JP2000248002A - 自己架橋ヒアルロン酸とその製造方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生
体適合性の特徴を最大限生かすために、なんら化学的架
橋剤や化学的修飾剤を使用することなく、またカチオン
性の高分子と複合体化することなく、安全性及び生体適
合性に優れた自己架橋ヒアルロン酸を提供すること。 【解決手段】 分岐度が０．５以上の分子量フラクショ
ンを部分的に含むことを特徴とする自己架橋ヒアルロン
酸を構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な自己架橋ヒ
アルロン酸及びその製造方法に関し、更にそれらの医用
材料に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチル
グルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した
直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の
結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌
の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさ
か、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖
球菌の培養物からも精製物が調製されている。

【０００３】ヒアルロン酸は、分子量について多分散性
であるが、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植また
は注入した場合であっても優れた生体適合性を示すこと
が知られている。さらに、新しい物性を有するヒアルロ
ン酸誘導体を得るために、多種多様な化学修飾、化学架
橋が提案されている。ヒアルロン酸の化学修飾、化学架
橋による水難溶化技術が多く報告されており、３次元架
橋によるヒアルロン酸ゲルの形成も知られている。

【０００４】これらの代表的なものとしては、ジビニル
スルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二
官能性試薬を架橋剤に使用して、得られた高膨潤性の架
橋ヒアルロン酸ゲルを挙げることができる（米国特許第
４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号
公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３
０６０１号公報参照）。

【０００５】また、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモ
ニウム塩がジメチルスルフォキシド等の有機溶媒に溶解
する特徴を利用したヒアルロン酸の化学的修飾方法が開
示されている（特開平３−１０５００３号）。また、ヒ
アルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルス
ルフォキシド中で、トリエチルアミンとヨウ化２−クロ
ロ−１−メチルピリジニウムを加え反応させ、ヒアルロ
ン酸のカルボキシル基と水酸基間でエステル結合を形成
させる方法も開示されている（欧州特許０３４１７４５
Ａ１）。

【０００６】また、共有結合を形成する化学的試薬を使
用しない方法として、ヒアルロン酸とアミノ基あるいは
イミノ基を有する高分子化合物とを、ヒアルロン酸のカ
ルボキシル基と高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ
基をイオン複合体として結合させてヒアルロン酸高分子
複合体を調製する方法が開示されている（特開平６−７
３１０３号公報参照）。

【０００７】また、ヒアルロン酸水溶液を、ｐＨ２．０
〜３．８、２０〜８０重量％水溶性有機溶剤存在下にお
くことを特徴とするヒアルロン酸ゲルの製造方法も開示
されている（特開平５−５８８８１公報参照）。

【０００８】また、一般的には、高分子水溶液から、凍
結、解凍させる操作を繰り返すことにより高分子ゲルを
製造する方法も提案されている。これらの代表的なもの
としては、ポリビニルアルコール、グルコマンナンを挙
げることができる（特開昭５７−１９００７２号公報、
特開平５−１６１４５９号公報参照）。

【０００９】しかし、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸を
含む生体試料を精製又は保存する際に、凍結、解凍させ
る操作や凍結乾燥は、一般的手法として多用されている
が、通常は中性で管理されているため、このような方法
で自己架橋ヒアルロン酸が形成されるという報告は未だ
ない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】ヒアルロン酸自体が本
来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすた
めに、なんら化学的架橋剤や化学的修飾剤を使用するこ
となく、またカチオン性の高分子と複合体化することな
く、生体適合性医用材料として使用可能な、自己架橋ヒ
アルロン酸は未だ開発されていない。

【００１１】本発明者らは、上記目的を達成するため
に、ヒアルロン酸自体の物理化学的性質を鋭意検討して
きた。その結果、（１）ヒアルロン酸の水溶液を特定の
ｐＨに調整し、該水溶液を凍結し、次いで解凍すること
を少なくとも１回行うことによって、（２）ヒアルロン
酸濃度５重量％以上でヒアルロン酸のカルボキシル基と
等モル以上の酸成分を含むヒアルロン酸酸性水溶液から
形成することによって、自己架橋ヒアルロン酸が得られ
ることを見出した。

【００１２】また、従来法による改質ヒアルロン酸は、
幾多の努力にもかかわらず化学的反応性物質を用いるた
め、新たな改質による毒性・生体不適合性等の危険性を
本質的に抱え込まざるをえないという課題があった。

【００１３】例えば、化学的修飾・架橋、及び金属塩な
どを用いるイオン的方法による、ヒアルロン酸誘導体
は、たとえ生体内の貯留性などを改善できても、改質さ
れたヒアルロン酸は架橋物質や金属などを共有結合やイ
オン結合でヒアルロン酸の分子中に内包するため、もは
や天然ヒアルロン酸と構造が異なり、その生理作用や生
体適合性、毒性を含む安全性が本質的にヒアルロン酸と
同等であるとは言い難く、さらにこれら架橋剤等の残留
毒性や、生体内に於ける分解産物に含まれる架橋剤の安
全性の問題を完全に回避することは難しかった。

【００１４】本発明者らは、本発明で得られた自己架橋
ヒアルロン酸が医用材料として理想的な生体適合性を有
することを見出し、本発明を完成させるに至った。

【００１５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、（１）
分岐度が０．５以上の分子量フラクションを部分的に含
むことを特徴とする自己架橋ヒアルロン酸、（２）ヒア
ルロン酸のｐＨ３．５以下の水溶液を凍結し、次いで解
凍して形成されることを特徴とする（１）記載の自己架
橋ヒアルロン酸、（３）ヒアルロン酸の水溶液を、ｐＨ
３．５以下に調整し、該水溶液を凍結し、次いで解凍す
ることを少なくとも１回行うことを特徴とする（２）記
載の自己架橋ヒアルロン酸の製造方法、（４）ヒアルロ
ン酸濃度５重量％以上でヒアルロン酸のカルボキシル基
と等モル以上の酸成分を含むヒアルロン酸酸性水溶液か
ら形成することを特徴とする（１）記載の自己架橋ヒア
ルロン酸の製造方法、（５）分岐度が０．５以上の分子
量フラクションを部分的に含む自己架橋ヒアルロン酸を
含有することを特徴とする医用材料である。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出
したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源
を問うことなく使用できる。発酵法で使用する菌株は自
然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロ
ン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３
９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−１００（微工研菌寄第9027号) 、特開平２−２３４６
８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−３００（微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定
にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変
異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。

【００１７】本発明でいう自己架橋ヒアルロン酸は、ヒ
アルロン酸が架橋構造を保持し、分岐点を有するヒアル
ロン酸として、高分子溶液論的に直鎖状のヒアルロン酸
と区別することができる。ヒアルロン酸自体は直鎖状の
高分子であり、分岐構造を有さないことが知られている
（多糖生化学１ 化学編 共立出版 昭和４４年）。

【００１８】自己架橋ヒアルロン酸の分子量と分岐度を
測定する方法には、ゲルパーミエションクロマトグラム
（ＧＰＣ）に検出器として示差屈折率計と多角度レーザ
ー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）を使うＧＰＣ−ＭＡＬＬ
Ｓ法、ＧＰＣに検出器として示差屈折率計と低角度レー
ザー光散乱検出器を使うＧＰＣ−ＬＡＬＬＳ法、あるい
は、ＧＰＣに検出器として示差屈折率計と粘度計を使う
ＧＰＣ−粘度法がある。

【００１９】本発明ではＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法を用い、
ＧＰＣで分離された分子量フラクションの分子量と分岐
度をオンラインで連続的に測定した。ＧＰＣ−ＭＡＬＬ
Ｓ法では、ＧＰＣで分離された各フラクションの分子量
と慣性半径を連続的に測定することができる。ＧＰＣ−
ＭＡＬＬＳ法には、自己架橋ヒアルロン酸の各フラクシ
ョンの分子量と慣性半径の関係を、対照となる直鎖状ヒ
アルロン酸の各フラクションの分子量と慣性半径の関係
と比較して分岐度を計算する慣性半径法と、同一溶出体
積のフラクションのヒアルロン酸の分子量と対照となる
直鎖状ヒアルロン酸の分子量を比較して分岐度を計算す
る溶出体積法がある。

【００２０】本発明では、溶出体積法を使って分岐度の
測定を行った。分岐度は自己架橋ヒアルロン酸の高分子
鎖１コ当たりに存在する分岐点の数であり、自己架橋ヒ
アルロン酸の分子量に対してプロットされる。各フラク
ションの分子量と慣性半径は、有限濃度におけるジムプ
ロット（１）式を用いて、分子量は散乱角度０°への外
挿値、慣性半径は角度依存の初期勾配から、それぞれ以
下の式に従って計算した。

【００２１】

【数１】

【００２２】ここで、Ｍは分子量、＜Ｓ² ＞は平均２乗
慣性半径、Ｋは光学定数、Ｒ（θ）は散乱角度θにおけ
る過剰還元散乱強度、ｃは高分子濃度、Ｐ（θ）は粒子
散乱関数、λは溶液中でのレーザー光の波長、Ａ₂ は第
２ビリアル係数でありヒアルロン酸では０．００２ｍｌ
・ｍｏｌ／ｇ² である。ｃは示差屈折率計の出力から、
ヒアルロン酸溶液の屈折率の濃度勾配（ｄｎ／ｄｃ：
０．１５３ｍｌ／ｇ）を使って計算した。

【００２３】ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法では、過剰還元散乱
強度から分子量と平均２乗慣性半径を計算しており、測
定精度は過剰還元散乱強度の大きさに依存する。（１）
式から、過剰還元散乱強度は濃度と分子量両者の関数に
なる。試料の分子量に依存して、試料濃度と注入量を決
定する必要がある。分子量フラクションに分別するＧＰ
Ｃカラムの選択とともに、ＧＰＣカラムへの濃度負荷が
現れない範囲内で、最大の試料濃度と注入量を選択す
る。

【００２４】溶出体積法による各フラクションの分岐度
は、以下の（２）式に従って計算した。同一溶出体積の
フラクションで、分岐高分子の分子量をＭ_b 、直鎖高分
子の分子量をＭ_l とすると、収縮因子ｇが求まる。

【００２５】

【数２】

【００２６】ここで、ａはMark-Houwink定数でヒアルロ
ン酸では０．７８である。ｅは素抜け因子で１．０とし
た。４官能性の長鎖無秩序分岐を仮定して、１本の高分
子鎖上の分岐点の数Ｂ（分岐度）は以下の（３）式から
計算される。

【００２７】

【数３】

【００２８】溶出体積法による分岐度の計算方法はＧＰ
Ｃ−ＬＡＬＬＳ法による分岐度測定と同じであり、その
詳細は、サイズ排除クロマトグラフィー（共立出版 平
成３年）に記載されている。

【００２９】自己架橋ヒアルロン酸は、ＧＰＣ溶媒で希
釈して濃度を調製し、０．２μｍのメンブランフィルタ
ーでろ過した後測定に供した。本発明でいう自己架橋ヒ
アルロン酸中に、安定に存在する架橋構造がある場合、
分岐構造が高分子溶液論的に確認される。

【００３０】本発明でいう自己架橋とは、ヒアルロン酸
以外に化学的架橋剤や化学的修飾剤等は使用しないこと
また、カチオン性の高分子と複合体化しないことを意味
するものである。また、自己架橋が進み、３次元架橋が
形成されるとゲルとなることから、当該ゲルも本発明で
いう自己架橋ヒアルロン酸に含まれることは言うまでも
ない。

【００３１】ヒアルロン酸の化学的架橋剤は、ヒアルロ
ン酸のカルボキシル基、水酸基、アセトアミド基と反応
して共有結合を形成する多価化合物であり、ポリグリシ
ジルエーテル等の多価エポキシ化合物、ジビニルスルホ
ン、ホルムアルデヒド、オキシ塩化リン、カルボジイミ
ド化合物とアミノ酸エステルの併用、カルボジイミド化
合物とジヒドラジド化合物の併用を例として挙げること
ができる。

【００３２】ヒアルロン酸の化学的修飾剤は、ヒアルロ
ン酸のカルボキシル基、水酸基、アセトアミド基と反応
して共有結合を形成する化合物であり、無水酢酸と濃硫
酸の併用、無水トリフルオロ酢酸と有機酸の併用、ヨウ
化アルキル化合物を例として挙げることができる。

【００３３】ヒアルロン酸と複合体化するカチオン性の
高分子は、ヒアルロン酸のカルボキシル基と高分子化合
物のアミノ基あるいはイミノ基の間でイオン複合体を形
成する高分子であり、キトサン、ポリリジン、ポリビニ
ルピリジン、ポリエチレンイミン、ポリジメチルアミノ
エチルメタクリレートを例として挙げることができる。

【００３４】本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物
組織抽出又は発酵法で得られた高分子精製品でも、更に
加水分解処理等をして得た低分子量のものでも同様に好
ましく使用できる。なお、本発明にいうヒアルロン酸
は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウ
ム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。

【００３５】本発明に用いられるヒアルロン酸の水溶液
は、ヒアルロン酸の粉末と水を混合し、撹拌して得られ
る。

【００３６】まず、ヒアルロン酸の調整された酸性溶液
の凍結解凍により得られる自己架橋ヒアルロン酸につい
て述べる。ヒアルロン酸の水溶液のｐＨを調整するため
に使用する酸は、ｐＨ３．５以下に調整できる酸であれ
ば、いずれの酸も使用することができる。酸の使用量を
低減するために、好ましくは強酸、例えば、塩酸、硝
酸、硫酸等を使用することが望ましい。

【００３７】ヒアルロン酸の水溶液のｐＨは、ヒアルロ
ン酸のカルボキシル基が充分な割合でプロトン化するｐ
Ｈに調整する。酸型のヒアルロン酸の解離の平衡定数
は、ヒアルロン酸濃度の無限希釈のときｌｏｇＫ₀ ＝
４．２５である（Acta Chimica Hungarica - Models in
Chemistry 129(5) 671-683 1992）。調整されるｐＨは
ヒアルロン酸塩の対イオンの種類、ヒアルロン酸の分子
量、水溶液濃度、凍結及び解凍の条件、並びに生成する
架橋ヒアルロン酸等の諸特性により適宜決められるが、
本発明では、ｐＨ３．５以下に調整することが必要であ
る。好ましくは、ｐＨ２．５以下である。

【００３８】凍結、解凍はヒアルロン酸の調整された酸
性水溶液を、任意の容器に入れた後、所定の温度で凍結
させ、凍結が終わった後、所定の温度で解凍させる操作
を少なくとも１回行う。凍結、解凍の温度と時間は、容
器の大きさ、水溶液量によりヒアルロン酸の酸性水溶液
が凍結、解凍する温度と時間の範囲内で適宜決められる
が、一般には、氷点以下の凍結温度、氷点以上の解凍温
度が好ましい。

【００３９】凍結、解凍時間を短くできることから、更
に好ましくは−５℃以下の凍結温度、５℃以上の解凍温
度が選ばれる。また、時間は、その温度で凍結、解凍が
終了する時間以上であれば特に制限されない。

【００４０】ヒアルロン酸の調整された酸性水溶液を凍
結し、次いで解凍する操作の繰り返し回数は、使用する
ヒアルロン酸の分子量、水溶液濃度、水溶液のｐＨ、凍
結及び解凍の温度と時間、並びに生成する架橋ヒアルロ
ン酸等の諸特性により適宜決められる。通常は１回以上
繰り返すことが好ましい。また、凍結、解凍の操作を繰
り返すごとに、その凍結、解凍の温度及び時間を変えて
も構わない。

【００４１】本発明に用いられるヒアルロン酸濃度５重
量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液とは、ヒアルロン酸
のカルボキシル基が充分な割合でプロトン化されるよう
に調製された水溶液を意味している。酸性に調製するた
めの用いる酸成分の量は、ヒアルロン酸塩の対イオンの
種類、ヒアルロン酸の分子量、ヒアルロン酸濃度、並び
に生成するゲルの強さ等の諸特性により適宜決められる
が、一般にはヒアルロン酸のカルボキシル基と等モル以
上の酸成分の量が好ましい。酸成分は、ヒアルロン酸よ
り強い酸であれば、いずれの酸も使用することができ
る。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例
えば、塩酸、硝酸、硫酸等を使用することが望ましい。

【００４２】次に、ヒアルロン酸濃度５重量％以上のヒ
アルロン酸酸性水溶液より得る自己架橋ヒアルロン酸に
ついて述べる。本発明に用いられるヒアルロン酸濃度５
重量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液は、生成するヒア
ルロン酸ゲルの中和処理の前に、ゲル化を進行させるた
めの熟成が必要である。この熟成させる温度や時間は、
ヒアルロン酸酸性水溶液のヒアルロン酸塩の対イオンの
種類、ヒアルロン酸の分子量、ヒアルロン酸濃度、並び
に生成するゲルの強さ等の諸特性により適宜決められる
が、温度については、ヒアルロン酸酸性水溶液が凍結し
ないために、そして、ヒアルロン酸の酸による分解を抑
えるために、−１０℃以上３０℃以下で行うことが好ま
しい。

【００４３】本発明に用いられるヒアルロン酸濃度５重
量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液の調製方法は問わな
いが、固体ヒアルロン酸と酸性水溶液を混合する方法、
低濃度で調製したヒアルロン酸酸性水溶液を所定の濃度
に濃縮する方法や、高濃度のヒアルロン酸水溶液に酸成
分を加える方法などが挙げられる。

【００４４】固体ヒアルロン酸と酸性水溶液を混合する
方法の場合、混合する固体ヒアルロン酸の形態は問わな
いが、粉末、ヒアルロン酸粉末を加圧成型して得られる
ブロック状の成型物、ヒアルロン酸を蒸留水に溶解して
水溶液にした後、通風乾燥して得られるキャストフィル
ムや凍結乾燥後に得られるスポンジ状ヒアルロン酸など
の形態が考えられる。混合方法としては、固体ヒアルロ
ン酸に酸性水溶液を所定の濃度になるように含浸させる
方法や、固体ヒアルロン酸に酸性水溶液を添加し混練す
る方法などがある。

【００４５】低濃度で調製したヒアルロン酸酸性水溶液
を所定の濃度に濃縮する方法の場合、まず、固体ヒアル
ロン酸を蒸留水に溶解した後に酸成分を加える事や固体
ヒアルロン酸を直接酸性水溶液に溶解する事などによっ
て、低濃度のヒアルロン酸酸性水溶液を調製する。ここ
で、溶解する固体ヒアルロン酸の形態は問わない。ま
た、ここでいう低濃度とは、目的のヒアルロン酸ゲルの
ヒアルロン酸濃度より低いことをいうが、扱い易いと言
う点で好ましくはヒアルロン酸濃度が５重量％以下が望
ましい。濃縮方法としては、超遠心分離、通風乾燥、減
圧乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。

【００４６】高濃度のヒアルロン酸水溶液に酸成分を加
える方法の場合、まず、固体ヒアルロン酸と蒸留水を混
合することや、低濃度のヒアルロン酸水溶液を濃縮する
ことなどにより、高濃度のヒアルロン酸水溶液を調製す
る。この時に用いる固体ヒアルロン酸の形態は問わな
い。得られた高濃度のヒアルロン酸水溶液に酸成分を添
加する方法としては、気体状態の酸、例えば塩化水素の
雰囲気下に曝す方法や、ヒアルロン酸に対して貧溶媒の
酸溶液、例えばエタノール−塩酸溶液中に浸す方法など
が挙げられる。

【００４７】ヒアルロン酸の調整された酸性溶液の凍結
解凍により得られた自己架橋ヒアルロン酸、及びヒアル
ロン酸濃度５重量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液より
得られた自己架橋ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸の酸加
水分解を避けるために、酸性に調整するために用いた酸
等の成分を除く必要がある。酸等の成分を除くために
は、通常は水性溶媒による洗浄もしくは透析を行う。自
己架橋ヒアルロン酸の機能を損なわないものであれば特
に制限はないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝
液等が用いられるが、好ましくは、生理食塩水、リン酸
緩衝液等が用いられる。

【００４８】この洗浄された自己架橋ヒアルロン酸は、
その使用目的に応じて、溶液状、溶媒中に浸漬した状
態、溶媒を含ませた湿潤状態、風乾、減圧乾燥あるいは
凍結乾燥等の処理を経た乾燥状態で医用材料として供さ
れる。

【００４９】医用材料として用いるためには、生体適合
性が高いことが必須であり、一般的に細胞毒性がないこ
とを証明する必要がある。本発明の自己架橋ヒアルロン
酸は、これらの条件を十分に満たすものであり、生体分
解性医用材料としてまたヒアルロン酸が用いられる分野
であれば特に制限なく使用することができる。例えば、
癒着防止材、関節注入剤、軟質組織注入剤、代用硝子
体、化粧料、診断・治療に用いる医療器具・医療用具等
の生物医学的製品又は医薬組成物への使用が挙げられ
る。

【００５０】自己架橋ヒアルロン酸及びその成形加工品
は、単一形態での使用は当然ながら、異なる自己架橋ヒ
アルロン酸の形態との混合又は併用、更にヒアルロン酸
溶液との混合又は併用による組合せ処方により効果の増
強が期待できる。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
する。なお、本発明はこれにより限定されるものではな
い。

【００５２】実施例１ 分子量が３．５×１０⁵ ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを蒸留水に溶解し、１．５重量％のヒアルロン酸の
水溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液の
ｐＨは、６．０であった。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩
酸でｐＨ１．５に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液
１５ｍｌを３０ｍｌの容器に入れ、−２０℃に設定した
冷凍庫に入れた。２４時間、４８時間、７２時間凍結し
た後、２５℃で解凍した。その結果、架橋ヒアルロン酸
が得られた。

【００５３】実施例２ 実施例１に於いて、分子量が２．２×１０⁵ ダルトンの
ヒアルロン酸ナトリウムを溶解してヒアルロン酸の水溶
液を調整した。実施例１と同様に調整し、−２０℃に設
定した冷凍庫に入れた。２４時間、４８時間、７２時間
凍結した後、２５℃で解凍した。その結果、架橋ヒアル
ロン酸が得られた。

【００５４】実施例３ 実施例１に於いて、分子量が６．０×１０⁴ ダルトンの
ヒアルロン酸ナトリウムを溶解してヒアルロン酸の水溶
液を調整した。実施例１と同様に調整し、−２０℃に設
定した冷凍庫に入れた。４０日間凍結した後、２５℃で
解凍した。その結果、架橋ヒアルロン酸が得られた。

【００５５】実施例４ 実施例１に於いて、分子量が４．０×１０⁴ ダルトンの
ヒアルロン酸ナトリウムを溶解してヒアルロン酸の水溶
液を調整した。実施例１と同様に調整し、−２０℃に設
定した冷凍庫に入れた。４０日間、６２日間、８１日間
凍結した後、２５℃で解凍した。その結果、架橋ヒアル
ロン酸が得られた。

【００５６】実施例５ 実施例１に於いて、分子量が２．０×１０⁴ ダルトンの
ヒアルロン酸ナトリウムを溶解してヒアルロン酸の水溶
液を調整した。実施例１と同様に調整し、−２０℃に設
定した冷凍庫に入れた。８１日間凍結した後、２５℃で
解凍した。その結果、架橋ヒアルロン酸が得られた。

【００５７】実施例６ 実施例４に於いて、６２日間凍結した後、２５℃で解凍
し、ｐＨ１．５のヒアルロン酸水溶液を、０．２ＮのＮ
ａＯＨ水溶液でｐＨ７．０に中和した。中和したヒアル
ロン酸水溶液を凍結乾燥し、架橋ヒアルロン酸を回収し
た。

【００５８】実施例７ 分子量が２．０×１０⁴ ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを重水に溶解し、１．５重量％のヒアルロン酸の水
溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液のｐ
Ｄは、６．０であった。この水溶液のｐＤを、１Ｎ重塩
酸の重水溶液でｐＤ１．１に調整した。ヒアルロン酸の
酸性水溶液１５ｍｌを３０ｍｌの容器に入れ、−２０℃
に設定した冷凍庫に入れた。８１日間凍結した後、２５
℃で解凍した。その結果、架橋ヒアルロン酸が得られ
た。

【００５９】実施例８ 分子量が２．２×１０⁵ ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを１Ｎ塩酸水溶液に溶解し、２０重量％のヒアルロ
ン酸の水溶液を調製した。ヒアルロン酸の酸性水溶液１
５ｍｌを３０ｍｌの容器に入れ、５℃に設定した冷凍庫
に入れた。３３日間冷蔵し、架橋ヒアルロン酸が得られ
た。

【００６０】比較例１ 実施例１に於いて、ヒアルロン酸の水溶液のｐＨを調整
せずに、凍結し、２４時間、４８時間、７２時間凍結し
た後、２５℃で解凍した。

【００６１】比較例２ 実施例８に於いて、ヒアルロン酸の水溶液のｐＨを調整
せずに、３３日間冷蔵した。

【００６２】実施例９ 架橋ヒアルロン酸の分子量 実施例１〜８で得られた架橋ヒアルロン酸と比較例１、
２で回収されたヒアルロン酸の分子量は、ＧＰＣ−ＭＡ
ＬＬＳを使って測定した。ＧＰＣ溶媒でポリマー濃度を
０．２重量％、０．１重量％、０．０５重量％に調製
し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、
０．１ｍｌ注入してＧＰＣ−ＭＡＬＬＳの測定を行っ
た。ＧＰＣカラムとして昭和電工社製ＳＢ８０６ＨＱを
１本、またはＷａｔｅｒｓ社製Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇ
ｅｌ５００を１本使用し、示差屈折率検出器として日本
分光社製８３０−ＲＩ、ＭＡＬＬＳはＷｙａｔｔ社製Ｄ
ＡＷＮＤＳＰ−Ｆを使用して、溶媒硝酸ナトリウムの
０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、流速０．３ｍｌ／
分、データ取得間隔１回／２秒で測定した。散乱強度の
測定は散乱角度２８．７°〜９０°の８検出器を使っ
た。データ処理ソフトウェアはＷｙａｔｔ社製ＡＳＴＲ
Ａ Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１０を使用した。測定結果を表
１に示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】実施例１０ 架橋ヒアルロン酸の分子量分布 実施例４で得られた架橋ヒアルロン酸と分子量が４．０
×１０⁴ ダルトンのヒアルロン酸の分子量分布は、ＧＰ
Ｃを使って測定した。ＧＰＣ溶媒でポリマー濃度を０．
２重量％に調製し、０．２μｍのメンブランフィルター
でろ過した後、０．１ｍｌ注入してＧＰＣの測定を行っ
た。ＧＰＣカラムとしてＷａｔｅｒｓ社製Ｕｌｔｒａｈ
ｙｄｒｏｇｅｌ５００を１本、示差屈折率検出器として
日本分光社製８３０−ＲＩを使用し、溶媒硝酸ナトリウ
ムの０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、流速０．３ｍｌ
／分、データ取得間隔１回／２秒で測定した。測定結果
を図１に示す。

【００６５】実施例１１ 架橋ヒアルロン酸の分岐度測定 実施例４、反応時間８１日間で得られた架橋ヒアルロン
酸と分子量が４．０×１０⁴ ダルトンのヒアルロン酸
は、ＧＰＣ溶媒でポリマー濃度を０．２重量％に調製
し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、
０．１ｍｌ注入してＧＰＣ−ＭＡＬＬＳの測定を行っ
た。ＧＰＣカラムとしてＷａｔｅｒｓ社製Ｕｌｔｒａｈ
ｙｄｒｏｇｅｌ５００を１本、示差屈折率検出器として
日本分光社製８３０−ＲＩを使用し、溶媒硝酸ナトリウ
ムの０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、流速０．３ｍｌ
／分、データ取得間隔１回／２秒で測定した。測定結果
を図２に示す。

【００６６】表１の結果から、例えば、実施例１では反
応時間が長くなるに従って、重量平均分子量が３．５×
１０⁵ から、４．３×１０⁵ 、４．７×１０⁵ 、６．１
×１０⁵ と増大している。実施例２、実施例３、実施例
４、実施例５と原料となるヒアルロン酸の分子量が小さ
くなっても、反応時間が長くなるに従って分子量が増大
している。

【００６７】表１の結果から、実施例６では、回収した
架橋ヒアルロン酸を中和、凍結乾燥しているが、実施例
４と同様に分子量が増大している。実施例７では、反応
溶媒に重水を使用している。軽水を使用している実施例
５と比較して、分子量の増大が大きくなっている。実施
例８では、反応時間が５℃だが、反応温度が−２０℃の
実施例１〜実施例７と同様に分子量が増大している。

【００６８】図１の結果から、分子量の増大が分子量分
布の変化、つまり高分子量成分の生成に起因しているこ
とが分かる。実施例４で反応時間８１日間で得られた架
橋ヒアルロン酸の直鎖状ヒアルロン酸（分子量４．０×
１０⁴ ダルトン）に対する分岐度の計算結果を図２に示
す。

【００６９】分岐度は同一溶出体積のフラクションの両
者の分子量から、数式２と数式３を使って計算した。図
２から、架橋ヒアルロン酸の分岐度は分子量約３万以上
の領域で、分岐度０．５以上から急速に増大していくこ
とがわかる。すなわち、本発明で得られた架橋ヒアルロ
ン酸は、安定な架橋構造が存在していることにより、分
岐ヒアルロン酸となり、分子量が増大していることがわ
かる。

【００７０】実施例１２ 架橋ヒアルロン酸の細胞毒性試験 正常ヒト皮膚由来線維芽細胞培養において、本発明で得
られた架橋ヒアルロン酸を共存させ、細胞増殖挙動の観
察によりその細胞毒性を評価した。実施例１〜５記載の
架橋ヒアルロン酸をリン酸緩衝生理的食塩水に透析し、
細胞を播種した細胞培養用プレート（ファルコン社製）
中に２０ｍｇづつ添加した。以下の培養条件で培養し、
細胞増殖能を評価した。また、架橋ヒアルロン酸非存在
下での培養をコントロールとした。

【００７１】 培養条件 プレート：細胞培養用１２ウェルプレート 培地：ＤＭＥＭ培地＋１０％ウシ胎児血清，２ｍｌ／ウェル 温度：３７℃（５％ＣＯ₂ 下） 播種細胞数：１×１０⁴ 個／ウェル

【００７２】培養開始後２日、５日、８日後に、細胞密
度を倒立顕微鏡を用いて観察したところ、実施例１〜８
いずれの架橋ヒアルロン酸が共存していてもコントロー
ルと同様に良好な増殖を示した。よって、本発明で得ら
れた架橋ヒアルロン酸には細胞毒性作用がなく、医用材
料として使用可能であることが示唆された。

【００７３】

【発明の効果】以上、本発明によれば、なんら化学的架
橋剤や化学的修飾剤を使用することなく、自己架橋ヒア
ルロン酸が得られる。化学的架橋剤や化学的修飾剤を使
用することに起因する生体適合性への悪影響が避けら
れ、生体適合性材料分野に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４で反応時間６２日間、及び８１日間で
得られた架橋ヒアルロンと直鎖状ヒアルロン酸（分子量
４．０×１０⁴ ダルトン）のＧＰＣクロマトグラムであ
る。

【図２】実施例４で反応時間８１日間で得られた架橋ヒ
アルロン酸の直鎖状ヒアルロン酸（分子量４．０×１０
⁴ ダルトン）に対して計算した分岐度と分子量の関係を
示すグラフである。

【符号の説明】

１ 直鎖状ヒアルロン酸（分子量４．０×１０⁴ ダルト
ン）のＧＰＣクロマトグラム ２ 実施例４で反応時間６２日間で得られた架橋ヒアル
ロンのＧＰＣクロマトグラム ３ 実施例４で反応時間８１日間で得られた架橋ヒアル
ロンのＧＰＣクロマトグラム

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分岐度が０．５以上の分子量フラクショ
   ンを部分的に含むことを特徴とする自己架橋ヒアルロン
   酸。
2. 【請求項２】 ヒアルロン酸のｐＨ３．５以下の水溶液
   を凍結し、次いで解凍して形成されることを特徴とする
   請求項１記載の自己架橋ヒアルロン酸。
3. 【請求項３】 ヒアルロン酸の水溶液を、ｐＨ３．５以
   下に調整し、該水溶液を凍結し、次いで解凍することを
   少なくとも１回行うことを特徴とする請求項２記載の自
   己架橋ヒアルロン酸の製造方法。
4. 【請求項４】 ヒアルロン酸濃度５重量％以上でヒアル
   ロン酸のカルボキシル基と等モル以上の酸成分を含むヒ
   アルロン酸酸性水溶液から形成することを特徴とする請
   求項１記載の自己架橋ヒアルロン酸の製造方法。
5. 【請求項５】 分岐度が０．５以上の分子量フラクショ
   ンを部分的に含む自己架橋ヒアルロン酸を含有すること
   を特徴とする医用材料。