JPH04228079A - セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質 - Google Patents
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はセファロスポリン・アセ
チルハイドロラ−ゼ遺伝子、該遺伝子を大腸菌の宿主・
ベクタ−系で用いられるベクタ−に組込んだ組換えＤＮ
Ａ分子、該組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌、
該遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を有するタン
パク質、該タンパク質の多量体、好ましくは４量体また
は８量体からなる酵素、および該タンパク質または該酵
素の製造法に関する。
チルハイドロラ−ゼ遺伝子、該遺伝子を大腸菌の宿主・
ベクタ−系で用いられるベクタ−に組込んだ組換えＤＮ
Ａ分子、該組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌、
該遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を有するタン
パク質、該タンパク質の多量体、好ましくは４量体また
は８量体からなる酵素、および該タンパク質または該酵
素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、セファロスポリン類、例えば
セファロスポリンＣおよび７アミノセファロスポラン酸
（以下７ＡＣＡと略記）などは、その３位のヒドロキシ
メチル基に結合したアセチル基を除去する反応（以下脱
アセチル化と略記）により、デアセチルセファロスポリ
ンＣあるいはデアセチル７ＡＣＡなどに誘導され、これ
らを出発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質
が合成され、医薬品として実用に供されている。セファ
ロスポリン類の脱アセチル化の方法としては、化学的あ
るいは酵素的方法があるが、中性に近いｐＨで、また常
温で反応が実施可能であり、副反応が少ない酵素法が有
利であると考えられており、既に幾つかの方法が開示さ
れている（特開昭５９−１０８７９０、特開昭４９−１
３２２９４および特開昭６１−６７４８９、米国特許第
３３０４２３６などが挙げられる）。
セファロスポリンＣおよび７アミノセファロスポラン酸
（以下７ＡＣＡと略記）などは、その３位のヒドロキシ
メチル基に結合したアセチル基を除去する反応（以下脱
アセチル化と略記）により、デアセチルセファロスポリ
ンＣあるいはデアセチル７ＡＣＡなどに誘導され、これ
らを出発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質
が合成され、医薬品として実用に供されている。セファ
ロスポリン類の脱アセチル化の方法としては、化学的あ
るいは酵素的方法があるが、中性に近いｐＨで、また常
温で反応が実施可能であり、副反応が少ない酵素法が有
利であると考えられており、既に幾つかの方法が開示さ
れている（特開昭５９−１０８７９０、特開昭４９−１
３２２９４および特開昭６１−６７４８９、米国特許第
３３０４２３６などが挙げられる）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは土壌より
分離したバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）の一菌株がセファロスポリン・アセチル
ハイドロラ−ゼを産生し、セファロスポリン類を脱アセ
チル化してデアセチルセファロスポリン類を効率良く生
産することを見出した。このことから、セファロスポリ
ン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著量生産する菌株を
造成すれば、工業的に飛躍的に有利なデアセチルセファ
ロスポリン類の製造法が確立されるものと推定される。 これまで、このようなセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼのみを著量生産する菌株は知られていなかっ
た。
分離したバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）の一菌株がセファロスポリン・アセチル
ハイドロラ−ゼを産生し、セファロスポリン類を脱アセ
チル化してデアセチルセファロスポリン類を効率良く生
産することを見出した。このことから、セファロスポリ
ン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著量生産する菌株を
造成すれば、工業的に飛躍的に有利なデアセチルセファ
ロスポリン類の製造法が確立されるものと推定される。 これまで、このようなセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼのみを著量生産する菌株は知られていなかっ
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、セファロ
スポリン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著量生産する
菌株を得るために、鋭意研究を重ねた結果、土壌より新
たに分離したバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）の一菌株よりセファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼ遺伝子を担うＤＮＡ断片を分離し、大腸菌でこ
れをクロ−ニングすることに成功し、該ＤＮＡ断片をベ
クタ−に組込んだ組換えＤＮＡで形質転換した大腸菌が
著量のセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを生
産することを見出した。本発明者らは、これらの知見に
基づいて本発明を完成するに至った。
スポリン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著量生産する
菌株を得るために、鋭意研究を重ねた結果、土壌より新
たに分離したバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）の一菌株よりセファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼ遺伝子を担うＤＮＡ断片を分離し、大腸菌でこ
れをクロ−ニングすることに成功し、該ＤＮＡ断片をベ
クタ−に組込んだ組換えＤＮＡで形質転換した大腸菌が
著量のセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを生
産することを見出した。本発明者らは、これらの知見に
基づいて本発明を完成するに至った。
【０００５】本発明のセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼ遺伝子を提供するバシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の一菌株は１９９０年２月１５日
から茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５
）に 「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＳ
０１３３」 受託番号微工研条寄第２７５５号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２７５５）としてブダペスト条約に基づき、
寄託されている。
ドロラ−ゼ遺伝子を提供するバシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の一菌株は１９９０年２月１５日
から茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５
）に 「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＳ
０１３３」 受託番号微工研条寄第２７５５号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２７５５）としてブダペスト条約に基づき、
寄託されている。
【０００６】以下、本発明をさらに詳しく説明する。
バシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＨＳ
０１３３株の諸性状 １．染色体ＤＮＡのｍｏｌ％（Ｇ＋Ｃ）：４３．４２．
形態： グラム陽性の短桿菌で、その大きさは（０．７〜０．８
）×（１．８〜２．６）μｍであり、周毛を有する。好
気的条件下で良く生育するが、グルコ−スを含む天然培
地では嫌気的条件下でも弱い生育を示す。細胞の中央に
胞子を形成し、その大きさは０．８×（１．３〜１．７
）μｍである。 ３．培養所見 （１）肉汁寒天平板培地（３０℃、７日間）形成の遅速
：２４時間でコロニ−形成 形：不定状 表面の状態：ひだがある 周縁：波状 高さ：丘状 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 （２）肉汁寒天斜面培地（３０℃、７日間）生育の良否
：良好 形：糸線状 表面の状態：ひだがある 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 粘稠性：牛酪質 （３）肉汁液体培養（３０℃、７日間）表面の生育状態
：液面に厚膜ができる 濁度：少量 臭気：わずかな芳香 沈殿：粘稠 沈殿の量：僅少 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養（２４℃、３０日間）穿刺
溝内の生育：穿刺線にそって一様に生育する。 菌層の形：糸線状 液化の状態と形：２４℃で７日目には地層状に０．５ｍ
ｍ液化する。 （５）リトマス・ミルク：リトマスを還元する。凝固す
ることなくカゼインは急速 に消化される。
０１３３株の諸性状 １．染色体ＤＮＡのｍｏｌ％（Ｇ＋Ｃ）：４３．４２．
形態： グラム陽性の短桿菌で、その大きさは（０．７〜０．８
）×（１．８〜２．６）μｍであり、周毛を有する。好
気的条件下で良く生育するが、グルコ−スを含む天然培
地では嫌気的条件下でも弱い生育を示す。細胞の中央に
胞子を形成し、その大きさは０．８×（１．３〜１．７
）μｍである。 ３．培養所見 （１）肉汁寒天平板培地（３０℃、７日間）形成の遅速
：２４時間でコロニ−形成 形：不定状 表面の状態：ひだがある 周縁：波状 高さ：丘状 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 （２）肉汁寒天斜面培地（３０℃、７日間）生育の良否
：良好 形：糸線状 表面の状態：ひだがある 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 粘稠性：牛酪質 （３）肉汁液体培養（３０℃、７日間）表面の生育状態
：液面に厚膜ができる 濁度：少量 臭気：わずかな芳香 沈殿：粘稠 沈殿の量：僅少 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養（２４℃、３０日間）穿刺
溝内の生育：穿刺線にそって一様に生育する。 菌層の形：糸線状 液化の状態と形：２４℃で７日目には地層状に０．５ｍ
ｍ液化する。 （５）リトマス・ミルク：リトマスを還元する。凝固す
ることなくカゼインは急速 に消化される。
【０００７】４．生化学的諸性状
（１）硝酸塩の還元：陽性
（２）脱窒反応：陽性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陽性
（５）インド−ルの生成：陰性
（６）Ｈ２Ｓの生成：酢酸鉛紙：陰性
ＴＳＩ：陰性
クリ−グラ−：陰性
（７）デンプンの加水分解：陽性
（８）クエン酸の利用：コ−ザ−：陽性クリステンセン
：陽性 （９）無機窒素源の利用：硝酸塩：陽性アンモニウム塩
：陽性 （１０）色素の生成：茶色の色素を生成する。 （１１）ウレア−ゼテスト：陽性 （１２）オキシダ−ゼテスト：陽性 （１３）カタラ−ゼテスト：陽性 （１４）ｐＨ：生育範囲：１．５〜８．８至適：６．０
〜８．８ （１５）温度：生育範囲：１６．５℃〜５０．５℃至適
：２６．０℃〜３６．０℃ （１６）ＯＦテスト：Ｄ−グルコ−ス：発酵的に生酸す
るがガスは生成しない。ラクト−ス：発酵的に生酸する
がガスは生成しない。 （１７）糖類からの酸およびガスの生成：■ 以下の糖
類からは酸を生成するが、ガスは生成しない。 Ｌ−アラビノ−ス、Ｄ−キシロ−ス、Ｄ−グルコ−ス、
Ｄ−マンノ−ス、Ｄ−フラクト−ス、マルト−ス、シュ
クロ−ス、トレハロ−ス、Ｄ−マンニト−ル、グリセロ
−ル、スタ−チ ■ 以下の糖類からは、酸およびガスを生成しない。Ｄ
−ガラクト−ス、ラクト−ス、Ｄ−ソルビト−ル、イノ
シト−ル （１８）栄養要求性：なし （１９）ペクチンの分解：陽性 （２０）馬尿酸の分解：陰性 （２１）レヴァンの生成（シュクロ−ス、ラフィノ−ス
から）：陽性 （２２）アルギニン・ハイドロラ−ゼ：陰性（２３）レ
シチナ−ゼ：陰性 （２４）嫌気下の生育：Ｄ−グルコ−スを含む天然培地
で弱い生育を示す。
：陽性 （９）無機窒素源の利用：硝酸塩：陽性アンモニウム塩
：陽性 （１０）色素の生成：茶色の色素を生成する。 （１１）ウレア−ゼテスト：陽性 （１２）オキシダ−ゼテスト：陽性 （１３）カタラ−ゼテスト：陽性 （１４）ｐＨ：生育範囲：１．５〜８．８至適：６．０
〜８．８ （１５）温度：生育範囲：１６．５℃〜５０．５℃至適
：２６．０℃〜３６．０℃ （１６）ＯＦテスト：Ｄ−グルコ−ス：発酵的に生酸す
るがガスは生成しない。ラクト−ス：発酵的に生酸する
がガスは生成しない。 （１７）糖類からの酸およびガスの生成：■ 以下の糖
類からは酸を生成するが、ガスは生成しない。 Ｌ−アラビノ−ス、Ｄ−キシロ−ス、Ｄ−グルコ−ス、
Ｄ−マンノ−ス、Ｄ−フラクト−ス、マルト−ス、シュ
クロ−ス、トレハロ−ス、Ｄ−マンニト−ル、グリセロ
−ル、スタ−チ ■ 以下の糖類からは、酸およびガスを生成しない。Ｄ
−ガラクト−ス、ラクト−ス、Ｄ−ソルビト−ル、イノ
シト−ル （１８）栄養要求性：なし （１９）ペクチンの分解：陽性 （２０）馬尿酸の分解：陰性 （２１）レヴァンの生成（シュクロ−ス、ラフィノ−ス
から）：陽性 （２２）アルギニン・ハイドロラ−ゼ：陰性（２３）レ
シチナ−ゼ：陰性 （２４）嫌気下の生育：Ｄ−グルコ−スを含む天然培地
で弱い生育を示す。
【０００８】以上の結果より、当該菌株の分類学的性質
をバ−ジ−ズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジ−２巻［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ Ｖｏｌ． ２ （１９８６）］の記載と対比す
ることによってバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）の一菌株であると同定し、本菌をバシラス・サ
チリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＨＳ０１３３（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＳ０１３３）
と命名した。
をバ−ジ−ズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジ−２巻［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ Ｖｏｌ． ２ （１９８６）］の記載と対比す
ることによってバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）の一菌株であると同定し、本菌をバシラス・サ
チリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＨＳ０１３３（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＳ０１３３）
と命名した。
【０００９】本発明は、図１に示されるアミノ酸配列を
コ−ドするＤＮＡ塩基配列、好ましくは図２および図３
（図中、＊＊＊は終止コドンを示す）のＤＮＡ塩基配列
を大腸菌の宿主・ベクタ−系で用いられるベクタ−に組
込み、得られた組換えＤＮＡ分子で形質転換した組換え
微生物によりセファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼを製造することを包含し、その方法は下記の工程から
なる。しかしながら、本発明によってセファロスポリン
・アセチルハイドロラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列
が明らかになることにより、これら工程の一部を省略ま
たは簡略化できることは当業者の認めるところであろう
。
コ−ドするＤＮＡ塩基配列、好ましくは図２および図３
（図中、＊＊＊は終止コドンを示す）のＤＮＡ塩基配列
を大腸菌の宿主・ベクタ−系で用いられるベクタ−に組
込み、得られた組換えＤＮＡ分子で形質転換した組換え
微生物によりセファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼを製造することを包含し、その方法は下記の工程から
なる。しかしながら、本発明によってセファロスポリン
・アセチルハイドロラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列
が明らかになることにより、これら工程の一部を省略ま
たは簡略化できることは当業者の認めるところであろう
。
【００１０】（１）バシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５５）を適当なセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ生産培地にて
培養した培養液よりセファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼを分離・精製し、適当なタンパク質断片化に用
いられるプロテア−ゼを用いて消化し、各ペプチド断片
を分離した後、一断片のアミノ末端よりアミノ酸配列を
決定する。
ｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５５）を適当なセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ生産培地にて
培養した培養液よりセファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼを分離・精製し、適当なタンパク質断片化に用
いられるプロテア−ゼを用いて消化し、各ペプチド断片
を分離した後、一断片のアミノ末端よりアミノ酸配列を
決定する。
【００１１】（２）得られたセファロスポリン・アセチ
ルハイドロラ−ゼに由来するペプチド断片のアミノ酸配
列の一部分について、対応する遺伝子のＤＮＡ塩基配列
を推定し、適当な領域の配列をもつオリゴヌクレオチド
の混合物を化学合成し、５’末端を３２Ｐで標識し、遺
伝子クロ−ニングのプロ−ブとして使用する。
ルハイドロラ−ゼに由来するペプチド断片のアミノ酸配
列の一部分について、対応する遺伝子のＤＮＡ塩基配列
を推定し、適当な領域の配列をもつオリゴヌクレオチド
の混合物を化学合成し、５’末端を３２Ｐで標識し、遺
伝子クロ−ニングのプロ−ブとして使用する。
【００１２】（３）バシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）から染色体ＤＮＡを抽出・精製し、各種制
限酵素で消化したのち、アガロ−スゲル電気泳動を行な
い、分離したＤＮＡ断片をゲルからニトロセルロ−ス膜
に移し取る。このニトロセルロ−ス膜と上記工程（２）
で調製した３２Ｐ標識プロ−ブを用いてサザンハイブリ
ダイゼ−ションを行ない、プロ−ブと相補性を示すＤＮ
Ａ断片を調べる。相補性を示したＤＮＡ断片の中でセフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼタンパク質の分
子量から予想される遺伝子のサイズよりやや大きいＤＮ
Ａ断片を選択し、アガロ−スゲル上でそのＤＮＡ断片が
含まれている領域を切り出しＤＮＡを抽出する。
ｔｉｌｉｓ）から染色体ＤＮＡを抽出・精製し、各種制
限酵素で消化したのち、アガロ−スゲル電気泳動を行な
い、分離したＤＮＡ断片をゲルからニトロセルロ−ス膜
に移し取る。このニトロセルロ−ス膜と上記工程（２）
で調製した３２Ｐ標識プロ−ブを用いてサザンハイブリ
ダイゼ−ションを行ない、プロ−ブと相補性を示すＤＮ
Ａ断片を調べる。相補性を示したＤＮＡ断片の中でセフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼタンパク質の分
子量から予想される遺伝子のサイズよりやや大きいＤＮ
Ａ断片を選択し、アガロ−スゲル上でそのＤＮＡ断片が
含まれている領域を切り出しＤＮＡを抽出する。
【００１３】（４）上記工程（３）のＤＮＡを大腸菌の
クロ−ニングベクタ−に組込み、大腸菌に導入したのち
、寒天培地上でコロニ−を形成させ、３２Ｐ標識プロ−
ブを用いてコロニ−ハイブリダイゼ−ションを行わせる
。プロ−ブと相補性を示す大腸菌のコロニ−を選択・分
離する。
クロ−ニングベクタ−に組込み、大腸菌に導入したのち
、寒天培地上でコロニ−を形成させ、３２Ｐ標識プロ−
ブを用いてコロニ−ハイブリダイゼ−ションを行わせる
。プロ−ブと相補性を示す大腸菌のコロニ−を選択・分
離する。
【００１４】（５）選択された大腸菌の菌株より組換え
プラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素切断地図を作成し
た後、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝
子と無関係な領域を切断・除去するとともにベクタ−に
組込まれたバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）由来のＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。決定された
ＤＮＡ塩基配列から予測されるアミノ酸配列をセファロ
スポリン・アセチルハイドロラ−ゼのアミノ酸部分配列
、分子量、末端アミノ酸分析、アミノ酸組成分析と照合
し、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺
伝子部分を決定する。
プラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素切断地図を作成し
た後、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝
子と無関係な領域を切断・除去するとともにベクタ−に
組込まれたバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）由来のＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。決定された
ＤＮＡ塩基配列から予測されるアミノ酸配列をセファロ
スポリン・アセチルハイドロラ−ゼのアミノ酸部分配列
、分子量、末端アミノ酸分析、アミノ酸組成分析と照合
し、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺
伝子部分を決定する。
【００１５】（６）セファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片に適当な修飾を施した
上で、大腸菌由来のプロモ−タ−の後に構造遺伝子が結
合するように大腸菌の遺伝子発現ベクタ−に組込ませて
発現用組換えプラスミドを造成する。
ロラ−ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片に適当な修飾を施した
上で、大腸菌由来のプロモ−タ−の後に構造遺伝子が結
合するように大腸菌の遺伝子発現ベクタ−に組込ませて
発現用組換えプラスミドを造成する。
【００１６】（７）発現用組換えプラスミドを大腸菌宿
主に導入し、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼを産生する新規な大腸菌を造成する。
主に導入し、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼを産生する新規な大腸菌を造成する。
【００１７】上記の工程中で、ＤＮＡの取り扱いに必要
な一般的な操作は当業者ならば容易に行なうことができ
るものであり、例えば、モレキュラ−・クロ−ニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）［Ｔ． Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、コ−ルド・スプリング・ハ−バ−・ラボ
ラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）］のような実験操作
書に従えば容易に実施できる。使用される酵素、試薬類
も全て市販の製品が使用可能であり、特に断わらない限
り、製品で指定された使用条件に従えば完全に目的を達
成することができる。
な一般的な操作は当業者ならば容易に行なうことができ
るものであり、例えば、モレキュラ−・クロ−ニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）［Ｔ． Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、コ−ルド・スプリング・ハ−バ−・ラボ
ラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）］のような実験操作
書に従えば容易に実施できる。使用される酵素、試薬類
も全て市販の製品が使用可能であり、特に断わらない限
り、製品で指定された使用条件に従えば完全に目的を達
成することができる。
【００１８】宿主として使用する大腸菌としては、エシ
ェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、ＤＨ１株、Ｃ６００株、
ＪＭ１０３株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株などが使用
可能である。また、クロ−ニングに使用する大腸菌ベク
タ−としてはｐＵＣ１３、ｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３
などのプラスミドベクタ−、λｇｔ１０などのファ−ジ
ベクタ−が挙げられる。上記のベクタ−および宿主は市
販されており容易に入手できる。
ェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、ＤＨ１株、Ｃ６００株、
ＪＭ１０３株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株などが使用
可能である。また、クロ−ニングに使用する大腸菌ベク
タ−としてはｐＵＣ１３、ｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３
などのプラスミドベクタ−、λｇｔ１０などのファ−ジ
ベクタ−が挙げられる。上記のベクタ−および宿主は市
販されており容易に入手できる。
【００１９】上記工程（１）においてタンパク質のアミ
ノ酸配列の決定法も公知である（例えば、市販のアミノ
酸配列自動シ−ケンサ−が使用できる）。上記工程（２
）において特定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの
混合物の合成には市販のＤＮＡ合成機を用い、その操作
手順に従って実施できる。上記工程（５）におけるＤＮ
Ａ塩基配列の決定は公知のＭ１３ベクタ−系を用いた
Ｓａｎｇｅｒ らの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７４， ５４６３
−５４６７ （１９７７）］により決定できる。
ノ酸配列の決定法も公知である（例えば、市販のアミノ
酸配列自動シ−ケンサ−が使用できる）。上記工程（２
）において特定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの
混合物の合成には市販のＤＮＡ合成機を用い、その操作
手順に従って実施できる。上記工程（５）におけるＤＮ
Ａ塩基配列の決定は公知のＭ１３ベクタ−系を用いた
Ｓａｎｇｅｒ らの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７４， ５４６３
−５４６７ （１９７７）］により決定できる。
【００２０】上記工程（６）において、目的の遺伝子を
大腸菌内で効率よく発現させるためのプラスミドを造成
するためには、宿主内で機能する適切なプロモ−タ−（
Ｌａｃ、Ｔａｃ、Ｔｒｃ、Ｔｒｐ、 ＰＬ など）とＳ
ｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ （ＳＤ） 配列を有する
発現ベクタ−（ｐＫＫ２２３−３、ｐＢＳ、ｐＤＲ５４
０、ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａなど）や、さらに翻訳開始コ
ドンＡＴＧを備えたＡＴＧベクタ−（ｐＫＫ２３３−２
など）に目的のセファロスポリン・アセチルハイドロラ
−ゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すればよい。こ
の発現プラスミドを適切な宿主（たとえば、Ｅ． ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０３株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｃ
６００株など）に導入することにより、効率のよい発現
が可能になる。
大腸菌内で効率よく発現させるためのプラスミドを造成
するためには、宿主内で機能する適切なプロモ−タ−（
Ｌａｃ、Ｔａｃ、Ｔｒｃ、Ｔｒｐ、 ＰＬ など）とＳ
ｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ （ＳＤ） 配列を有する
発現ベクタ−（ｐＫＫ２２３−３、ｐＢＳ、ｐＤＲ５４
０、ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａなど）や、さらに翻訳開始コ
ドンＡＴＧを備えたＡＴＧベクタ−（ｐＫＫ２３３−２
など）に目的のセファロスポリン・アセチルハイドロラ
−ゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すればよい。こ
の発現プラスミドを適切な宿主（たとえば、Ｅ． ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０３株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｃ
６００株など）に導入することにより、効率のよい発現
が可能になる。
【００２１】発現されたセファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼは従来の精製法に従い、遠心分離、カラム
クロマトグラフィ−などを適当に組合わせて精製すれば
よい。
イドロラ−ゼは従来の精製法に従い、遠心分離、カラム
クロマトグラフィ−などを適当に組合わせて精製すれば
よい。
【００２２】以下、実施例により本発明をより詳細に説
明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ １．セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼの分離
・精製およびアミノ酸配列の部分決定 （１）セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
の分離・精製２．５％グルコ−ス、０．７５％コ−ン・
スティ−プ・リカ−、１．０％アミノ酸混合物、０．３
％ＫＨ２ＰＯ４、０．８ｐｐｍ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ
の組成からなる培地（ｐＨ７．０）２０Ｌを３０Ｌ容量
ジャ−ファ−メンタ−に仕込み、滅菌後、あらかじめ０
．５％グルコ−ス、０．７５％コ−ン・スティ−プ・リ
カ−、０．５％アミノ酸混合物、０．０２％ＫＨ２ＰＯ
４ の組成からなる培地（ｐＨ７．０）で前培養したバ
シラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２７５５）を６％になるように植菌した。２
８℃で４８時間培養後、培養液に１％の活性炭を添加し
、２時間撹拌した。その後、濾過し、濾液を粗酵素液と
した。粗酵素液に０．７％となるように、ＤＥＡＥセフ
ァデックスＡ−５０（ファルマシア社製）を添加し、２
Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８．０に調節後、１時
間撹拌した。濾過後、セファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼ活性の吸着したＤＥＡＥセファデックスＡ−
５０を４Ｌの０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次に０．４Ｍ
塩化ナトリウムを含む同緩衝液で活性を溶出させた。限
外濾過装置（東ソ−社製）を用いて濃縮・脱塩後、あら
かじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロ−スＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラムに活性を
吸着させた。同緩衝液および０．１５Ｍ塩化ナトリウム
を含む同緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含
む同緩衝液で活性を溶出させた。限外濾過濃縮・脱塩後
、高速液体カラムクロマトグラフィ−による精製を行な
った。 カラムはＤＥＡＥトヨパ−ルパック６５０Ｍ（東ソ−社
製）を用いた。溶出は塩濃度を連続的に上昇させてゆく
濃度勾配溶出法によった。即ち、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む同緩衝液を使用し、塩化ナトリウム濃度を最
終濃度０．５Ｍまで上昇させた。溶出された活性画分を
集め、限外濾過濃縮後、分子ふるいカラムを使用した高
速液体カラムクロマトグラフィ−による精製を行なった
。カラムは、ＴＳＫ−Ｇ３０００（東ソ−社製）を用い
、移動相には、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を
用いた。溶出された活性画分を集め、限外濾過濃縮後、
逆相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィ
−により精製した。カラムは、マイクロボンダパックＣ
１８ （ウォ−タ−ズ社製）を用い、溶出はアセトニト
リル濃度を連続的に上昇させてゆく濃度勾配溶出法によ
った。 即ち、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水系を使用し、
アセトニトリル濃度を最終濃度９８％まで上昇させた。 溶出されたセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
画分を５０℃で、減圧濃縮した後、６Ｍ塩酸グアニジン
を含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶か
し、２ｍＭになるようにＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）を添加し、さらにセファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼの２００倍モル量の２−メルカプトエタノ
−ルを添加後、窒素気流下、３７℃で４時間還元処理し
た。その後、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼの１９０倍モル量のヨ−ド酢酸ナトリウムを添加し、
３７℃、１０分間遮光下で反応させ還元カルボキシメチ
ル化した。次に再び、前述の方法に従って逆相カラムを
使用した高速液体カラムクロマトグラフィ−による精製
を行なった。得られたセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼ画分を Ｌａｅｍｍｌｉ の方法［Ｎａｔｕ
ｒｅ， ２２７， ６８０−６８５ （１９７０）］に
従い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で分析したところ分子量３５ｋＤの位置に
単一バンドを認め、均一に精製されていることを確認し
た。また、本精製セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼを７Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に溶かした後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を用いて１０倍希釈することにより再活性化す
ること、および先に示した高速液体カラムクロマトグラ
フィ−を用いた分子ふるいカラムクロマトグラフィ−で
分子量２８０ｋＤの位置に活性が溶出されることから、
セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼは天然型で
は均一サブユニットからなる８量体であると推定された
。一方、Ｈｅｄｒｉｃｋ らの方法［Ａｒｃｈ． Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， １２６， １５５
−１６４（１９６８）］を用いて分子量を測定したとこ
ろ約１５０ｋＤとなり、またこの位置に活性を認めるこ
とから４量体でも活性があると考えられた。本精製セフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラーゼをエドマン分解
法およびヒドラジン分解法により末端分析したところ、
アミノ末端はメチオニン、カルボキシル末端はグリシン
と同定された。
明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ １．セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼの分離
・精製およびアミノ酸配列の部分決定 （１）セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
の分離・精製２．５％グルコ−ス、０．７５％コ−ン・
スティ−プ・リカ−、１．０％アミノ酸混合物、０．３
％ＫＨ２ＰＯ４、０．８ｐｐｍ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ
の組成からなる培地（ｐＨ７．０）２０Ｌを３０Ｌ容量
ジャ−ファ−メンタ−に仕込み、滅菌後、あらかじめ０
．５％グルコ−ス、０．７５％コ−ン・スティ−プ・リ
カ−、０．５％アミノ酸混合物、０．０２％ＫＨ２ＰＯ
４ の組成からなる培地（ｐＨ７．０）で前培養したバ
シラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２７５５）を６％になるように植菌した。２
８℃で４８時間培養後、培養液に１％の活性炭を添加し
、２時間撹拌した。その後、濾過し、濾液を粗酵素液と
した。粗酵素液に０．７％となるように、ＤＥＡＥセフ
ァデックスＡ−５０（ファルマシア社製）を添加し、２
Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８．０に調節後、１時
間撹拌した。濾過後、セファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼ活性の吸着したＤＥＡＥセファデックスＡ−
５０を４Ｌの０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次に０．４Ｍ
塩化ナトリウムを含む同緩衝液で活性を溶出させた。限
外濾過装置（東ソ−社製）を用いて濃縮・脱塩後、あら
かじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロ−スＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラムに活性を
吸着させた。同緩衝液および０．１５Ｍ塩化ナトリウム
を含む同緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含
む同緩衝液で活性を溶出させた。限外濾過濃縮・脱塩後
、高速液体カラムクロマトグラフィ−による精製を行な
った。 カラムはＤＥＡＥトヨパ−ルパック６５０Ｍ（東ソ−社
製）を用いた。溶出は塩濃度を連続的に上昇させてゆく
濃度勾配溶出法によった。即ち、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む同緩衝液を使用し、塩化ナトリウム濃度を最
終濃度０．５Ｍまで上昇させた。溶出された活性画分を
集め、限外濾過濃縮後、分子ふるいカラムを使用した高
速液体カラムクロマトグラフィ−による精製を行なった
。カラムは、ＴＳＫ−Ｇ３０００（東ソ−社製）を用い
、移動相には、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を
用いた。溶出された活性画分を集め、限外濾過濃縮後、
逆相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィ
−により精製した。カラムは、マイクロボンダパックＣ
１８ （ウォ−タ−ズ社製）を用い、溶出はアセトニト
リル濃度を連続的に上昇させてゆく濃度勾配溶出法によ
った。 即ち、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水系を使用し、
アセトニトリル濃度を最終濃度９８％まで上昇させた。 溶出されたセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
画分を５０℃で、減圧濃縮した後、６Ｍ塩酸グアニジン
を含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶か
し、２ｍＭになるようにＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）を添加し、さらにセファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼの２００倍モル量の２−メルカプトエタノ
−ルを添加後、窒素気流下、３７℃で４時間還元処理し
た。その後、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼの１９０倍モル量のヨ−ド酢酸ナトリウムを添加し、
３７℃、１０分間遮光下で反応させ還元カルボキシメチ
ル化した。次に再び、前述の方法に従って逆相カラムを
使用した高速液体カラムクロマトグラフィ−による精製
を行なった。得られたセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼ画分を Ｌａｅｍｍｌｉ の方法［Ｎａｔｕ
ｒｅ， ２２７， ６８０−６８５ （１９７０）］に
従い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で分析したところ分子量３５ｋＤの位置に
単一バンドを認め、均一に精製されていることを確認し
た。また、本精製セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼを７Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に溶かした後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を用いて１０倍希釈することにより再活性化す
ること、および先に示した高速液体カラムクロマトグラ
フィ−を用いた分子ふるいカラムクロマトグラフィ−で
分子量２８０ｋＤの位置に活性が溶出されることから、
セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼは天然型で
は均一サブユニットからなる８量体であると推定された
。一方、Ｈｅｄｒｉｃｋ らの方法［Ａｒｃｈ． Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， １２６， １５５
−１６４（１９６８）］を用いて分子量を測定したとこ
ろ約１５０ｋＤとなり、またこの位置に活性を認めるこ
とから４量体でも活性があると考えられた。本精製セフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラーゼをエドマン分解
法およびヒドラジン分解法により末端分析したところ、
アミノ末端はメチオニン、カルボキシル末端はグリシン
と同定された。
【００２３】（２）セファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼのアミノ酸配列の部分決定精製したセファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ１ｍｇを１ｍｌの２Ｍ
尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）に
溶かした後、０．０１ｍｇのリシルエンドペプチダ−ゼ
を添加し、３７℃で４時間反応させた。反応物を高速液
体カラムクロマトグラフィ−を用いて分離した。カラム
はマイクロボンダパックＣ１８ （ウォ−タ−ズ社製）
を用い、溶出はアセトニトリル濃度を連続的に上昇させ
ていく濃度勾配溶出法によった。即ち、０．１％トリフ
ルオロ酢酸を含む水系を使用し、アセトニトリル濃度を
最終濃度９８％まで上昇させた。なお検出は２１４ｎｍ
で行なった。分離された各ピ−クのうち、滞留時間が長
く明瞭な画分を分取し、再度、同逆相カラムを用いて精
製後、気相式自動アミノ酸配列シ−ケンサ−（アプライ
ド・バイオシステム社製）を用いてアミノ酸配列を解析
し、図４に示されるペプチド断片のアミノ末端から３４
番目までのアミノ酸配列を決定した。
ロラ−ゼのアミノ酸配列の部分決定精製したセファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ１ｍｇを１ｍｌの２Ｍ
尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）に
溶かした後、０．０１ｍｇのリシルエンドペプチダ−ゼ
を添加し、３７℃で４時間反応させた。反応物を高速液
体カラムクロマトグラフィ−を用いて分離した。カラム
はマイクロボンダパックＣ１８ （ウォ−タ−ズ社製）
を用い、溶出はアセトニトリル濃度を連続的に上昇させ
ていく濃度勾配溶出法によった。即ち、０．１％トリフ
ルオロ酢酸を含む水系を使用し、アセトニトリル濃度を
最終濃度９８％まで上昇させた。なお検出は２１４ｎｍ
で行なった。分離された各ピ−クのうち、滞留時間が長
く明瞭な画分を分取し、再度、同逆相カラムを用いて精
製後、気相式自動アミノ酸配列シ−ケンサ−（アプライ
ド・バイオシステム社製）を用いてアミノ酸配列を解析
し、図４に示されるペプチド断片のアミノ末端から３４
番目までのアミノ酸配列を決定した。
【００２４】２．ＤＮＡプロ−ブの合成および末端標識
上記工程１で得られたアミノ酸配列中から図４の下
線で示される箇所の配列を選択し、これらのアミノ酸配
列から推定される遺伝子上の可能なＤＮＡ塩基配列全て
を含むオリゴヌクレオチド混合物を図５に示すように合
成した。即ち、可能なオリゴヌクレオチドを４群に分け
て合成して混合物をつくり、これらをＤＮＡプロ−ブＣ
ＡＨ−ＲＭ１、ＣＡＨ−ＲＭ２、ＣＡＨ−ＲＭ３および
ＣＡＨ−ＲＭ４と称した。オリゴヌクレオチドの合成は
全て日本ゼオン社製の全自動型ＤＮＡ合成機ＺＥＯＮ−
ＧＥＮＥＴ Ａ−ＩＩを用いて行なった。得られたＤＮ
Ａプロ−ブの５’末端をＷａｌｌａｃｅらの方法［Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６， ３５４３
−３５５７（１９７９）］に従ってＴ４ポリヌクレオチ
ドキナ−ゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて標識した。
上記工程１で得られたアミノ酸配列中から図４の下
線で示される箇所の配列を選択し、これらのアミノ酸配
列から推定される遺伝子上の可能なＤＮＡ塩基配列全て
を含むオリゴヌクレオチド混合物を図５に示すように合
成した。即ち、可能なオリゴヌクレオチドを４群に分け
て合成して混合物をつくり、これらをＤＮＡプロ−ブＣ
ＡＨ−ＲＭ１、ＣＡＨ−ＲＭ２、ＣＡＨ−ＲＭ３および
ＣＡＨ−ＲＭ４と称した。オリゴヌクレオチドの合成は
全て日本ゼオン社製の全自動型ＤＮＡ合成機ＺＥＯＮ−
ＧＥＮＥＴ Ａ−ＩＩを用いて行なった。得られたＤＮ
Ａプロ−ブの５’末端をＷａｌｌａｃｅらの方法［Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６， ３５４３
−３５５７（１９７９）］に従ってＴ４ポリヌクレオチ
ドキナ−ゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて標識した。
【００２５】３．バシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）からの染色体ＤＮＡの抽出・精製とサザンハ
イブリダイゼ−ション Ｈａｒｒｉｓ−Ｗａｒｒｉｃ
ｋ らの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７２， ２２０７−２２１
１ （１９７５）］に従い、バシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌体をリゾチ−ム処理、次いで
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム処理を行ない、
得られた溶菌液から塩化セシウム−臭化エチジウム平衡
密度勾配超遠心分離により、染色体ＤＮＡを抽出・精製
した。このＤＮＡ １μｇあたり各種制限酵素約１０ユ
ニットを至適条件下で反応させ、反応液を０．８％アガ
ロ−スゲル電気泳動に供し、制限酵素切断パタ−ンを分
析後、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ らの方法［Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．， ９８， ５０３−５１７ （１９７５）
］に従い、ハイブリダイゼ−ションに供した。ゲルを０
．５Ｎ水酸化ナトリウムを含む１．５Ｍ塩化ナトリウム
溶液中、室温で１時間アルカリ変性させ、さらに１．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）中、室温で１時間中和処理した後、ニトロセルロ
−ス膜を密着させ、ＤＮＡをゲルから膜へ移行させた。 移行後のニトロセルロ−ス膜を用いて、標識したプロ−
ブによるハイブリダイゼ−ションを実施した。 ハイブリダイゼ−ションは４倍濃度のＳＳＣ（１×ＳＳ
Ｃ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０）、１０倍濃度の Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ 溶液（１× Ｄｅｎｈａｒｄｔ 溶液：０．０
２％ フィコ−ル、０．０２％ ポリビニルピロリドン
、０．０２％ 牛血清アルブミン）、標識したプロ−ブ
約１×１０６ｃｐｍ／ｍｌを用いて３８℃で一晩行ない
、４倍濃度のＳＳＣにより室温で数回洗浄後、膜をオ−
トラジオグラフィ−に供した。さらに、膜の洗浄温度を
段階的に上昇させ、そのつどオ−トラジオグラフィ−に
供する操作を繰り返した。４８℃、５３℃の洗浄後でも
明らかにポジティブシグナルを示すＤＮＡバンドを確認
した。その結果、使用制限酵素の種類によりハイブリダ
イズするバンドのサイズは異なっており、目的遺伝子の
推定ＤＮＡ鎖長１ｋｂよりサイズが大きく、かつ、クロ
−ニングに支障をきたさない程度のものとしてはＤｒａ
Ｉ切断による２．５〜３ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断によ
る４〜４．５ｋｂの断片が見出された。
ｉｌｉｓ）からの染色体ＤＮＡの抽出・精製とサザンハ
イブリダイゼ−ション Ｈａｒｒｉｓ−Ｗａｒｒｉｃ
ｋ らの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７２， ２２０７−２２１
１ （１９７５）］に従い、バシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌体をリゾチ−ム処理、次いで
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム処理を行ない、
得られた溶菌液から塩化セシウム−臭化エチジウム平衡
密度勾配超遠心分離により、染色体ＤＮＡを抽出・精製
した。このＤＮＡ １μｇあたり各種制限酵素約１０ユ
ニットを至適条件下で反応させ、反応液を０．８％アガ
ロ−スゲル電気泳動に供し、制限酵素切断パタ−ンを分
析後、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ らの方法［Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．， ９８， ５０３−５１７ （１９７５）
］に従い、ハイブリダイゼ−ションに供した。ゲルを０
．５Ｎ水酸化ナトリウムを含む１．５Ｍ塩化ナトリウム
溶液中、室温で１時間アルカリ変性させ、さらに１．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）中、室温で１時間中和処理した後、ニトロセルロ
−ス膜を密着させ、ＤＮＡをゲルから膜へ移行させた。 移行後のニトロセルロ−ス膜を用いて、標識したプロ−
ブによるハイブリダイゼ−ションを実施した。 ハイブリダイゼ−ションは４倍濃度のＳＳＣ（１×ＳＳ
Ｃ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０）、１０倍濃度の Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ 溶液（１× Ｄｅｎｈａｒｄｔ 溶液：０．０
２％ フィコ−ル、０．０２％ ポリビニルピロリドン
、０．０２％ 牛血清アルブミン）、標識したプロ−ブ
約１×１０６ｃｐｍ／ｍｌを用いて３８℃で一晩行ない
、４倍濃度のＳＳＣにより室温で数回洗浄後、膜をオ−
トラジオグラフィ−に供した。さらに、膜の洗浄温度を
段階的に上昇させ、そのつどオ−トラジオグラフィ−に
供する操作を繰り返した。４８℃、５３℃の洗浄後でも
明らかにポジティブシグナルを示すＤＮＡバンドを確認
した。その結果、使用制限酵素の種類によりハイブリダ
イズするバンドのサイズは異なっており、目的遺伝子の
推定ＤＮＡ鎖長１ｋｂよりサイズが大きく、かつ、クロ
−ニングに支障をきたさない程度のものとしてはＤｒａ
Ｉ切断による２．５〜３ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断によ
る４〜４．５ｋｂの断片が見出された。
【００２６】４．セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング （１）遺伝子ライブラリ−の作成 上記工程３で抽出・精製したバシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体ＤＮＡ１２μｇに制限酵素
ＤｒａＩ約１２０ユニットを加え、３７℃で９０分反応
させた後、反応液を等量のフェノ−ルで抽出し、得られ
た水層にエタノ−ルを添加してＤＮＡを沈殿させた。得
られたＤＮＡを６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス
塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で溶解後、０．
８％アガロ−スゲル電気泳動に供し、２〜４ｋｂのサイ
ズに相当する領域を切り出した。市販のキット（バイオ
１０１社製、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ）を使用し、ゲルから
ＤＮＡ断片を溶出・回収し、３０μｌのＴＥ緩衝液に溶
解した。他方、遺伝子ライブラリ−作成用のベクタ−と
して、ｐＵＣ１３を使用した。ｐＵＣ１３（１０μｇ）
に制限酵素ＳｍａＩ約１００ユニットを加え、３７℃で
１４０分反応させた後、６５℃で１０分インキュベ−ト
し、アルカリホスファタ−ゼ（ＢＡＰ）約２０ユニット
を加え、さらに６５℃で８０分反応させた。前述の方法
に従って、フェノ−ル抽出を行なった後、ＤＮＡをエタ
ノ−ルで沈殿させ、最終的に５０μｌのＴＥ緩衝液に溶
解した。上記のバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）染色体のＤｒａＩ切断断片溶液７．５μｌとベ
クタ−ｐＵＣ１３のＳｍａＩ−ＢＡＰ処理溶液２．５μ
ｌを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼを用いて６℃で約２０
時間反応させ、両者を連結させ、組換えＤＮＡを形成さ
せた。この組換えＤＮＡを用いて、Ｈａｎａｈａｎらの
方法［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １６６， ５５
７−５８０ （１９８３）］に従い、エシェリキア・コ
リ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換した。次
に、アンピシリン４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス［１％
バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化
ナトリウム（ｐＨ７．３）］寒天培地上に密着させたニ
トロセルロ−ス膜上でコロニ−を形成させた。これらの
コロニ−をバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）の遺伝子ライブラリ−と称した。
ラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング （１）遺伝子ライブラリ−の作成 上記工程３で抽出・精製したバシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体ＤＮＡ１２μｇに制限酵素
ＤｒａＩ約１２０ユニットを加え、３７℃で９０分反応
させた後、反応液を等量のフェノ−ルで抽出し、得られ
た水層にエタノ−ルを添加してＤＮＡを沈殿させた。得
られたＤＮＡを６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス
塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で溶解後、０．
８％アガロ−スゲル電気泳動に供し、２〜４ｋｂのサイ
ズに相当する領域を切り出した。市販のキット（バイオ
１０１社製、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ）を使用し、ゲルから
ＤＮＡ断片を溶出・回収し、３０μｌのＴＥ緩衝液に溶
解した。他方、遺伝子ライブラリ−作成用のベクタ−と
して、ｐＵＣ１３を使用した。ｐＵＣ１３（１０μｇ）
に制限酵素ＳｍａＩ約１００ユニットを加え、３７℃で
１４０分反応させた後、６５℃で１０分インキュベ−ト
し、アルカリホスファタ−ゼ（ＢＡＰ）約２０ユニット
を加え、さらに６５℃で８０分反応させた。前述の方法
に従って、フェノ−ル抽出を行なった後、ＤＮＡをエタ
ノ−ルで沈殿させ、最終的に５０μｌのＴＥ緩衝液に溶
解した。上記のバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）染色体のＤｒａＩ切断断片溶液７．５μｌとベ
クタ−ｐＵＣ１３のＳｍａＩ−ＢＡＰ処理溶液２．５μ
ｌを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼを用いて６℃で約２０
時間反応させ、両者を連結させ、組換えＤＮＡを形成さ
せた。この組換えＤＮＡを用いて、Ｈａｎａｈａｎらの
方法［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １６６， ５５
７−５８０ （１９８３）］に従い、エシェリキア・コ
リ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換した。次
に、アンピシリン４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス［１％
バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化
ナトリウム（ｐＨ７．３）］寒天培地上に密着させたニ
トロセルロ−ス膜上でコロニ−を形成させた。これらの
コロニ−をバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）の遺伝子ライブラリ−と称した。
【００２７】（２）コロニ−ハイブリダイゼ−ションに
よるセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ・ポジ
ティブクロ−ンの選択上記工程（１）でニトロセルロ−
ス膜上に形成させたコロニ−をもう一つのニトロセルロ
−ス膜にレプリカした。このレプリカ膜をアンピシリン
４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス寒天培地上に密着させ、
３７℃で３時間インキュベ−トした後、さらにクロラム
フェニコ−ル２５０μｇ／ｍｌを含むＬブロス寒天培地
上に移し、３７℃で一晩インキュベ−トした。次いで、
基本的には、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ らの方法［Ｐｒｏｃ
． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．
， ７２， ３９６１−３９６５ （１９７５）］に従
い、コロニ−ハイブリダイゼ−ションを実施した。即ち
、膜を０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で処理し（１０〜
１５分）、コロニ−の溶菌、ＤＮＡのアルカリ変性を行
なった後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて中
和（５〜１０分）し、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを
含む１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で処理（１０
〜１５分）した。８０℃で２時間、減圧下でベ−キング
を行なってＤＮＡを膜に固定した後、固定化ＤＮＡを標
識プロ−ブＣＡＨ−ＲＭ２とハイブリダイズさせた。反
応は４倍濃度のＳＳＣ、１０倍濃度の Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ 溶液および約２×１０６ｃｐｍ／ｍｌの標識したプ
ロ−ブを含む溶液中、３８℃で１６時間行った。その後
、４倍濃度のＳＳＣで３〜４回、室温で洗浄後、３８℃
で２分間洗浄し、オ−トラジオグラフィ−に供した（感
光条件：−８０℃、３時間）。洗浄温度とオ−トラジオ
グラフィ−上のシグナルの強弱との関係を見るため、さ
らに洗浄温度を段階的に高め、そのつどオ−トラジオグ
ラフィ−に供した。洗浄は４３℃、４８℃、５３℃で各
々２分間処理した。
よるセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ・ポジ
ティブクロ−ンの選択上記工程（１）でニトロセルロ−
ス膜上に形成させたコロニ−をもう一つのニトロセルロ
−ス膜にレプリカした。このレプリカ膜をアンピシリン
４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス寒天培地上に密着させ、
３７℃で３時間インキュベ−トした後、さらにクロラム
フェニコ−ル２５０μｇ／ｍｌを含むＬブロス寒天培地
上に移し、３７℃で一晩インキュベ−トした。次いで、
基本的には、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ らの方法［Ｐｒｏｃ
． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．
， ７２， ３９６１−３９６５ （１９７５）］に従
い、コロニ−ハイブリダイゼ−ションを実施した。即ち
、膜を０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で処理し（１０〜
１５分）、コロニ−の溶菌、ＤＮＡのアルカリ変性を行
なった後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて中
和（５〜１０分）し、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを
含む１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で処理（１０
〜１５分）した。８０℃で２時間、減圧下でベ−キング
を行なってＤＮＡを膜に固定した後、固定化ＤＮＡを標
識プロ−ブＣＡＨ−ＲＭ２とハイブリダイズさせた。反
応は４倍濃度のＳＳＣ、１０倍濃度の Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ 溶液および約２×１０６ｃｐｍ／ｍｌの標識したプ
ロ−ブを含む溶液中、３８℃で１６時間行った。その後
、４倍濃度のＳＳＣで３〜４回、室温で洗浄後、３８℃
で２分間洗浄し、オ−トラジオグラフィ−に供した（感
光条件：−８０℃、３時間）。洗浄温度とオ−トラジオ
グラフィ−上のシグナルの強弱との関係を見るため、さ
らに洗浄温度を段階的に高め、そのつどオ−トラジオグ
ラフィ−に供した。洗浄は４３℃、４８℃、５３℃で各
々２分間処理した。
【００２８】その結果、高温の洗浄温度においても、ポ
ジティブシグナルを示したのは約３００００個のコロニ
−のうち３個であった。これらのコロニ−についてアン
ピシリン４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス５ｍｌを用いて
３７℃で一晩液体培養し、組換えプラスミドを調製した
［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ らの方法：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．， ７， １５１３−１５２３ （１
９７９）］。これらのプラスミドをベクタ−ＤＮＡであ
るｐＵＣ１３に切断部位を持つ制限酵素（ＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩなど）で切断し、断片化し
たのち、アガロ−スゲル電気泳動を行ない、標識したプ
ロ−ブとサザンハイブリダイゼ−ションを行なった。そ
の結果、三つのうち二つの組換えプラスミドがＤＮＡプ
ロ−ブと明らかにハイブリダイズする制限酵素切断断片
を保有していることが見出された。ポジティブを示した
二つのプラスミドでハイブリダイズする断片のサイズが
相違しており、ベクタ−ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片
が異なっていることが考えられたので、それぞれの組換
えプラスミドをｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２と命名
し、両者を区別した。
ジティブシグナルを示したのは約３００００個のコロニ
−のうち３個であった。これらのコロニ−についてアン
ピシリン４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス５ｍｌを用いて
３７℃で一晩液体培養し、組換えプラスミドを調製した
［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ らの方法：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．， ７， １５１３−１５２３ （１
９７９）］。これらのプラスミドをベクタ−ＤＮＡであ
るｐＵＣ１３に切断部位を持つ制限酵素（ＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩなど）で切断し、断片化し
たのち、アガロ−スゲル電気泳動を行ない、標識したプ
ロ−ブとサザンハイブリダイゼ−ションを行なった。そ
の結果、三つのうち二つの組換えプラスミドがＤＮＡプ
ロ−ブと明らかにハイブリダイズする制限酵素切断断片
を保有していることが見出された。ポジティブを示した
二つのプラスミドでハイブリダイズする断片のサイズが
相違しており、ベクタ−ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片
が異なっていることが考えられたので、それぞれの組換
えプラスミドをｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２と命名
し、両者を区別した。
【００２９】５．ポジティブクロ−ンの同定と塩基配列
決定 （１）ポジティブクロ−ンの同定組換えプラスミド
ｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２について、各種制限酵
素で切断し、制限酵素切断地図の作成を試みたが、その
過程でプラスミドｐＣＡＨ０１は二つの異なるＤｒａＩ
切断断片が、プラスミドｐＣＡＨ０２は少なくとも３つ
の異なるＤｒａＩ切断断片がベクタ−ＤＮＡのＳｍａＩ
部位に挿入されており、そのうち一つのＤｒａＩ切断断
片上にＤＮＡプロ−ブがハイブリダイズすることが明ら
かになった。そこで今後は組換えプラスミドｐＣＡＨ０
１を使用することにした。図６にプラスミドｐＣＡＨ０
１の制限酵素切断地図およびＤＮＡプロ−ブがハイブリ
ダイズする位置を示した。プラスミドｐＣＡＨ０１は外
来のバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染
色体ＤＮＡ由来のＤｒａＩ断片を二つ含んでおり（１．
８ｋｂおよび２．５ｋｂ）、２．５ｋｂ断片にのみＤＮ
Ａプロ−ブがハイブリダイズすることから１．８ｋｂの
ＤｒａＩ断片を除去することにした。プラスミドｐＣＡ
Ｈ０１からこの２．５ｋｂ断片を含む２．６ｋｂのＤｒ
ａＩ−ＰｓｔＩ断片を取り出し、ベクタ−プラスミドｐ
ＵＣ１３のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ間に挿入することにより
小型化された組換えプラスミドｐＣＡＨ０３（５．３ｋ
ｂ）を得た。組換えプラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素
切断地図を図７に示した。
決定 （１）ポジティブクロ−ンの同定組換えプラスミド
ｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２について、各種制限酵
素で切断し、制限酵素切断地図の作成を試みたが、その
過程でプラスミドｐＣＡＨ０１は二つの異なるＤｒａＩ
切断断片が、プラスミドｐＣＡＨ０２は少なくとも３つ
の異なるＤｒａＩ切断断片がベクタ−ＤＮＡのＳｍａＩ
部位に挿入されており、そのうち一つのＤｒａＩ切断断
片上にＤＮＡプロ−ブがハイブリダイズすることが明ら
かになった。そこで今後は組換えプラスミドｐＣＡＨ０
１を使用することにした。図６にプラスミドｐＣＡＨ０
１の制限酵素切断地図およびＤＮＡプロ−ブがハイブリ
ダイズする位置を示した。プラスミドｐＣＡＨ０１は外
来のバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染
色体ＤＮＡ由来のＤｒａＩ断片を二つ含んでおり（１．
８ｋｂおよび２．５ｋｂ）、２．５ｋｂ断片にのみＤＮ
Ａプロ−ブがハイブリダイズすることから１．８ｋｂの
ＤｒａＩ断片を除去することにした。プラスミドｐＣＡ
Ｈ０１からこの２．５ｋｂ断片を含む２．６ｋｂのＤｒ
ａＩ−ＰｓｔＩ断片を取り出し、ベクタ−プラスミドｐ
ＵＣ１３のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ間に挿入することにより
小型化された組換えプラスミドｐＣＡＨ０３（５．３ｋ
ｂ）を得た。組換えプラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素
切断地図を図７に示した。
【００３０】（２）塩基配列決定
組換えプラスミドｐＣＡＨ０３より、ＤＮＡプロ−ブが
ハイブリダイズする０．２４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片を取り出し、Ｓａｎｇｅｒ らの方法［Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．
Ａ．， ７４，５４６３−５４６７ （１９７７）］に
従って、ＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、上記工
程１で得られたセファロスポリン・アセチルハイドロラ
−ゼの部分的なアミノ酸配列に一致する塩基配列が見出
され、この断片がセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼ遺伝子の一部を含むことが明らかになった。次い
で、プラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素切断地図に基づ
き、０．３８ｋｂのＤｒａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間、１．
４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ間の塩基配列を決定
することにより、図８および図９（図中、＊＊＊は終止
コドンを示す）に示されるように約２ｋｂのＤｒａＩ−
ＥｃｏＲＩ間の塩基配列が明らかになった。その結果、
翻訳開始コドンＡＴＧの規定するメチオニンを含む３１
８個のアミノ酸残基よりなるタンパク質をコ−ドする塩
基配列が存在することが判明した。また、セファロスポ
リン・アセチルハイドロラ−ゼタンパク質の分子量、ア
ミノ末端およびカルボキシル末端のアミノ酸、リシルエ
ンドペプチダーゼ消化断片のアミノ酸組成との照合でも
、よい一致を示すことから、上記の塩基配列にコ−ドさ
れるタンパク質がセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼであると推定された。このようにして、プラスミ
ドｐＣＡＨ０３中のバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）由来のＤＮＡ断片中に、セファロスポリン・
アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子が完全に含まれてい
ることが明らかになった。
ハイブリダイズする０．２４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片を取り出し、Ｓａｎｇｅｒ らの方法［Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．
Ａ．， ７４，５４６３−５４６７ （１９７７）］に
従って、ＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、上記工
程１で得られたセファロスポリン・アセチルハイドロラ
−ゼの部分的なアミノ酸配列に一致する塩基配列が見出
され、この断片がセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼ遺伝子の一部を含むことが明らかになった。次い
で、プラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素切断地図に基づ
き、０．３８ｋｂのＤｒａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間、１．
４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ間の塩基配列を決定
することにより、図８および図９（図中、＊＊＊は終止
コドンを示す）に示されるように約２ｋｂのＤｒａＩ−
ＥｃｏＲＩ間の塩基配列が明らかになった。その結果、
翻訳開始コドンＡＴＧの規定するメチオニンを含む３１
８個のアミノ酸残基よりなるタンパク質をコ−ドする塩
基配列が存在することが判明した。また、セファロスポ
リン・アセチルハイドロラ−ゼタンパク質の分子量、ア
ミノ末端およびカルボキシル末端のアミノ酸、リシルエ
ンドペプチダーゼ消化断片のアミノ酸組成との照合でも
、よい一致を示すことから、上記の塩基配列にコ−ドさ
れるタンパク質がセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼであると推定された。このようにして、プラスミ
ドｐＣＡＨ０３中のバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）由来のＤＮＡ断片中に、セファロスポリン・
アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子が完全に含まれてい
ることが明らかになった。
【００３１】６．発現用プラスミドの造成 プラスミ
ドｐＣＡＨ０３上のクロ−ン化されたバシラス・サチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＤＮＡ断片中にはセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子以外の
領域も含まれており、遺伝子の形質発現に無関係と考え
られる領域を図１０に示す工程に従い削除した。一般的
に、大腸菌内で異種遺伝子を高発現させるためには、発
現効率の高いプロモ−タ−、ＳＤ配列および翻訳開始コ
ドンＡＴＧからなる配列の直後に目的の構造遺伝子を連
結させた発現プラスミドを造成するのが効果的である。 そこで、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを
大腸菌で著量生産させるために、プロモ−タ−、ＳＤ配
列、ＡＴＧを含むベクタ−を用いて、図１１に示される
工程に従い発現用プラスミドを造成した。なお、セファ
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子は以下
のように調製できる。該遺伝子が完全に含まれる領域を
Ｍ１３ｍｐ系ベクタ−にクロ−ニングすることにより、
一本鎖ＤＮＡを取得し、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼのアミノ酸配列上２番目のアミノ酸から数
個のアミノ酸を規定するオリゴヌクレオチドをプライマ
−として、いわゆるプライマ−伸長法によりセファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子部分のみが
二本鎖となったＤＮＡ断片を得る。図１２に、図１１で
得られた発現プラスミドのコピ−数を増大させ、かつ、
薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性（Ａｐｒ）からテ
トラサイクリン耐性（Ｔｃｒ）に変えた改良型の発現プ
ラスミド造成の工程を示した。
ドｐＣＡＨ０３上のクロ−ン化されたバシラス・サチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＤＮＡ断片中にはセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子以外の
領域も含まれており、遺伝子の形質発現に無関係と考え
られる領域を図１０に示す工程に従い削除した。一般的
に、大腸菌内で異種遺伝子を高発現させるためには、発
現効率の高いプロモ−タ−、ＳＤ配列および翻訳開始コ
ドンＡＴＧからなる配列の直後に目的の構造遺伝子を連
結させた発現プラスミドを造成するのが効果的である。 そこで、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを
大腸菌で著量生産させるために、プロモ−タ−、ＳＤ配
列、ＡＴＧを含むベクタ−を用いて、図１１に示される
工程に従い発現用プラスミドを造成した。なお、セファ
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子は以下
のように調製できる。該遺伝子が完全に含まれる領域を
Ｍ１３ｍｐ系ベクタ−にクロ−ニングすることにより、
一本鎖ＤＮＡを取得し、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼのアミノ酸配列上２番目のアミノ酸から数
個のアミノ酸を規定するオリゴヌクレオチドをプライマ
−として、いわゆるプライマ−伸長法によりセファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子部分のみが
二本鎖となったＤＮＡ断片を得る。図１２に、図１１で
得られた発現プラスミドのコピ−数を増大させ、かつ、
薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性（Ａｐｒ）からテ
トラサイクリン耐性（Ｔｃｒ）に変えた改良型の発現プ
ラスミド造成の工程を示した。
【００３２】以下に各工程を詳述する。（１）小型化プ
ラスミドの造成図１０に示したように、セファロスポリ
ン・アセチルハイドロラーゼ（図中でＣＡＨと略記）構
造遺伝子の下流域を短縮するため、プラスミドｐＣＡＨ
０３をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断し、得られる約４
．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した後、ＤＮＡポリメラー
ゼクレノウ断片を用いて両端が平滑化されたＤＮＡを調
製した。さらに精製後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結反応を行ない、セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼ遺伝子全域を含んだ小型化プラスミドｐＣＡＨ１
０を造成した。
ラスミドの造成図１０に示したように、セファロスポリ
ン・アセチルハイドロラーゼ（図中でＣＡＨと略記）構
造遺伝子の下流域を短縮するため、プラスミドｐＣＡＨ
０３をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断し、得られる約４
．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した後、ＤＮＡポリメラー
ゼクレノウ断片を用いて両端が平滑化されたＤＮＡを調
製した。さらに精製後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結反応を行ない、セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼ遺伝子全域を含んだ小型化プラスミドｐＣＡＨ１
０を造成した。
【００３３】（２）発現用プラスミド造成のための一本
鎖ＤＮＡの調製 上記工程（１）で調製した小型化プラスミドｐＣＡＨ１
０をＳａｃＩとＳａｌＩで切断し、得られる約１．５ｋ
ｂ断片を精製し、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片として回収し
た。一方ファージＭ１３ｍｐ１１の二本鎖ＤＮＡをＳａ
ｃＩとＳａｌＩで切断した後、これに上記のＳａｃＩ−
ＳａｌＩ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させて
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子全域
を組込んだファージＭ１３−ＣＡＨの二本鎖ＤＮＡを造
成した。次いで Ｍｅｓｓｉｎｇ の方法［Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０１， ２０
−７８ （１９８３）］に従って一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
鎖ＤＮＡの調製 上記工程（１）で調製した小型化プラスミドｐＣＡＨ１
０をＳａｃＩとＳａｌＩで切断し、得られる約１．５ｋ
ｂ断片を精製し、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片として回収し
た。一方ファージＭ１３ｍｐ１１の二本鎖ＤＮＡをＳａ
ｃＩとＳａｌＩで切断した後、これに上記のＳａｃＩ−
ＳａｌＩ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させて
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子全域
を組込んだファージＭ１３−ＣＡＨの二本鎖ＤＮＡを造
成した。次いで Ｍｅｓｓｉｎｇ の方法［Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０１， ２０
−７８ （１９８３）］に従って一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
【００３４】（３）プライマー伸長
基本的には、 Ｇｏｅｄｄｅｌ らの方法［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８， ４０５７−４０
７４ （１９８０）］に従い、セファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼタンパク質合成開始部位（ＡＴＧ）
よりも上流にあるバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）由来のタンパク質非コード領域を削除したセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子が
含まれる領域を調製した。プライマー伸長法に使用する
プライマーとしてセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼのアミノ酸配列上２番目のグルタミンから７番目
のプロリンに対応する塩基配列をもつオリゴヌクレオチ
ドを合成し、ＣＡＨ−Ｐ１と命名した。次いで上記工程
（２）で調製したファージＭ１３−ＣＡＨ一本鎖ＤＮＡ
７．５μｇに３ｐｍｏｌｅのプライマーＣＡＨ−Ｐ１を
加え、６０℃で２０分間加熱した後、室温になるまで放
置した。次いで、これにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰ（各０．２５ｍＭ）、ＤＮＡポリメラーゼク
レノウ断片（２ユニット）を加え、７ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ塩化ナトリウムの反応液２
０μｌ中、３７℃で２時間プライマー伸長反応をさせた
。反応後、フェノール抽出・エタノール沈殿の操作を行
なった後、ＤＮＡを少量の蒸留水に溶解し、４ユニット
のＳ１ヌクレアーゼ を加え、３０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．６）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫
酸亜鉛の反応液４０μｌ中、３７℃で３０分間反応させ
て、一本鎖部分を分解した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片
を含む溶液をフェノール抽出後、ＤＮＡをエタノールで
沈殿させ、さらに末端部の修復反応を行なわせるため、
前述の方法によりＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片処理
を行なった。
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８， ４０５７−４０
７４ （１９８０）］に従い、セファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼタンパク質合成開始部位（ＡＴＧ）
よりも上流にあるバシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）由来のタンパク質非コード領域を削除したセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子が
含まれる領域を調製した。プライマー伸長法に使用する
プライマーとしてセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼのアミノ酸配列上２番目のグルタミンから７番目
のプロリンに対応する塩基配列をもつオリゴヌクレオチ
ドを合成し、ＣＡＨ−Ｐ１と命名した。次いで上記工程
（２）で調製したファージＭ１３−ＣＡＨ一本鎖ＤＮＡ
７．５μｇに３ｐｍｏｌｅのプライマーＣＡＨ−Ｐ１を
加え、６０℃で２０分間加熱した後、室温になるまで放
置した。次いで、これにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰ（各０．２５ｍＭ）、ＤＮＡポリメラーゼク
レノウ断片（２ユニット）を加え、７ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ塩化ナトリウムの反応液２
０μｌ中、３７℃で２時間プライマー伸長反応をさせた
。反応後、フェノール抽出・エタノール沈殿の操作を行
なった後、ＤＮＡを少量の蒸留水に溶解し、４ユニット
のＳ１ヌクレアーゼ を加え、３０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．６）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫
酸亜鉛の反応液４０μｌ中、３７℃で３０分間反応させ
て、一本鎖部分を分解した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片
を含む溶液をフェノール抽出後、ＤＮＡをエタノールで
沈殿させ、さらに末端部の修復反応を行なわせるため、
前述の方法によりＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片処理
を行なった。
【００３５】（４）発現用プラスミドの造成本実施例に
用いる発現用プラスミド造成のためのベクターであるｐ
ＫＫ２３３−２（アンピシリン耐性）はファルマシア社
で市販されているもので、Ｔｒｃプロモーターを有し、
制限酵素ＮｃｏＩによる切断および末端修復によりＡＴ
Ｇ直後で平滑化されるＡＴＧベクターの一種である。図
１１に示すように、まず、上記工程（３）で得たセファ
ロスポリン・アセチルハイドロラーゼのアミノ末端に相
当する部分が平滑化されたＤＮＡ断片をＰｓｔＩで切断
し、これにより１．２７ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製
した。一方、Ｔｒｃプロモーターを含むｐＫＫ２３３−
２をＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断
片処理した後、ＰｓｔＩで切断し、約４．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片を得た。次いで上記の２つの断片を混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで連結反応を行なわせた後、エシェリキ
ア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３株を形質転換し、
アンピシリン４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス寒天培地上
で生育してくるコロニーを選択した。これらのコロニー
についてＬブロスで一晩液体培養を行ない、集菌後、菌
体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＴＧベクターとセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子を含む
断片との連結部分の塩基配列を決定した。その結果、目
的通りにＡＴＧコドンの直後にセファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼのアミノ末端メチオニンを除く構造
遺伝子が連結された発現用プラスミドが得られ、これを
ｐＣＡＨ２１と命名した。また、この発現用プラスミド
を保有する大腸菌をエシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１と命名した。発現用プラ
スミドｐＣＡＨ２１の複製系はｐＢＲ３２２由来のもの
であり、プラスミドコピ−数をさらに増大させ、大腸菌
内での発現レベルを上昇させる目的で、複製開始領域（
ｏｒｉ）をｐＡＴ１５３由来のものに変更することにし
た。また同時に薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性（
Ａｐｒ）よりテトラサイクリン耐性（Ｔｃｒ）に変更す
ることにした。図１２にプラスミド改変手順を示した。 まず、ｐＣＡＨ２１をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリ
メラ−ゼクレノウ断片処理した後、ＳｃａＩで切断する
ことにより、Ｔｒｃプロモ−タ−、セファロスポリン・
アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子および５Ｓリボゾ−ムＲ
ＮＡのＴ１Ｔ２ タ−ミネ−タ−（５ＳｒｒｎＢＴ１Ｔ
２）を含む約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。他方、ベ
クタ−プラスミドとしては市販のｐＡＴ１５３を使用し
た。ｐＡＴ１５３をＥｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡポリメ
ラ−ゼクレノウ断片で処理した後、ＤｒａＩで切断した
。さらにベクタ−自身の閉環を防止する目的でアルカリ
ホスファタ−ゼ処理を行ない、ｐＡＴ１５３複製領域お
よびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約２．５ｋｂの
ＤＮＡ断片を調製した。次いで上記２つのＤＮＡ断片を
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼで連結反応を行なわせた後
、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３株
を形質転換し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含む
Ｌブロス寒天培地で生育してくるコロニ−を選択した。 これらのコロニ−についてＬブロスで一晩液体培養を行
ない、集菌後、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制
限酵素切断による分析を行なったところ、連結方向の異
なる二種の組換えプラスミドが得られた。セファロスポ
リン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子とテトラサイクリ
ン耐性遺伝子の方向が同じプラスミドをｐＣＡＨ２１１
、逆方向に挿入されたプラスミドをｐＣＡＨ２１２と命
名した。また、これらの組換え発現用プラスミドを保有
する大腸菌をそれぞれエシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１１、エシェリキア・コ
リ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２と命
名した。
用いる発現用プラスミド造成のためのベクターであるｐ
ＫＫ２３３−２（アンピシリン耐性）はファルマシア社
で市販されているもので、Ｔｒｃプロモーターを有し、
制限酵素ＮｃｏＩによる切断および末端修復によりＡＴ
Ｇ直後で平滑化されるＡＴＧベクターの一種である。図
１１に示すように、まず、上記工程（３）で得たセファ
ロスポリン・アセチルハイドロラーゼのアミノ末端に相
当する部分が平滑化されたＤＮＡ断片をＰｓｔＩで切断
し、これにより１．２７ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製
した。一方、Ｔｒｃプロモーターを含むｐＫＫ２３３−
２をＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断
片処理した後、ＰｓｔＩで切断し、約４．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片を得た。次いで上記の２つの断片を混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで連結反応を行なわせた後、エシェリキ
ア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３株を形質転換し、
アンピシリン４０μｇ／ｍｌを含むＬブロス寒天培地上
で生育してくるコロニーを選択した。これらのコロニー
についてＬブロスで一晩液体培養を行ない、集菌後、菌
体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＴＧベクターとセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子を含む
断片との連結部分の塩基配列を決定した。その結果、目
的通りにＡＴＧコドンの直後にセファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼのアミノ末端メチオニンを除く構造
遺伝子が連結された発現用プラスミドが得られ、これを
ｐＣＡＨ２１と命名した。また、この発現用プラスミド
を保有する大腸菌をエシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１と命名した。発現用プラ
スミドｐＣＡＨ２１の複製系はｐＢＲ３２２由来のもの
であり、プラスミドコピ−数をさらに増大させ、大腸菌
内での発現レベルを上昇させる目的で、複製開始領域（
ｏｒｉ）をｐＡＴ１５３由来のものに変更することにし
た。また同時に薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性（
Ａｐｒ）よりテトラサイクリン耐性（Ｔｃｒ）に変更す
ることにした。図１２にプラスミド改変手順を示した。 まず、ｐＣＡＨ２１をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリ
メラ−ゼクレノウ断片処理した後、ＳｃａＩで切断する
ことにより、Ｔｒｃプロモ−タ−、セファロスポリン・
アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子および５Ｓリボゾ−ムＲ
ＮＡのＴ１Ｔ２ タ−ミネ−タ−（５ＳｒｒｎＢＴ１Ｔ
２）を含む約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。他方、ベ
クタ−プラスミドとしては市販のｐＡＴ１５３を使用し
た。ｐＡＴ１５３をＥｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡポリメ
ラ−ゼクレノウ断片で処理した後、ＤｒａＩで切断した
。さらにベクタ−自身の閉環を防止する目的でアルカリ
ホスファタ−ゼ処理を行ない、ｐＡＴ１５３複製領域お
よびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約２．５ｋｂの
ＤＮＡ断片を調製した。次いで上記２つのＤＮＡ断片を
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼで連結反応を行なわせた後
、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３株
を形質転換し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含む
Ｌブロス寒天培地で生育してくるコロニ−を選択した。 これらのコロニ−についてＬブロスで一晩液体培養を行
ない、集菌後、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制
限酵素切断による分析を行なったところ、連結方向の異
なる二種の組換えプラスミドが得られた。セファロスポ
リン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子とテトラサイクリ
ン耐性遺伝子の方向が同じプラスミドをｐＣＡＨ２１１
、逆方向に挿入されたプラスミドをｐＣＡＨ２１２と命
名した。また、これらの組換え発現用プラスミドを保有
する大腸菌をそれぞれエシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１１、エシェリキア・コ
リ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２と命
名した。
【００３６】７．セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼ遺伝子の大腸菌における発現 （１）セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ
遺伝子の発現 エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐ
ＣＡＨ２１１もしくはエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２をテトラサイクリン２
０μｇ／ｍｌを含む２倍濃度のＬブロス５０ｍｌ（０．
５Ｌ容フラスコ）に植菌し、３７℃で２４時間振盪培養
した。培養液０．５ｍｌを取り、遠心分離により集菌後
、０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
懸濁した。超音波破砕装置で細胞を破砕後、これを遠心
分離し、得られる上清を酵素液とした。また、上記工程
１で得られたバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）の培養液を遠心分離して得られる上清を比較のため
の酵素液とした。セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼは基質としてセファロスポリンＣや７ＡＣＡ以外
に酢酸パラニトロフェニル（以下ｐＮＰＡと略記）にも
作用して、呈色物質パラニトロフェノ−ル（以下ｐＮＰ
と略記）を生成する。ｐＮＰは分光光学的に測定可能で
あり、セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの簡
易活性測定法としてｐＮＰＡを基質とする方法を採用し
た。反応は、０．０２％ｐＮＰＡ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）、および酵素液からなる３ｍｌの溶液
中、３０℃で行ない、分光光度計を用いて４００ｎｍで
の光学密度を測定することにより酵素活性を定量した。 ３０℃、ｐＨ６．８の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅ
のｐＮＰを生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定めた
。その結果、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｊ
Ｍ１０３／ｐＣＡＨ２１１およびエシェリキア・コリ（
Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の培養液あ
たりの酵素活性は、９．９Ｕ／ｍｌおよび１２．４Ｕ／
ｍｌであった。これに対し、バシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の酵素活性は０．３６Ｕ／ｍｌで
あった。発現用プラスミドｐＣＡＨ２１１のＴｒｃプロ
モーターおよびＳＤ−ＡＴＧ間の配列を大腸菌トリプト
ファン・オペロン由来のＴｒｐプロモーターとＳＤ−Ａ
ＴＧ間の配列に置換したプラスミドを造成し、これをエ
シェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導
入し、得られた形質転換体を上記と同様の方法で培養し
たところ、培養液あたりの酵素活性は７５．５Ｕ／ｍｌ
であった。これらの発現用プラスミドを保有する大腸菌
をスケールアップした培養装置、例えばジャーファーメ
ンターなどを用いて、適切な培地・培養条件で増殖させ
ることにより、セファロスポリン・アセチルハイドロラ
ーゼの生産量を増大させることができる。
ラーゼ遺伝子の大腸菌における発現 （１）セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ
遺伝子の発現 エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐ
ＣＡＨ２１１もしくはエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２をテトラサイクリン２
０μｇ／ｍｌを含む２倍濃度のＬブロス５０ｍｌ（０．
５Ｌ容フラスコ）に植菌し、３７℃で２４時間振盪培養
した。培養液０．５ｍｌを取り、遠心分離により集菌後
、０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
懸濁した。超音波破砕装置で細胞を破砕後、これを遠心
分離し、得られる上清を酵素液とした。また、上記工程
１で得られたバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）の培養液を遠心分離して得られる上清を比較のため
の酵素液とした。セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼは基質としてセファロスポリンＣや７ＡＣＡ以外
に酢酸パラニトロフェニル（以下ｐＮＰＡと略記）にも
作用して、呈色物質パラニトロフェノ−ル（以下ｐＮＰ
と略記）を生成する。ｐＮＰは分光光学的に測定可能で
あり、セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの簡
易活性測定法としてｐＮＰＡを基質とする方法を採用し
た。反応は、０．０２％ｐＮＰＡ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）、および酵素液からなる３ｍｌの溶液
中、３０℃で行ない、分光光度計を用いて４００ｎｍで
の光学密度を測定することにより酵素活性を定量した。 ３０℃、ｐＨ６．８の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅ
のｐＮＰを生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定めた
。その結果、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｊ
Ｍ１０３／ｐＣＡＨ２１１およびエシェリキア・コリ（
Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の培養液あ
たりの酵素活性は、９．９Ｕ／ｍｌおよび１２．４Ｕ／
ｍｌであった。これに対し、バシラス・サチリス（Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の酵素活性は０．３６Ｕ／ｍｌで
あった。発現用プラスミドｐＣＡＨ２１１のＴｒｃプロ
モーターおよびＳＤ−ＡＴＧ間の配列を大腸菌トリプト
ファン・オペロン由来のＴｒｐプロモーターとＳＤ−Ａ
ＴＧ間の配列に置換したプラスミドを造成し、これをエ
シェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導
入し、得られた形質転換体を上記と同様の方法で培養し
たところ、培養液あたりの酵素活性は７５．５Ｕ／ｍｌ
であった。これらの発現用プラスミドを保有する大腸菌
をスケールアップした培養装置、例えばジャーファーメ
ンターなどを用いて、適切な培地・培養条件で増殖させ
ることにより、セファロスポリン・アセチルハイドロラ
ーゼの生産量を増大させることができる。
【００３７】（２）セファロスポリンＣおよび７ＡＣＡ
の脱アセチル化基質としてセファロスポリンＣあるいは
７ＡＣＡを用いて、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の酵素液による脱アセ
チル化を行った。反応は、１０ｍＭの基質を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに酵素液０．
２ｍｌを加え、３７℃で４０分間行ない、１．２ｍｌの
０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）の添加により停止さ
せた。反応終了液を高速液体カラムクロマトグラフィー
に供し、生成物であるデアセチルセファロスポリンＣあ
るいはデアセチル７ＡＣＡを定量した。カラムはコスモ
シール（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ）５Ｃ８ （ナカライテスク
社製）を用い、溶出はメタノール濃度を連続的に上昇さ
せてゆく濃度勾配溶出法によった。即ち、２０ｍＭリン
酸二水素ナトリウム、５ｍＭテトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウム−ヒドロキシド（ＴＢＡＨ）を含む溶液を使用し
、メタノール濃度を最終濃度２０％まで上昇させた。ま
た、生成物の検出は２５４ｎｍで行なった。セファロス
ポリン・アセチルハイドロラーゼの活性は、３７℃、ｐ
Ｈ７．０の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅの生成物を
与える酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。その結果、セ
ファロスポリンＣあるいは７ＡＣＡに対するエシェリキ
ア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１
２の酵素液の培養液あたりの活性はともに７．４Ｕ／ｍ
ｌであった。
の脱アセチル化基質としてセファロスポリンＣあるいは
７ＡＣＡを用いて、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の酵素液による脱アセ
チル化を行った。反応は、１０ｍＭの基質を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに酵素液０．
２ｍｌを加え、３７℃で４０分間行ない、１．２ｍｌの
０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）の添加により停止さ
せた。反応終了液を高速液体カラムクロマトグラフィー
に供し、生成物であるデアセチルセファロスポリンＣあ
るいはデアセチル７ＡＣＡを定量した。カラムはコスモ
シール（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ）５Ｃ８ （ナカライテスク
社製）を用い、溶出はメタノール濃度を連続的に上昇さ
せてゆく濃度勾配溶出法によった。即ち、２０ｍＭリン
酸二水素ナトリウム、５ｍＭテトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウム−ヒドロキシド（ＴＢＡＨ）を含む溶液を使用し
、メタノール濃度を最終濃度２０％まで上昇させた。ま
た、生成物の検出は２５４ｎｍで行なった。セファロス
ポリン・アセチルハイドロラーゼの活性は、３７℃、ｐ
Ｈ７．０の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅの生成物を
与える酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。その結果、セ
ファロスポリンＣあるいは７ＡＣＡに対するエシェリキ
ア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１
２の酵素液の培養液あたりの活性はともに７．４Ｕ／ｍ
ｌであった。
【００３８】（３）組換えセファロスポリン・アセチル
ハイドロラーゼの形状大腸菌で生産されたセファロスポ
リン・アセチルハイドロラーゼのサブユニットおよび活
性型の分子量を測定した結果、上記工程１で得られたも
のと同じ結果を得たことから、組換えセファロスポリン
・アセチルハイドロラーゼも天然型セファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼと同じく８量体で存在すると考
えられる。また、組換えセファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼを逆相カラムを使用した高速液体カラムク
ロマトグラフィーにより精製した後、エドマン分解法お
よびヒドラジン分解法により末端分析したところ、天然
型と同じくアミノ末端はメチオニン、カルボキシル末端
はグリシンであった。さらに、自動アミノ酸配列シーケ
ンサーを用いてアミノ末端メチオニンからの配列を調べ
た結果、決定された２５番目までのアミノ酸配列が構造
遺伝子から推定される配列（図２）と完全に一致してい
た。
ハイドロラーゼの形状大腸菌で生産されたセファロスポ
リン・アセチルハイドロラーゼのサブユニットおよび活
性型の分子量を測定した結果、上記工程１で得られたも
のと同じ結果を得たことから、組換えセファロスポリン
・アセチルハイドロラーゼも天然型セファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼと同じく８量体で存在すると考
えられる。また、組換えセファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼを逆相カラムを使用した高速液体カラムク
ロマトグラフィーにより精製した後、エドマン分解法お
よびヒドラジン分解法により末端分析したところ、天然
型と同じくアミノ末端はメチオニン、カルボキシル末端
はグリシンであった。さらに、自動アミノ酸配列シーケ
ンサーを用いてアミノ末端メチオニンからの配列を調べ
た結果、決定された２５番目までのアミノ酸配列が構造
遺伝子から推定される配列（図２）と完全に一致してい
た。
【００３９】
【発明の効果】実施例において詳述したように、本発明
者らは、バシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）ＳＨＳ０１３３株が生産するセファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼの遺伝子を含む領域をクローニング
し、大腸菌中で発現可能なベクターを用いて組換えプラ
スミドを造成することによって、セファロスポリン・ア
セチルハイドロラーゼ生産の飛躍的な増大と、その広範
な応用の前提条件を与えることができた。また、クロー
ン化されたセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ
遺伝子を含むＤＮＡ断片は、セファロスポリン・アセチ
ルハイドロラーゼの機能を有益に利用するための極めて
強力な手段を提供するものである。
者らは、バシラス・サチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）ＳＨＳ０１３３株が生産するセファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼの遺伝子を含む領域をクローニング
し、大腸菌中で発現可能なベクターを用いて組換えプラ
スミドを造成することによって、セファロスポリン・ア
セチルハイドロラーゼ生産の飛躍的な増大と、その広範
な応用の前提条件を与えることができた。また、クロー
ン化されたセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ
遺伝子を含むＤＮＡ断片は、セファロスポリン・アセチ
ルハイドロラーゼの機能を有益に利用するための極めて
強力な手段を提供するものである。
【図１】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼのアミノ酸配列を示す配列図である。
ゼのアミノ酸配列を示す配列図である。
【図２】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼ遺伝子の塩基配列（下段）およびそれから推定される
アミノ酸配列（上段）を示す配列図である（前半部）。
ゼ遺伝子の塩基配列（下段）およびそれから推定される
アミノ酸配列（上段）を示す配列図である（前半部）。
【図３】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼ遺伝子の塩基配列（下段）およびそれから推定される
アミノ酸配列（上段）を示す配列図である（後半部）。
ゼ遺伝子の塩基配列（下段）およびそれから推定される
アミノ酸配列（上段）を示す配列図である（後半部）。
【図４】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−
ゼの部分決定された３４個のアミノ酸配列を示す配列図
である。
ゼの部分決定された３４個のアミノ酸配列を示す配列図
である。
【図５】 図４中に下線を施したアミノ酸配列から推
定される遺伝子上可能なＤＮＡ塩基配列全てを含む４種
の合成オリゴヌクレオチドプロ−ブを示す配列図である
。
定される遺伝子上可能なＤＮＡ塩基配列全てを含む４種
の合成オリゴヌクレオチドプロ−ブを示す配列図である
。
【図６】 組換えプラスミドｐＣＡＨ０１の制限酵素
切断地図およびＤＮＡプロ−ブがハイブリダイズする位
置を示す模式図である。
切断地図およびＤＮＡプロ−ブがハイブリダイズする位
置を示す模式図である。
【図７】 組換えプラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素
切断地図を示す模式図である。
切断地図を示す模式図である。
【図８】 クロ−ン化されたセファロスポリン・アセ
チルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列
図である（前半部）。
チルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列
図である（前半部）。
【図９】 クロ−ン化されたセファロスポリン・アセ
チルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列
図である（後半部）。
チルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列
図である（後半部）。
【図１０】 組換えプラスミドｐＣＡＨ０３からセフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子より下流
にある領域を削除した小型化プラスミドｐＣＡＨ１０の
造成図である。
ァロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子より下流
にある領域を削除した小型化プラスミドｐＣＡＨ１０の
造成図である。
【図１１】 大腸菌での発現用プラスミドｐＣＡＨ２
１の造成図である。
１の造成図である。
【図１２】 大腸菌での発現用プラスミドｐＣＡＨ２
１１およびｐＣＡＨ２１２の造成図である。
１１およびｐＣＡＨ２１２の造成図である。
Claims (10)
- 【請求項１】 図１に示されるアミノ酸配列をコ−ド
するＤＮＡ塩基配列。 - 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡ塩基配列を大腸
菌の宿主・ベクタ−系で用いられるベクタ−に組込んだ
組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 請求項２記載の組換えＤＮＡ分子で形
質転換された大腸菌。 - 【請求項４】 図１に示されるアミノ酸配列を有する
タンパク質。 - 【請求項５】 図１に示されるアミノ酸配列のアミノ
末端にさらにメチオニンを有するアミノ酸配列を有する
タンパク質。 - 【請求項６】 請求項３記載の大腸菌により産生され
る請求項４または５に記載のタンパク質。 - 【請求項７】 請求項４、５または６のいずれかに記
載のタンパク質の多量体からなる酵素。 - 【請求項８】 該酵素が該タンパク質の４量体または
８量体である請求項７記載の酵素。 - 【請求項９】 請求項３に記載の大腸菌を培養し、培
養液から請求項４または５のいずれかに記載のタンパク
質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造法。 - 【請求項１０】 請求項３に記載の大腸菌を培養し、
培養液から請求項７または８のいずれかに記載の酵素を
採取することを特徴とする該酵素の製造法。
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