JP2000245471A - ギ酸脱水素酵素遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いたギ酸脱水素酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤ⁺に対す
るＫｍ値が小さく、かつ温度安定性やｐＨ安定性の範囲
が広いギ酸脱水素酵素を簡便な方法で大量に、しかも低
コストで製造することに有用な、遺伝子、組換えベクタ
ー、形質転換体及びこれを用いたギ酸脱水素酵素の製造
方法を提供する。 【解決手段】 配列番号１で示されるアミノ酸配列又は
配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなるギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はギ酸脱水素酵素遺伝
子と、この遺伝子を含有する組換えベクター、組換えベ
クターによる形質転換体、並びにこの形質転換体を用い
たギ酸脱水素酵素の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤ⁺と記す）を電子受容体として利用でき
るギ酸脱水素酵素［EC1.2.1.2］は、ギ酸とＮＡＤ⁺より
炭酸を副産物としてＮＡＤＨを生成することから、ＮＡ
ＤＨを必要とする酵素反応系においてＮＡＤＨ再生用酵
素として有望視されている。また、反応生成物が炭酸で
あることから副産物が反応系に蓄積しない利点があり、
工業的規模でのＮＡＤＨ再生用酵素として注目されてい
る。さらに、ギ酸に対するＫｍ値の低い酵素は、ギ酸の
特異的検出や微量定量にも有用である。これまで上記の
ギ酸脱水素酵素は、モラキセラ属細菌（Moraxella sp.:
J. Bacteriol. vol.170, 3189, 1988年）やアクロモバ
クター・パーヴァラス（Achromobacter parvulus: Eur.
J. Biochem vol. 99, 569, 1979年）、シュードモナス
・オキザラティカス（Pseudomonas oxalaticus: Eur.
J. Biochem. vol. 83, 485, 1978年）など由来の酵素が
知られている。しかしながら、これらの菌株はギ酸脱水
素酵素の生産性が低く、また得られるギ酸脱水素酵素
は、比活性が低い、ギ酸及びＮＡＤ⁺に対するギ酸脱水
素酵素のＫｍ値が大きい、温度安定性やｐＨ安定性の範
囲が狭いことなどから、工業的利用に適さないものであ
った。

【０００３】このような問題点を解決するために、本発
明者らはギ酸脱水素酵素の存在が知られているメタノー
ル資化性細菌の分離を広範囲に行った結果、ハイホマイ
クロビウム属（Hyphomicrobium sp.）の微生物が、高い
比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤ⁺に対するＫｍ値が小さ
く、かつ温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広いギ酸脱水
素酵素を生産することを見出し、このギ酸脱水素酵素及
びその製造方法について既に特許を出願している（特願
平10-250930号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の発明により、高
い比活性を有し、ギ酸及びＮＡＤ⁺に対するＫｍ値が小
さく、かつ温度安定性やｐＨ安定性の範囲が広いギ酸脱
水素酵素が得られ、その精製も容易に行うことが可能と
なった。しかしながら、上記の発明において３０Ｌの培
養でギ酸脱水素酵素を製造する場合、メタノールを単一
炭素源とする特殊な培地を用い、６日間という長期に渡
って生産菌体を培養する必要があり、さらにこの微生物
が産生するギ酸脱水素酵素が少量であるために、生産効
率が非常に悪く、ギ酸脱水素酵素の大量生産が困難であ
るという問題点は依然として未解決であった。

【０００５】本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてな
されたものであり、上記のギ酸脱水素酵素を遺伝子工学
的に大量製造するための遺伝子操作材料と、この材料を
用いたギ酸脱水素酵素の製造方法を提供することを目的
としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意研究の結果、ハイホマイク
ロビウム属（Hyphomicrobium sp.）の微生物が産生する
ギ酸脱水素酵素の遺伝子を単離し、その遺伝子のＤＮＡ
塩基配列を解明することにより、本発明に到達した。す
なわち、第１の発明は、配列番号１で示されるアミノ酸
配列又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において１
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され
たアミノ酸配列からなるギ酸脱水素酵素をコードする遺
伝子を要旨とするものである。また、第２の発明は、配
列番号２で示される塩基配列又は配列番号２で示される
塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換も
しくは付加された塩基配列からなるＤＡＮを有し、かつ
ギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子を要旨とするもので
ある。さらに、第３の発明は、上記の遺伝子を含有する
組換えベクターを要旨とするものである。第４の発明
は、上記の組換えベクターを含む形質転換体を、第５の
発明は、この形質転換体を培地中で培養し、培養物から
ギ酸脱水素酵素を採取することを特徴とするギ酸脱水素
酵素の製造方法を要旨とするものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明に係るギ酸脱水素酵素は、
配列番号１で示したアミノ酸配列、あるいは、配列番号
１で示されるアミノ酸配列における１もしくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を
有するタンパク質である。従って、本発明の遺伝子は上
記アミノ酸配列をコードする遺伝子であって、具体的に
は、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡに代表される
遺伝子である。

【０００８】このような遺伝子の単離及びこの遺伝子を
含有する組換えベクターの作成、組換えベクターによる
形質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等は公知の
方法、例えばモレキュラー・クローニング（コールドス
プリングハーバー出版社、１９８９年）に記載されてい
る方法を組み合わせて行なうことができる。例えば遺伝
子は、配列番号２で示される塩基配列の一部配列を合成
し、この合成ＤＮＡをプローブとしてＤＮＡライブラリ
ーから単離する方法、配列番号２で示される塩基配列の
両端部分の合成ＤＮＡをプライマーとし、染色体ＤＮＡ
を鋳型とするＰＣＲ法によって目的遺伝子を増幅する方
法等によって取得することができる。

【０００９】本発明の組換えベクターは、上記のように
して得られたギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含有
するものであり、ベクターに上記のようにして得られた
ギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子を連結することによ
り得ることができる。ベクターとしては、特に限定され
るものではなく、例えばプラスミドベクターpKK223-3
（ファルマシア社製）、pUC19（宝酒造社製）、pBluesc
riptKS(+)（ストラタジーン社製）、pBR322（東洋紡社
製）等があげられる。また、このようにして得られた組
換えベクターを形質転換法により例えば大腸菌、枯草
菌、酵母等に導入することにより、ギ酸脱水素酵素の発
現能を有する形質転換体を得ることができる。このよう
にして製造した形質転換体を用いてギ酸脱水素酵素を製
造する方法としては、形質転換体をギ酸脱水素酵素の生
産に適しかつそれぞれの宿主微生物の生育に適した培地
で、培養、集菌した後、形質転換体の菌体を超音波或い
はリゾチーム等で溶菌し、遠心分離することによって製
造することができる。さらに、遠心上清は市販のイオン
交換樹脂、アフィニティー樹脂等を用いて精製すること
ができる。

【００１０】

【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。

【００１１】実施例１：ハイブリダイゼーションプロー
ブの作製 （１）ギ酸脱水素酵素N末端アミノ酸配列の解析 ハイホマイクロビウム属ＪＣ−１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１６９７３）より精製したギ酸脱水素酵素を、気相ペプ
チドシーケンサー４７３Ａ（Applied Biosytems社製）
を用いて、エドマン分解した後，ＰＴＨアミノ酸誘導体
とし、ＰＴＨアミノ酸誘導体分析装置１２０A（Applied
Biosytems社製）を用いてこの誘導体を解析した。その
結果、ギ酸脱水素酵素のＮ末端２０アミノ酸残基の配列
が、配列番号３で示されるアミノ酸配列であることが解
った。

【００１２】（２）ＦＤＨ保存領域の解析 ８種の異なる微生物に由来するギ酸脱水素酵素のアミノ
酸配列を比較したところ、完全に保存された領域とし
て、配列番号４で示されるアミノ酸配列を見出した。

【００１３】（３）ＰＣＲによるギ酸脱水素酵素遺伝子
の部分増幅とジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベル化 上記で解析したＮ末端アミノ酸配列よりセンスプライマ
ーを、また保存領域のアミノ酸配列よりアンチセンスプ
ライマーをデザインし、図１に示すＤＮＡを合成した。
ハイホマイクロビウム属ＪＣ−１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１６９７３）の菌体１ｇを公知の方法(Saito & Miura,
Biochim.Biophys., Acta, vol.72, p619, 1963)に従い
リゾチーム（生化学工業社製）により溶菌後、ＳＤＳ含
有アルカリ性緩衝液とフェノールでＤＮＡを抽出した。
さらに、ＲＮＡをＲＮアーゼで分解して染色体ＤＮＡを
１ｍｇ精製した。公知の方法(Simpson et al., Bioche
m.Biophys. Res. Commun., vol.151. p487, 1988) に従
って、得られた染色体ＤＮＡのうち１０ｎｇをテンプレ
ートとし、上述のプライマーおよびサーマスアクアティ
カス由来のＤＮＡポリメラーゼ（寶酒造社製）を用いた
ＰＣＲを、９４℃１分、６０℃９０秒、７２℃９０秒の
条件で３０サイクル行った。増幅したＤＮＡ断片（約９
００ｂｐ）は、アガロースゲルで分離した後、βアガラ
ーゼ（寶酒造社製）を用いて抽出精製した。このＤＮＡ
断片をＤＩＧラベリングキット（ベーリンガー・マンハ
イム社製）を用いたランダムプライム法によってＤＩＧ
標識し、以下の実験に用いるプローブとした。

【００１４】実施例２：ギ酸脱水素酵素遺伝子の同定 （１）サザンブロット解析 上記で調製した染色体ＤＮＡ１μｇを制限酵素SalI（寶
酒造社製）で完全分解し、アガローズゲルで電気泳動し
た後、ナイロンメンブレンＮＹ１３Ｎ（Schliecher & S
chuel社製）にトランスファーした。このナイロンメン
ブレンに、上述のＤＩＧ標識プローブを６０℃にて一晩
ハイブリダイズさせた後、室温にて５分間洗浄し、さら
に、６０℃にて１５分の洗浄を２度行った。ＤＩＧデテ
クションキット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用
いたＣＳＰＤによる化学発光を、ＲＸフィルム（富士写
真社製）で検出した結果、約５ｋｂの陽性バンドを得
た。

【００１５】（２）ハイホマイクロビウム属ＪＣ−１７
株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６９７３）染色体ＤＮＡライブラ
リーの作製 上記で得た染色体ＤＮＡのうち１０μｇを制限酵素SalI
（寶酒造社製）で分解し、アガロースゲルで分離した
後、βアガラーゼ（寶酒造社製）を用いて５ｋｂ付近の
断片を抽出精製した。それとは別に、ベクターpBluescr
iptII(+)１μｇ（寶酒造社製）を制限酵素SalIで完全分
解し、細菌由来のアルカリフォスファターゼ（寶酒造社
製）で処理してベクターＤＮＡ断片０．８μｇを得た。
得られた染色体ＤＮＡ断片０．２８μｇとベクターＤＮ
Ａ断片０．１μｇとをＴ４ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼ（寶酒造社製）を用いて１６℃で３０分間ライゲーシ
ョン反応を行い、組換え体ＤＮＡを得た。得られた組換
え体ＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル２００
μｇ（寶酒造社製）に混合し、０℃下で１時間静置した
後、４２℃で１２０秒間加温することにより、形質転換
を行なった。

【００１６】得られた形質転換体を１ｍｌのＬ培地に植
菌し３７℃で１時間培養後、培養液をアンピシリンを含
むＬ寒天平板培地に塗抹し、アンピシリン耐性菌株を得
た。これら菌株をアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ
培地に植菌後一晩培養し、集菌後プラスミドをアルカリ
−ＳＤＳ法により調製し、ハイホマイクロビウム染色体
ＤＮＡライブラリーとした。

【００１７】（３）ギ酸脱水素酵素の遺伝子の単離 上記のハイホマイクロビウム染色体ＤＮＡライブラリー
による形質転換体を、アンピシリンを含むＬ寒天平板培
地に載せたニトロセルローズフィルター上で一晩培養し
た。このフィルターを、２００μｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコールを含むＬ寒天平板培地上に移し、一晩培養し
た後ＳＤＳおよびアルカリで溶菌した。このニトロセル
ローズフィルターを、上述のサザンブロット解析と同じ
条件でコロニーハイブリダイゼーションすることによ
り、約２０００のコロニーを調べた結果、４株の陽性ク
ローンを得た。

【００１８】（４）ギ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列の
決定 上記の４株の陽性クローンから１株を選び、アンピシリ
ンを５０μｇ／ｍｌ含むＬ培地１００ｍｌに植菌した。
３７℃にて一晩培養した後アルカリ−ＳＤＳ法によりプ
ラスミドを調整し、このプラスミドをpFSIとした。pFSI
１μｇを、公知の方法（Sanger, Nicklen & Coulson, P
roc. Natl. Acad. Sci., vol.74, p5463, 1977)に従
い、ダイデオキシチェーンターミネーション反応での塩
基配列解析に供した。反応にはTaq dye primer cycle S
equencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いた。
上記反応物をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（Applied Bi
osystems社製）を用いて分析することにより、配列番号
２で示される１１９７塩基対の塩基配列を決定した。

【００１９】実施例３：ギ酸脱水素酵素発現プラスミド
の構築 配列番号５で示されるギ酸脱水素酵素遺伝子の開始コド
ン１塩基上流から１９塩基目までの配列の５’末端にEc
oRI認識配列をつなげたＤＮＡおよび、配列番号６で示
されるギ酸脱水素酵素遺伝子の終止コドン下流９８塩基
目から１１７塩基までのアンチセンス配列の５’末端に
HindIII認識配列をつなげたＤＮＡをそれぞれ合成し、
ＰＣＲプライマーとした。プラスミドpFSI１０ｎｇをテ
ンプレートとし、上述のプライマーおよびサーマスアク
アティカス由来のＤＮＡポリメラーゼ（寶酒造社製）を
用いたＰＣＲを、９４℃で１分、６０℃で９０秒、７２
℃で９０秒の条件で３０サイクル行った。増幅したＤＮ
Ａ断片（約１３００ｂｐ）を、アガロースゲルで分離し
た後、βアガラーゼ（寶酒造社製）を用いて抽出精製し
た。このＤＮＡ断片と１５０ｎｇとpT７Blue T-vector
（Novagen社製）１００ｎｇを混合し、Ｔ４ファージ由
来のＤＮＡリガーゼ（寶酒造社製）を用い１６℃で３０
分間ライゲーションした。得られたプラスミドを、制限
酵素EcoRI（寶酒造社製）およびHindIII（寶酒造社製）
で切断し、アガロースゲルで分離した後、ギ酸脱水素酵
素遺伝子を含むＤＮＡ断片をβアガラーゼ（寶酒造社
製）を用いて抽出精製した。一方、pKK223-3（ファルマ
シア社製）を、ＳＤ配列下流に位置するEcoRI認識部位
およびマルチクローニングサイトのHindIII認識部位で
切断した。

【００２０】上記のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ
断片１５０ｎｇとベクターＤＮＡ（pKK223-3）断片１０
０ｎｇを、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（寶酒造
社製品）を用い１６℃で３０分間連結反応を行い、ギ酸
脱水素酵素遺伝子を含有する組換えベクターpKKFDHを得
た。図１はこの組換えベクターpKKFDHの作製概要図であ
る。次いで、pKKFDHを大腸菌JM109コンピテントセル２
００μｌ（寶酒造社製）に混合し、０℃下で１時間静置
後、４２℃で１２０秒間加温し、形質転換を行なった。
得られた形質転換体を１ｍｌのＬ培地に植菌して３７℃
で１時間培養した後、培養液をアンピシリンを５０μｇ
／ｍｌ含むＬ寒天平板に塗抹して、ギ酸脱水素酵素遺伝
子を含む形質転換大腸菌のコロニーを１００個得た。こ
れを大腸菌（エシェリチア・コリ）JM109/pKKFDHとし
た。

【００２１】実施例４：大腸菌でのギ酸脱水素酵素の製
造 実施例３で作成した形質転換大腸菌JM109/pKKFDHをアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ培地３００ｍｌに植菌
後、３７℃にて一晩前培養を行なった。前培養液をアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ培地３０Ｌに植菌し、
３７℃にて８時間培養後イソプロピルβチオガラクトピ
ラノシドを１ｍＭ加え、さらに１０時間培養した後集菌
した。得られた菌体は、１ｍＭのジチオスライトールを
含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０
００ｍｌに懸濁後、Insonator210M（KUBOTA社製）を用
いて超音波処理した。菌体破砕物を除いた上澄より、Ｄ
ＥＡＥ−セファセルカラムクロマトグラフィー、フェニ
ルセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーお
よび５’ＡＭＰ−セファロース４Ｂカラムクロマトグラ
フィーを用いてギ酸脱水素酵素の精製を行ない、ギ酸脱
水素酵素を３０００ユニット回収した。

【００２２】以上の結果から、ハイホマイクロビウム属
ＪＣ−１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６９７３）を３０Ｌ培
養する場合の培養時間は前培養を含めて約１５０時間、
酵素活性量は１５００ユニットであるので、単位時間、
単位培養液量あたりのギ酸脱水素酵素生産量は、１０倍
に向上することがわかる。また、得られたギ酸脱水素酵
素の性質を調べたところ、５０℃、１時間処理後の残存
活性は１００％、至適作用ｐＨは６．０〜７．５、ギ酸
およびＮＡＤ⁺に対するＫｍはそれぞれ１．０８ｍＭ、
０．０５ｍＭであった。これらの結果から、本発明の方
法によって得られたギ酸脱水素酵素が、ハイホマイクロ
ビウム属ＪＣ−１７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６９７３）由
来のギ酸脱水素酵素と同じ性質を有するものでることが
確認された。

【００２３】なお、ギ酸脱水素酵素の活性測定法並びに
活性表示法は以下の通りである。すなわち、活性測定に
用いた反応溶液組成は、５０μｍｏｌKPB、５μｍｏｌ
ギ酸、1μｍｏｌＮＡＤ⁺、適当量の蒸留水で最終体積を
１ｍｌとした。反応は酵素溶液の添加によって開始し、
３０℃で１分間行い、酵素反応によって生成するＮＡＤ
Ｈ増加の初速度を分光光度計（３４０ｎｍ）で測定し
た。ＮＡＤ⁺の分子吸光係数は６２２０Ｍ^-1ｃｍ^-1と
し、１μｍｏｌのギ酸を１分間に消費できる酵素量を１
ユニットとした。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、高い比活性を有し、ギ
酸及びＮＡＤ⁺に対するＫｍ値が小さく、かつ温度安定
性やｐＨ安定性の範囲が広いギ酸脱水素酵素を簡便な方
法で大量に、しかも低コストで製造することが可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むプラスミ
ドｐＫＫＦＤＨの構築の手順を示す図である。

【配列表】 <110> UNITIKA LTD. <120> NUCLEIC ACIDS ENCODING FORMATE DEHYDROGENASE, VECTOR AND TRANSFORM ANT THEREOF, AND METHOD FOR PRODUSING FORMATE DEHYDROGENASE THEREWITH <130> P0017863 <160> 6 <210> 1 <211> 399 <212> PRT <213> Hyphomicrobium sp. <400> 1 Met Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asn Gly Tyr 1 5 10 15 Pro Lys Ser Tyr Ala Arg Asp Asp Ile Pro Lys Ile Thr Lys Tyr Pro 20 25 30 Asp Gly Gln Thr Thr Pro Thr Pro Gln Ala Ile Asp Phe Val Pro Gly 35 40 45 His Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Ala 65 70 75 80 Asn Ser Arg Leu Asp Gln Glu Leu Pro Asp Ala Glu Ile Val Ile Ser 85 90 95 Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Met Thr Ala Glu Arg Ile Ala Lys Ala 100 105 110 Pro Lys Leu Lys Met Ile Val Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Thr 115 120 125 Asp Leu Gln Ala Ala Met Asp Arg Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Tyr Cys Asn Ser Asn Ser Val Ala Glu His Val Val Met Gln Met Leu 145 150 155 160 Ser Leu Val Arg Asn Tyr ile Pro Ser Tyr Asn Trp Val Ile Lys Gly 165 170 175 Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu Arg Ser Tyr Asp Ile Glu Gly 180 185 190 Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Arg Val Leu 195 200 205 Arg Leu Leu Lys Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Met Asp Arg Tyr 210 215 220 Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr His His Thr 225 230 235 240 Ser Leu Glu Ser Leu Thr Lys Ala Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys 245 250 255 Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys 260 265 270 Asn Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285 Cys Asp Arg Asp Ala Ile Val Arg Ala Leu Glu Ser Gly Gln Leu Ala 290 295 300 Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Gln Asp His 305 310 315 320 Pro Trp Arg Lys Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335 Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 340 345 350 Leu Glu Cys Tyr Phe Asp Lys Lys Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile 355 360 365 Val Gln Gly Gly Lys Leu Ala Gly Val Gly Ala His Ser Tyr Ser Ala 370 375 380 Gly Asn Ala Thr Ser Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Arg 385 390 395 <210> 2 <211> 1197 <212> DNA <213> Hyphomicrobium sp. <400> 2 atg gct aag atc gta tgt gtg ctc tac gac gac ccc gtc aac gga tat 48 Met Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asn Gly Tyr 1 5 10 15 ccg aaa tcc tac gcg cgg gac gac atc ccc aaa att acg aaa tac ccc 96 Pro Lys Ser Tyr Ala Arg Asp Asp Ile Pro Lys Ile Thr Lys Tyr Pro 20 25 30 gat gga caa acg acc ccg acg ccg cag gcg atc gat ttc gtt cca ggg 144 Asp Gly Gln Thr Thr Pro Thr Pro Gln Ala Ile Asp Phe Val Pro Gly 35 40 45 cat ctt ctc ggt agc gta tcg ggc gaa ctt ggg ctt cgc aaa tac cta 192 His Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu 50 55 60 gag agc aat ggc cat acg ctg gtt gtc acc tcc gac aag gat ggt gcc 240 Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Ala 65 70 75 80 aat tcc aga ctg gac caa gaa ctg ccg gac gct gag atc gtc atc tcg 288 Asn Ser Arg Leu Asp Gln Glu Leu Pro Asp Ala Glu Ile Val Ile Ser 85 90 95 caa ccg ttc tgg cca gca tac atg acg gcg gag cga att gcg aaa gcg 336 Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Met Thr Ala Glu Arg Ile Ala Lys Ala 100 105 110 ccg aaa ctg aaa atg att gtt act gct ggc atc ggc tcc gat cac acc 384 Pro Lys Leu Lys Met Ile Val Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Thr 115 120 125 gac ctg cag gcg gcc atg gat cgc ggc att acc gtc gca gaa gtc acg 432 Asp Leu Gln Ala Ala Met Asp Arg Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 tac tgc aac tcc aac agc gtc gcc gag cat gtc gtc atg cag atg ctg 480 Tyr Cys Asn Ser Asn Ser Val Ala Glu His Val Val Met Gln Met Leu 145 150 155 160 tcg ctc gtc cgc aac tac atc ccc tcg tat aat tgg gta atc aag ggt 528 Ser Leu Val Arg Asn Tyr ile Pro Ser Tyr Asn Trp Val Ile Lys Gly 165 170 175 ggg tgg aac atc gcc gat tgc gtt gag cga tct tac gac atc gag ggt 576 Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu Arg Ser Tyr Asp Ile Glu Gly 180 185 190 atg cac gtc ggt aca gtt gcg gca ggc cgc atc ggc ttg cgc gtg ttg 624 Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Arg Val Leu 195 200 205 cgt ctg ctg aaa ccc ttc gat gtg cat ctt cac tat atg gat cgc tac 672 Arg Leu Leu Lys Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Met Asp Arg Tyr 210 215 220 aag ctg ccc gat gca gtt gaa aag gaa ctc aac ctc acg cat cac acg 720 Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr His His Thr 225 230 235 240 agc ctg gaa agc ctc acc aag gct tgc gac gtc gta acg ttg aac tgc 768 Ser Leu Glu Ser Leu Thr Lys Ala Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys 245 250 255 ccg ctt cat ccc gaa acc gag cat atg atc aac gat aag acc ctg aaa 816 Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys 260 265 270 aac ttc aag cgc ggc gca tac ctt gtg aac aca gct cgc ggc aaa ctc 864 Asn Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285 tgc gat cgg gac gcc atc gta cgc gcg ctc gaa agc ggg cag ctt gca 912 Cys Asp Arg Asp Ala Ile Val Arg Ala Leu Glu Ser Gly Gln Leu Ala 290 295 300 ggt tat gcg ggt gac gtt tgg ttt cca cag ccg gcg ccg caa gac cat 960 Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Gln Asp His 305 310 315 320 cct tgg cgg aag atg ccg cat cac ggc atg aca ccg cac att tcc ggc 1008 Pro Trp Arg Lys Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335 acg tcg ctt tcg gca caa gca agg tac gca gcc gga acg cgg gaa att 1056 Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 340 345 350 ctt gaa tgt tat ttc gac aag aag ccc atc cgc aac gag tac ttg att 1104 Leu Glu Cys Tyr Phe Asp Lys Lys Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile 355 360 365 gtt caa ggc ggc aag ctc gcc ggt gtc ggc gcg cac tcg tat agc gca 1152 Val Gln Gly Gly Lys Leu Ala Gly Val Gly Ala His Ser Tyr Ser Ala 370 375 380 ggc aac gca act tcc ggc tcg gaa gaa gcc gcg aag ttt aaa cgc 1197 Gly Asn Ala Thr Ser Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Arg 385 390 395 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Hyphomicrobium sp. <400> 3 Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asn Gly Tyr Pro 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ala 20 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Hyphomicrobium sp. <400> 4 Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gaattcgatg gctaagatcg tatgtg 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 aagcttctaa acggtgctgc ggagaa 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA03 DA05 DA06 EA04 4B050 CC03 DD02 FF09E FF11E FF14E LL05 4B065 AA01X AA01Y AA26X AB01 AC14 CA28 CA60

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列又は
   配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなるギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列又は配列
   番号２で示される塩基配列において１もしくは数個の塩
   基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤ
   ＮＡを有し、かつギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１ないし２の遺伝子を含有する組
   換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地中で培
   養し、培養物からギ酸脱水素酵素を採取することを特徴
   とするギ酸脱水素酵素の製造方法。