JPH07255482A - 遺伝子増幅方法 - Google Patents
遺伝子増幅方法Info
- Publication number
- JPH07255482A JPH07255482A JP23226292A JP23226292A JPH07255482A JP H07255482 A JPH07255482 A JP H07255482A JP 23226292 A JP23226292 A JP 23226292A JP 23226292 A JP23226292 A JP 23226292A JP H07255482 A JPH07255482 A JP H07255482A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- oligonucleotide
- pcr
- template
- gene amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 微量で、しかも配列情報の得られていないＤ
ＮＡ断片を、簡単な操作で効率よく増幅することのでき
る方法を提供する。 【構成】 塩基配列情報のないＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅
するに際して、反応溶液中で熱変性させた鋳型ＤＮＡの
任意の領域に単一種のオリゴヌクレオチドをアニールさ
せ、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして鋳型Ｄ
ＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成、伸長させることにより
鋳型ＤＮＡの任意の領域をカバーする種々のＤＮＡ配列
を合成し、次いでこれらのＤＮＡ配列の各々を上記オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅する。
ＮＡ断片を、簡単な操作で効率よく増幅することのでき
る方法を提供する。 【構成】 塩基配列情報のないＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅
するに際して、反応溶液中で熱変性させた鋳型ＤＮＡの
任意の領域に単一種のオリゴヌクレオチドをアニールさ
せ、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして鋳型Ｄ
ＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成、伸長させることにより
鋳型ＤＮＡの任意の領域をカバーする種々のＤＮＡ配列
を合成し、次いでこれらのＤＮＡ配列の各々を上記オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は遺伝子増幅方法に関す
るものである。さらに詳しくは、この発明は、特定染色
体領域のＤＮＡライブラリーの構築や、さらには特定染
色体領域に由来する遺伝子（ｃＤＮＡ）の単離そのプロ
ーブの開発等、広く医学、生物工学分野に有用な、改良
されたＰＣＲ法による遺伝子増幅方法に関するものであ
る。
るものである。さらに詳しくは、この発明は、特定染色
体領域のＤＮＡライブラリーの構築や、さらには特定染
色体領域に由来する遺伝子（ｃＤＮＡ）の単離そのプロ
ーブの開発等、広く医学、生物工学分野に有用な、改良
されたＰＣＲ法による遺伝子増幅方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術とその課題】近年、生命体を構成する組
織、機構についての分子生物学的解明と、それにともな
う技術的応用が急速に進歩し、遺伝子工学やバイオテク
ノロジーの基礎が次々に確立されてきている。このよう
な状況において、原核生物から真核生物にいたるあらゆ
る生物の遺伝子について、種や個々の組織に特有な種々
の遺伝子が同定され、その遺伝情報の解析により多数の
知見が蓄積されてきており、今日ではその研究対象がヒ
トを含めた高等生物のゲノムＤＮＡにまで及んでいる。
織、機構についての分子生物学的解明と、それにともな
う技術的応用が急速に進歩し、遺伝子工学やバイオテク
ノロジーの基礎が次々に確立されてきている。このよう
な状況において、原核生物から真核生物にいたるあらゆ
る生物の遺伝子について、種や個々の組織に特有な種々
の遺伝子が同定され、その遺伝情報の解析により多数の
知見が蓄積されてきており、今日ではその研究対象がヒ
トを含めた高等生物のゲノムＤＮＡにまで及んでいる。
【０００３】とくに、３０億対とも言われる膨大なヒト
ゲノムの塩基配列を決定し、その遺伝子地図を作成する
ためには、染色体の特定領域についてそのＤＮＡライブ
ラリーを構築し、個々のＤＮＡ断片を指標（プローブ）
として染色体の物理的地図を作成することが必須の過程
となっている。また、このような特定染色体領域の物理
的地図は、分子レベルでの解明が未だなされていない大
部分のヒト遺伝病について、その原因遺伝子を同定し、
構造を解析するための有効な手段となりうる。
ゲノムの塩基配列を決定し、その遺伝子地図を作成する
ためには、染色体の特定領域についてそのＤＮＡライブ
ラリーを構築し、個々のＤＮＡ断片を指標（プローブ）
として染色体の物理的地図を作成することが必須の過程
となっている。また、このような特定染色体領域の物理
的地図は、分子レベルでの解明が未だなされていない大
部分のヒト遺伝病について、その原因遺伝子を同定し、
構造を解析するための有効な手段となりうる。
【０００４】従来より、染色体のＤＮＡライブラリーを
作製する場合には、断片化した染色体ＤＮＡをクローニ
ングベクター等にクローン化して、個々のクローンのコ
レクションから、いわゆるライブラリーを構築する方法
が用いられてきている。このようにして、現在、ヒトゲ
ノムを研究対象として、染色体のソーティングあるいは
雑種細胞を用いた特定染色体ライブラリー、さらにジャ
ンプングライブラリーやYeaste Aritificial Chromosom
e （ＹＡＣ）ライブラリー等が作製され、目的遺伝子に
接近するための新たなプローブの開発に利用されてい
る。
作製する場合には、断片化した染色体ＤＮＡをクローニ
ングベクター等にクローン化して、個々のクローンのコ
レクションから、いわゆるライブラリーを構築する方法
が用いられてきている。このようにして、現在、ヒトゲ
ノムを研究対象として、染色体のソーティングあるいは
雑種細胞を用いた特定染色体ライブラリー、さらにジャ
ンプングライブラリーやYeaste Aritificial Chromosom
e （ＹＡＣ）ライブラリー等が作製され、目的遺伝子に
接近するための新たなプローブの開発に利用されてい
る。
【０００５】しかしながら、このような従来の遺伝子ラ
イブラリーを用いた場合には、染色体の特定領域のプロ
ーブを数多く得ることに時間がかかり、その結果、目的
遺伝子の解析に多大な労力、時間、および費用を要する
ことが避けられなかった。これに対して、近年、物理的
に切り出した染色体特定領域のＤＮＡ断片を、ＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction ）法によって増幅するこ
とにより、そのＤＮＡライブラリーやプローブを調製す
る方法が提案されている（例えば、Ludecke,et al Natu
re338,348,1989）。このＰＣＲ法は、一般に、ある塩基
配列に相補的な一対の合成オリゴヌクレオチドをin vit
ro ＤＮＡ合成のプライマーとして用い、アニーリン
グ、伸長、変性のサイクルを繰り返すことにより、鋳型
ＤＮＡにほぼ均一なＤＮＡ断片を多量に得ることを可能
にするものであり、その増幅過程の自動化にともない、
遺伝子クローニングへの適用が急速に浸透しつつある。
イブラリーを用いた場合には、染色体の特定領域のプロ
ーブを数多く得ることに時間がかかり、その結果、目的
遺伝子の解析に多大な労力、時間、および費用を要する
ことが避けられなかった。これに対して、近年、物理的
に切り出した染色体特定領域のＤＮＡ断片を、ＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction ）法によって増幅するこ
とにより、そのＤＮＡライブラリーやプローブを調製す
る方法が提案されている（例えば、Ludecke,et al Natu
re338,348,1989）。このＰＣＲ法は、一般に、ある塩基
配列に相補的な一対の合成オリゴヌクレオチドをin vit
ro ＤＮＡ合成のプライマーとして用い、アニーリン
グ、伸長、変性のサイクルを繰り返すことにより、鋳型
ＤＮＡにほぼ均一なＤＮＡ断片を多量に得ることを可能
にするものであり、その増幅過程の自動化にともない、
遺伝子クローニングへの適用が急速に浸透しつつある。
【０００６】しかしながら、このＰＣＲ法においては、
鋳型ＤＮＡ断片の少なくとも両端の塩基配列が既知であ
ることが条件となるため、染色体特定領域から切り出し
た配列未知のＤＮＡ断片に適用する場合には、たとえば
個々のＤＮＡ断片をベクター等とライゲーションする必
要があり、そのために鋳型ＤＮＡに種々の化学的、酵素
的前処理を必要とした。このため、このようなライゲー
ションＰＣＲは既知遺伝子を対象とする通常のＰＣＲ法
に比べ、その操作過程が複雑となるばかりか、増幅の効
率も低下し、また鋳型となるＤＮＡ断片も多く必要とす
るなどの不都合があった。
鋳型ＤＮＡ断片の少なくとも両端の塩基配列が既知であ
ることが条件となるため、染色体特定領域から切り出し
た配列未知のＤＮＡ断片に適用する場合には、たとえば
個々のＤＮＡ断片をベクター等とライゲーションする必
要があり、そのために鋳型ＤＮＡに種々の化学的、酵素
的前処理を必要とした。このため、このようなライゲー
ションＰＣＲは既知遺伝子を対象とする通常のＰＣＲ法
に比べ、その操作過程が複雑となるばかりか、増幅の効
率も低下し、また鋳型となるＤＮＡ断片も多く必要とす
るなどの不都合があった。
【０００７】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、微量で、しかも塩基配列情報の得ら
れていないＤＮＡ断片を、簡単な操作で効率よく増幅す
ることのできる新しい遺伝子増幅方法を提供することを
目的としている。
されたものであり、微量で、しかも塩基配列情報の得ら
れていないＤＮＡ断片を、簡単な操作で効率よく増幅す
ることのできる新しい遺伝子増幅方法を提供することを
目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、塩基配列情報のないＤＮＡ断片
をＰＣＲ増幅するに際して、反応溶液中で熱変性させた
鋳型ＤＮＡの任意の領域に単一種のオリゴヌクレオチド
をアニールさせ、このオリゴヌクレオチドをプライマー
として鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成、伸長させ
ることにより鋳型ＤＮＡの任意の領域をカバーする種々
のＤＮＡ配列を合成し、次いでこれらのＤＮＡ配列の各
々を上記オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ
増幅することを特徴とする遺伝子増幅方法と、この方法
によって増幅したＤＮＡ配列を保持するクローン群から
なる遺伝子ライブラリーとを提供する。
を解決するものとして、塩基配列情報のないＤＮＡ断片
をＰＣＲ増幅するに際して、反応溶液中で熱変性させた
鋳型ＤＮＡの任意の領域に単一種のオリゴヌクレオチド
をアニールさせ、このオリゴヌクレオチドをプライマー
として鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成、伸長させ
ることにより鋳型ＤＮＡの任意の領域をカバーする種々
のＤＮＡ配列を合成し、次いでこれらのＤＮＡ配列の各
々を上記オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ
増幅することを特徴とする遺伝子増幅方法と、この方法
によって増幅したＤＮＡ配列を保持するクローン群から
なる遺伝子ライブラリーとを提供する。
【０００９】また、この発明の遺伝子増幅方法は、鋳型
ＤＮＡとオリゴヌクレオチドを、ポリエチレングリコー
ル等の両親媒性高分子を含有する１０〜４０℃の反応溶
液中で９０〜１５０分間アニールさせることを好ましい
態様としてもいる。以下、この発明の遺伝子増幅方法に
ついてさらに詳しく説明する。この発明において、増幅
の対象とする遺伝子は、たとえば物理的に切り出した染
色体特定領域の断片や、あるいはＹＡＣライブラリー等
としてクローン化されているＤＮＡ配列のような塩基配
列情報の得られていない（少なくとも、通常のＰＣＲ増
幅に必要な塩基配列情報の得られていない）ＤＮＡ断片
である。従来、このようなＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する
場合には、前記の通りのライゲーションＰＣＲ法が用い
られてきたが、この発明の方法は、ライゲーションＰＣ
Ｒ法のように、鋳型ＤＮＡに化学的、酵素的前処理を施
すことなく、通常のＰＣＲとほぼ同様の手続き、装置に
より配列未知のＤＮＡ断片を効率よく増幅することを可
能にするものである。
ＤＮＡとオリゴヌクレオチドを、ポリエチレングリコー
ル等の両親媒性高分子を含有する１０〜４０℃の反応溶
液中で９０〜１５０分間アニールさせることを好ましい
態様としてもいる。以下、この発明の遺伝子増幅方法に
ついてさらに詳しく説明する。この発明において、増幅
の対象とする遺伝子は、たとえば物理的に切り出した染
色体特定領域の断片や、あるいはＹＡＣライブラリー等
としてクローン化されているＤＮＡ配列のような塩基配
列情報の得られていない（少なくとも、通常のＰＣＲ増
幅に必要な塩基配列情報の得られていない）ＤＮＡ断片
である。従来、このようなＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する
場合には、前記の通りのライゲーションＰＣＲ法が用い
られてきたが、この発明の方法は、ライゲーションＰＣ
Ｒ法のように、鋳型ＤＮＡに化学的、酵素的前処理を施
すことなく、通常のＰＣＲとほぼ同様の手続き、装置に
より配列未知のＤＮＡ断片を効率よく増幅することを可
能にするものである。
【００１０】すなわち、この発明の方法は、まず、熱変
性させた鋳型ＤＮＡの任意の領域に単一種のオリゴヌク
レオチドをアニールさせ、このオリゴヌクレオチドをＰ
ＣＲプライマーとして、そこから鋳型ＤＮＡと相補的な
ＤＮＡ鎖を伸長させ、鋳型ＤＮＡの任意の配列領域に対
応する相補的ＤＮＡを合成する。そして、これらの変
性、アニーリング、伸長のサイクルを繰り返すことによ
り、両端にプライマー配列またはその相補配列を共通し
て有し、鋳型ＤＮＡの任意の領域をカバーする種々のＤ
ＮＡ配列を合成する（以下、このプロセスを、非特異的
ＰＣＲと記載することがある）。
性させた鋳型ＤＮＡの任意の領域に単一種のオリゴヌク
レオチドをアニールさせ、このオリゴヌクレオチドをＰ
ＣＲプライマーとして、そこから鋳型ＤＮＡと相補的な
ＤＮＡ鎖を伸長させ、鋳型ＤＮＡの任意の配列領域に対
応する相補的ＤＮＡを合成する。そして、これらの変
性、アニーリング、伸長のサイクルを繰り返すことによ
り、両端にプライマー配列またはその相補配列を共通し
て有し、鋳型ＤＮＡの任意の領域をカバーする種々のＤ
ＮＡ配列を合成する（以下、このプロセスを、非特異的
ＰＣＲと記載することがある）。
【００１１】この非特異的ＰＣＲは、プライマーとし
て、その全配列が鋳型ＤＮＡのいずれの配列にも相補的
でない（であろう）オリゴヌクレオチドを単一で用いる
という点において、通常のＰＣＲと大きく相違する。こ
のようなオリゴヌクレオチドとしては、複数の制限酵素
認識配列を有し、かつ３′−末端側に少なくとも２個の
塩基を有する単一種の２０−３０ヌクレオチドを用いる
ことができる。すなわち、ＤＮＡ鎖の配列中にはランダ
ムな塩基配列が存在するため、上記オリゴヌクレオチド
の３′−末端側の配列を、それらに相補的な鋳型ＤＮＡ
の配列にアニールさせることによって、鋳型ＤＮＡの任
意の領域にＰＣＲプライマーを付与することが可能とな
る。また、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いた場合には、最終的に増幅される種々のＤＮＡ 配
列が、その両端に複数の制限酵素切断部位を有するよう
になり、ベクター等へのライゲーションを容易に行うこ
とができる。このようなオリゴヌクレオチドの具体例と
しては、５′−ＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＴ
ＴＣＣＣ−ＯＨ３′の塩基配列からなる合成ヌクレオチ
ド（以下、ＢＶＥ２２ｃｃと記載する）を例示すること
ができる。このＢＶＥ２２ｃｃは、２２個のヌクレオチ
ドからなる配列中に、制限酵素ＢｇｌII、ＥｃｏＲＶお
よびＥｃｏＲＩに対する認識配列（各々、ＡＧＡＴＣ
Ｔ，ＧＡＴＡＴＣ，ＧＡＡＴＴＣ）を有し、かつ３′−
末端側にシトシン（Ｃ）の連続配列を有している。もち
ろん、この発明によって増幅したＤＮＡ配列は、たとえ
ばゲノムライブラリー等のスクリーニングのためのプロ
ーブとして直接利用することもでき、その場合には、制
限酵素認識配列を含まないオリゴヌクレオチドを用いる
こともできる。
て、その全配列が鋳型ＤＮＡのいずれの配列にも相補的
でない（であろう）オリゴヌクレオチドを単一で用いる
という点において、通常のＰＣＲと大きく相違する。こ
のようなオリゴヌクレオチドとしては、複数の制限酵素
認識配列を有し、かつ３′−末端側に少なくとも２個の
塩基を有する単一種の２０−３０ヌクレオチドを用いる
ことができる。すなわち、ＤＮＡ鎖の配列中にはランダ
ムな塩基配列が存在するため、上記オリゴヌクレオチド
の３′−末端側の配列を、それらに相補的な鋳型ＤＮＡ
の配列にアニールさせることによって、鋳型ＤＮＡの任
意の領域にＰＣＲプライマーを付与することが可能とな
る。また、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いた場合には、最終的に増幅される種々のＤＮＡ 配
列が、その両端に複数の制限酵素切断部位を有するよう
になり、ベクター等へのライゲーションを容易に行うこ
とができる。このようなオリゴヌクレオチドの具体例と
しては、５′−ＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＴ
ＴＣＣＣ−ＯＨ３′の塩基配列からなる合成ヌクレオチ
ド（以下、ＢＶＥ２２ｃｃと記載する）を例示すること
ができる。このＢＶＥ２２ｃｃは、２２個のヌクレオチ
ドからなる配列中に、制限酵素ＢｇｌII、ＥｃｏＲＶお
よびＥｃｏＲＩに対する認識配列（各々、ＡＧＡＴＣ
Ｔ，ＧＡＴＡＴＣ，ＧＡＡＴＴＣ）を有し、かつ３′−
末端側にシトシン（Ｃ）の連続配列を有している。もち
ろん、この発明によって増幅したＤＮＡ配列は、たとえ
ばゲノムライブラリー等のスクリーニングのためのプロ
ーブとして直接利用することもでき、その場合には、制
限酵素認識配列を含まないオリゴヌクレオチドを用いる
こともできる。
【００１２】ただし、この発明の非特異的ＰＣＲは、上
記のとおり、鋳型ＤＮＡに対する相補配列の少ないオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして使用するため、鋳型
ＤＮＡとプライマーとのアニーリング効率が低い。そこ
で、この発明の方法は、非特異的ＰＣＲにおける鋳型Ｄ
ＮＡとオリゴヌクレオチドのアニーリング反応を長時間
かけて行なわせることを推奨する。すなわち、通常のＰ
ＣＲのアニーリング反応が１〜２分間程度であるのに対
し、この発明では、９０〜１５０分間とし、鋳型ＤＮＡ
とオリゴヌクレオチドが互いに接近、会合する機会を増
加させる。
記のとおり、鋳型ＤＮＡに対する相補配列の少ないオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして使用するため、鋳型
ＤＮＡとプライマーとのアニーリング効率が低い。そこ
で、この発明の方法は、非特異的ＰＣＲにおける鋳型Ｄ
ＮＡとオリゴヌクレオチドのアニーリング反応を長時間
かけて行なわせることを推奨する。すなわち、通常のＰ
ＣＲのアニーリング反応が１〜２分間程度であるのに対
し、この発明では、９０〜１５０分間とし、鋳型ＤＮＡ
とオリゴヌクレオチドが互いに接近、会合する機会を増
加させる。
【００１３】また、このアニーリング反応を、低温で行
なわせることが好ましい。つまり、通常のＰＣＲでは、
５０〜６０℃の反応溶液中で鋳型ＤＮＡとプライマーを
アニールさせるが、このような温度範囲では反応溶液中
に浮遊する鋳型ＤＮＡやプライマーが熱ゆらぎの影響を
受けるため、それぞれが接近しても、互いにアニールす
ることが困難となる。そこで、アニーリング反応時の反
応溶液の温度を１０〜４０℃程度の低温とし、熱ゆらぎ
の影響を少なくする。
なわせることが好ましい。つまり、通常のＰＣＲでは、
５０〜６０℃の反応溶液中で鋳型ＤＮＡとプライマーを
アニールさせるが、このような温度範囲では反応溶液中
に浮遊する鋳型ＤＮＡやプライマーが熱ゆらぎの影響を
受けるため、それぞれが接近しても、互いにアニールす
ることが困難となる。そこで、アニーリング反応時の反
応溶液の温度を１０〜４０℃程度の低温とし、熱ゆらぎ
の影響を少なくする。
【００１４】さらに、この発明の方法では、鋳型ＤＮＡ
とプライマーとのアニーリング効率を増加するため、た
とえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、あるいは
グルコース、スクロース等の多糖類のような両親媒性高
分子を反応溶液中に添加してもよい。つまり、これらの
両親媒性高分子は、反応溶液の粘性を高めて、浮遊する
鋳型ＤＮＡやプライマーのブラウン運動を適度に抑え、
かつ会合性を高めてアニーリングに適した条件を整え
る。なお、これらの両親媒性高分子は、ＤＮＡ分子に対
しては化学的作用を持たず、またＰＣＲにおける変性や
伸長のステップにも影響を及ぼすことはない。
とプライマーとのアニーリング効率を増加するため、た
とえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、あるいは
グルコース、スクロース等の多糖類のような両親媒性高
分子を反応溶液中に添加してもよい。つまり、これらの
両親媒性高分子は、反応溶液の粘性を高めて、浮遊する
鋳型ＤＮＡやプライマーのブラウン運動を適度に抑え、
かつ会合性を高めてアニーリングに適した条件を整え
る。なお、これらの両親媒性高分子は、ＤＮＡ分子に対
しては化学的作用を持たず、またＰＣＲにおける変性や
伸長のステップにも影響を及ぼすことはない。
【００１５】これらの、非特異的ＰＣＲにおけるアニー
リング効率を高めるための手段は、たとえば増幅の対象
となる鋳型ＤＮＡおよび／またはプライマーとして用い
るオリゴヌクレオチドの分子量や添加量等に応じて、適
宜に単独で、あるいは各々を組み合わせて採用すること
ができる。次に、上記の非特異的ＰＣＲによって合成し
た種々のＤＮＡ配列の各々を、別の条件のＰＣＲ（以
下、特異的ＰＣＲと記載することがある）によって、そ
の配列を変えることなく増幅する。この場合に、増幅の
対象となるＤＮＡ配列は前記の通り、いずれも両端にプ
ライマー配列またはその相補配列を共通して有するた
め、前段の非特異的ＰＣＲで用いたオリゴヌクレオチド
をプライマーとして使用する。なお、この特異的ＰＣＲ
は、プライマーが単一種であり、鋳型（ＤＮＡ配列）が
複数種であることを除けば、通常行なわれるＰＣＲとほ
ぼ同一の原理により鋳型ＤＮＡをそのサイクル数に応じ
て増幅する。また、変性、アニーリング、伸長の各条件
も、通常のＰＣＲと同様とすることができ、あるいは各
々の条件を若干変更して多段階で行なうこともできる。
リング効率を高めるための手段は、たとえば増幅の対象
となる鋳型ＤＮＡおよび／またはプライマーとして用い
るオリゴヌクレオチドの分子量や添加量等に応じて、適
宜に単独で、あるいは各々を組み合わせて採用すること
ができる。次に、上記の非特異的ＰＣＲによって合成し
た種々のＤＮＡ配列の各々を、別の条件のＰＣＲ（以
下、特異的ＰＣＲと記載することがある）によって、そ
の配列を変えることなく増幅する。この場合に、増幅の
対象となるＤＮＡ配列は前記の通り、いずれも両端にプ
ライマー配列またはその相補配列を共通して有するた
め、前段の非特異的ＰＣＲで用いたオリゴヌクレオチド
をプライマーとして使用する。なお、この特異的ＰＣＲ
は、プライマーが単一種であり、鋳型（ＤＮＡ配列）が
複数種であることを除けば、通常行なわれるＰＣＲとほ
ぼ同一の原理により鋳型ＤＮＡをそのサイクル数に応じ
て増幅する。また、変性、アニーリング、伸長の各条件
も、通常のＰＣＲと同様とすることができ、あるいは各
々の条件を若干変更して多段階で行なうこともできる。
【００１６】このようにして増幅した種々のＤＮＡ配列
は、各々、鋳型ＤＮＡの任意の配列領域を含み、かつ各
種の遺伝子操作に必要な数量からなるため、たとえば遺
伝子スクリーニングのためのプローブとして用いること
ができ、あるいは、ベクターにクローニングして遺伝子
ライブラリーとすることもできる。次に実施例を示して
この発明の遺伝子増幅方法を具体的に説明するが、言う
までもなく、この発明は以下の例に限定されるものでは
ない。
は、各々、鋳型ＤＮＡの任意の配列領域を含み、かつ各
種の遺伝子操作に必要な数量からなるため、たとえば遺
伝子スクリーニングのためのプローブとして用いること
ができ、あるいは、ベクターにクローニングして遺伝子
ライブラリーとすることもできる。次に実施例を示して
この発明の遺伝子増幅方法を具体的に説明するが、言う
までもなく、この発明は以下の例に限定されるものでは
ない。
【００１７】なお、以下の実施例では、特異的ＰＣＲを
条件を変えて２段階で行なったため、非特異的ＰＣＲを
1st ＰＣＲ、２種類の特異的ＰＣＲを各々、2nd ＰＣＲ
および3rd ＰＣＲと記載する。
条件を変えて２段階で行なったため、非特異的ＰＣＲを
1st ＰＣＲ、２種類の特異的ＰＣＲを各々、2nd ＰＣＲ
および3rd ＰＣＲと記載する。
【００１８】
【実施例】実施例１ （染色体ＤＮＡの増幅）分裂中期の第４染色体５０〜１
００％断片の２片から回収した染色体ＤＮＡをこの発明
の方法を用いて合成、増幅した。
００％断片の２片から回収した染色体ＤＮＡをこの発明
の方法を用いて合成、増幅した。
【００１９】まず、1st ＰＣＲとして、染色体ＤＮＡ断
片を含有する１μｌのピックアップ溶液（組成は表１と
同じ）を充填したチューブに、1st ＰＣＲ溶液２μｌを
添加し、ＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキンエルマ
ー・シータス社製）を用いて変性（９０℃，５min ）、
アニーリング（２２℃，１２０min ）、伸長（５０℃，
２０min ）のサイクルを６回繰り返した。またその際
に、各サイクルのアニーリングから伸長までは、温度を
２２℃から５０℃まで２０分間かけて徐々に上昇させ
た。なお、この1st ＰＣＲに用いた反応溶液組成は、表
１に示したとおりである。
片を含有する１μｌのピックアップ溶液（組成は表１と
同じ）を充填したチューブに、1st ＰＣＲ溶液２μｌを
添加し、ＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキンエルマ
ー・シータス社製）を用いて変性（９０℃，５min ）、
アニーリング（２２℃，１２０min ）、伸長（５０℃，
２０min ）のサイクルを６回繰り返した。またその際
に、各サイクルのアニーリングから伸長までは、温度を
２２℃から５０℃まで２０分間かけて徐々に上昇させ
た。なお、この1st ＰＣＲに用いた反応溶液組成は、表
１に示したとおりである。
【００２０】次に、この1st ＰＣＲ終了後、その反応産
物（３μｌ）に、６μｌの2nd ＰＣＲ溶液（組成は表１
に同じ）を添加し、全量を９μｌとして、変性（９２
℃，1.5 min ）、アニーリング（５０℃，１min ）、伸
長（７２℃，２min ）のサイクルを１１回繰り返す2nd
ＰＣＲを行なった。ただし、１回目のサイクルのみ、変
性を９２℃で５分間行なった。
物（３μｌ）に、６μｌの2nd ＰＣＲ溶液（組成は表１
に同じ）を添加し、全量を９μｌとして、変性（９２
℃，1.5 min ）、アニーリング（５０℃，１min ）、伸
長（７２℃，２min ）のサイクルを１１回繰り返す2nd
ＰＣＲを行なった。ただし、１回目のサイクルのみ、変
性を９２℃で５分間行なった。
【００２１】最後に、3rd ＰＣＲとして、2nd ＰＣＲ産
物（９μｌ）に５１μｌの3rd ＰＣＲ溶液を添加し、全
量を６０μｌとして、変性（９２℃，1.5 min ）、アニ
ーリング（５５℃，１min ）、伸長（７２℃，２min ）
のサイクルを３０回繰り返した。なお、この3rd ＰＣＲ
溶液の組成は、表１に示したとおりである。
物（９μｌ）に５１μｌの3rd ＰＣＲ溶液を添加し、全
量を６０μｌとして、変性（９２℃，1.5 min ）、アニ
ーリング（５５℃，１min ）、伸長（７２℃，２min ）
のサイクルを３０回繰り返した。なお、この3rd ＰＣＲ
溶液の組成は、表１に示したとおりである。
【００２２】
【表１】
【００２３】このようにして、３段階のＰＣＲによって
増幅した染色体ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ鎖の集合を、
アガロース電気泳動法、および全長ヒトゲノムＤＮＡを
プローグとして用いたサザンブロット法により分析し
た。なお、この分析のための比較例として、ヒトゲノム
ＤＮＡのＲsa I 断片１pgおよび１０fg（positive cont
rol）と、レーザー照射により完全昇華した分裂中期染
色体ＤＮＡおよび鋳型なし（negative control）につい
ても上記と同様の方法により増幅を行なった。
増幅した染色体ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ鎖の集合を、
アガロース電気泳動法、および全長ヒトゲノムＤＮＡを
プローグとして用いたサザンブロット法により分析し
た。なお、この分析のための比較例として、ヒトゲノム
ＤＮＡのＲsa I 断片１pgおよび１０fg（positive cont
rol）と、レーザー照射により完全昇華した分裂中期染
色体ＤＮＡおよび鋳型なし（negative control）につい
ても上記と同様の方法により増幅を行なった。
【００２４】結果は図１のアガロース電気泳動図（Ａ）
およびサザンブロット図（Ｂ）に示した通りである。な
お、この図１（Ａ）（Ｂ）において、１は分裂中期の第
４染色体５０〜１００％断片由来のＤＮＡ、２は完全昇
華した分裂中期染色体ＤＮＡ、３および４はヒトゲノム
ＤＮＡのＲsa I 断片の、各々、１pgおよび１０fg、５
は鋳型ＤＮＡを添加しない場合のそれぞれの増幅状態を
示したものである。また、分子量マーカーであるλ／Ｐ
st I は（Ａ）−６に示した。
およびサザンブロット図（Ｂ）に示した通りである。な
お、この図１（Ａ）（Ｂ）において、１は分裂中期の第
４染色体５０〜１００％断片由来のＤＮＡ、２は完全昇
華した分裂中期染色体ＤＮＡ、３および４はヒトゲノム
ＤＮＡのＲsa I 断片の、各々、１pgおよび１０fg、５
は鋳型ＤＮＡを添加しない場合のそれぞれの増幅状態を
示したものである。また、分子量マーカーであるλ／Ｐ
st I は（Ａ）−６に示した。
【００２５】この図１から明らかな様に、この発明の方
法は、染色体特定領域から切り出した配列情報の得られ
ていないＤＮＡ断片（chromosome４ｐ５０〜１００％）
を、ヒトゲノムＤＮＡのＲsa I 断片同様に、効率よく
増幅した。なお両者の増幅産物の平均サイズは、ヒトゲ
ノムＤＮＡ断片が約５００bpに対し、染色体ＤＮＡ断片
は約３００〜４００bpと小さいが、これは染色体調製時
の機械的または化学的ダメージによるものであると推察
される。また、昇華させた染色体（all burneddown met
aphase ）および鋳型なし（no template ）を増幅させ
た場合にも、かすかなバンドが得られたが、これらは、
たとえば染色体に対する昇華処理（レーザー照射）が不
十分であったため、あるいは操作過程での何らかの汚染
等に帰因すると思われるが、いずれにしても正常な鋳型
ＤＮＡ存在下での増幅効率に比べれば、その違いは明ら
かである。実施例２ （ＤＮＡライブラリーの構築およびそのインサートの確
認）実施例１で得た染色体ＤＮＡのＰＣＲ産物を、各
々、λファージベクターにクローニングし、ライブラリ
ーを作成した。
法は、染色体特定領域から切り出した配列情報の得られ
ていないＤＮＡ断片（chromosome４ｐ５０〜１００％）
を、ヒトゲノムＤＮＡのＲsa I 断片同様に、効率よく
増幅した。なお両者の増幅産物の平均サイズは、ヒトゲ
ノムＤＮＡ断片が約５００bpに対し、染色体ＤＮＡ断片
は約３００〜４００bpと小さいが、これは染色体調製時
の機械的または化学的ダメージによるものであると推察
される。また、昇華させた染色体（all burneddown met
aphase ）および鋳型なし（no template ）を増幅させ
た場合にも、かすかなバンドが得られたが、これらは、
たとえば染色体に対する昇華処理（レーザー照射）が不
十分であったため、あるいは操作過程での何らかの汚染
等に帰因すると思われるが、いずれにしても正常な鋳型
ＤＮＡ存在下での増幅効率に比べれば、その違いは明ら
かである。実施例２ （ＤＮＡライブラリーの構築およびそのインサートの確
認）実施例１で得た染色体ＤＮＡのＰＣＲ産物を、各
々、λファージベクターにクローニングし、ライブラリ
ーを作成した。
【００２６】まず、実施例１で得た3rd ＰＣＲ溶液の1/
2 量から、フェノール／クロロフォルムおよびクロロフ
ォルム／イソアミルアルコールによる抽出、およびエタ
ノール沈澱によってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをＥco
Ｒ I で処理して両端にクローニング部位を形成した。
微小ＤＮＡ断片を限外濾過により除去した後、増幅した
ＤＮＡ（５０〜１００ng）の画分を、予めフォスファタ
ーゼ処理したλファージgt１１のＥcoＲ I 部位に挿入
連結し、これをin vitroパッケージングして大腸菌Ｙ１
０９０ｒ−細胞に感染させた。その結果、５×１０6 個
のクローンが得られた。
2 量から、フェノール／クロロフォルムおよびクロロフ
ォルム／イソアミルアルコールによる抽出、およびエタ
ノール沈澱によってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをＥco
Ｒ I で処理して両端にクローニング部位を形成した。
微小ＤＮＡ断片を限外濾過により除去した後、増幅した
ＤＮＡ（５０〜１００ng）の画分を、予めフォスファタ
ーゼ処理したλファージgt１１のＥcoＲ I 部位に挿入
連結し、これをin vitroパッケージングして大腸菌Ｙ１
０９０ｒ−細胞に感染させた。その結果、５×１０6 個
のクローンが得られた。
【００２７】次にこのλファージライブラリーから、６
８個のクローンを無作為に選び、そのインサートを確認
した。すなわち、各クローンを鋳型ＤＮＡとし、λファ
ージのＥcoＲ I 部およびこれに隣接する配列と同一配
列のプライマーを用いて、通常のＰＣＲによりインサー
トを増幅し、そのサイズをアガロース電気泳動法により
分析した。
８個のクローンを無作為に選び、そのインサートを確認
した。すなわち、各クローンを鋳型ＤＮＡとし、λファ
ージのＥcoＲ I 部およびこれに隣接する配列と同一配
列のプライマーを用いて、通常のＰＣＲによりインサー
トを増幅し、そのサイズをアガロース電気泳動法により
分析した。
【００２８】図２は、分析した６８種類のインサートの
うち、２０について、各々のアガロース電気泳動図を示
したものである。その結果、分析した６８個のクローン
のインサートサイズは、約１００〜１５００bpに分布し
ており、これは実施例１で増幅した染色体ＤＮＡのサイ
ズ分布とよく一致した（図１参照）。また、これらのイ
ンサートをヒトゲノムＤＮＡ（ＥcoＲ I またはＨｉｎ
ｄ III 断片）とハイブリダイズさせたところ、クロー
ンのうち４０〜６０％はヒトユニーク配列、１０％前後
が高頻度反復配列、２０〜３０％が低・中頻度反復配列
であることが確認された。実施例３ （各ＰＣＲにおけるプライマーおよび／または両親媒性
高分子の最適濃度範囲を試験）ヒトゲノムＤＮＡのＲsa
I 断片１０fgを、実施例１記載と同様の方法により増
幅した。
うち、２０について、各々のアガロース電気泳動図を示
したものである。その結果、分析した６８個のクローン
のインサートサイズは、約１００〜１５００bpに分布し
ており、これは実施例１で増幅した染色体ＤＮＡのサイ
ズ分布とよく一致した（図１参照）。また、これらのイ
ンサートをヒトゲノムＤＮＡ（ＥcoＲ I またはＨｉｎ
ｄ III 断片）とハイブリダイズさせたところ、クロー
ンのうち４０〜６０％はヒトユニーク配列、１０％前後
が高頻度反復配列、２０〜３０％が低・中頻度反復配列
であることが確認された。実施例３ （各ＰＣＲにおけるプライマーおよび／または両親媒性
高分子の最適濃度範囲を試験）ヒトゲノムＤＮＡのＲsa
I 断片１０fgを、実施例１記載と同様の方法により増
幅した。
【００２９】1st ＰＣＲは、その反応溶液中のＰＥＧ濃
度を0 、8 、または１２％、プライマー濃度を0.2 、0.
5 、または1.0 μＭのいずれかに調製して行なった。６
回のＰＣＲシリーズ終了後、各反応溶液の1/6 量を1.5
％アガロースゲルに電気泳動し、エチヂウムブロマイド
で染色してそれぞれの反応効率を分析した。この試験の
結果は、図３のアガロース電気泳動図（1st ＰＣＲ）に
示した通りである。なお、この図３（1st ＰＣＲ）にお
いて、１は分子量マーカーとして用いたλファージＤＮ
ＡのＰst I 断片（以下、λ／Ｐst I と記載する）の電
気泳動図であり、２〜４はプライマー濃度を1.0 μＭと
し、ＰＥＧ濃度を各々０，８，１２％とした場合の、ま
た５〜７はＰＥＧ濃度を１２％とし、プライマー濃度を
各々0.2 、0.5 、1.0 μＭとした場合のＤＮＡ断片（１
０fg) の増幅状態を示したものである。この図３（1st
ＰＣＲ）から明らかなように、プライマー濃度を1.0 μ
Ｍとした場合にはＰＥＧ濃度が高いほどＤＮＡ鎖の合成
効率は増加し（２〜４）、また、ＰＥＧ濃度を１２％と
した場合にはプライマー濃度が高いほど、合成効率は増
加した（５〜７）。ただし、図示していないが、ＰＥＧ
濃度が１５％以上、またはプライマー濃度が３μＭ以上
では、鋳型ＤＮＡが存在しない場合にもＤＮＡ鎖の合成
が観察された。このため、この発明の非特異的ＰＣＲに
おいては、プライマーとしてＢＶＥ２２ccを用い、両親
媒性高分子としてＰＥＧを用いた場合には、その反応溶
液中のＰＥＧ濃度を１０〜１５％の範囲内とし、プライ
マー濃度を1.0 〜1.5 μＭの範囲内程度とすることが好
ましいことが判明した。
度を0 、8 、または１２％、プライマー濃度を0.2 、0.
5 、または1.0 μＭのいずれかに調製して行なった。６
回のＰＣＲシリーズ終了後、各反応溶液の1/6 量を1.5
％アガロースゲルに電気泳動し、エチヂウムブロマイド
で染色してそれぞれの反応効率を分析した。この試験の
結果は、図３のアガロース電気泳動図（1st ＰＣＲ）に
示した通りである。なお、この図３（1st ＰＣＲ）にお
いて、１は分子量マーカーとして用いたλファージＤＮ
ＡのＰst I 断片（以下、λ／Ｐst I と記載する）の電
気泳動図であり、２〜４はプライマー濃度を1.0 μＭと
し、ＰＥＧ濃度を各々０，８，１２％とした場合の、ま
た５〜７はＰＥＧ濃度を１２％とし、プライマー濃度を
各々0.2 、0.5 、1.0 μＭとした場合のＤＮＡ断片（１
０fg) の増幅状態を示したものである。この図３（1st
ＰＣＲ）から明らかなように、プライマー濃度を1.0 μ
Ｍとした場合にはＰＥＧ濃度が高いほどＤＮＡ鎖の合成
効率は増加し（２〜４）、また、ＰＥＧ濃度を１２％と
した場合にはプライマー濃度が高いほど、合成効率は増
加した（５〜７）。ただし、図示していないが、ＰＥＧ
濃度が１５％以上、またはプライマー濃度が３μＭ以上
では、鋳型ＤＮＡが存在しない場合にもＤＮＡ鎖の合成
が観察された。このため、この発明の非特異的ＰＣＲに
おいては、プライマーとしてＢＶＥ２２ccを用い、両親
媒性高分子としてＰＥＧを用いた場合には、その反応溶
液中のＰＥＧ濃度を１０〜１５％の範囲内とし、プライ
マー濃度を1.0 〜1.5 μＭの範囲内程度とすることが好
ましいことが判明した。
【００３０】次に、上記1st ＰＣＲで用いた各々の反応
溶液のうち、ＰＥＧ１２％、プライマー1.0 μＭを含有
する溶液を、実施例１記載の方法と同一の2nd ＰＣＲに
より処理した後、3rd ＰＣＲに供した。3rd ＰＣＲは、
その反応溶液中のプライマー濃度を3.0 、4.0 、または
6.0 μＭのいずれかに調整して行なった。その結果は、
図３（3rd ＰＣＲ）に示した通りである。
溶液のうち、ＰＥＧ１２％、プライマー1.0 μＭを含有
する溶液を、実施例１記載の方法と同一の2nd ＰＣＲに
より処理した後、3rd ＰＣＲに供した。3rd ＰＣＲは、
その反応溶液中のプライマー濃度を3.0 、4.0 、または
6.0 μＭのいずれかに調整して行なった。その結果は、
図３（3rd ＰＣＲ）に示した通りである。
【００３１】なお、この図３（3rd ＰＣＲ）において、
８〜１０は、各々、プライマー濃度を3.0 、4.0 、6.0
μＭとした場合の増幅状態を示したものである。この図
３から明らかなように試験した３種類のプライマー濃度
のうち、６μＭプライマーの増幅効率が最も良好であっ
た。しかしながら、この濃度では、他のプライマー濃度
（3.0 または4.0 μＭ）、あるいは1st ＰＣＲ（ＰＥＧ
１２％、プライマー1.0 μＭ）で合成したＤＮＡ鎖より
も平均サイズの小さいＤＮＡ鎖が増幅された。このた
め、特異的ＰＣＲは、その最終段階において反応溶液中
のプライマー濃度を4.0 〜5.0 μＭ程度とするのが好ま
しいことが判明した。
８〜１０は、各々、プライマー濃度を3.0 、4.0 、6.0
μＭとした場合の増幅状態を示したものである。この図
３から明らかなように試験した３種類のプライマー濃度
のうち、６μＭプライマーの増幅効率が最も良好であっ
た。しかしながら、この濃度では、他のプライマー濃度
（3.0 または4.0 μＭ）、あるいは1st ＰＣＲ（ＰＥＧ
１２％、プライマー1.0 μＭ）で合成したＤＮＡ鎖より
も平均サイズの小さいＤＮＡ鎖が増幅された。このた
め、特異的ＰＣＲは、その最終段階において反応溶液中
のプライマー濃度を4.0 〜5.0 μＭ程度とするのが好ま
しいことが判明した。
【００３２】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明の方
法により、微量で、しかも塩基配列情報の得られていな
いＤＮＡ断片を、簡単な操作で効率よく増幅することが
可能となる。このため、たとえば、染色体特定領域のＤ
ＮＡライブラリーの構築や、その物理的地図作製のため
のプローブの開発等が極めて容易となる。
法により、微量で、しかも塩基配列情報の得られていな
いＤＮＡ断片を、簡単な操作で効率よく増幅することが
可能となる。このため、たとえば、染色体特定領域のＤ
ＮＡライブラリーの構築や、その物理的地図作製のため
のプローブの開発等が極めて容易となる。
【図１】各々、この発明の方法により増幅したＤＮＡ断
片のアガロース電気泳動図（Ａ）およびヒトゲノム全Ｄ
ＮＡをプローブに用いたサザンブロット図（Ｂ）であ
る。
片のアガロース電気泳動図（Ａ）およびヒトゲノム全Ｄ
ＮＡをプローブに用いたサザンブロット図（Ｂ）であ
る。
【図２】この発明の方法により増幅したＤＮＡ断片を導
入したλファージクローンのインサートサイズを例示し
たアガロース電気泳動図である。
入したλファージクローンのインサートサイズを例示し
たアガロース電気泳動図である。
【図３】この発明の方法により試験したＤＮＡ断片のア
ガロース電気泳動図である。
ガロース電気泳動図である。
Claims (9)
- 【請求項１】 塩基配列情報のないＤＮＡ断片をＰＣＲ
増幅するに際して、反応溶液中で熱変性させた鋳型ＤＮ
Ａの任意の領域に単一種のオリゴヌクレオチドをアニー
ルさせ、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして鋳
型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成、伸長させることに
より鋳型ＤＮＡの任意の領域をカバーする種々のＤＮＡ
配列を合成し、次いでこれらのＤＮＡ配列の各々を上記
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅する
ことを特徴とする遺伝子増幅方法。 - 【請求項２】 鋳型ＤＮＡとオリゴヌクレオチドを、反
応溶液中で９０〜１５０分間アニールさせる請求項１の
遺伝子増幅方法。 - 【請求項３】 鋳型ＤＮＡとオリゴヌクレオチドを、１
０〜４０℃の反応溶液中でアニールさせる請求項１の遺
伝子増幅方法。 - 【請求項４】 鋳型ＤＮＡとオリゴヌクレオチドを、両
親媒性高分子を含有する反応溶液中でアニールさせる請
求項１の遺伝子増幅方法。 - 【請求項５】 鋳型ＤＮＡ断片とオリゴヌクレオチド
を、両親媒性高分子を含有する１０〜４０℃の反応溶液
中で９０〜１５０分間アニールさせる請求項１の遺伝子
増幅方法。 - 【請求項６】 両親媒性高分子が、分子量１，０００〜
１０，０００のポリエチレングリコールである請求項４
または５の遺伝子増幅方法。 - 【請求項７】 オリゴヌクレオチドが、複数の制限酵素
認識配列を有し、かつ３′−末端側に少なくとも２個の
塩基を有する単一の２０−３０ヌクレオチドである請求
項１の遺伝子増幅方法。 - 【請求項８】 オリゴヌクレオチドが、下記の塩基配列
を有する請求項７の遺伝子増幅方法。 ５′−ＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＣ
−ＯＨ３′ - 【請求項９】 請求項１の方法により増幅したＤＮＡ配
列を保持するクローン群からなる遺伝子ライブラリー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23226292A JPH07255482A (ja) | 1991-08-30 | 1992-08-31 | 遺伝子増幅方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22057091 | 1991-08-30 | ||
| JP3-220570 | 1991-08-30 | ||
| JP23226292A JPH07255482A (ja) | 1991-08-30 | 1992-08-31 | 遺伝子増幅方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07255482A true JPH07255482A (ja) | 1995-10-09 |
Family
ID=26523783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23226292A Pending JPH07255482A (ja) | 1991-08-30 | 1992-08-31 | 遺伝子増幅方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07255482A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6274306B1 (en) | 1999-03-17 | 2001-08-14 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Carrier for extracting bacteria, method of extracting microorganism and method of assaying microorganisms |
| US6287769B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-09-11 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Method of amplifying DNA fragment, apparatus for amplifying DNA fragment, method of assaying microorganisms, method of analyzing microorganisms and method of assaying contaminant |
| JP2023524067A (ja) * | 2020-05-01 | 2023-06-08 | コーネル ユニバーシティー | ヌクレアーゼ、ライゲーション、脱アミノ化、ｄｎａ修復、およびポリメラーゼ反応と、キャリーオーバー防止との組み合わせを用いた、核酸配列、変異、コピー数、またはメチル化変化の特定および相対的定量化のための方法およびマーカー |
-
1992
- 1992-08-31 JP JP23226292A patent/JPH07255482A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6287769B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-09-11 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Method of amplifying DNA fragment, apparatus for amplifying DNA fragment, method of assaying microorganisms, method of analyzing microorganisms and method of assaying contaminant |
| US6274306B1 (en) | 1999-03-17 | 2001-08-14 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Carrier for extracting bacteria, method of extracting microorganism and method of assaying microorganisms |
| JP2023524067A (ja) * | 2020-05-01 | 2023-06-08 | コーネル ユニバーシティー | ヌクレアーゼ、ライゲーション、脱アミノ化、ｄｎａ修復、およびポリメラーゼ反応と、キャリーオーバー防止との組み合わせを用いた、核酸配列、変異、コピー数、またはメチル化変化の特定および相対的定量化のための方法およびマーカー |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0543484B1 (en) | A method of DNA amplification | |
| JP3010738B2 (ja) | 核酸の交雑、増幅方法 | |
| Zoller et al. | [32] Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors | |
| CN105121664B (zh) | 混合物及其相关组合物中的核酸的测序方法 | |
| JP6808617B2 (ja) | 連続性を維持した転位 | |
| EP3532635B1 (en) | Barcoded circular library construction for identification of chimeric products | |
| US20100120097A1 (en) | Methods and compositions for nucleic acid sequencing | |
| EP1138764A2 (en) | Two-step reverse transcription | |
| US6528256B1 (en) | Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cDNA and genomic DNA | |
| EP3346006A1 (en) | Method for amplifying dna | |
| Silflow et al. | Sequence complexity of polyadenylated ribonucleic acid from soybean suspension culture cells | |
| CN115210370A (zh) | 使用重编程tracrRNA的RNA检测和转录依赖性编辑 | |
| EP3877544B1 (en) | Liquid sample workflow for nanopore sequencing | |
| AU782529C (en) | Sequence based screening | |
| CA2567735A1 (en) | Rapid production of double-stranded target dna molecules | |
| JPH025863A (ja) | 相補的鎖からなる関連する対象および参照高分子の処理方法 | |
| US20030013671A1 (en) | Genomic DNA library | |
| EP0812911A2 (en) | A method of forming a macromolecular microgene polymer | |
| JP3416981B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| CA3150283A1 (en) | Selective enrichment | |
| KR102696880B1 (ko) | 세포의 유전체에서 표적 핵산을 변형시키는 방법 | |
| WO1992013104A1 (en) | 5' and 3' polymerase chain reaction walking from known dna sequences | |
| US20040029155A1 (en) | Method for identifying a biomolecule | |
| US20020031771A1 (en) | Sequence based screening | |
| JP2022548000A (ja) | シーケンシングライブラリーの多重製造方法 |