ 蒸留水 １１．８μｌ 合計 ２４．５μｌ

【００８６】前記組成の液にミネラルオイル２０μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１分間」のサイクルを４０回繰り返し反応させた。最
後に７２℃で１０分間断片の伸長反応を行いＰＣＲを完
了した。これより得られたＤＮＡ断片を、以降、フラグ
メントＤという。

【００８７】１３．ＤＮＡシークエンス フラグメントＤについて、Ｐ８プライマーをもとにダイ
ターミネーター法でダイレクトシークエンスを行った。

【００８８】１４．全長ｃＤＮＡ化 フラグメントＡ，Ｂ、ＣおよびＤの塩基配列をもとに、
センスプライマー5'-AGAGCAGCAG AGGTGGCTGC ACT-3'
（配列表の配列番号１５に記載の塩基配列）を、アンチ
センスプライマー5'-GGCTTGTTCC TCAGCTGGGA CTG-3'
（配列表の配列番号１６に記載の塩基配列）を設定し、
これを用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
して、下記の条件でＰＣＲを行った。 ｃＤＮＡ １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ センスプライマー １μｌ アンチセンスプライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ７．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．２μｌ 蒸留水 １１．８μｌ 合計 ２４．５μｌ

【００８９】前記組成の液にミネラルオイル１５μｌを
重層し、９６℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間」のサイクルを４０回繰り返し反応させ
た。最後に７２℃で１０分間断片の伸長反応を行いＰＣ
Ｒを完了した。この全長ｃＤＮＡをダイターミネーター
法でシークエンスした。全長のコード領域を含む目的の
ｃＤＮＡが取れたことを確認し、この遺伝子を、ショウ
ジョウバエのニューラライズド遺伝子のヒトにおけるホ
モログ遺伝子と認定した。この塩基配列を配列表の配列
番号２に示す。またこの遺伝子がコードするヒトニュー
ラライズド蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１
に示す。

【００９０】１５．形質転換体の作製 上記で得られた全長のヒトニューラライズドｃＤＮＡ
を、プラスミドベクターｐＢＴＭ１１６のＥｃｏＲＩ−
ＰｓｔＩサイトにＨＡタグを含む８３ｍｅｒのリンカー
を挿入したｐＢＴＭ１１６ＨＡのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ
サイトに挿入した。このプラスミドベクターを大腸菌Ｄ
Ｈ５αに導入して、形質転換体を作製した。

【００９１】実施例２ ニューラライズドｍＲＮＡの各
組織における発現 ヒトの各組織のポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびヒト
の各種細胞のポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）それぞれにつ
いて、各２μｇをブロットしたメンブレン（Ｈｕｍａｎ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｂｌｏｔ Ｉ、同ＩＩおよびＨｕｍａｎ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（クローンテック社
製））に、ランダムプライムドラベリングキット（登録
商標、宝酒造社製）を用いて³²Ｐ−ＣＴＰで標識化した
フラグメントＡを、ハイストリンジェンシーの条件下
で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ ７．３９ページないし７．５２ページの記載
にしたがってハイブリダイズさせ、ノーザンブロットハ
イブリダイゼーション法による解析を行った。

【００９２】この結果、ニューラライズドのｍＲＮＡが
脳および筋肉組織で発現していることが分かった。

【００９３】この結果、各細胞については、明らかな発
現は見られなかった。

【００９４】上記の結果より、ニューラライズド遺伝子
およびニューラライズド蛋白質は神経特異的な分子であ
ると考えられる。

【００９５】実施例３ ニューラライズド蛋白質を認識
する抗体の作製 １．抗原の作製 下記のペプチドＡおよびペプチドＢを合成した。 ペプチドＡ：配列表の配列番号１に記載のニューラライ
ズド蛋白質のアミノ酸配列の１２３番目のＬｅｕから１
４３番目のＣｙｓまでの２１アミノ酸からなるペプチ
ド。 ペプチドＢ：配列表の配列番号１に記載のニューラライ
ズド蛋白質のアミノ酸配列の２７２番目のＰｒｏから２
９１番目のＡｓｐまでの２０アミノ酸のＮ末端にシステ
イン（Ｃｙｓ）を付加したアミノ酸からなるペプチド。 システインの付加はスカシ貝ヘモシアニン（ＫＨＬ）と
結合させるために付加した。合成は岩城硝子（株）に委
託した。合成したペプチド２ｍｇをマレイミド化ＫＬＨ
（ピアス社製）２ｍｇに結合させた。反応はピアス社の
キットの説明書に記載の方法にしたがった。

【００９６】２．免疫 抗原（ペプチドＡおよびペプチドＢ）について、抗原液
（１μｇ／ｍｌ）１００μｌ、ＰＢＳ ０．５ｍｌを及
びフロイントコンプリートアジュバンド（ディフコ社
製）０．５ｍｌをシリンジに取り、混合してエマルジョ
ンとし、ウサギの背に４箇所に分けて皮下接種した。１
週間後、２回目の免疫を行った。２回目からはアジュバ
ンドをフロイントインコンプリートアジュバンド（ディ
フコ社製）に変えて免疫を行った。その他の操作は１回
目と同様である。２回目以降は１週間間隔を開けて、合
計６回免疫を行った。

【００９７】３．抗体の精製 最終免疫の１週間後、採血した。この血液を室温で３時
間静置し、十分に血液凝固を行った後、３，０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離を行い、上清（血清）を回収した。
この血清に飽和硫安を最終濃度が５０％になるように加
えて塩析した。このサンプルを遠心分離して、抗体が含
まれる画分を沈殿させた。その後、沈殿物をＰＢＳに溶
解し、さらにＰＢＳに対して塩析した。その後、プロテ
インＧセファロースカラム（登録商標、ファルマシア社
製）を用いて、抗体をアフィニティー精製した。その結
果、全量で３７０ｍｇのＩｇＧ画分が得られた。

【００９８】ＩｇＧ画分について、免疫に使用したペプ
チドをＮＨＳ−活性化セファロース（ファルマシア社
製）に添付のマニュアルにしたがい結合させて作製した
カラムそ使用してアフィニティー精製した。その結果、
全量で５ｍｇの精製抗体が得られた。

【００９９】４．抗体の力価の測定 得られた精製抗体の力価をＥＬＩＳＡにて測定した。 （１）抗原液（ペプチドＡおよびペプチドＢ）をそれぞ
れ２５μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈して、９６ウェルＥＬ
ＩＳＡプレート（キセノバインド（Ｘｅｎｏｂｉｎｄ）
登録商標、キセノポア社製）の各ウェルに５０μｌずつ
分注し、４℃で一晩放置した。 （２）抗原液を捨て、蒸留水で４倍に希釈したブロック
エース（登録商標、大日本製薬社製）を各ウェルに２０
０μｌずつ分注し、室温で２時間放置することによりブ
ロッキングを行った。

【０１００】（３）ブロッキング液を捨て、一次抗体と
して精製抗体を添加した。精製抗体は、９６ウェルの１
列目から順に、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５
μｇ／ｍｌ、・・・とＰＢＳで倍々希釈した液を、１２
列目まで各ウェルに５０μｌずつ分注した。１２列目の
抗体濃度は約０．５μｇ／ｍｌとなる。なお、コントロ
ールには、免疫していないウサギから精製したＩｇＧを
用いた。各抗体の分注後、室温で１時間反応させた。 （４）抗体液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢ
Ｓでプレートを４回洗浄し、次いで二次抗体液としてＰ
ＢＳで１０００倍希釈したビオチン化ウサギＩｇＧ抗体
（ベクター社製）各ウェルに５０μｌずつ分注した。そ
の後、室温で３０分間反応させた。 （５）二次抗体を捨てた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、１０００倍希釈した
ＡＢＣ液（ベクター社製）を各ウェルに５０μｌずつ分
注した。その後、室温で３０分間放置した。 （６）ＡＢＣ液を捨てた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、オルトフェニレンジ
アミン（ＯＰＤ）−Ｈ₂Ｏ₂／ＰＢＳを各ウェルに１００
μｌずつ分注した。十分に発色させた後、２Ｎ硫酸で反
応を止めた後、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレート
リーダー（バイオラッド社製）にて測定した。

【００１０１】この結果、ペプチドＡを免疫して得られ
た抗体（以下抗体Ａということがある）およびペプチド
Ｂ（以下抗体Ｂということがある）を免疫して得られた
抗体のいずれも、抗体の力価はコントロールに比べて高
かった。

【０１０２】実施例４ ウェスタンブロット （１）プラスミドベクターｐＢＴＭ１１６のＥｃｏＲＩ
−ＰｓｔＩサイトにＨＡタグを含む８３ｍｅｒのリンカ
ーを挿入したｐＢＴＭ１１６ＨＡのＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ
ＩサイトにヒトニューラライズドｃＤＮＡのコード領域
を挿入した。このプラスミドをＣＯＳ細胞に導入した。 （２）前記ニューラライズドｃＤＮＡを導入したＣＯＳ
細胞、その親株（ニューラライズド遺伝子を導入してい
ない細胞）、ヒトの脳組織および筋肉組織について、細
胞および組織を回収後溶解させた。細胞は１×１０
⁶ 個、脳組織はクローンテック社製のヒューマンブレイ
ンプロテインメドレー（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｍｅｄｌｅｙ）を用いた。細胞溶解液は、
６８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４％グリセロール、３
％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＤＴＴ、１０μｇ／ｍｌ大豆トリ
プシンインヒビター、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍ
Ｍフェニルメチルスルフォニルフロライド（ＰＭＳ
Ｆ）、１μｇ／ｍｌロイペプチンを用いた。細胞溶解液
を細胞のペレットに１００μｌ加えてよく攪拌して溶か
した。１０分間煮沸した後、１５０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離を行い、上清液を回収した。

【０１０３】（３）上清液１０μｌについて１０−２０
％のグラジエントゲルで電気泳動した。 （４）電気泳動後、トランスブロットシステム（マリソ
ル社製）を用い、ニトロセルロース膜に転写した。 （５）ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク／ＰＢ
Ｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に浸し、１時間放置し、ブ
ロッキングした。その後、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０／Ｐ
ＢＳで５分間ずつ２回洗浄した。 （６）実施例３で作製した抗ニューラライズド抗体を１
μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈した後、ニトロセルロース膜
に加え、室温で４０分間反応させた。その後、０．３％
Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。 （７）次いで、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ
（アマシャム社製）をＰＢＳで２００００倍希釈した液
を、ニトロセルロース膜に加え、さらに４０分間室温に
て反応させた。その後、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢ
Ｓで５分間ずつ３回洗浄した。

【０１０４】（８）次いで、ＥＣＬキット（アマシャム
社製）の発色液を５ｍｌだけニトロセルロース膜に加
え、１分間反応させた。その後、このメンブレンをＸ線
フィルムに２０秒間露光し、現像した後、写真撮影し
た。この結果、いずれの抗体を用いた場合も、ニューラ
ライズド遺伝子を導入したＣＯＳ細胞、脳組織、筋肉組
織のそれぞれの溶解液でニューラライズド蛋白質のバン
ドが検出された。これより、抗体Ａおよび抗体Ｂはニュ
ーラライズド蛋白質を認識することが確認された。

【０１０５】実施例５ 組織染色 ヒトの神経系の組織とヒトの脳組織について、抗体Ａお
よび抗体Ｂを用いて下記の操作により免疫染色を行っ
た。 （１）ヒトの脳組織をコンパウンドに入れ、凍結ブロッ
クを作製した。そのブロックについて、クライオスタッ
トで凍結切片にし、その切片をスライドグラスに載せ
た。 （２）次いで、凍結切片組織を１０％バッファードホル
マリン処理を１０分間行って固定した。その後、ＰＢＳ
（ｐＨ７．５）で５分間ずつ３回洗浄した。さらに０．
３％Ｈ₂Ｏ₂／メタノールで３０分処理し、ＰＢＳで２回
洗浄した。 （３）０．１５％ロバ正常血清／ＰＢＳをスライドグラ
ス上の組織の上に載せ、室温で１時間放置しブロッキン
グを行った。

【０１０６】（４）抗体Ａおよび抗体Ｂを１μｇ／ｍｌ
にＰＢＳで希釈したものを、それぞれスライドグラス上
の組織に加え、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．５）で５分間ずつ３回洗浄した。 （５）ＰＢＳで１０００倍希釈したビオチン化ウサギＩ
ｇＧ抗体（アマシャム社製）を組織に加え、室温で１時
間反応させた。その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で５分間
ずつ３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識化アビジン−
ビオチン複合体溶液を加え、４０分間反応させた後、Ｐ
ＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。 （６）０．１％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、０．０
２％Ｈ₂Ｏ₂／ＰＢＳ（ｐＨ７．５）液にスライドグラス
を浸し、室温にて１０分間反応させた。その後、蒸留水
にスライドグラスを移し、反応を止めた。ヘマトキシリ
ン染色後、流水で洗浄した。いずれの抗体を用いた場合
も、脳組織においてニューラライズド蛋白質が染色され
るのが観察された。

【０１０７】実施例６ マウスニューラライズドｃＤＮ
Ａの単離ならびにその塩基配列および該遺伝子がコード
するアミノ酸配列の決定 １．ＤＮＡ断片の取得 ｃＤＮＡライブラリーには、マウス新生仔脳ｃＤＮＡラ
イブラリー（クローンテック社製）を用い、以下の条件
でＰＣＲを行った。フラグメントＡの塩基配列から前記
Ｐ３プライマーを用いて、マウス新生仔脳ｃＤＮＡライ
ブラリーを鋳型としてシングルＰＣＲを下記の条件で行
った。 マウス新生仔脳ｃＤＮＡライブラリー（１μｇ／ｍｌ） １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ ０．６μｌ Ｐ３プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ４．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．７２μｌ 蒸留水 ６．６８μｌ 合計 １４．５μｌ

【０１０８】前記組成の液にミネラルオイル１５μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間」のサイクルを５０回繰り返し反応させ
た。続いて５５℃で２分間、最後に７２℃で１０分間断
片の伸長反応を行いＰＣＲを完了した。

【０１０９】このＰＣＲ産物を鋳型として２度目のＰＣ
Ｒを実施した。前記Ｐ４プライマーと、前記Ｔ３プライ
マーを用いて、下記の条件でＰＣＲを行った。 ＰＣＲ産物 ２μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ Ｐ４プライマー １μｌ Ｔ３プライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ７．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．２μｌ 蒸留水 １１．８μｌ 合計 ２４．５μｌ

【０１１０】前記組成の液にミネラルオイル２０μｌを
重層し、９４℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１分間」のサイクルを４０回繰り返し反応させた。続
いて５５℃で２分間、最後に７２℃で１０分間断片の伸
長反応を行いＰＣＲを完了した。このＤＮＡ断片を、以
降、フラグメントＭＡという。

【０１１１】上記で得た５’伸長反応によるフラグメン
トＭＡをミニゲル電気泳動（０．７５％アガロースゲ
ル）させて、フラグメントＭＡのバンドをゲルから切り
出した。ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（バイオ１０１社製）でフ
ラグメントＭＡを回収して、ミニゲル電気泳動でバンド
をチェックした。

【０１１２】フラグメントＭＡを１μｌ取り、９９μｌ
のＴＥにて希釈した。２６０ｎｍでの吸光度（Ａ２６
０）を測定し、ＤＮＡ濃度を計算した（Ａ２６０が１．
０のときのＤＮＡ濃度を５０μｌ／ｍｌとした。）。Ｄ
ＮＡ濃度が１μｌ／μｌになるようにＴＥでフラグメン
トＭＡを希釈した。

【０１１３】この希釈液について、Ｔ３プライマーを用
いて、ダイターミネーター法により、オートシークエン
サー（ＡＢＩモデル３７３Ａ）を用いて、ＤＮＡシーク
エンスを行い、フラグメントＭＡの塩基配列を決定し
た。

【０１１４】２．マウスニューラライズドｃＤＮＡの取
得 ５’プライマーとしてフラグメントＭＡの一部に相当す
るセンスプライマーＰ９ 5'-GACTCCATCG GGGGCTCCTT C
CC-3' （配列表の配列番号１７に記載の塩基配列）を、
３’プライマーとしてアンチセンスプライマーＰ１０
5'-CTAGGAGCTGCGGTAGGTCT TGA-3' （配列表の配列番号
１８に記載の塩基配列）をＤＮＡ合成機（ＡＢＩモデル
３９２）で合成した。

【０１１５】マウス新生仔脳ｃＤＮＡライブラリー（ク
ローンテック社製）を鋳型として上記のプライマーを用
いて下記の条件でＰＣＲ反応を行った。 ｃＤＮＡ １μｌ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ センスプライマー １μｌ アンチセンスプライマー １μｌ ３．３×ＰＣＲ緩衝液 ７．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．２μｌ 蒸留水 １１．８μｌ 合計 ２４．５μｌ

【０１１６】前記組成の液にミネラルオイル１５μｌを
重層し、９６℃で５分間放置した後、Ｔａｑポリメラー
ゼＸＬ０．５μｌ（登録商標、宝酒造社製）を加え、
「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間」のサイクルを４０回繰り返し反応させ
た。最後に７２℃で１０分間断片の伸長反応を行いＰＣ
Ｒを完了した。

【０１１７】この全長ｃＤＮＡをダイターミネーター法
でシークエンスした。この遺伝子を、ショウジョウバエ
のニューラライズド遺伝子のマウスにおけるホモログ遺
伝子と認定した。この塩基配列を配列表の配列番号４に
示す。またこの遺伝子がコードするマウスニューラライ
ズド蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示
す。

【０１１８】３．形質転換体の作製 上記の塩基配列からなるマウスニューラライズド遺伝子
をｐＣＲＩＩベクター（登録商標、インビトロジェン社
製）のＴＡクローニングサイトに挿入し、該ベクターを
大腸菌ＤＨ５αに導入して形質転換体を作製した。

【０１１９】

【発明の効果】ショウジョウバエニューラライズド遺伝
子は、神経細胞形成の過程で作動する遺伝子群の一つで
あり、その欠失によりショウジョウバエでは幼虫期に未
熟な神経細胞の異常増殖を引き起こすことから、神経系
細胞の増殖・分化誘導シグナルを司る遺伝子と考えられ
ている。本発明により、従来ショウジョウバエで知られ
ていたニューラライズド遺伝子がヒトやマウスといった
脊椎動物、より具体的には哺乳類動物にも存在すること
が明らかとされた。ヒトニューラライズド遺伝子は、脳
と筋肉組織に高発現し、悪性腫瘍形成に関与する遺伝子
の一つとして有力な候補である。本発明のニューラライ
ズド蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子の
アンチセンス遺伝子、該蛋白質を認識する抗体は脳腫瘍
の解析の試薬として有力なツールである。

【０１２０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５７４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Gly Asn Asn Phe Ser Ser Ile Pro Ser Leu Pro Arg Gly Asn Pro 1 5 10 15 Ser Arg Ala Pro Arg Gly His Pro Gln Asn Leu Lys Asp Ser Ile Gly 20 25 30 Gly Pro Phe Pro Val Thr Ser His Arg Cys His His Lys Gln Lys His 35 40 45 Cys Pro Ala Val Leu Pro Ser Gly Gly Leu Pro Ala Thr Pro Leu Leu 50 55 60 Phe His Pro His Thr Lys Gly Ser Gln Ile Leu Met Asp Leu Ser His 65 70 75 80 Lys Ala Val Lys Arg Gln Ala Ser Phe Cys Asn Ala Ile Thr Phe Ser 85 90 95 Asn Arg Pro Val Leu Ile Tyr Glu Gln Val Arg Leu Lys Ile Thr Lys 100 105 110 Lys Gln Cys Cys Trp Ser Gly Ala Leu Arg Leu Gly Phe Thr Ser Lys 115 120 125 Asp Pro Ser Arg Ile His Pro Asp Ser Leu Pro Lys Tyr Ala Cys Pro 130 135 140 Asp Leu Val Ser Gln Ser Gly Phe Trp Ala Lys Ala Leu Pro Glu Glu 145 150 155 160 Phe Ala Asn Glu Gly Asn Ile Ile Ala Phe Trp Val Asp Lys Lys Gly 165 170 175 Arg Val Phe His Arg Ile Asn Asp Ser Ala Val Met Leu Phe Phe Ser 180 185 190 Gly Val Arg Thr Ala Asp Pro Leu Trp Ala Leu Val Asp Val Tyr Gly 195 200 205 Leu Thr Arg Gly Val Gln Leu Leu Asp Ser Glu Leu Val Leu Pro Asp 210 215 220 Cys Leu Arg Pro Arg Ser Phe Thr Ala Leu Arg Arg Pro Ser Leu Arg 225 230 235 240 Arg Glu Ala Asp Asp Ala Arg Leu Ser Val Ser Leu Cys Asp Leu Asn 245 250 255 Val Pro Gly Ala Asp Gly Asp Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Cys Pro 260 265 270 Ile Pro Gln Asn Ser Leu Asn Ser Gln His Ser Arg Ala Leu Pro Ala 275 280 285 Gln Leu Asp Gly Asp Leu Arg Phe His Ala Leu Arg Ala Gly Ala His 290 295 300 Val Arg Ile Leu Asp Glu Gln Thr Val Ala Arg Val Glu His Gly Arg 305 310 315 320 Asp Glu Arg Ala Leu Val Phe Thr Ser Arg Pro Val Arg Val Ala Glu 325 330 335 Thr Ile Phe Val Lys Val Thr Arg Ser Gly Gly Ala Arg Pro Gly Ala 340 345 350 Leu Ser Phe Gly Val Thr Thr Cys Asp Pro Gly Thr Leu Arg Pro Ala 355 360 365 Asp Leu Pro Phe Ser Pro Glu Ala Leu Val Asp Arg Lys Glu Phe Trp 370 375 380 Ala Val Cys Arg Val Pro Gly Pro Leu His Ser Gly Asp Ile Leu Gly 385 390 395 400 Leu Val Val Asn Ala Asp Gly Glu Leu His Leu Ser His Asn Gly Ala 405 410 415 Ala Ala Gly Met Gln Leu Cys Val Asp Ala Ser Gln Pro Leu Trp Met 420 425 430 Leu Phe Gly Leu His Gly Thr Ile Thr Gln Ile Arg Ile Leu Gly Ser 435 440 445 Thr Ile Leu Ala Glu Arg Gly Ile Pro Ser Leu Pro Cys Ser Pro Ala 450 455 460 Ser Thr Pro Thr Ser Pro Ser Ala Leu Gly Ser Arg Leu Ser Asp Pro 465 470 475 480 Leu Leu Ser Thr Cys Ser Ser Gly Pro Leu Gly Ser Ser Ala Gly Gly 485 490 495 Thr Ala Pro Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Glu Ser Pro Val Thr Pro 500 505 510 Gly Leu Gly Gln Trp Ser Asp Glu Cys Thr Ile Cys Tyr Glu His Ala 515 520 525 Val Asp Thr Val Ile Tyr Thr Cys Gly His Met Cys Leu Cys Tyr Ala 530 535 540 Cys Gly Leu Arg Leu Lys Lys Ala Leu His Ala Cys Cys Pro Ile Cys 545 550 555 560 Arg Arg Pro Ile Lys Asp Ile Ile Lys Thr Tyr Arg Ser Ser 565 570

【０１２１】配列番号：２ 配列の長さ：２２０７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 CCGAACGCCC ACGCCAGCGA CCCTGACTCT ATGGCCCCGG GGGAGCGCGC CGGAGCCGCC 60 GCGCCGCCCA CCCCCAGCCG GAACCCTAGC GTCCCGGGGA GCAAGCGGGG AGCCCCGGGC 120 GTCCCCGGCC CCGGCCCAGG GCCCTGCTTG TGGCCCCCGC TCCCGCCACG GGGCATGGGA 180 GGCAGGTAGC CCAGCTCGCG CCAGGACACC CGTGGCGGGC GGAACCCGCC AAGGACCGCG 240 AAGTCCAGAG AAAGGAAGCT GAGGAGCTGC CCGCCCGCCC CCGGCTGCAG CCCCAGCAGG 300 GCCCTCCCCC GGTGGCGCGC ACCCGCGCGC GCACACTCGC ACACCGCACC TCAGCTCCTG 360 CCCGGCCTCG CCCCCACCCG CGAGCGCCGA ACCTCCTGGG GCCGGATGCC ATG GGT 416 AAC AAC TTC TCC AGT ATC CCC TCG CTG CCC CGA GGA AAC CCG AGC CGC 464 GCG CCG CGG GGC CAC CCC CAG AAC CTC AAA GAC TCT ATC GGG GGC CCC 512 TTC CCC GTC ACT TCT CAC CGA TGC CAC CAC AAG CAG AAG CAC TGT CCG 560 GCA GTG CTG CCC AGC GGG GGG CTC CCA GCC ACG CCG CTG CTC TTC CAC 608 CCG CAC ACC AAG GGC TCC CAG ATC CTC ATG GAC CTC AGC CAC AAG GCT 656 GTC AAG AGG CAG GCC AGC TTC TGC AAC GCC ATC ACC TTC AGC AAC CGC 704 CCG GTC CTC ATC TAC GAG CAA GTC AGG CTG AAG ATC ACC AAG AAG CAG 752 TGC TGC TGG AGC GGG GCC CTG CGG CTG GGC TTC ACC AGC AAG GAC CCG 800 TCC CGC ATC CAC CCT GAC TCG CTG CCC AAG TAC GCC TGC CCC GAC CTG 848 GTG TCC CAG AGT GGC TTC TGG GCC AAG GCG CTG CCT GAG GAG TTT GCC 896 AAT GAG GGC AAC ATC ATC GCA TTC TGG GTG GAC AAG AAG GGC CGT GTC 944 TTC CAC CGC ATC AAC GAC TCG GCT GTT ATG CTG TTC TTC AGC GGG GTC 992 CGC ACG GCC GAC CCG CTC TGG GCC CTG GTG GAC GTC TAC GGC CTC ACG 1040 CGG GGC GTC CAG CTG CTT GAT AGC GAG CTG GTG CTC CCG GAC TGT CTG 1088 CGG CCG CGC TCC TTC ACC GCC CTG CGG CGG CCG TCG CTG CGG CGC GAG 1136 GCG GAC GAC GCG CGC CTC TCG GTG AGC CTA TGC GAC CTC AAC GTG CCG 1184 GGC GCG GAC GGC GAC GAG GCC GCG CCG GCC GCC GGC TGC CCC ATC CCG 1232 CAG AAC TCA CTC AAC TCG CAG CAC AGC CGC GCG CTG CCG GCG CAG CTC 1280 GAC GGC GAC CTG CGT TTC CAC GCC CTG CGC GCC GGC GCG CAC GTC CGC 1328 ATC CTC GAC GAG CAG ACG GTG GCG CGC GTG GAG CAC GGG CGC GAC GAG 1376 CGC GCG CTC GTC TTC ACC AGC CGG CCC GTG CGC GTG GCC GAG ACC ATC 1424 TTC GTC AAG GTC ACG CGC TCG GGT GGC GCG CGG CCC GGC GCG CTG TCG 1472 TTC GGC GTC ACC ACG TGC GAC CCC GGC ACG CTG CGG CCG GCC GAC CTG 1520 CCT TTC AGC CCT GAG GCC CTG GTG GAC CGC AAG GAA TTC TGG GCC GTG 1568 TGC CGC GTG CCC GGG CCC CTG CAC AGC GGC GAC ATC CTG GGC CTG GTG 1616 GTC AAC GCC GAC GGC GAG CTG CAC CTC AGC CAC AAT GGC GCG GCC GCC 1664 GGC ATG CAG CTG TGC GTG GAC GCC TCG CAG CCG CTT TGG ATG CTC TTC 1712 GGC CTG CAC GGG ACC ATC ACG CAG ATC CGC ATC CTC GGC TCC ACT ATC 1760 CTG GCC GAG CGG GGT ATC CCG TCA CTC CCC TGC TCC CCT GCC TCC ACG 1808 CCA ACC TCG CCC AGT GCC CTG GGC AGC CGC CTG TCT GAC CCC TTG CTC 1856 AGC ACG TGC AGC TCT GGC CCT CTG GGT AGC TCT GCT GGT GGG ACA GCC 1904 CCC AAT TCG CCA GTG AGC CTG CCC GAG TCG CCA GTG ACC CCA GGT CTG 1952 GGC CAG TGG AGC GAT GAG TGC ACC ATT TGC TAT GAA CAC GCG GTG GAC 2000 ACG GTC ATC TAC ACA TGT GGC CAC ATG TGC CTC TGC TAC GCC TGT GGC 2048 CTG CGC CTC AAG AAG GCT CTG CAC GCC TGC TGC CCC ATC TGC CGC CGC 2096 CCC ATC AAG GAC ATC ATC AAG ACC TAC CGC AGC TCC TAG CCCGTTGCGG 2145 TGGCCCATCC CGCATACCCA TCTTCTCGGG CTTCAGCCCA GTCCCAGCTG AGGAACAAGC 2205 CA 2207

【０１２２】配列番号：３ 配列の長さ：５４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Asp Ser Ile Gly Gly Ser Phe Pro Val Pro Ser His Arg Cys His His 1 5 10 15 Lys Gln Lys His Cys Pro Pro Thr Leu Ser Gly Gly Gly Leu Pro Ala 20 25 30 Thr Pro Leu Leu Phe His Pro His Thr Lys Gly Ser Gln Ile Leu Met 35 40 45 Asp Leu Ser His Lys Ala Val Lys Arg Gln Ala Ser Phe Cys Asn Ala 50 55 60 Ile Thr Phe Ser Asn Arg Pro Val Leu Ile Tyr Glu Gln Val Arg Leu 65 70 75 80 Lys Xaa Thr Lys Lys Gln Cys Cys Trp Ser Gly Ala Leu Arg Leu Gly 85 90 95 Phe Thr Ser Lys Asp Pro Ser Arg Ile His Pro Asp Ser Leu Pro Lys 100 105 110 Tyr Ala Cys Pro Asp Leu Val Ser Gln Ser Gly Phe Trp Ala Lys Ala 115 120 125 Leu Pro Glu Glu Phe Ala Asn Glu Gly Asn Ile Ile Ala Phe Trp Val 130 135 140 Asp Lys Lys Gly Arg Val Phe Tyr Arg Ile Asn Glu Ser Ala Ala Met 145 150 155 160 Leu Phe Phe Ser Gly Val Arg Thr Val Asp Pro Leu Trp Ala Leu Val 165 170 175 Asp Val Tyr Gly Leu Thr Arg Gly Val Gln Leu Leu Asp Ser Glu Leu 180 185 190 Val Leu Pro Asp Cys Leu Arg Pro Arg Ser Phe Thr Ala Leu Arg Arg 195 200 205 Pro Ser Leu Arg Cys Glu Ala Asp Glu Ala Arg Leu Ser Val Ser Leu 210 215 220 Cys Asp Leu Asn Val Pro Gly Ala Asp Gly Asp Asp Gly Ala Pro Pro 225 230 235 240 Ala Gly Cys Pro Ile Pro Gln Asn Ser Leu Asn Ser Gln His Ser Arg 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Leu Arg Phe His Ala Leu Arg 260 265 270 Ala Gly Ala His Val Arg Ile Leu Asp Glu Gln Thr Val Ala Arg Leu 275 280 285 Glu His Gly Arg Asp Glu Arg Ala Leu Val Phe Thr Ser Arg Pro Val 290 295 300 Ser Val Ala Glu Thr Ile Phe Ile Lys Val Thr Arg Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320 Arg Glu Gly Ala Leu Ser Phe Gly Val Thr Thr Cys Asp Pro Gly Thr 325 330 335 Leu Arg Pro Ala Asp Leu Pro Phe Ser Pro Glu Ala Leu Val Asp Arg 340 345 350 Lys Glu Phe Trp Ala Val Cys Arg Val Pro Gly Pro Leu His Ser Gly 355 360 365 Asp Ile Leu Gly Leu Val Val Asn Ala Asp Gly Glu Leu His Leu Ser 370 375 380 His Asn Gly Ala Ala Ala Gly Met Gln Leu Cys Val Asp Ala Ser Gln 385 390 395 400 Pro Leu Trp Met Leu Phe Ser Leu His Gly Ala Ile Thr Gln Val Arg 405 410 415 Ile Leu Gly Ser Thr Ile Met Thr Glu Arg Gly Gly Pro Ser Leu Pro 420 425 430 Cys Ser Pro Ala Ser Thr Pro Thr Ser Pro Ser Ala Leu Gly Ile Arg 435 440 445 Leu Ser Asp Pro Leu Leu Ser Thr Cys Gly Ser Gly Pro Leu Gly Gly 450 455 460 Ser Ala Gly Gly Thr Ala Pro Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Glu Pro 465 470 475 480 Pro Val Thr Pro Gly Leu Gly Gln Trp Ser Asp Glu Cys Thr Ile Cys 485 490 495 Tyr Glu His Ala Val Asp Thr Val Ile Tyr Thr Cys Gly His Met Cys 500 505 510 Leu Cys Tyr Ser Cys Gly Leu Arg Leu Lys Lys Ala Leu His Ala Cys 515 520 525 Cys Pro Ile Cys Arg Arg Pro Ile Lys Asp Ile Ile Lys Thr Tyr Arg 530 535 540 Ser Ser 545

【０１２３】配列番号：４ 配列の長さ：１６４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GAC TCC ATC GGG GGC TCC TTC CCG GTG CCC TCT CAC CGA TGC CAT CAC 48 AAG CAG AAG CAT TGC CCG CCT ACG CTG TCA GGT GGG GGG CTC CCG GCC 96 ACG CCG CTG CTC TTC CAC CCC CAC ACT AAG GGC TCC CAG ATC CTC ATG 144 GAC CTC AGC CAC AAG GCC GTC AAG AGG CAG GCC AGC TTC TGC AAT GCC 192 ATC ACC TTC AGT AAC CGC CCG GTG CTC ATC TAC GAG CAA GTC AGG CTG 240 AAG NTC ACC AAG AAG CAA TGC TGC TGG AGC GGG GCC CTG CGA CTT GGC 288 TTC ACC AGC AAG GAC CCT TCC CGC ATC CAC CCC GAC TCG CTG CCC AAG 336 TAC GCC TGC CCT GAC CTG GTG TCT CAG AGT GGC TTC TGG GCC AAA GCA 384 TTG CCT GAG GAG TTT GCC AAC GAG GGC AAC ATC ATT GCC TTC TGG GTG 432 GAC AAG AAG GGC CGC GTC TTC TAC CGG ATC AAT GAG TCA GCT GCT ATG 480 CTT TTC TTC AGT GGG GTC CGG ACG GTG GAC CCG CTC TGG GCC CTG GTG 528 GAC GTC TAC GGC CTC ACG CGG GGT GTC CAG CTG CTA GAC AGC GAG CTG 576 GTG CTG CCC GAC TGC CTG CGG CCG CGC TCC TTC ACC GCG CTG CGG CGG 624 CCG TCG CTG CGG TGC GAG GCG GAT GAA GCG CGC CTG TCG GTG AGC CTG 672 TGC GAC CTC AAC GTG CCG GGA GCC GAC GGC GAC GAC GGC GCA CCG CCT 720 GCC GGC TGC CCG ATC CCG CAG AAC TCG CTC AAT TCT CAG CAC AGC CGC 768 GCG CTG CCG GCG CAG CTC GAC GGC GAC CTG CGC TTC CAC GCG CTT CGC 816 GCC GGC GCG CAC GTC CGC ATC CTG GAC GAG CAG ACG GTG GCG CGC CTG 864 GAG CAC GGG CGC GAC GAG CGC GCG CTC GTC TTC ACC AGC CGG CCT GTG 912 AGC GTG GCC GAG ACC ATC TTC ATC AAG GTC ACG CGC TCG GGC GGG GGG 960 CGA GCG GGC GCG CTG TCC TTC GGG GTC ACC ACG TGT GAC CCT GGC ACG 1008 CTG CGG CCC GCG GAC CTG CCC TTC AGC CCC GAG GCC CTG GTG GAC CGC 1056 AAG GAG TTC TGG GCG GTG TGT CGC GTG CCC GGG CCT CTG CAC AGC GGC 1104 GAC ATC CTG GGC CTG GTG GTC AAC GCG GAC GGA GAG CTG CAC CTG AGT 1152 CAC AAC GGC GCG GCG GCC GGC ATG CAG CTG TGC GTG GAT GCC TCG CAG 1200 CCC CTC TGG ATG CTC TTC AGC CTG CAT GGC GCC ATC ACG CAG GTC CGC 1248 ATC CTC GGC TCC ACC ATC ATG ACT GAA CGG GGT GGC CCA TCT CTC CCC 1296 TGC TCA CCT GCC TCC ACT CCA ACC TCA CCC AGT GCC CTG GGC ATC CGC 1344 CTC TCT GAC CCC CTG CTC AGC ACC TGC GGT TCT GGG CCC CTA GGT GGC 1392 TCT GCT GGA GGG ACA GCC CCC AAC TCA CCT GTG AGC CTG CCC GAG CCA 1440 CCG GTG ACC CCA GGT CTG GGC CAG TGG AGT GAT GAA TGC ACC ATT TGC 1488 TAT GAA CAC GCA GTG GAT ACA GTC ATC TAC ACG TGT GGC CAC ATG TGC 1536 CTG TGC TAC TCC TGT GGC CTG CGC CTC AAG AAG GCC CTG CAC GCC TGC 1584 TGC CCC ATC TGC CGT CGC CCC ATC AAG GAC ATC ATC AAG ACC TAC CGC 1632 AGC TCC TAG 1641

【０１２４】配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TAGACGTCCA CCAGGGCCCA GAC 23

【０１２５】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CGGAGCACTC TCCACGACTC TAT 23

【０１２６】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AGCACTGCCG GACAGTGCTT CTG 23

【０１２７】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GTGGTGGCAT CGGTGAGAAG TGA 23

【０１２８】配列番号：９ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ATTAACCCTC ACTAAAG 17

【０１２９】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGCCGTGTCT TCCACCGCAT CAA 23

【０１３０】配列番号：１１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CTCGGCTGTT ATGCTGTTCT TCA 23

【０１３１】配列番号：１２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AATACGACTC ACTATAG 17

【０１３２】配列番号：１３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GTGGACGCCT CGCAGCCGCT TTG 23

【０１３３】配列番号：１４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CGATGAGTGC ACCATTTGCT ATG 23

【０１３４】配列番号：１５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AGAGCAGCAG AGGTGGCTGC ACT 23

【０１３５】配列番号：１６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGCTTGTTCC TCAGCTGGGA CTG 23

【０１３６】配列番号：１７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GACTCCATCG GGGGCTCCTT CCC 23

【０１３７】配列番号：１８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ＣＴＡＧＧＡＧＣＴＧ ＣＧＧＴＡＧＧＴＣＴ ＴＧＡ
２３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列を少なくとも有するアミノ酸配列からなる蛋白質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配
   列を少なくとも有するアミノ酸配列からなる蛋白質。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列における一または複数のアミノ酸を置換、欠失または
   付加してなるアミノ酸配列からなる蛋白質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配
   列における一または複数のアミノ酸を置換、欠失または
   付加してなるアミノ酸配列からなる蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか一項に記載
   の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のポリヌクレオチドのう
   ちの一部であって、連続する１２塩基以上からなるポリ
   ヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項５に記載のポリヌクレオチドのア
   ンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌク
   レオチドまたは該アンチセンスポリヌクレオチドの誘導
   体のうちの一部であって、連続する１２塩基以上からな
   るポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 化学修飾された請求項５ないし７のいず
   れか一項に記載のポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 配列表の配列番号２または配列表の配列
   番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡのホモログであ
   るｃＤＮＡを取得する方法であって、請求項５ないし８
   のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのコード領域
   部分からなるポリヌクレオチドをプローブとして、ｃＤ
   ＮＡライブラリーから該プローブとしたポリヌクレオチ
   ドとハイブリダイズするｃＤＮＡを取得する方法。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号２または配列表の配
    列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡのホモログで
    あって、請求項９に記載の方法によって取得されるｃＤ
    ＮＡ。
11. 【請求項１１】 請求項１または２に記載の蛋白質のホ
    モログであって、請求項１０に記載のｃＤＮＡがコード
    するアミノ酸配列からなる蛋白質。
12. 【請求項１２】 請求項１、２、３、４または１１に記
    載の蛋白質を認識する抗体。