JP2000258392A

JP2000258392A - 電気泳動装置

Info

Publication number: JP2000258392A
Application number: JP11058873A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Takahashi; 智高橋; Kazunari Imai; 一成今井; Susumu Watanabe; 進渡辺; Masao Kamahori; 政男釜堀; Susumu Hiraoka; 進平岡
Original assignee: Hitachi Ltd; Hitachi Science Systems Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd; Hitachi Science Systems Ltd
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2000-09-22

Abstract

(57)【要約】【課題】正確な泳動スペクトルを得るのに適した電気泳
動装置を提供すること。また、複数の泳動路の長さが異
なっても、それらの泳動路で泳動する試料の測定結果の
比較を容易にするのに適した電気泳動装置を提供するこ
と。【解決手段】キャピラリー端９０ａには蛍光標識された
試料を注入後電圧を印加する。試料は泳動し、ＤＮＡ断
片が分子量に応じて分離する。レ−ザ１０８からキャピ
ラリ−アレイにレ−ザ光を照射すると、各断片から蛍光
が発生し、キャピラリ−毎のＤＮＡ断片像が２次元検出
器１１８により検出される。該検出信号はデ−タ処理ユ
ニット１１９においてキャピラリ−毎に異なる蛍光解析
パラメ−タで解析され、表示される。また、検出結果を
キャピラリ−長が異なることによって生じる泳動時間差
を補正する処理を行った上で表示したり、あるいはその
時間差が解消するようにキャピラリ−内に生じる電界強
度を実質的に同じに設定される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は電気泳動装置、特に
ＤＮＡの塩基配列を決定するのに適した電気泳動装置に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡや蛋白質の分析技術は、遺伝子解
析や遺伝子診断を含む医学、生物学の分野で重要で、特
に最近では、高スループットのＤＮＡ解析装置の開発が
進んでいる。これらの解析は主にゲル電気泳動によって
行われている。

【０００３】ゲル電気泳動は電気泳動の分離媒体にゲル
状物質を使うもので、通常、レーザ誘起蛍光検出により
検出される。たとえば測定試料がＤＮＡの場合、蛍光標
識したＤＮＡを調製し、２枚のガラス板の間に形成した
アクリルアミドゲル（平板ゲル）の上端に蛍光標識ＤＮ
Ａ試料を注入する。その後、ゲルの両端に電界を印加し
て各成分を分子量分離させつつ下端方向に泳動させ、一
定距離泳動した位置をレーザで照射し、その位置を通過
する蛍光成分を検出する。この結果を解析することでＤ
ＮＡ塩基配列を決定したり、制限酵素断片の多型性を識
別することができる。

【０００４】最近では平板ゲルに代わって、石英毛細管
（キャピラリー）内にゲルを重合させて充填したキャピ
ラリーゲルが用いられるようになった。キャピラリーゲ
ル電気泳動は、平板ゲル電気泳動と比較して大きな電界
を加えられるため、高速、高分離が可能な方法として注
目を集めている（Analytical Chemistry 62,900(199
0)）。通常、キャピラリーゲル電気泳動装置では１本の
キャピラリー管を用い、その下端近傍のキャピラリー内
部をレーザ照射し、蛍光検出するオンカラム計測を行っ
ている。

【０００５】また、スループットの向上を目的とし、複
数のキャピラリーをアレイ化して多くの試料を同時に分
析するキャピラリーアレイゲル電気泳動装置が報告され
ている。その一つはキャピラリーアレイスキャン方式
（Nature,359,167(1992)）で、複数のキャピラリーアレ
イを順次移動させ、キャピラリーを１本ずつ順番にレー
ザ照射し、オンカラム蛍光計測するものである。他はキ
ャピラリーアレイシースフロー方式（Nature,361,565-5
66(1993)、特開平06-138037号公報）である。この装置
ではキャピラリーアレイ下端をシース液中に浸し、ゲル
電気泳動によって分子量分離された試料成分をそのまま
シース液中に溶出させ、キャピラリーの存在しない部分
で像分割プリズム及び分光フィルタ等で複数の蛍光波長
の強度を同時に検出し、複数のキャピラリーで各々分離
された試料成分を同時に計測するものである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】キャピラリーアレイゲ
ル電気泳動装置では、試料注入部での配列が主にマイク
ロタイタープレート様（9ｍｍ間隔）であるのに対し、
検出部では密集した配置（0.2ｍｍ間隔や0.4ｍｍ間隔な
ど）であり、個々のキャピラリーゲルの長さが異なって
しまう。そのため、通常通り同一電圧を印加した場合、
個々のキャピラリーゲルでの電界強度等が異なり、泳動
速度がキャピラリーゲルの長さ（泳動路の長さ）によっ
て変化するため、試料毎の測定結果の比較がしにくく、
測定の異常などの判定をするなどの評価が行いにくく、
測定結果がわかりにくかった。

【０００７】また、光照射により蛍光体から発する蛍光
の複数の波長成分を各々検出し、この蛍光の複数の波長
成分から、複数の蛍光体の各々の成分を演算する際に、
通常は１種類の演算係数を使っているが、泳動路毎に最
適値が異なっており、結果として演算精度が低下しやす
かった。

【０００８】本発明の一つの目的は、正確な泳動スペク
トルを得るのに適した電気泳動装置を提供することにあ
る。

【０００９】本発明のもう一つの目的は、複数の泳動路
の長さが異なっても、それらの泳動路で泳動する試料の
測定結果の比較を容易にするのに適した電気泳動装置を
提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の電気泳動装置
は、一つの観点によれば、蛍光体が標識された試料が泳
動する複数の泳動路と、前記蛍光体から蛍光を発生させ
るように前記泳動路に光を照射する手段と、前記発生し
た蛍光の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段と、そ
の検出結果を解析し表示する手段とを含み、該解析表示
手段は前記検出結果を前記泳動路毎に異なるパラメ−タ
で解析し表示することを特徴とする。

【００１１】本発明の電気泳動装置は、もう一つの観点
によれば、蛍光体が標識された試料が泳動する複数の泳
動路と、前記蛍光体から蛍光を発生させるように前記泳
動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生した蛍光の
複数の波長成分をそれぞれ検出する手段と、その検出さ
れた蛍光の複数の波長成分の強度を解析し表示する手段
とを含み、該解析表示手段は前記蛍光の複数の波長成分
の強度を前記泳動路毎に異なる蛍光解析パラメ−タで補
正することを特徴とする。

【００１２】本発明の電気泳動装置は、更にもう一つの
観点によれば、蛍光体が標識された試料が泳動する複数
の泳動路と、前記蛍光体から蛍光を発生させるように前
記泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生した蛍
光の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段と、その検
出された蛍光の複数の波長成分の強度を解析し表示する
手段とを含み、該解析表示手段は前記複数の泳動路の長
さの相違にもとづく前記試料の泳動時間差を補正して表
示することを特徴とする。

【００１３】本発明の電気泳動装置は、別の観点によれ
ば、蛍光体が標識された試料が泳動する複数の泳動路
と、該複数の泳動路に前記試料を泳動させる電界を形成
する手段と、前記蛍光体から蛍光を発生させるように前
記泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生した蛍
光の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段とを含み、
前記電界形成手段は前記電界を形成するための電圧であ
ってかつ前記複数の泳動路毎に独立した電圧を発生させ
る手段を含むことを特徴とする。

【００１４】本発明の電気泳動装置は、更に別の観点に
よれば、蛍光体が標識された試料が泳動する複数の泳動
路と、該複数の泳動路に前記試料を泳動させる電界を形
成する手段と、前記蛍光体から蛍光を発生させるように
前記泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生した
蛍光の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段とを含
み、前記電界形成手段は前記電界を形成するための電圧
であってかつ前記複数の泳動路がその長さに応じて分け
られた泳動路群毎に独立した電圧を発生させる手段を含
むことを特徴とする。

【００１５】本発明の電気泳動装置は、更に他の観点に
よれば、蛍光体が標識された試料が泳動する複数の泳動
路と、該複数の泳動路に前記試料を泳動させる電界を形
成するように前記複数の泳動路にそれぞれ外部抵抗を介
して電圧を印加する手段と、前記蛍光体から蛍光を発生
させるように前記泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、
前記発生した蛍光の複数の波長成分をそれぞれ検出する
手段とを含み、前記それぞれの外部抵抗の抵抗値は該外
部抵抗値と該外部抵抗値にそれぞれ対応する前記泳動路
の内部抵抗値との和がそれぞれ実質的に同じになるよう
に設定されていることを特徴とする。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明の一実施例としてＤＮＡの
塩基配列を決定することのできる電気泳動装置を用い
る。この実施例は、ゲルを充填した複数のキャピラリー
つまりキャピラリーアレイを使い、計測をシースフロー
セル内で行う方式のものである。

【００１７】本発明にもとづく一実施例を示す電気泳動
装置の説明に先立って、まずＤＮＡシーケンシング用の
試料（蛍光標識ＤＮＡ断片）を調製する方法について説
明する。１本の泳動路（ゲルキャピラリー）で４つの塩
基種を識別するために、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシ
ン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）断片毎に異なる蛍
光体を標識したプライマーを使用する。Ａ断片には、蛍
光極大波長が約５５０ｎｍの蛍光体を標識したプライマ
ー（プライマーＡと略記）を、同様にＣ、Ｇ、Ｔ断片に
は、蛍光極大波長がそれぞれ約５２０、５７５、６０５
ｎｍの蛍光体を標識したプライマー（それぞれプライマ
ーＣ、プライマーＧ、プライマーＴと略記）を使用す
る。これらを使用し、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らの周
知のジデオキシ法によりＤＮＡポリメラーゼ反応をそれ
ぞれ行なわせ、蛍光標識ＤＮＡ断片を調製する。これら
の断片群は最終的に単一サンプルチューブに入れて混合
し、エタノール沈殿処理の後、脱イオン化ホルムアミド
（微量のトリス緩衝液、またはＥＤＴＡ液を含む）に溶
解させ、試料液とする。試料液のゲルキャピラリーへの
注入前には、試料液を９５℃で２分間加熱して熱変性さ
せ、その後すぐに氷冷し、注入操作に使用する。なお、
蛍光標識をプライマーにではなく、ターミネータに標識
した試薬を用いる場合も、周知の方法により試料を調製
し、同様に測定に使用することができる。

【００１８】図１は本発明にもとづく一実施例の電気泳
動装置のキャピラリーアレイ及び蛍光測定部となるシー
スフローセル部を示す。

【００１９】内部にゲルを充填した４８本のキャピラリ
ーを用い、その一端を一直線状に揃えて並べたキャピラ
リーアレイを作製する。ここで使用するキャピラリーは
種々の内外径のものが使用できるが、たとえば、内径
０．０７５ｍｍ、外径０．２ｍｍ、長さ約２０ｃｍのも
のを使用し、泳動路として機能するように周知の方法で
その内部にアクリルアミドゲルを充填して使用する。ゲ
ル濃度は４％Ｔ（（アクリルアミド＋ビスアクリルアミ
ド）の全溶液量に対する比率）、５％Ｃ（ビスアクリル
アミドの（アクリルアミド＋ビスアクリルアミド）に対
する比率）とする。なお、キャピラリーはその表面に折
り曲げ時の破損を防ぐなどの目的でポリイミドコーティ
ングがされているが、本実施例では、ポリイミドにカー
ボンを混入させてコーティングを黒色としたものを使用
する。もちろん、ポリイミド以外の別のコーティングで
も使用可能である。また、キャピラリー内に充填するゲ
ルは上記以外の種々の組み合わせの濃度が可能である
し、ゲルの代わりにポリマー等の物質を充填してもよ
い。

【００２０】図１には、わかり易くするため、８本のキ
ャピラリ−からなるキャピラリ−アレイアレイが示され
ている。また、液体をシールするためのＯリング等の部
品は省略している。キャピラリー保持具９１及び９２は
それぞれ３ｍｍ間隔及び０．４ｍｍ間隔の取付溝を形成
したもので、これは、キャピラリー同士の間隔を揃え、
キャピラリーアレイの取付などを容易に行うことができ
る。まず４８本のキャピラリー９０を同一平面上に並
べ、キャピラリー保持具９１及び９２に固定して、一端
が３ｍｍ間隔、他端が０．４ｍｍ間隔になるようにし、
それらの端を切断して揃える。３ｍｍ間隔に固定された
キャピラリー端９０ａは試料注入側の端であり、反対側
の９０ｂは泳動分離された試料断片が排出されるキャピ
ラリー端である。キャピラリ−端９０ｂはキャピラリ−
保持具９１とともに、シースフローセル部に取り付けら
れる。

【００２１】キャピラリ−保持具９２の、キャピラリ−
保持具９１側には４８本のキャピラリー９０の他にその
外側にそれぞれ６本ずつダミーガラス棒９３をキャピラ
リー９０と同じ間隔で取り付ける。このダミーガラス棒
９３はキャピラリー９０の端９０ｂの個々の環境をすべ
て同じするために設けるもので、キャピラリー９０とほ
ぼ同等の外径を持つものであればよい。本実施例ではキ
ャピラリー９０と同じキャピラリーとされ、その内部が
ゲルで埋められている。ダミーガラス棒９３の数はシー
スフローセルの流路の断面の幅に依存し、幅全体にキャ
ピラリーが均一に存在するように調整する。このような
ダミーガラス棒９３により、キャピラリ−端９０ｂの個
々のシースフローの環境が同じになり、キャピラリー９
０の１本目から４８本目まで安定した均一の流れを形成
できることになる。なお、このダミーガラス棒は装置構
成上必須のものではなく、なくても測定自体は可能であ
る。

【００２２】シースフローセル部は、流路の断面が０．
２３ｍｍ×２４．２ｍｍの石英ガラス製のシースフロー
セル８３を含み、その上下をシースフローセル固定用の
保持具８２、８４で固定したものである。保持具８２、
８４はその内部にシース用の液体（シース液）が流れる
ような空間を有する。シース液はアクリルアミドゲルを
調製したものと同等の緩衝液とする。シース液はシース
液容器８０からチューブ８１を介し、保持具８２、フロ
ーセル８３、保持具８４を通り、チューブ８５を介して
廃液容器８６に流れ込むという流路を形成する。

【００２３】シース液容器８０を廃液容器８６より高く
配置することで、流路をシース液がサイホンの原理でゆ
っくりと安定に流れ、キャピラリー９０の端９０ｂの近
傍にシースフローが形成されることになる。キャピラリ
ー９０のシースフローセル部への取付は、キャピラリー
端面９０ｂの乾燥によるダメージを可能な限り低減する
ため、シースフローセル内部をシース液で満たした後に
行う。同様にキャピラリー端面９０ａも乾燥によるダメ
ージを可能な限り低減するため、切断した後は緩衝液中
に保持するようにする。

【００２４】図２は本発明にもとづく一実施例の電気泳
動装置の全体構成を示す。キャピラリー保持具９２、キ
ャピラリー９０、キャピラリー保持具９１、シースフロ
ーセル８３は同一平面内に配置されており、これらはシ
ースフローセル８３側が上になるように垂直に立てて固
定され、シ−ス液はシースフローセル８３内を下から上
方に流れる。キャピラリー９０の下部には、１列に並ん
だ端９０ａと同じ間隔に形成された４８穴のウエルを有
する試料容器１００（各ウエルには測定する試料液が入
る）、及び緩衝液の入る電極槽１０１、洗浄液の入る洗
浄液槽１０２が移動台１０３上に並べて配置され、これ
らを、移動台１０３を駆動装置（図示省略）により駆動
することで、上下、左右（試料容器１００、及び電極槽
１０１、洗浄液槽１０２の並び方向）に移動することが
でき、キャピラリー端９０ａを目的によって試料液、緩
衝液、洗浄液に挿入させることができる。

【００２５】試料容器１００の４８穴のウエル内には測
定用の試料液をピペットで注入する。電極槽１０１には
緩衝液を、洗浄液槽１０２には洗浄液として蒸留水をそ
れぞれ注入する。まず、移動台１０３により、キャピラ
リー端９０ａを洗浄液槽１０２内に浸し、先端に付着し
ている可能性のあるゴミや緩衝液を洗浄する。次いで、
移動台１０３により試料容器１００内の試料液をキャピ
ラリー端９０ａに接触させ、試料液側に約２５Ｖ／ｃｍ
の電界強度となる電圧−５００Ｖ（負極側）、シースフ
ローセル８３内のシース液側を０Ｖ（正極側）にして電
圧を印加し、キャピラリー内に試料を注入する。図では
正極、負極の電極及び高電圧電源を省略している。負極
の電極は、試料容器１００の４８穴のウエル毎に白金電
極を設けたりすることで容易に実現できる。正極の電極
は、シースフローセル保持具８４をステンレスで作製し
て保持具８４そのものを電極としたり、シースフローセ
ル８３内の上部に白金電極を設けたり、また廃液容器８
６内に白金電極を設けたりすることでできる。

【００２６】試料注入後、移動台１０３を動作させ、キ
ャピラリー端９０ａを電極槽１０１に移して緩衝液中に
挿入する。電極槽内の緩衝液中には白金電極が保持され
ており、これに電圧を印加する。印加する電圧は最初の
５分間を約２５Ｖ／ｃｍの電界強度となる電圧−５００
Ｖとし、次に約５０Ｖ／ｃｍの電界強度となる電圧−１
０００Ｖ、次いで約７５Ｖ／ｃｍの電界強度となる電圧
−１５００Ｖと段階的に大きくする。キャピラリ−９０
である泳動路中を試料が電気泳動すると、ＤＮＡ断片が
分子量毎に分離してキャピラリー端９０ｂからシースフ
ローセル中に溶出する。この溶出される試料断片をシー
スフロー状態で蛍光計測する。シースフローにすること
で、各キャピラリー端９０ｂから溶出する試料断片同士
が混じらないように流れることになる。この構成によ
り、４８試料の同時注入と同時電気泳動及び解析が実現
できる。また、試料の注入は、予め、試料容器１００に
試料液を入れておけば、従来の平板ゲルの場合のように
さらにピペッティングにより１試料ずつ手操作で行う必
要がなくなり、操作性を向上させることができる。

【００２７】蛍光測定法について説明する。試料を励起
するための光源として、波長５１４．５ｎｍのアルゴン
レーザ装置１０８を使用する。アルゴンレーザ光１１２
をミラー１１０で反射させ、シースフローセル８３に焦
点距離が約７０ｍｍのレンズ（図示せず）で絞って照射
する。生じる蛍光は集光レンズ１１４、４種の分光フィ
ルタ１１５ａ〜ｄ、像分割プリズム１１６、結像レンズ
１１７により、２次元検出器１１８に結像され、泳動に
よって分離される各試料のＤＮＡ断片からの蛍光強度の
時間波形はデータ処理ユニット１１９で解析及び表示さ
れる。

【００２８】上記構成では、４８本のキャピラリーは各
々長さが異なっている（正確には左右対称となってい
る）。これは、多数のキャピラリ−を同一平面上に並べ
て配置する場合、それぞれのキャピラリ−の発光点から
の蛍光の高集光率を得ためには検出側端ではキャピラリ
−を密集させることが必要であり、一方試料注入側端で
は試料注入（採取）のし易さの観点からキャピラリ−を
それほど密集させることができないためである。具体的
には、中心のキャピラリー長さがほぼ２００ｍｍのと
き、一番外側のキャピラリーの長さはほぼ２２０ｍｍと
なり、それらの間に約１割の差が生じる。そのため、す
べてのキャピラリーを同一電圧で泳動する場合、各キャ
ピラリ−内での電界強度が異なり、試料の泳動速度が各
キャピラリー毎に異なることとなるので、同一塩基長の
試料断片が検出される時間に差が生じてしまう。一般
に、泳動速度は（キャピラリー長さが一定の時）電界強
度に比例し、また試料断片が検出される時間は（電界強
度が一定の時）検出位置までのキャピラリー長さに比例
する。そこで、キャピラリー長の増大に伴って生じる電
界強度の減少と、検出時間の遅れ分を補正し、補正され
た泳動時間でもって表示するようにする（後述）。これ
により、キャピラリー間（泳動路間）の検出時間の違い
が校正され、試料毎の比較が容易になる。また泳動速度
やピーク間隔等を直接比較することができ、試料の異
常、ゲルを含めた泳動の異常の判断が容易になる。

【００２９】蛍光像の検出について、図３及び図４を参
照してより詳しく説明する。シースフローセル８３内に
キャピラリー端９０ｂが配置され、その上部にレーザ光
路に沿って蛍光発光点２２０、２３０が生じる。蛍光発
光点２２０から発する蛍光は、集光レンズ１１４を通過
し、像分割プリズム１１６により４つに分割され、結像
レンズ１１７により、それぞれ結像される（２２１ａ〜
２２１ｄ）。この際、４種の分光フィルタ１１５ａ〜１
１５ｄを像分割プリズムの前面（または後面）に配置す
ることで、それぞれ分割された光が別々の波長成分とな
るようにできる。蛍光発光点２３０についても同様であ
る。図から分かるように、それぞれの発光点２２０、２
３０からの蛍光はレ−ザ光路と平行な方向にそれぞれ結
像され（２２１、２３１）、同じ発光点からの異なる波
長成分の蛍光は像分割プリズム１１５ａ〜１１５ｄによ
り各発光点毎に、レ−ザ光路に対して直角な方向にそれ
ぞれ結像される（２２１ａ〜２２１ｄ、２３１ａ〜２３
１ｄ）。示される蛍光発光点２２０、２３０以外のすべ
ての発光点についても事情は同じである。

【００３０】以上から明らかなように、すべての発光点
について各波長の蛍光分割が同時に行われる。つまり、
たとえばレーザ光走査や検出器の機械走査をする場合の
ように時間分割されることはないので、蛍光強度の測定
間隔が長くなることはなく、高速に計測できるようにも
できる。リアルタイムで連続的に計測することも可能で
ある。

【００３１】本実施例では、キャピラリーアレイを泳動
するすべての試料を、同時に、各々４分割して高精度に
計測することができる。そこで４種の分光フィルタ１１
５ａ〜ｄをプライマーＡ、プライマーＣ、プライマー
Ｇ、プライマーＴの蛍光を主に透過するように調整する
ことにより、プライマーＡ、プライマーＣ、プライマー
Ｇ、プライマーＴを識別して計測することができるよう
になる。

【００３２】しかし、図５に示されるように、実際は、
各蛍光標識プライマーの蛍光はブロードであり、４種の
蛍光標識プライマーの蛍光が重なり合っている。そのた
め、その重なりを下記のように行列演算により補正する
ことで、プライマーＡ、プライマーＣ、プライマーＧ、
プライマーＴ単独の蛍光強度の時間波形が得られる。こ
れはそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ断片の泳動スペクトルであ
り、この泳動スペクトルから通常の方法によりＤＮＡの
塩基配列を決定することができる。

【００３３】（ｙ（ｔ））＝（Ｍ）（ｘ（ｔ））（ｙ（ｔ））：各塩基毎の、時間の関数としての蛍光強
度を示す４ｘ１行列（各要素はｙ1（ｔ）, ｙ2（ｔ）,
ｙ3（ｔ）, y4（ｔ）である）（ｘ（ｔ））：測定された、時間の関数としての蛍光強
度を示す４ｘ１行列（各要素はｘ1（ｔ）, ｘ2（ｔ）,
ｘ3（ｔ）, ｘ4（ｔ）である）（Ｍ）：補正用の４ｘ４行列（演算係数行列）（各要素はMab（a=1,2,3,4；b=1,2,3,4）である）この行列（Ｍ）は、泳動路によってその各要素の値（演
算係数）が異なる。これは図４から分かるように、複数
の泳動路全体に対してほぼ中央の蛍光発光点２２０から
発する蛍光は、集光レンズ１１４でコリメートされた
後、分光フィルタ１１５ａ〜１１５ｄ及び像分割プリズ
ム１１６の面に対してほぼ垂直に入射するのに対し、端
にある蛍光発光点２３０から発する蛍光は分光フィルタ
１１５ａ〜ｄ及び像分割プリズム１１６の面に対して斜
めに入射する。すなわち、蛍光発光点の位置が異なるこ
とにより蛍光の結像系に対する入射角が異なる。このた
め、それぞれの蛍光発光点から発生される蛍光は集光範
囲、透過波長範囲、透過率等においてそれぞれ異なる。
したがって、演算係数行列（Ｍ）の各要素（演算係数）
である蛍光解析パラメ−タは泳動路毎（キャピラリ−
毎）に異なる値をもつことになる。つまり、泳動路毎に
最適化された演算係数行列を使って演算を行う必要があ
る。泳動路毎のその最適値は、泳動路毎に４種の蛍光標
識体を個別に順番に泳動させ、上記装置で蛍光測定する
ことで算定することができる。図６は実際に求めた演算
係数行列の、泳動路位置に対する各要素（演算係数）た
る蛍光解析パラメ−タの最適値の一例を示す。図６の例
は別の種類のターミーネータ標識試薬を用いた場合の例
である。単一の行列で演算するのに比べ、最適値を泳動
路毎に細かく設定することができる。

【００３４】以上により、泳動路毎に最適化された蛍光
解析パラメ−タである演算係数にもとづいて蛍光強度
（ｙ（ｔ））が演算により求められるため、Ａ、Ｃ、
Ｇ、Ｔ断片の泳動スペクトルがより正確に算定され、精
度の高い塩基配列の決定が可能になる。

【００３５】異なる発光点からの蛍光をレ−ザ光路に沿
って結像させ、各発光点から異なる波長の光をレ−ザ光
路に対して直角な方向に結像させるのに、前述したフィ
ルター＆プリズムを用いる分光方式の代わりにたとえば
回折格子を使った分光方式を用いてもよい。

【００３６】また、実施例ではシースフローセル内で計
測を実行する方式について説明したが、キャピラリーの
一部の被覆を除去しこの部分にレーザ光を照射し、その
部分での蛍光を測定するような場合でも同様に実施可能
である。

【００３７】前述したように、キャピラリ−アレイ（泳
動路アレイ）の試料注入側端と検出側端とではキャピラ
リ−間隔が異なることから泳動路長すなわちキャピラリ
−長がそれぞれ異なることとなり、そのため泳動路内の
電界したがって試料の泳動速度が各泳動路（キャピラリ
−）毎に異なり、キャピラリ−毎に、同一塩基長の試料
断片が検出される時間に差が生じてしまう。本発明によ
ればこの補正が可能で、その一実施例を次に説明する。

【００３８】あるＤＮＡ断片のキャピラリ−内での泳動
速度ｖは近似的にキャピラリ−（泳動路）内の電界強度
Ｅに比例する。また、電界強度Ｅは該電界を生成するた
めにキャピラリ−の両端に印加される電圧Ｖに比例し、
キャピラリ−長Ｌ（実施例の場合は試料注入端から検出
位置までの距離に一致）に逆比例するから、結局、ＤＮ
Ａ断片の検出時間ｔはキャピラリ−長Ｌの２乗と電圧Ｖ
の逆数とにそれぞれ比例することになる。したがって、
中央部のキャピラリ−の長さをＬｃ、それ以外のキャピ
ラリ−の長さをＬｘとし、更に、同じＤＮＡ断片につい
ての、中央部のキャピラリ−での検出時間をｔｃ、それ
以外のキャピラリ−での検出時間をｔｘとすると、ｔｘ
はｔｃと（Ｌｘ／Ｌｃ）²の積に等しい。すなわち、ｔ
ｘはｔｃの（Ｌｘ／Ｌｃ）²倍となる。そこで、測定に
より得られたｔｘを（Ｌｃ／Ｌｘ）²倍すると、その結
果はｔｃと等しくなる。これは、（Ｌｃ／Ｌｘ）²ｔｘ
＝ｔｃを意味し、したがって長さの異なるキャピラリ−
内（泳動路内）で泳動した同じ長さのＤＮＡ断片を同時
刻に表示できることになる。

【００３９】図７は同じ測定試料についての、上記時間
補正なしの試料信号パタ−ン及び時間補正ありの信号パ
タ−ンの、デ−タ処理ユニット１１９に表示される表示
例を示す。図７（Ａ）及び図７（Ｂ）は試料がｐＧＥＭ
（表示はＧ断片の表示）であり、中心部のキャピラリ−
長が約２０ｃｍである場合の例を示す。縦軸は時間、横
軸はキャピラリ−の位置を示す。図７（Ａ）が時間補正
がなされていないデ−タ、図７（Ｂ）が時間補正がなさ
れた、本発明の実施例にもとづくデ−タを示す。このよ
うに時間補正をすることにより、試料毎の比較が容易で
かつ精度の高い塩基配列の解析が可能となる。

【００４０】今までの実施例はキャピラリ−に印加され
る電圧Ｖを一定にした場合のものであるが、各キャピラ
リ−の電界強度Ｅしたがって泳動速度ｖを実質的に一定
にするように印加電圧Ｖをキャピラリ−毎に異ならせる
ことによっても、同一の試料断片が検出される時間の、
キャピラリ−毎（泳動路）の差を補正することができ
る。

【００４１】図８は本発明にもとづくもう一つの実施例
の電気泳動装置のキャピラリ−電圧印加部を示す。他の
部分及びその機能等は図１〜６と実質的に同じである。
この実施例は、各キャピラリ−の電界強度Ｅしたがって
泳動速度ｖを実質的に一定にするように、電界強度Ｅを
生成するための印加電圧Ｖをキャピラリ−毎（泳動路
毎）に異ならせ、それによって、同一の試料断片が検出
される時間の、キャピラリ−毎の差を補正するようにし
たものである。

【００４２】同図において、緩衝液が入る電極槽１０１
がキャピラリ−毎の小電極槽１０１１に分割され、各小
電極槽に緩衝液が入れられるとともに、電極（白金電
極）１０１２が設けられる。試料容器１００の各ウエル
にも同様に独立した電極（白金電極）が設けられる（図
示省略）。それぞれの小電極槽１０１１の電極及び対応
するウエルの電極はそれぞれ対応する電極端子１０１３
に接続され、それらの電極端子は対応する独立の高圧電
源１０１４にそれぞれスイッチ１０１５を介して接続さ
れる。なお、電極１０１２は試料容器１００にも使える
用に構成するのが望ましい。

【００４３】このような構成により各キャピラリ−（泳
動路）にはその長さに応じた電圧を独立に印加すること
ができる。中央のキャピラリ−に印加される電圧をＶ
ｃ、それ以外のキャピラリ−に印加される電圧をＶｘと
すると、Ｅ＝一定（したがってｖ＝一定）の条件を満た
すには、各キャピラリ−の長さに応じて、Ｖｘを、Ｖｘ
＝（Ｌｘ／Ｌｃ）Ｖｃを実質的に満たすように設定すれ
ばよい。具体的には、たとえば電界強度Ｅを１００Ｖ／
ｃｍ一定に設定するためには、約２０ｃｍ長の中央のキ
ャピラリ−に２０００Ｖを印加するとすれば、約２２ｃ
ｍ長になる端部のキャピラリ−には２２００Ｖの電圧を
印加するように高圧電源の設定をすればよい。

【００４４】このようにすることにより、キャピラリ−
間（泳動路間）の泳動時間の違いの補正が正確になり、
試料毎の測定結果の比較が容易になる。また泳動速度や
ピーク間隔等を直接比較することができ、試料の異常、
ゲルを含めた泳動の異常などの判断が容易になる。

【００４５】図９は本発明にもとづく別のもう一つの実
施例の電気泳動装置のキャピラリ−電圧印加部を概念的
に示すものである。この実施例は４８本のキャピラリ−
を長さの近い複数の群に分け、その群単位でキャピラリ
−に異なる電圧を印加して電界の強度をほぼ一定になる
ようにしたものである。図示していない部分は既述の実
施例と同じとみてよい。図において、１０１３ａは９個
の電極端子群を示し、これらの電極端子群は対応する９
個のキャピラリ−群（泳動路群）にそれぞれ異なった電
圧を与えるようにスイッチ１０１５ａを介して対応する
高圧電源１０１４ａにそれぞれ接続される。キャピラリ
−群は図の左側から順にキャピラリ−番号（泳動路番
号）１〜３、４〜６、７〜１０、１１〜１４、１５〜３
４、３５〜３８、３９〜４２、４３〜４５、４６〜４８
で示される９個のキャピラリ−群からなり、これらのキ
ャピラリ−群の各々は互いに長さの近いキャピラリ−
（泳動路）を含む。中央部のキャピラリ−群の平均キャ
ピラリ−長が最も短く、中央部のキャピラリ−群から両
端部のキャピラリ−群に向かうにしたがって平均キャピ
ラリ−長が順次長くなり、したがって両端部のキャピラ
リ−群の平均キャピラリ−長が最も長い。

【００４６】４８本のキャピラリ−に高圧電源１０１４
ａからキャピラリ−群単位（泳動路群単位）でたとえば
次の表に示す別々の電圧を与えれば、４８本のキャピラ
リ−の電界強度をほぼ１００Ｖ／ｃｍにすることができ
る。

【００４７】キャピラリ−群印加電圧（平均キャピラリ−長）（キャピラリ−番号で示す）１〜３、４６〜４８２１９０Ｖ２１．９ｃｍ４〜６、４３〜４５２１４０Ｖ２１．４ｃｍ７〜１０、３９〜４２２１００Ｖ２１．０ｃｍ１１〜１４、３５〜３８２０６０Ｖ２０．６ｃｍ１５〜３４２０１０Ｖ２０．１ｃｍ図９の実施例は図８の実施例に比べて高圧電源の数を減
らすことができるというメリットを有する。

【００４８】図１０は本発明にもとづく更に別の実施例
の電気泳動装置のキャピラリ−電圧印加部を概念的に示
すものである。図示しない部分は既述の実施例と同じと
みてよい。ゲル等を充填したキャピラリ−（泳動路）の
電気抵抗は定常状態では５００ＭΩ〜１０００ＭΩであ
る（成分によって異なる）。そこで、図１０の実施例で
は、電極端子１０１３はそれぞれ外部抵抗１０１６を介
して高圧電源１０１４ｂに接続され、それぞれの外部抵
抗の抵抗値は、該抵抗値と該抵抗値のそれぞれ対応する
キャピラリ−（泳動路）の抵抗値との和が実質的に同じ
になるように設定される。これによって、各キャピラリ
−の電界強度が実質的に均一となるので、キャピラリ−
毎（泳動路毎）の泳動時間差がこの構成によってより少
なくなり、補正が容易となる。

【００４９】なお、図８〜１０を通じて高圧電源１０１
４、１０１４ａ、１０１４ｂ及び抵抗１０１６は可変形
であることが望ましい。

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、正確な泳動スペクトル
を得るのに適した電気泳動装置が提供される。本発明に
よればまた、複数の泳動路の長さが異なっても、それら
の泳動路で泳動する試料の測定結果の比較を容易にする
のに適した電気泳動装置が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明にもとづく一実施例を示す電気泳動装置
のキャピラリーアレイ及び蛍光測定部となるシースフロ
ーセル部の構成配置図。

【図２】本発明にもとづく一実施例を示す電気泳動装置
の全体構成を示す立体図。

【図３】図２のＡ方向視図。

【図４】図２のＢ方向視図。

【図５】図２の分光フイルタの透過特性と蛍光標識プラ
イマ−の蛍光特性との関係を示す図。

【図６】蛍光強度を演算するときに用いられる、演算係
数行列の各要素（演算係数＝蛍光解析パラメ−タ）の最
適値の一例を示す図。

【図７】同じ測定試料についての、時間補正なしの試料
信号パタ−ン及び時間補正ありの信号パタ−ンの表示例
を示す図。

【図８】本発明にもとづくもう一つの実施例を示す電気
泳動装置のキャピラリ−電圧印加部の概念図。

【図９】本発明にもとづく別のもう一つの実施例を示す
電気泳動装置のキャピラリ−電圧印加部の概念図。

【図１０】本発明にもとづく更に別の実施例を示す電気
泳動装置のキャピラリ−電圧印加部の概念図。

【符号の説明】

８３…フロ−セル、９０…キャピラリー、９０ａ、９０
ｂ…キャピラリ−端、１００…試料容器、１０１…電極
槽、１０２…洗浄液槽、１０３…移動台、１０８…アル
ゴンレーザ装置、１１４…集光レンズ、１１５ａ〜ｄ…
分光フィルタ、１１６…像分割プリズム、１１７…結像
レンズ、１１８…２次元検出器、１１９…データ処理ユ
ニット、２２０、２３０…蛍光発光点、２２１ａ〜ｄ、
２３１ａ〜ｄ…結像、１０１１…小電極槽、１０１２…
電極、１０１３…電極端子、１０１４、１０１４ａ、１
０１４ｂ…高圧電源、１０１５、１０１５ａ…スイッ
チ、１０１６…抵抗。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者今井一成茨城県ひたちなか市大字市毛882番地株式会社日立製作所計測器事業部内 (72)発明者渡辺進茨城県ひたちなか市大字市毛1040番地株式会社日立サイエンスシステムズ内 (72)発明者釜堀政男東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者平岡進東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 EA19 FA01 FA06 GA04 GB01 GB03 HA01 HA02 HA15 JA03 KA05 KA09 LA03 NA01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光体が標識された試料が泳動する複数の
泳動路と、前記蛍光体から蛍光を発生させるように前記
泳動路に光を照射する手段と、前記発生した蛍光の複数
の波長成分をそれぞれ検出する手段と、その検出結果を
解析し表示する手段とを含み、該解析表示手段は前記検
出結果を前記泳動路毎に異なるパラメ−タで解析し表示
することを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】蛍光体が標識された試料が泳動する複数の
泳動路と、前記蛍光体から蛍光を発生させるように前記
泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生した蛍光
の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段と、その検出
された蛍光の複数の波長成分の強度を解析し表示する手
段とを含み、該解析表示手段は前記蛍光の複数の波長成
分の強度を前記泳動路毎に異なる蛍光解析パラメ−タで
補正することを特徴とする電気泳動装置。
【請求項３】蛍光体が標識された試料が泳動する複数の
泳動路と、前記蛍光体から蛍光を発生させるように前記
泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生した蛍光
の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段と、その検出
された蛍光の複数の波長成分の強度を解析し表示する手
段とを含み、該解析表示手段は前記複数の泳動路の長さ
の相違にもとづく前記試料の泳動時間差を補正して表示
することを特徴とする電気泳動装置。
【請求項４】蛍光体が標識された試料が泳動する複数の
泳動路と、該複数の泳動路に前記試料を泳動させる電界
を形成する手段と、前記蛍光体から蛍光を発生させるよ
うに前記泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生
した蛍光の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段とを
含み、前記電界形成手段は前記電界を形成するための電
圧であってかつ前記複数の泳動路毎に独立した電圧を発
生させる手段を含む電気泳動装置。
【請求項５】請求項４において、前記電圧は前記複数の
泳動路の長さに応じて異なることを特徴とする電気泳動
装置。
【請求項６】蛍光体が標識された試料が泳動する複数の
泳動路と、該複数の泳動路に前記試料を泳動させる電界
を形成する手段と、前記蛍光体から蛍光を発生させるよ
うに前記泳動路にレ−ザ光を照射する手段と、前記発生
した蛍光の複数の波長成分をそれぞれ検出する手段とを
含み、前記電界形成手段は前記電界を形成するための電
圧であってかつ前記複数の泳動路がその長さに応じて分
けられた泳動路群毎に独立した電圧を発生させる手段を
含む電気泳動装置。
【請求項７】蛍光体が標識された試料が泳動する複数の
泳動路と、該複数の泳動路に前記試料を泳動させる電界
を形成するように前記複数の泳動路にそれぞれ外部抵抗
を介して電圧を印加する手段と、前記蛍光体から蛍光を
発生させるように前記泳動路にレ−ザ光を照射する手段
と、前記発生した蛍光の複数の波長成分をそれぞれ検出
する手段とを含み、前記それぞれの外部抵抗の抵抗値は
該外部抵抗値と該外部抵抗値にそれぞれ対応する前記泳
動路の内部抵抗値との和がそれぞれ実質的に同じになる
ように設定されていることを特徴とする電気泳動装置。