JP2000256196A

JP2000256196A - 抗炎症，抗アレルギー剤

Info

Publication number: JP2000256196A
Application number: JP11058853A
Authority: JP
Inventors: Hirohiko Akamatsu; 浩彦赤松; Kazuhiko Hamada; 和彦濱田; Haruyoshi Seino; 治良情野; Jinfu Niwa; 靱負丹羽
Original assignee: Pias Corp
Current assignee: Pias Corp
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2000-09-19

Abstract

(57)【要約】【課題】炎症やアレルギーの悪化の原因の１つである
ヒト好中球の過剰な活性酸素や好中球の細胞質中カルシ
ウム濃度の上昇を抑制する安全性の高い抵炎症剤，抗ア
レルギー剤を提供することを課題とする。【解決手段】荷電アミノ基の含有率が25〜100 ％であ
る、水溶性キトサン塩、若しくは水溶性キトサン誘導体
塩を抵炎症剤，抗アレルギー剤に含有させたことを特徴
とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗炎症，抗アレル
ギー剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、抗炎症剤、抗アレルギー剤と
しては、内服薬や外用剤として種々のものが開発され、
使用されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の抗炎症
剤、抗アレルギー剤は、いずれも副作用等の面から安全
性の高いものが非常に少ないのが現状である。

【０００４】たとえば、外用剤としては古くからステロ
イド剤等が使用されているが、局部的に炎症を抑制する
にすぎず、治癒後に炎症が再発した場合には、投与前よ
りも症状が悪化する場合がある。

【０００５】一方、経口投与による内服薬としては、プ
ロスタグランジンの生成を抑制するような抗炎症剤が使
用されているが、食欲不振、胸やけ等の胃腸症状等の面
での副作用がある。

【０００６】ところで、近年においては、好中球などの
食細胞由来の炎症やアレルギー悪化因子として過剰な活
性酸素やＣａ²⁺濃度の上昇による活性化（竹縄忠臣、
他：白血球と生体防御、講談社１４５，１９９０）が示
唆されている。

【０００７】例えば、種々のヒト炎症性皮膚疾患におい
て好中球由来の過剰な活性酸素や好中球の活性化が悪化
要因の一つであることが知られている（宮地良樹：日本
臨床46：2252,1988)。

【０００８】炎症性のニキビ・吹き出物に関しては、P.
acnes 由来の遊走因子等により毛包壁に達した好中球よ
り産生される過剰な活性酸素が発症や悪化因子になるこ
とが示唆されている（赤松浩彦、他：活性酸素・フリー
ラジカル３：３０６，１９９２）。

【０００９】本発明は、上述のような観点より、炎症や
アレルギーの悪化の原因の一つであるヒト好中球の過剰
な活性酸素や好中球の細胞質中カルシウム濃度の上昇を
抑制する安全性の高い抗炎症剤、抗アレルギー剤を提供
することを課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、このような課
題を解決するためになされたもので、その課題を解決す
るための手段は、荷電アミノ基の含有率（割合）が25〜
100 ％である、水溶性キトサン塩、若しくは水溶性キト
サン誘導体塩を含有させたことである。

【００１１】キトサンは、保湿性や抗コレステロール効
果等を有し、安全性が優れていることから化粧品用原料
や機能性食品素材として実用化されている。

【００１２】又、創傷治癒効果、抗菌性、免疫賦活作用
等の数々の生理活性機能を有することが示唆され、各方
面で応用検討されている。

【００１３】最近になり、キトサンの水不溶性のパウダ
ーやスポンジは、動物に対して優れた創傷治癒効果を有
することから、獣医用の創傷被覆剤として実用化されて
いる。

【００１４】キトサンやその誘導体は、新しい生理機能
が期待され、生体適合性も高いことから応用研究が活発
に行われている。

【００１５】甲殻類や糸状菌から得られるキチンを脱ア
セチル化等を行うことにより、Ｃ−２（２位の炭素原
子）にアミノ基を有する（置換度が0.4 〜1.0 程度）を
生体適合性の優れた機能性素材であるキトサンが得られ
る。

【００１６】本発明者等は、荷電アミノ基の含有率が25
〜100 ％である水溶性キトサン塩及び水溶性キトサン誘
導体塩が、炎症やアレルギー性疾患に関与するヒト由来
好中球由来の過剰な活性酸素やＣａ²⁺濃度の上昇による
活性化を有意に抑制し、抗炎症効果および抗アレルギー
効果を発揮することを新たに見い出した。

【００１７】重要な点は、水溶性のキトサン塩及びキト
サンを基本骨格としたキトサン誘導体塩由来の荷電アミ
ノ基が一定以上存在すると、ヒト好中球に作用し、過剰
な活性酵素産生の抑制やＣａ²⁺濃度上昇による活性化の
抑制に寄与するため、塩形成による荷電アミノ基の含有
率が25〜100 ％を示すことである。

【００１８】荷電アミノ基の含有率が25〜100 ％である
水溶性キトサン塩として、脱アセチル化度25〜100 ％で
あるキトサンとグリコール酸との共存により塩形成され
たキトサン・グリコール酸塩が挙げられる。

【００１９】塩の種類は特に限定されないが、ピロリド
ンカルボン酸塩、グルタミン酸、乳酸塩、アスコルビン
酸塩、塩酸塩等が挙げられる。

【００２０】荷電アミノ基の含有率が25〜100 ％である
キトサンを基本骨格とした水溶性キトサン誘導体塩とし
て、Ｏ−アシル化キトサン・グリコール酸塩、部分Ｎ−
アシル化キトサン・グリコール酸塩、硫酸化キトサン・
グルタミン酸塩、カルボキシメチル化キトサン・グリコ
ール酸塩、リン酸化キトサン・グリコール酸塩、グリコ
ール化キトサン・グリコール酸塩等が挙げられる。

【００２１】塩の種類は特に限定されないが、グリコー
ル酸、ピロリドンカルボン酸塩、グルタミン酸、乳酸
塩、アスコルビン酸塩、塩酸塩等が挙げられる。

【００２２】分子量に関しては、特に限定されないが、
高分子量の場合、平均分子量50000〜1000000 程度が好
ましく、低分子量の場合、平均分子量3000以下が好まし
い。

【００２３】配合濃度に関しても特に限定されないが、
0.001 ％〜0.1 ％の低濃度でも十分な効果を発揮すると
いう利点がある。

【００２４】本発明の荷電アミノ基を有する水溶性のキ
トサン塩、及びキトサン誘導体塩は、ヒト好中球に作用
し、炎症やアレルギーの悪化の原因の一つである好中球
由来の過剰な活性酸素や好中球の細胞中の過剰なカルシ
ウム濃度上昇を抑制することにより抗炎症効果、抗アレ
ルギー効果を発揮する。

【００２５】本発明の抗炎症、抗アレルギー剤は安全
性、生体適合性が高く、水溶性であることから液状、ク
リーム状、ジェル状、乳液状、軟膏状等の皮膚外用剤
類、基礎化粧品類、医薬部外品類、医薬品類、点滴剤、
健康飲料類等に広く利用することができる。

【００２６】ビタミンＣ、β−カロチン、ＳＯＤ等の活
性酸素スカベンジャー（活性酸素消去成分）と共存させ
ると、効果が相乗的に高まるという利点もある。

【００２７】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明する。

【００２８】〔実施例１〕ヒト好中球由来活性酸素産
生の抑制効果荷電アミノ基の含有率が25〜100 ％であるキトサン塩
（平均分子量：800000，1000) 、キトサン誘導体（平均
分子量：100000〜800000) を下記実験系に１〜100 μg/
mLに添加し、評価した。

【００２９】各キトサン誘導体は、従来の方法（Hiran
o,S et al:Carbohydr.Res.,137,205,1985等）を参考に
し、硫酸化やアシル化等の置換度を調整することによ
り、荷電アミノ基の含有率が25〜100 ％となるように設
定した。

【００３０】荷電アミノ基の含有率は、コロイド滴定法
（Toei,K.,T.Kohata:Anal.Chem.Acta,83,59,1976) 等を
利用し求めた。

【００３１】健康人８名の静脈血より、Ficoll-Hypaque
gradient density 法により、上層部の赤血球の混入し
た好中球層を分離し、文献に従い好中球のviability を
保持する操作を行い、赤血球を除去し、好中球を収穫し
た（Niwa Y, et al: Arch Dermatol 121: 73,1985)。

【００３２】Ｏ^2-測定のために、好中球を５％グルコー
スを含有するKrebs Ringer phosphate（以下ＫＲＰと略
す）bufferに浮遊させた好中球遊離液を、また細胞内Ｃ
ａ²⁺濃度測定のために、好中球を10⁷個の割合で0.1mM
ＣａＣｌ₂含有ＫＲＰbuffer１mLに浮遊させた好中球遊
離液（Ozaki Y, et al: Biochem Biophys Acta 972:11
3, 1988 ) を作成した。

【００３３】好中球を被検血清でオプソニン化されたザ
イモサンで刺激した後、Johnstonら（Johnston RB Jr,
et al: J Clin Invest 57: 836, 1976 )の方法でＯ^2-を
測定した。

【００３４】より具体的に説明すると、１×10⁶個の好
中球を１mg/mL のオプソニン化されたザイモサンと10分
間培養した後、0.1mM のフェリチトクロームＣ（type I
II,Sigma)を加え、さらに30分間、37度にて培養した。

【００３５】その後、ベックマンのスペクトロフォトメ
ーターを用いて吸光度（波長550nm)を測定し、フェリチ
トクロームＣの還元量から産生されたＯ^2-を算出した。

【００３６】本実施例では、先ず荷電アミノ基の含有率
が85％のキトサン・グリコール酸塩を用い、濃度を１μ
g/mL、10μg/mL、100 μg/mLの３種類の濃度について活
性酸素産生度を求めた。

【００３７】その結果を表１に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】また、荷電アミノ基の含有率が異なる各種
のキトサン誘導体の100 μg/mLのサンプルについて活性
酸素産生度を求めた。

【００４０】その結果を表２に示す。

【００４１】

【表２】

【００４２】表１、表２において、活性酸素産生度の数
値は、３回行った試験結果の平均値を、キトサン誘導体
の無添加のものを100 ％として、その相対値で表したも
のである。

【００４３】表１に示すように、本実施例のキトサン誘
導体である荷電アミノ基含有率が８５％のキトサン・グ
リコール酸塩は、１μg/mL、10μg/mL、100 μg/mLと濃
度依存的にオプソニン化されたザイモサンにより過剰に
産生されるヒト好中球由来の活性酸素産生を有意に抑制
することが確認された。

【００４４】また、表２に示すように、荷電アミノ基含
有率が25〜100 ％のキトサン・グリコール酸塩、リン酸
化キトサン・グリコール酸塩、部分Ｎ−プロピオニル化
キトサン・グリコール酸塩、Ｏ−プロピオニル化キトサ
ン・グリコール酸塩、グリコール化キトサン・グリコー
ル酸塩、カルボキシメチル化キトサン・グルタミン酸塩
等の本実施例の各種キトサン誘導体は、オプソニン化さ
れたザイモサンにより過剰に産生されるヒト好中球由来
の活性酸素産生を有意に抑制することが確認され、抗炎
症、抗アレルギー作用を有することが示唆された。

【００４５】またカルボキシメチル化キトサン・グルタ
ミン酸塩については、本実施例の荷電アミノ基含有率４
２％のものと、比較例である荷電アミノ基含有率２７％
のものとで、明らかに活性酸素産生度の差異が認められ
た。

【００４６】一方、細胞フリーのキサンチン−キサンチ
ンオキシダーゼ系において生成した活性酸素の除去効果
（スカベンジャー効果）は認められなかったが、従来の
活性酸素スカベンジャー成分（ビタミンＣ、ＳＯＤ、ア
スタキサンチン、β−カロチン）と本発明の抗炎症剤、
抗アレルギー剤を共存させると、ヒト好中球由来の活性
酸素産生の抑制効果が相乗的に高まることも見い出され
た。

【００４７】〔実施例２〕ヒト好中球由来Ｃａ²⁺濃度
の抑制効果実施例１と同様のサンプルを、下記実験系に１〜100 μ
g/mL添加し、評価した。

【００４８】Fura２にアセトキシメチル基を結合させ
て、細胞膜への透過性を高めたFura２−AM(Sigma、MO、
USA ) を用いて、文献に従い（Ozaki Y, et al: Bioche
m Biophys Acta 972: 113, 1988 ) 、測定した。

【００４９】すなわち、好中球遊離液10mLに１mMのFura
2−AM 10μL を加え、37℃で30分間インキュベートし
た後、ＫＲＰbufferにて洗浄し、再び細胞を溶液中に浮
遊させ、その浮遊液1.5mL を採り、10^-6M fMLP(Sigma)
を添加し、蛍光分光光度計（日立F-4000) を用いて、そ
の細胞浮遊液の励起波長340nm 、及び380nm 、蛍光波長
510nm にてresting 時の蛍光強度を測定した。

【００５０】細胞内Fura２のＣａ²⁺の結合時の最大蛍光
（Fmax )、及び非結合時の最小蛍光（Fmin) に10％ Tri
ton-X-100 30μL 、及び100mM EGTA(ｐＨ9.3 ）30μL
をそれぞれ添加して求めた。

【００５１】以上より、Ｃａ²⁺の濃度は、次式のような
340nm と380nm の励起波長のFura２の蛍光強度の比によ
って算出された。

【００５２】

【００５３】上記式において、ＲはＦ 340nmとＦ 380nm
の比を示し、Ｒ_maxはTriton法等によりFura２をＣａ²⁺
と十分結合させたときのＲを示し、Ｒ_minは EGTA 存在
下のＣａ²⁺非結合時のＲを示し、ＫｄはＣａ²⁺とFura２
の解離定数を示し、ｂはＣａ ²⁺非存在下でのＦ 380nmと
Ｃａ²⁺存在下でのＦ 380nmとの比を示す。

【００５４】また、上記式で算出された数値の単位は、
ｎＭである。

【００５５】本実施例では、先ず荷電アミノ基の含有率
が80％のキトサン・グリコール酸塩を用い、濃度を１μ
g/mL、10μg/mL、100 μg/mLの３種類の濃度について細
胞内Ｃａ²⁺濃度を求めた。

【００５６】その結果を表３に示す。

【００５７】

【表３】

【００５８】また、荷電アミノ基の含有率が異なる各種
のキトサン誘導体の100 μg/mLのサンプルについて細胞
内Ｃａ²⁺濃度を求めた。

【００５９】その結果を表４に示す。

【００６０】

【表４】

【００６１】表３、表４において、細胞内Ｃａ²⁺濃度の
数値は、３回行った試験結果の平均値を、キトサン誘導
体の無添加のものを100 ％として、その相対値で表した
ものである。

【００６２】表３に示すように、本実施例の荷電アミノ
基含有率が８５％のキトサン・グリコール酸塩は、１μ
g/mL、10μg/mL、100 μg/mLと濃度依存的に、10^-6M fM
LP刺激のヒト好中球の細胞内Ｃａ²⁺濃度を有意に抑制す
ることが確認された。

【００６３】また、表４に示すように、荷電アミノ基含
有率が25〜100 ％のキトサン・グリコール酸塩、リン酸
化キトサン・グリコール酸塩、部分Ｎ−プロピオニル化
キトサン・グリコール酸塩、Ｏ−プロピオニル化キトサ
ン・グリコール酸塩、グリコールキトサン・グリコール
酸塩、カルボキシメチル化キトサン・グルタミン酸塩等
の本実施例の各種キトサン誘導体は、10^-6M fMLP刺激の
ヒト好中球の細胞内Ｃａ²⁺濃度を有意に抑制することが
確認され、抗炎症、抗アレルギー作用を有することが示
唆された。

【００６４】〔実施例３〕炎症・アレルギー性の皮膚
症状を有する皮膚炎患者に対する有効性

【００６５】落屑、丘疹、紅斑丘疹、紅斑、潮紅、酒
さ、膿疱の内、いずれか２つ以上の炎症・アレルギー性
症状の皮膚炎を有する皮膚炎患者４０人（平均年齢：2
8.5才：アレルギー性接触性皮膚炎、尋常性ざそう、乾
癬、酒さ性皮膚炎、乾皮症、脂漏性皮膚炎）に対して、
疾患部位に本発明の成分を有効量含有するローションを
１日２回、４週間塗布し有効性を評価した。

【００６６】使用前と使用後の炎症部位の各症状の状態
を、４：高度、３：中等度、２：軽度、１：軽微、０：
症状なしの５段階で評価した。

【００６７】症状平均スコアの変化から、軽減効果を求
めた。

【００６８】尚、使用したローションの組成は次のとお
りである。

【００６９】成分重量（％）エタノール７．０ポリエチレングリコール２．０グリセリン６．０パラベン０．２８５％荷電アミノ基含有キトサン・グリコール酸塩０．１６０％荷電アミノ基含有スクシニル化キトサン・グリコール酸塩０．０５精製水残量

【００７０】試験結果を表５に示す。

【００７１】

【表５】

【００７２】表５からも明らかなように、試験終了時は
試験開始時に比較して、炎症部位の各症状のすべてが有
意に軽減された。

【００７３】観察期間に比例して軽減効果も更に上昇す
ることが確認された。

【００７４】副作用は認められなかった。

【００７５】使用中止２ケ月後に、同じ皮膚炎症患者に
再度プラセボ・ローション（本発明の成分を含まない）
を同様に塗布し、有効性を評価した。

【００７６】その結果、使用１，４週間後共に、上記実
施例で見られたような軽減効果は全ての症状で認められ
なかった。

【００７７】次に、本発明のキトサン誘導体塩を含有す
る抗炎症，抗アレルギー剤を配合した各種製剤の処方例
を示す。

【００７８】（処方例１）ローション成分重量（％）エタノール３．０ポリエチレングリコール３．０パラベン０．２５０％荷電アミノ基含有リン酸化キトサン・グリコール酸塩０．１５精製水残量

【００７９】（処方例２）ローション成分重量（％）エタノール１０．０ポリエチレングリコール２．０グリセリン５．０パラベン０．３８０％荷電アミノ基含有キトサン・グリコール酸塩０．２ローズマリーエキス０．１精製水残量

【００８０】（処方例３）クリーム又は親水軟膏成分重量（％）セタノール５．０ワセリン２．５流動パラフィン１７．０ＰＯＥ（１５）モノステアリルソルビタン２．０グリセリン７．５パラベン０．１６５％荷電アミノ基含有リン酸化キトサン・グルタミン酸塩０．４精製水残量

【００８１】（処方例４）乳液成分重量（％）セタノール２．０エタノール７．５流動パラフィン３．５ＰＯＥ（１５）モノステアリルソルビタン２．５天然型ビタミンＥ０．０５グリセリン７．５パラベン０．０５７５％荷電アミノ基含有キトサン・乳酸塩０．１９５％荷電アミノ基含有部分Ｎ−ステアロイル化キトサン・グリコール酸塩０．０２精製水残量

【００８２】（処方例５）エッセンス成分重量（％）エタノール５．０ヒドロキシメチルセルロース０．５グリセリン１０．０ポリエチレングリコール３．０パラベン０．３８０％荷電アミノ基含有グリコールキトサン・塩酸塩０．３精製水残量

【００８３】（処方例６）点滴剤又は注射剤成分重量（％）生理食塩水９９．７ブドウ糖０．２７０％荷電アミノ基含有カルボキシメチル化キトサン・塩酸塩０．１

【００８４】（処方例７）健康飲料又は医薬品飲料成分重量（％）ビタミンＣ０．１朝鮮人参エキス３．０果糖２．０ショ糖１．０香料微量７０％荷電アミノ基含有Ｏ−プロピオニル化キトサン・グルタミン酸塩０．０５８０％荷電アミノ基含有キトサン・乳酸塩０．０２パラベン０．０５精製水残量

【００８５】

【発明の効果】以上のように、本発明は、抗炎症，抗ア
レルギー剤に、荷電アミノ基の含有率が25〜100 ％であ
る、水溶性キトサン塩、若しくは水溶性キトサン誘導体
塩を含有させたものであるため、炎症やアレルギーの悪
化の原因の一つであるヒト好中球の過剰な活性酸素や好
中球の細胞質中カルシウム濃度の上昇による活性化を抑
制する安全性の高い抗炎症剤、好中球アレルギー剤を提
供することが可能となった。

【００８６】この結果、荷電アミノ基の含有率が25〜10
0 ％である水溶性キトサン塩、若しくは水溶性キトサン
誘導体塩を抗炎症、抗アレルギー剤として用い、皮膚外
用剤等に広く使用することができる。

フロントページの続き (72)発明者情野治良神戸市西区室谷１−３−１ピアス株式会社中央研究所内 (72)発明者丹羽靱負高知県土佐清水市旭町４−６Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 EA23 MA01 MA04 NA14 ZB11 ZB13 4C090 AA09 BA47 BB17 DA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】荷電アミノ基の含有率が25〜100 ％であ
る、水溶性キトサン塩、若しくは水溶性キトサン誘導体
塩を含有することを特徴とする抗炎症，抗アレルギー
剤。