JP2000262274A - 細菌抽出用担体、微生物抽出方法および微生物群測定方法 - Google Patents

細菌抽出用担体、微生物抽出方法および微生物群測定方法

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JP2000262274A JP11071485A JP7148599A JP2000262274A JP 2000262274 A JP2000262274 A JP 2000262274A JP 11071485 A JP11071485 A JP 11071485A JP 7148599 A JP7148599 A JP 7148599A JP 2000262274 A JP2000262274 A JP 2000262274A
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microorganisms
bacteria
microorganism
extraction
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Koichi Inoue
高一 井上
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Society for Techno Innovation of Agriculture Forestry and Fisheries
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Sanyo Electric Co Ltd
Society for Techno Innovation of Agriculture Forestry and Fisheries
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物を容易に抽出することができる微生物
抽出方法を提供することである。 【解決手段】 細菌抽出用担体１００は複数の細孔１１
０を有しかつＤＮＡを有さない材料体により構成され
る。細孔１１０の平均細孔径は５〜１００μｍであり、
深さが５μｍ以上である。採取場所に埋設した細菌抽出
用担体１００の細孔１１０に細菌２００，３００，４０
０が入り込んで生息する。所定時間経過後、細菌抽出用
担体１００を取り出して洗浄し、大きな異物を除去す
る。さらに、細菌抽出用担体１００を破砕して細菌２０
０，３００，４００を遊離させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌抽出用担体、
微生物抽出方法ならびに微生物群測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、家庭等から排出される有機系廃棄
物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する
生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理
機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解を
することにより肥料が作製される。このような生ゴミ処
理機によるコンポスト化では、そのコンポスト化過程
（有機物分解過程）において、温度等をモニタすること
によりコンポスト化の度合いを評価する。そして、その
評価に基づき良質な肥料が作製されるように生ゴミ処理
機の状態を調節する。
【０００３】しかしながら、より良質な肥料を作製する
ためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物群（少
なくとも微生物の種類）の情報が必要である。この微生
物群の情報は、微生物により生ごみの分解を良好に制御
するためにも必要である。また、作製された肥料の添加
により土壌の改良を進めるうえでは、土壌中の微生物群
の情報を知ることも重要である。
【０００４】従来、微生物群の情報を得る方法として、
例えば細菌群の存在する土壌、木質チップ、食品等を採
取し、そこから細菌群を抽出するとともに、抽出した細
菌群に含まれる個々の細菌を単離して生化学検査する方
法が用いられる。
【０００５】生ゴミ処理機の内部の細菌群について調べ
る場合、生ゴミ処理機の処理槽内に処理担体として含ま
れる木質チップを採取する。この木質チップを滅菌した
大量の生理的食塩水中に投入し、懸濁法により木質チッ
プから細菌を遊離させる。この処理液をフィルタを用い
て濾過することにより、木質チップ等の異物およびサイ
ズの大きな原生動物等を除去する。さらに、この濾過液
を遠心分離することにより、上澄液中に細菌群を抽出さ
せる。
【０００６】上記のようにして細菌群を抽出した後、遠
心分離の上澄液をさらに希釈し、これを寒天培地上に接
種する。寒天培地において細菌群を培養し、細菌群に含
まれる個々の細菌を単離する。単離した個々の細菌につ
いて生化学検査を行うことにより、微生物群の情報を得
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】生ゴミ処理機において
処理担体として用いられる木質チップは植物細胞からな
りＤＮＡを有する可能性がある。このため、処理槽内の
細菌群のＤＮＡを分析する場合においては、木質チップ
と細菌とを完全に分離する必要がある。したがって、上
記に示すように、懸濁法による処理工程およびフィルタ
を用いた濾過工程が必要となり、細菌を抽出する工程が
複雑となる。
【０００８】また、複数の細菌により構成される細菌群
から個々の細菌を単離するので時間がかかる上に、単離
の難しい細菌の分析が困難である。
【０００９】一方、ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction;ポリメラーゼ連鎖反応）
法が用いられている。このＰＣＲ法は、増幅しようとす
るＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基
配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程お
よび伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返す
ことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅す
ることを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いる
と、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定
の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することがで
きる。
【００１０】しかしながら、このＰＣＲ法を用いるため
には、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列
が既知であることが必要である。したがって、従来のＰ
ＣＲ法では、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土
壌に存在する微生物の種類および塩基配列が知られてい
ないと、それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することは
できない。
【００１１】そこで、単一のプライマーで塩基配列の情
報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ
断片を増幅するＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorph
icＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Arbitrarily Prim
ed-Polymerase Chain Reaction) 法が提案されている。
これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニ
ーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイ
オン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配
列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを
伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複
製される。
【００１２】これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ
法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報
がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断
片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電
気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープ
リントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分
析することにより微生物の状態を解析することが可能と
なる。
【００１３】細菌から調整した染色体ＤＮＡの分析にお
いて、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法を複数
の細菌により構成される細菌群に適用する場合、プライ
マーおよびＰＣＲ条件を調整して例えば１０8 ｂｐ（塩
基対）に対して１つのＤＮＡ断片が増幅されるように増
幅の確率を低く設定すると、細菌の染色体ＤＮＡと増幅
されたＤＮＡ断片とを対応付けることが容易になり、解
析の効率が向上する。その反面、多くの細菌により構成
される細菌群を識別する場合には、増幅されるＤＮＡ断
片の種類数が多すぎるために、増幅されたＤＮＡ断片と
鋳型となった細菌との対応付けが困難となり、細菌群が
形成する生態系を把握することが困難になる。
【００１４】本発明の目的は、細菌の抽出を簡易化する
ことが可能な細菌抽出用担体を提供することである。
【００１５】本発明の他の目的は、微生物を容易に抽出
することができる微生物抽出方法を提供することであ
る。
【００１６】本発明の他の目的は、複数の微生物を正確
に識別することが可能な微生物群測定方法を提供するこ
とである。
【００１７】
【課題を解決するための手段および発明の効果】本発明
に係る細菌抽出用担体は、複数の細孔を有しかつＤＮＡ
を有さない材料体により構成され、細孔の平均細孔径が
５μｍ以上１００μｍ以下であるとともに各細孔の深さ
が５μｍ以上である。
【００１８】本発明に係る細菌抽出用担体は、所定時間
細菌の採取場所に配置された後、回収される。回収され
た細菌抽出用担体は、洗浄され、さらに細菌抽出用担体
から細菌が遊離される。
【００１９】上記の細菌抽出用担体は、細菌の生息に適
した複数の細孔を有するため、細菌は細孔内に入り込み
濃縮された状態で生息する。したがって、細菌抽出用担
体を採取することにより、採取場所から細菌を濃縮した
状態で採取することが可能となる。
【００２０】また、細菌は細孔内に入り込んだ状態で生
息するため、細菌抽出用担体を洗浄した場合において
も、細菌は除去されにくい。一方、細孔よりも大きな異
物等は細孔内に入り込んでいないため、洗浄により容易
に除去される。それにより、細菌と異物とを分離するた
めの濾過工程を短縮化することが可能となる。
【００２１】さらに、細菌抽出用担体を破砕することに
より細菌抽出用担体と細菌とを遊離させる場合におい
て、細菌抽出用担体はＤＮＡを有さない材料体により構
成されるため、細菌抽出用担体が抽出した細菌の中に含
まれていても細菌のＤＮＡの分析に支障はない。したが
って、細菌抽出用担体と細菌とを完全に分離する必要が
なく、微生物の抽出に要する工程数を削減することが可
能となる。
【００２２】以上のことから、本発明に係る細菌抽出用
担体を用いることにより、細菌を容易に抽出することが
可能となる。
【００２３】材料体は、プラスチック、合成繊維、セラ
ミックス、金属、ガラスまたは紙により形成されてもよ
い。このような材料体により形成される細菌抽出用担体
はＤＮＡを持たない。
【００２４】材料体は、微生物が好む栄養素を含んでも
よい。これにより、細菌が細菌抽出用担体に集まって生
息するため、細菌をさらに濃縮した状態で採取すること
が可能となる。
【００２５】また、材料体は、微生物により分解可能な
素材から形成されてもよい。この場合においては、細菌
抽出用担体を構成する材料体を分解可能な細菌が細菌抽
出用担体に集まって生息する。それにより、このような
材料体を分解可能な細菌を濃縮した状態で採取すること
が可能となる。さらに、細菌抽出用担体自体がこの細菌
により分解されるため、細菌抽出用担体の重さ、重合度
等を測定することにより、細菌による分解の速度や分解
状態を調べることが可能となる。
【００２６】本発明に係る微生物抽出方法は、複数の細
孔を有しかつＤＮＡを有さない材料体により構成された
微生物抽出用担体を微生物群の採取場所に配置し、所定
時間経過後に微生物抽出用担体を回収し、回収した微生
物抽出用担体から微生物群を遊離させるものである。
【００２７】本発明に係る微生物抽出方法においては、
複数の細孔を有する微生物抽出用担体を微生物群の採取
場所に配置するため、微生物を濃縮した状態で採取する
ことが可能となる。また、微生物は微生物抽出用担体の
細孔内に入り込んだ状態で生息するため、微生物抽出用
担体を洗浄した場合においても、微生物は微生物抽出用
担体から除去されにくい。したがって、細孔よりも大き
な異物等のみを除去することが可能となる。それによ
り、微生物を容易に抽出することが可能となる。
【００２８】また、微生物抽出用担体を破砕することに
より微生物群を遊離させてもよい。この場合、破砕した
微生物抽出用担体が微生物中に含まれていても、微生物
抽出用担体はＤＮＡを有さない材料体により構成される
ため、微生物のＤＮＡ分析に支障はない。したがって、
微生物抽出用担体を微生物中から完全に除去するための
工程が削減され、微生物抽出の簡易化が図られる。
【００２９】微生物抽出用担体に微生物が好む栄養素を
含ませてもよい。これにより、微生物が微生物抽出用担
体に集まって生息するため、微生物をさらに濃縮した状
態で採取することが可能となる。
【００３０】また、微生物により分解可能な材料体から
構成される微生物抽出用担体を用いてもよい。
【００３１】この場合においては、微生物抽出用担体を
構成する材料体を分解可能な細菌が微生物抽出用担体に
集まって生息する。したがって、このような材料体を分
解可能な微生物を濃縮した状態で採取することが可能と
なる。さらに、微生物抽出用担体自体がこの微生物によ
り分解されるため、微生物抽出用担体の重さ、重合度等
を測定することにより、微生物による分解の速度や分解
状態を調べることが可能となる。
【００３２】本発明に係る微生物群測定方法は、微生物
群に含まれる複数の異なる微生物を識別する微生物測定
方法であって、複数の細孔を有しかつＤＮＡを有さない
材料体により構成された微生物抽出用担体を用いて微生
物群を抽出し、微生物抽出用担体を抽出した微生物とと
もに破砕し、増幅確率の異なる複数のプライマーを準備
し、複数のプライマーの各々を用いて、抽出した微生物
群に含まれる複数の異なる微生物のＤＮＡに対し、熱変
性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラ
ーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリ
メラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、微生
物群の複数の異なる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅
し、増幅されたＤＮＡ断片を識別方法により分類し、微
生物群に含まれる複数の異なる微生物を識別するもので
ある。
【００３３】本発明に係る微生物群測定方法において
は、複数の細孔を有する微生物抽出用担体を微生物の採
取場所に所定期間配置した後、これを回収することによ
り微生物を濃縮した状態で採取する。この微生物抽出用
担体を破砕することにより、微生物抽出用担体から微生
物を遊離させる。この場合、微生物抽出用担体はＤＮＡ
を有さない材料体により構成されるため、微生物中に微
生物抽出用担体が含まれていても、微生物のＤＮＡ分析
に支障はない。
【００３４】このようにして抽出した複数の異なる微生
物のＤＮＡに対し、増幅確率の異なる複数のプライマー
の各々を用いて一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用す
ることにより、複数の異なる微生物からＤＮＡ断片を増
幅することが可能となる。したがって、微生物群に含ま
れる複数の微生物を正確に識別することが可能になる。
【００３５】また、増幅確率の異なる複数のプライマー
を用いることにより、１つの微生物から複数種類のＤＮ
Ａ断片が得られる。それにより、微生物群に含まれる各
微生物から複数個の情報を得ることができ、測定の精度
が向上する。その結果、種々の微生物生態系の測定を短
時間にかつ正確に行うことができる。
【００３６】さらに、一般的に測定しようとする微生物
群を構成する微生物の種類数や微生物の染色体ＤＮＡの
大きさは未知であるが、増幅確率の異なるあるいは増幅
確率のオーダ（桁）の異なるプライマーを同時に用いる
ことで、適当な種類数のＤＮＡ断片が増幅されるプライ
マーの増幅結果を電気泳動像から選択することができ
る。
【００３７】上記のようにして選択した適当な増幅確率
を有する複数のプライマーを用いることにより、微生物
群を構成する微生物の種類数が未知の場合においても微
生物群からＤＮＡ断片を増幅し、増幅したＤＮＡ断片の
種類数から微生物群を構成する微生物の種類数を調べる
ことができる。
【００３８】また、上記のようにして選択した適当な増
幅確率を有する複数のプライマーを用いることにより、
微生物群を構成する主要な微生物の種類が未知である場
合においても、主要な微生物または主要な微生物群から
ＤＮＡ断片を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片の種類数か
ら主要な微生物または主要な微生物群の染色体の大きさ
を予測することが可能となる。さらに、予測される染色
体ＤＮＡの大きさから、主要な微生物群を構成する微生
物が細菌、放線菌、原生動物等のいずれに属するかを調
べることができる。
【００３９】識別方法は電気泳動法であってもよい。こ
の場合、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法により分類
する。それにより、電気泳動像において、増幅されたＤ
ＮＡ断片はサイズにより分類されたバンドとして現れ
る。このバンドのパターンを分析することにより、微生
物群を構成する微生物の種類数を調べることができる。
【００４０】
【発明の実施の形態】図１は本発明の一実施例における
細菌抽出用担体を示す模式的断面図である。
【００４１】図１に示す細菌抽出用担体１００は、ＤＮ
Ａを持たない素材により構成されている。また、細菌抽
出用担体１００は複数の細孔１１０を有し、表面が凹凸
形状を有する。それにより、細菌抽出用担体１００は大
きな表面積を有する。
【００４２】細菌抽出用担体１００は、超音波処理等に
より容易に細菌が剥離することが可能な素材および形状
であることが好ましく、または容易に破砕することが可
能でかつ遠心分離により微生物と分離可能な素材および
形状であることが好ましい。
【００４３】細菌抽出用担体１００の素材としては、例
えば、プラスチック等の有機物、セラミックス、金属、
ガラス、紙等が挙げられる。
【００４４】また、細菌抽出用担体１００の細孔１１０
は、平均細孔径が５〜１００μｍであり、深さが５μｍ
以上であることが好ましい。なお、特定の細菌を抽出す
る場合には、抽出する細菌が生息するのに適した細孔径
とすることが好ましい。これにより、細菌が細孔１１０
内において生息可能になるとともに、細孔径よりも大き
な異物が細孔１１０内に入るのを防ぐことが可能とな
る。
【００４５】なお、細菌抽出用担体１００の細孔径分布
は、水銀ポロシメータを用いた水銀圧入法により測定す
ることが可能である。
【００４６】細菌抽出用担体１００は、細菌が好む栄養
素、例えば、各種アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、麦芽エキス、ビタミン類、糖類、アルコール
類、硝酸塩、アンモニウム塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、リ
ン酸塩、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシ
ウム、鉄、銅、マンガン、コバルト、亜鉛などを単一、
もしくは、複数組み合わせて含浸してもよい。また、一
定の保水率を保つことが可能であり、周辺の環境よりも
温度を高く保つことが可能であることが好ましい。それ
により、細菌抽出用担体１００において、細菌の生息に
良好な環境が得られるため、細菌が集まりやすい。
【００４７】次に、図１の細菌抽出用担体１００を用い
た細菌抽出方法について説明する。ここでは、図１に示
す細菌抽出用担体１００を用いて、生ゴミ処理機の処理
槽内の細菌群を抽出する場合について説明する。
【００４８】生ゴミ処理機の処理槽内に処理担体として
木質チップを入れ、木質チップ中に図１に示す細菌抽出
用担体１００を埋設する。この場合、処理槽内において
は、わずかな細菌しか存在しない。
【００４９】次に、処理槽内に一定量の生ごみを投入す
るとともに、処理槽内を攪拌する。この操作を所定期間
繰り返し行う。なお、所定期間中、処理槽内の温度およ
び湿度は良好な処理状態に保つ。
【００５０】上記のような生ごみの投入に伴い、処理槽
内の細菌の種類および数が増加する。細菌は、処理槽内
の木質チップにおいて生息するとともに、細菌抽出用担
体１００において生息する。
【００５１】図２は処理槽内における細菌抽出用担体１
００を示す模式的断面図である。図２に示すように、細
菌抽出用担体１００の複数の細孔１１０内に多くの細菌
２００，３００，４００が入り込む。このように、細菌
抽出用担体１００においては、細菌２００，３００，４
００が濃縮された状態で生息する。特に、細菌抽出用担
体１００の保水率および温度を細菌の生息に良好な状態
に設定するとともに細菌２００，３００，４００の好む
栄養素を細菌抽出担体１００に含浸させた場合、細菌
は、細菌抽出用担体１００において高濃度に濃縮された
状態で生息する。
【００５２】生ゴミ処理機の運転を開始してから所定期
間経過した後、処理槽内の細菌抽出用担体１００を採取
し、滅菌した０．８５％食塩水により洗浄する。この場
合、細菌２００，３００，４００は細孔１１０内に入り
込んでいるため、洗浄しても細菌抽出用担体１００から
除去されにくい。一方、木質チップや生ゴミ等の異物お
よび細孔径よりも大きい微生物は細孔１１０内に入り込
んでいないため、洗浄により容易に除去することが可能
である。
【００５３】次に、洗浄した細菌抽出用担体１００を破
砕し、細菌２００，３００，４００を剥離させる。必要
に応じて超音波処理により剥離させる。さらに、沈降分
離あるいは遠心分離を行い、細菌２００，３００，４０
０と細菌抽出用担体１００とを分離する。このようにし
て、処理槽内の細菌２００，３００，４００を抽出す
る。
【００５４】上記に示す細菌の抽出方法においては、複
数の細孔１１０を有する細菌抽出用担体１００を用いる
ことにより、細菌２００，３００，４００を濃縮した状
態で処理槽内から採取することが可能となる。
【００５５】また、細孔径よりも大きな異物等を洗浄に
より容易に除去することが可能であるため、異物を除去
するための濾過等の操作が不要となる。さらに、細菌抽
出用担体１００はＤＮＡを持たない素材から構成されて
いるため、抽出した細菌２００，３００，４００の中に
細菌抽出用担体１００の粉末が含まれていても、細菌２
００，３００，４００のＤＮＡの分析に支障はない。
【００５６】以上のように、本実施例における細菌の抽
出方法によれば、生ゴミ処理機の処理槽内の細菌を容易
に抽出することが可能となる。
【００５７】なお、本発明の微生物抽出方法は、細菌に
限らず、原生動物等の微生物の抽出にも適用することが
できる。その場合には、抽出すべき微生物の大きさに応
じて担体の細孔を設定する。
【００５８】次に、上記の細菌抽出方法により抽出され
た細菌群の測定方法について説明する。
【００５９】ここでは、上記の細菌抽出方法により生ゴ
ミ処理機の処理層内から抽出した細菌群を測定する場合
について説明する。
【００６０】図３は細菌群測定方法に用いるＤＮＡ断片
増幅装置の一例を示す模式図である。
【００６１】図３において、ＤＮＡ断片増幅装置は、タ
イタプレートと呼ばれる支持プレート５０により構成さ
れる。支持プレート５０の上面には、複数の孔部（反応
溶液収納部）５１が形成されている。図３の例では、支
持プレート５０の上面に９６個の孔部５１が形成されて
いる。
【００６２】支持プレート５０の一端部側の３２個の孔
部５１内には、１０9 ｂｐ（塩基対）に１個のＤＮＡ断
片が増幅される増幅確率を有するプライマーが配置され
る。支持プレート５０の中央部の３２個の孔部５１内に
は、１０8 ｂｐに１個のＤＮＡ断片が増幅される増幅確
率を有するプライマーが配置される。支持プレート５０
の他端部側の３２個の孔部５１内には、１０7 ｂｐに１
個のＤＮＡ断片が増幅される増幅確率を有するプライマ
ーが配置される。
【００６３】図４は本実施例における細菌群測定方法に
用いるＤＮＡ断片増幅装置の他の例を示す模式図であ
る。
【００６４】図４のＤＮＡ断片増幅装置においても、支
持プレート５０の上面に複数の孔部５１が形成されてい
る。複数の孔部５１には、増幅確率の異なる複数のプラ
イマーが増幅確率の順に連続的に配置されている。
【００６５】ここで、細菌の染色体ＤＮＡの塩基長を約
１０7 ｂｐとして考える。例えば、１０種類の微生物が
存在する細菌叢（そう）を測定する場合、１０8 ｂｐに
１個のＤＮＡ断片が増幅されるように増幅確率を設定す
ると、１０種類の微生物に対して１個のＤＮＡ断片が増
幅され、すなわち１種類の細菌が検出される。したがっ
て、１０種類のプライマーを用意することにより１０種
類の細菌を検出することができる。実際には、増幅に偏
りがあるので、２０〜３０種類程度のプライマーを用意
することが望ましい。
【００６６】また、細菌叢に含まれる細菌の数が多い場
合や細菌の染色体ＤＮＡの塩基長が長い場合には、増幅
確率を低く設定することが有効となる。逆に、細菌叢に
含まれる細菌の数が少ない場合や細菌の染色体ＤＮＡの
塩基長が短い場合には、増幅確率を高く設定することが
有効となる。
【００６７】図３のＤＮＡ断片増幅装置では、増幅確率
の異なるプライマーあるいは増幅確率のオーダ（桁）の
異なるプライマーが順に配置され、かつ各増幅確率ごと
に３２種類のプライマーが用意されている。また、図４
のＤＮＡ断片増幅装置では、増幅確率の異なる９６種類
のプライマーが増幅確率の順に用意されている。
【００６８】細菌叢に含まれる複数の細菌をすべてのプ
ライマーを用いて、後述するランダムＰＣＲ（Polymera
se Chain Reaction ；ポリメラーゼ連鎖反応）法により
一度に増幅する。ここで、ランダムＰＣＲ法とは、特定
の塩基配列を有するプライマーを用いて未知の塩基配列
を有する複数の異なる微生物からＤＮＡ断片を連鎖反応
的に増幅する反応法である。
【００６９】図３に示すように、増幅確率の高いプライ
マーを用いて増幅されたＤＮＡ断片の電気泳動像におい
ては多数のバンド（帯）が現れる。逆に、増幅確率の低
いプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片の電気泳動
像においては少数のバンドが現れる。したがって、対象
となる細菌叢に含まれる種類数、細菌の染色体の大き
さ、ＤＮＡ断片の種類数またはＤＮＡ断片の大きさに応
じて最適な増幅確率で増幅された電気泳動像に基づいて
細菌を解析することができる。
【００７０】ここで、本実施例における細菌群測定方法
に用いるランダムＰＣＲ法について説明する。
【００７１】ランダムＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と
同様に、次の３段階の工程を繰り返し行う。ただし、ラ
ンダムＰＣＲ法では、後述するように、未知の塩基配列
を有する複数の異なる微生物に対して特定の塩基配列を
有するプライマーを用いることにより解析可能な量のＤ
ＮＡ断片を増幅する。
【００７２】（１）熱変性工程 ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本
鎖（ＤＮＡ鎖）にする。
【００７３】（２）プライマーのアニーリング工程（プ
ライマーの結合工程） プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように
熱処理を行う。
【００７４】（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程
（ポリメラーゼによる複製工程） プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を
合成し、２本鎖化する。
【００７５】上記（１）〜（３）の工程を１サイクルと
してこのサイクルを繰り返し行う。次に、ランダムＰＣ
Ｒ法を具体的に説明する。まず、複数の異なる細菌の染
色体ＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プ
ライマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、および
４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチド三リン
酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を含む
反応溶液を準備する。
【００７６】ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の
５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳
型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応
を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。ま
た、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するため
に不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短
鎖オリゴヌクレオチド）である。この場合、特定の塩基
配列および塩基長を有するプライマーを用いる。
【００７７】上記反応溶液に対して次のランダムＰＣＲ
法を適用する。第１のサイクルとして、上記反応溶液を
例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶
液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニー
リング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分
間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序
で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全Ｄ
ＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱
変性工程よりも長めに設定する。
【００７８】引続き、第２のサイクルとして、上記反応
溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記
反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーの
アニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で
３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
順序で例えば３３回繰り返す。
【００７９】最後に、第３のサイクルとして、上記反応
溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記
反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーの
アニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分
間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序
で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反
応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第
２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも
長めに設定する。
【００８０】ここで、上記第１のサイクル、第２のサイ
クルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第
２回目のサイクルを図５〜図７を用いて説明する。な
お、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプラ
イマーと結合する部分の塩基配列を示している。
【００８１】図５〜図７では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣ
Ｇの塩基配列（配列番号１）を有するプライマーを用い
ている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニ
ン、Ｃはシトシンを示す。
【００８２】図５（ａ）に示すように最初、上記反応溶
液中には複数の異なる細菌に含まれていた長いＤＮＡ
（完全ＤＮＡ）１が存在する。ここでは、１個の完全Ｄ
ＮＡに着目して説明する。
【００８３】最初に、図５（ｂ）に示すように、第１の
サイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程
より長い熱変性工程を行うことにより、上記長いＤＮＡ
１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖
（ＤＮＡ鎖）２ａ，２ｂの状態になる。
【００８４】次に、図５（ｃ）に示すように、プライマ
ーのアニーリング工程でプライマー１１ａがその塩基配
列に適合する各１本鎖２ａ，２ｂの適合位置に配置（相
補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とは
プライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位
置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基
配列と類似の塩基配列の位置である。上記ランダムＰＣ
Ｒ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温
度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基
配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合
する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に
相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することが
できるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に
結合することもできる。なお、図１〜図３では、簡単の
ためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩
基配列の位置に結合する場合を図示している。
【００８５】続いて、図１（ｄ）に示すように、ポリメ
ラーゼにより伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長
反応が起こり、１本鎖２ａ，２ｂにそれぞれ沿って１本
鎖２ｃ，２ｄが伸長して２本鎖化した鎖３ａ，３ｂが形
成される。
【００８６】第２のサイクルの１回目のサイクルでは、
第１のサイクルで２本鎖化した鎖３ａ，３ｂが熱変性工
程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）２ａ，２ｃおよび１本
鎖（ＤＮＡ鎖）２ｂ，２ｄとなるが、ここでは、鎖３ａ
から分かれた１本鎖２ｃに着目して説明する。
【００８７】図２に示すように、熱変性工程で分離した
１本鎖２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプ
ライマー１１ｂが適合位置に配置するように結合する。
その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラー
ゼによって伸長反応が起こり、１本鎖２ｃに沿って１本
鎖２ｅが伸長して２本鎖化した鎖３ｄとなる。
【００８８】その後、図３に示すように、第２のサイク
ルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖３ｄ
が熱変性工程でそれぞれ１本鎖２ｃ，２ｅとなるが、こ
こでは、鎖３ｄから分かれた１本鎖２ｅに着目して説明
する。
【００８９】図３に示すように、熱変性工程で分離した
１本鎖２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程
で、同様に、プライマー１１ｃが適合位置に配置するよ
うに結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工
程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖２
ｅに沿って１本鎖２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮ
Ａ断片）３ｅが形成される。
【００９０】このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤ
ＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種
のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連
鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅
される。
【００９１】上記のランダムＰＣＲ法により増幅された
ＤＮＡ断片を異なる細菌ごとに分類するためにゲル電気
泳動法にかける。そして、電気泳動像のバンド（帯）を
解析することにより、細菌の存在状態を推定することが
できる。また、時間をおいて採取した細菌に対して上記
のランダムＰＣＲ法を適用することによりＤＮＡ断片を
増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を同様にゲル電気泳動法
にかける。そして、電気泳動像のバンドの状態の変化を
解析することにより、経時的な細菌存在状態の変化を推
定することができる。
【００９２】上記のランダムＰＣＲ法を生ゴミ処理機の
処理槽内または土壌中から採取した複数の細菌に適用す
ることにより、生ゴミ処理機の処理槽内または土壌中の
細菌の存在状態を推定することができる。また、時間を
おいて同様に採取した生ゴミ処理機の処理槽内または土
壌中の細菌の存在状態を調べることにより、生ゴミ処理
機の処理槽内または土壌中の経時的な細菌存在状態の変
化を推定することができる。さらに、生ゴミ中の有機物
の分解過程における有機物の分解状態を推定することも
できる。
【００９３】この結果に従って、生ゴミ処理機の処理槽
の条件を変えることにより、生ゴミの処理を良好に行え
るとともに、良好な肥料を作製することができる。
【００９４】なお、上記においては、本発明に係る細菌
抽出用担体１００を用いて生ゴミ処理機の処理槽内の細
菌群を抽出し、抽出した細菌群を細菌群測定方法により
分析する場合について説明したが、本発明はこれ以外の
場合にも適用可能である。例えば、本発明に係る細菌抽
出用担体１００を土壌中に埋設して土壌中の細菌群を抽
出し、この細菌群を細菌群測定方法により分析してもよ
い。この場合、土壌中の細菌群の情報を得ることが可能
となる。
【００９５】また、難分解性物質、例えば、有機塩素系
化合物（ダイオキシン、ＰＣＢ、ジクロロメタン、四塩
化炭素、1,2-ジクロロエタン、1,1-ジクロロエチレン、
シス-1,2- ジクロロエチレン、1,1,1-トリクロロエタ
ン、1,1,2-トリクロロエタン、トリクロロエチレン、テ
トラクロロエチレン等）、有機化合物（ベンゼン、トル
エン、キシレン、フェノール、安息好酸等とそれらの誘
導体）、シアン化合物、農薬（1,3-ジクロロプロペン、
チラウム、シマジン、チオベンカルブ等）、有機リン化
合物（パラチオン、メチルパラチオン、メチルジメト
ン、ＥＰＮ（エチルパラニトロフェニルチオノベンゼン
ホスホネイト）等）、アンモニア態窒素化合物、硝酸態
窒素化合物、プラスチック、（ポリエチレン、ポリスチ
レン、ポリプロピレン、塩化ビニル樹脂、ポリエチレン
テレフタレート、ユリア樹脂、フェノール樹脂等）を含
浸させた細菌抽出用担体１００、あるいはこの難分解性
物質を素材とする細菌抽出用担体１００を土壌中に埋設
した場合、難分解性物質を分解可能な細菌が細菌抽出用
担体１００に集まって生息する。したがって、細菌抽出
用担体１００において生息する細菌群を抽出して分析す
ることにより、この難分解性物質を分解可能な細菌を土
壌中から検出することが可能となる。
【００９６】生分解性プラスチック、例えば、ポリカプ
ロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸、ポ
リ3-ヒドロキシ酪酸、ポリ3-ヒドロキシ酪酸とポリヒド
ロキシ吉草酸の共重合体、デンプン、ポリカプロラクト
ンとデンプンのブレンド体、脂肪族ポリエステルとポリ
アミドの共重合体、脂肪族ポリエステルと芳香族ポリエ
ステルの共重合体、エステル型ポリウレタン、糖含有高
分子、セルロース、キトサンとセルロースの混合物、ポ
リ- γ- メチルグルタメート等から構成される細菌抽出
用担体１００を土壌中に埋設した場合、生分解性プラス
チックを分解可能な細菌が細菌抽出用担体１００に集ま
って生息する。したがって、この細菌抽出用担体１００
において生息する細菌を抽出することにより、生分解性
プラスチックを分解可能な細菌を土壌から検出すること
が可能となる。この場合、生分解性プラスチックを素材
とする細菌抽出用担体１００自体が細菌により分解され
ることから、細菌抽出用担体１００の重さ、重合度等を
測定することにより、細菌による生分解性プラスチック
の分解の速度や分解状態を調べることが可能となり、ま
た、分解のための最適条件を調べることが可能となる。
【００９７】また、細菌群から単離した細菌を生化学検
査により同定するとともに、同定した細菌のＤＮＡのバ
ンドパターンを上記の微生物群測定方法により分析す
る。このようにして、複数の細菌について細菌の種類と
その細菌のＤＮＡのバンドパターンを分析し、得られた
データをもとに細菌のＤＮＡのバンドパターンのデータ
ベースを作成してもよい。この場合、例えば上記のよう
にして土壌から採取した細菌群に含まれる複数の細菌の
ＤＮＡを上記の細菌群測定方法により分析し、得られた
細菌群のＤＮＡのバンドパターンに基づいてデータベー
スから細菌の種類を検索する。それにより、細菌群を構
成する細菌の種類を調べることが可能となる。
【００９８】特に、上記のようなデータベースから細菌
の種類を検索する方法は、水銀、砒素、ダイオキシン、
環境ホルモン等の有害な汚染物質に汚染された土壌、食
品等の発見および汚染状態を知るのに有効である。すな
わち、上記のようにして分析された土壌中の細菌群のＤ
ＮＡのバンドパターンに基づいてデータベースをサーチ
し、細菌群を構成する細菌の種類を同定する。同定した
細菌の中に汚染物質に関係のある細菌が含まれている場
合は、細菌を採取した土壌中にこの汚染物質が含まれる
可能性が示唆される。また、汚染物質に関係のある細菌
の存在の程度により、土壌中の汚染状態が示唆される。
なお、汚染物質とそれに関係する細菌の一例を表１およ
び表２に示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】表１および表２に示すように、例えばメタ
ノバクテリア属、クロストリディウム属またはシュウド
モナス属の細菌が土壌中に含まれていた場合、水銀によ
る土壌汚染の可能性が示唆される。また、ダイオキシン
を分解できるファネロケーテ属の存在から、ダイオキシ
ンの存在の有無と存在の程度を推定することも可能であ
る。
【０１０２】従来、土壌、食品等における汚染物質の有
無とその程度を調べるには、汚染物質の種類ごとに適し
た分析方法により分析を行う必要がある。特に、有機物
の汚染状態を調べるためには、有機物中に含まれる各元
素により分析方法が異なるため、予め汚染物質を予測し
た上で分析を行う必要がある。このため、複数の汚染物
質を同時に調べることが困難であり、また、分析試料を
大量に採取する必要があった。
【０１０３】上記のようにＤＮＡのバンドパターンのデ
ータベースから細菌を検索する方法によれば、汚染物質
の予測不可能な土壌、食品等の試料および複数種類の汚
染物質を含む試料であっても、これらを少量採取して分
析することにより、汚染物質の種類およびその程度を迅
速に調べることが可能となる。
【０１０４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sanyo Electric Co., Ltd. <110> Society for Techno-innovation of Agriculture, Forestry and Fisheri es <120> Carrier for Extracting Bacteria, Method of Extracting Microorganis m and Method of Assaying Microorganisms <130> NSR0980228 <160> 1 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ggcttcgaat cg 12
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例における細菌抽出用担体を示
す模式的断面図である。
【図２】図１に示す細菌抽出用担体の処理槽内における
状態を示す模式的断面図である。
【図３】本発明の一実施例における微生物群測定方法に
用いるＤＮＡ断片増幅装置の一例を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施例における微生物群測定方法に
用いるＤＮＡ断片増幅装置の他の例を示す模式図であ
る。
【図５】ランダムＰＣＲ法における第１のサイクル中の
過程を示す模式図である。
【図６】ランダムＰＣＲ法における第２のサイクルの１
回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【図７】ランダムＰＣＲ法における第２のサイクルの２
回目のサイクル中の過程を示す模式図である。
【符号の説明】
１ ＤＮＡ ２ａ，２ｂ，２ｃ，２ｄ，２ｅ １本鎖 ３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ，３ｅ ２本鎖 １１ａ，１１ｂ，１１ｃ プライマー ５０ 支持プレート ５１ 孔部 １００ 細菌抽出用担体 １１０ 細孔 ２００，３００，４００ 細菌
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B063 QA18 QQ06 QR32 QR62 QS16 QS25 4B065 AA01X BC42 CA49

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複数の細孔を有しかつＤＮＡを有さない
    材料体により構成され、前記細孔の平均細孔径が５μｍ
    以上１００μｍ以下であるとともに各前記細孔の深さが
    ５μｍ以上であることを特徴とする細菌抽出用担体。
  2. 【請求項２】 前記材料体は、プラスチック、合成繊
    維、セラミックス、金属、ガラスまたは紙により形成さ
    れることを特徴とする請求項１記載の細菌抽出用担体。
  3. 【請求項３】 前記材料体は、微生物が好む栄養素を含
    むことを特徴とする請求項１または２記載の細菌抽出用
    担体。
  4. 【請求項４】 前記材料体は、微生物により分解可能な
    素材から形成されることを特徴とする請求項１〜３のい
    ずれかに記載の細菌抽出用担体。
  5. 【請求項５】 複数の細孔を有しかつＤＮＡを有さない
    材料体により構成された微生物抽出用担体を微生物群の
    採取場所に配置し、所定時間経過後に前記微生物抽出用
    担体を回収し、回収した前記微生物抽出用担体から前記
    微生物群を遊離させることを特徴とする微生物抽出方
    法。
  6. 【請求項６】 前記微生物抽出用担体を破砕することに
    より前記微生物群を遊離させることを特徴とする請求項
    ５記載の微生物抽出方法。
  7. 【請求項７】 前記微生物抽出用担体に微生物が好む栄
    養素を含ませることを特徴とする請求項５または６記載
    の微生物抽出方法。
  8. 【請求項８】 微生物により分解可能な材料体から構成
    される前記微生物抽出用担体を用いることを特徴とする
    請求項５または６記載の微生物抽出方法。
  9. 【請求項９】 微生物群に含まれる複数の異なる微生物
    を識別する微生物群測定方法であって、 複数の細孔を有しかつＤＮＡを有さない材料体により構
    成された微生物抽出用担体を用いて微生物群を抽出し、
    前記微生物抽出用担体を抽出した微生物とともに破砕
    し、 増幅確率の異なる複数のプライマーを準備し、前記複数
    のプライマーの各々を用いて、抽出した前記微生物群に
    含まれる複数の異なる微生物のＤＮＡに対し、熱変性工
    程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ
    による伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラ
    ーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前記微生
    物群の複数の異なる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅
    し、前記増幅されたＤＮＡ断片を識別方法により分類
    し、前記微生物群に含まれる複数の異なる微生物を識別
    することを特徴とする微生物群測定方法。
  10. 【請求項１０】 前記識別方法は、電気泳動法であるこ
    とを特徴とする請求項９記載の微生物群測定方法。
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