JP2000270879A

JP2000270879A - 核酸固定化ゲル保持繊維並びに該繊維配列体及びその薄片

Info

Publication number: JP2000270879A
Application number: JP11084101A
Authority: JP
Inventors: Fujio To; 不二夫湯; Fumiaki Watanabe; 文昭渡辺; Wataru Fujii; 渉藤井; Takashi Akita; 隆秋田; Kei Murase; 圭村瀬; Chiho Ito; 千穂伊藤
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2000-10-03

Abstract

(57)【要約】【解決手段】核酸固定化ゲル保持繊維並びに核酸固定
化ゲル保持繊維配列体及びその薄片。【効果】核酸が任意に高密度且つ正確に配列された核
酸固定化ゲル保持繊維配列体の繊維断面を有する薄片を
再現性よく効率的に得ることができる。この薄片を用い
て、検体中の核酸の種類および量を調べることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸が固定化され
た高分子材料に関する。詳しくは、繊維の表面に核酸固
定化ゲルが保持された核酸固定化ゲル保持繊維並びに核
酸固定化ゲル保持繊維配列体及びその薄片に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種生物におけるゲノムプロジェ
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ
る。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各
種の方法で調べることができるが、その有力な方法の一
つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝
子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリ
ダイゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸
間ハイブリダイゼーション反応や各種のPCR反応を利用
した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその
生体機能発現との関係を調べることができる。しかしな
がら、これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限が
ある。したがって、今日のゲノムプロジェクトを通して
明らかにされつつあるような、一個体レベルという極め
て多数の遺伝子から構成される複雑な反応系全体からみ
ると、上記方法により遺伝子の総合的・系統的解析を行
うことは困難である。最近になって、多数遺伝子の一括
発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡ
チップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開
発され、注目を集めている。

【０００３】これらの方法は、いずれも核酸：核酸間ハ
イブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法で
ある点で原理的には従来の方法と同じであるが、マイク
ロアレイ又はチップと呼ばれる平面基盤片上に、多数の
ＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられ
ている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体
的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子
等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基盤片上でハ
イブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色
素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方
法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺
伝子量を迅速に推定できる。即ち、この新しい方法の本
質は、基本的には反応試料の微量化と、その反応試料を
再現性よく多量・迅速・系統的に分析、定量しうる形に
配列・整列する技術との統合であると理解される。

【０００４】核酸を基盤上に固定化するための技術とし
ては、上記ノーザン法同様、ナイロンシート等の上に高
密度に固定化する方法の他、更に密度を高めるため、ガ
ラス等の基盤の上にポリリジン等をコーティングして固
定化する方法、あるいはシリコン等の基盤の上に短鎖の
核酸を直接固相合成していく方法などが開発されてい
る。

【０００５】しかし、例えば、ガラス等の固体表面を化
学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸をスポッティン
グ固定化する方法[Science 270, 467-470(1995)]は、ス
ポット密度でシート法より優れるものの、スポット密度
及びスポット当たり固定できる核酸量がシリコン基盤上
における直接合成法(U.S.Patent 5,445,934、U.S.Paten
t 5,774,305）と比較して少量であり、再現が困難であ
る点が指摘されている。他方、シリコン等の基盤の上に
フォトリソグラフィー技術を用い、多種の短鎖核酸をそ
の場で規則正しく固相合成していく方法に関しては、単
位面積当たりに合成しうる核酸種数（スポット密度）及
びスポット当たりの固定化量（合成量）、並びに再現性
等において、スポッティング法より優れるとされるもの
の、固定化しうる化合物種は、フォトリソグラフィーに
より制御可能な比較的短鎖の核酸に限られる。さらに、
高価な製造装置と多段の製造プロセスにより、チップ当
たりの大きなコストダウンが困難とされる。その他、微
小な担体上に核酸を固相合成しライブラリー化する手法
として、微小なビーズを利用する方法が知られている。
この方法は、チップ法より長鎖の核酸を多種・安価に合
成することが可能であり、またｃＤＮＡ等より長鎖の核
酸も固定可能と考えられる。しかしながら、チップ法と
異なり、指定の化合物を指定の配列基準で再現性よく整
列させたものを作製することは困難である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような状況下、鎖
長によらず核酸を所定の濃度に固定化でき、測定可能な
形に高密度に再現よく配列化可能で、安価な大量製造に
適応しうる新たな体系的方法論の確立は、今後重要性を
増すと考えられる遺伝子解析に強く求められるものであ
り、本発明が解決しようとする課題である。

【０００７】具体的には、本発明が解決しようとする課
題は、ナイロンシートやガラス基盤のような二次元担体
上への微量スポッティングや微量分注による核酸配列体
製造法に比べ、核酸固定化量が高く、単位面積あたり配
列される核酸分子種の高密度化が可能で、大量生産によ
り適した配列体、すなわち核酸が固定化された二次元的
（平面的）配列体（固定化核酸二次元配列体という）の
製造法の確立である。また、本発明が解決しようとする
課題はシリコン基盤上へのフォトリソグラフィーと固相
合成との組み合わせによる高密度オリゴ核酸配列体製造
法と比べ、ｃＤＮＡを含む長鎖の核酸にも適応可能で、
製造コストのより低い固定化核酸二次元配列体製造法の
確立である。そこで、本発明は、核酸固定化ゲル保持繊
維並びに核酸固定化ゲル保持繊維配列体及びその薄片を
提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の如
き課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、核酸整列
化プロセスと固定化プロセスとを同一の二次元担体上で
行う従来法の発想を改め、核酸の固定化プロセスを一次
元構造体としての繊維上（１本の繊維上）に独立して行
い、それらの整列化プロセスに各種の繊維賦形技術を導
入することにより三次元構造体としての繊維束を作製
し、得られる繊維束の切片化プロセスを経ることで、固
定化核酸二次元高密度配列体を作製し得ることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
繊維の表面に核酸が固定化されたゲルが保持された核酸
固定化ゲル保持繊維である。

【０００９】さらに、本発明は、前記核酸固定化ゲル保
持繊維の束を含む核酸固定化ゲル保持繊維配列体であ
る。該配列体としては、例えば配列体中の繊維が規則的
に配列されたものが挙げられ、１ｃｍ²あたり１００本
以上の繊維を含むものが挙げられる。また、核酸固定化
ゲルに含まれる核酸の種類としては、各繊維の全部又は
一部において異なるものが挙げられる。さらに、本発明
は、前記核酸固定化ゲル保持繊維配列体の繊維軸と交差
する切断面を有する、前記核酸固定化ゲル保持繊維配列
体の薄片である。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、核酸が固定化されたゲルを保持する繊維（以
下「核酸固定化ゲル保持繊維」ともいう。）である。本
発明において、ゲルに固定化する対象となる核酸として
は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）
が挙げられる。本発明に用いる核酸は、市販のものでも
よく、また、生細胞などから得られた核酸でもよい。

【００１１】生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、
公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの
方法（ Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (19
76)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Faval
oroらの方法（ Favaloro etal., Methods Enzymol.65:
718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核
酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮ
Ａや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化
学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合
成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド
等を用いることもできる。

【００１２】本発明に用いることができるゲルの種類は
特に制限されないが、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ
−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールア
クリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチ
ルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキス
トリン等の単量体の一種類または二種類以上と、メチレ
ンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体を共重
合したゲルを用いることができる。その他本発明に用い
ることができるゲルとして、例えば、アガロース、アル
ギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエ
チレングリコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲ
ルを用いることができる。

【００１３】本発明では、核酸をそのままゲルに固定化
してもよく、また、核酸に化学的修飾を施した誘導体
や、必要に応じて変成させた核酸を固定化してもよい。
核酸のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方
法や、ゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよ
く、核酸を一旦高分子体や無機粒子などの担体に共有結
合あるいは非共有結合により結合させ、その担体をゲル
に固定化してもよい。

【００１４】例えば、核酸の末端基にビニル基を導入し
（ＷＯ98/39351）、アクリルアミド等のゲルの構成成分
と共重合させることができる。共重合においては、単量
体、多官能性単量体及び重合開始剤と共に共重合する方
法、単量体及び重合開始剤と共に共重合したのち、架橋
剤でゲル化する方法などがある。また、アガロースを臭
化シアン法でイミドカルボネート化しておき、末端アミ
ノ化した核酸のアミノ基と結合させてからゲル化するこ
ともできる。この際、核酸固定化したアガロースと他の
ゲル（例えばアクリルアミドゲル等）との混合ゲルにし
てもよい。

【００１５】その他の方法としては、高分子粒子や無機
粒子等の担体に核酸を結合し、該粒子を上述のゲルに包
括固定化する方法が挙げられる。例えば、ビオチン化し
た核酸とアビジン化したアガロースビーズ（シグマ社製
アビジン化アガロース等）を反応させることによっ
て、核酸が固定化されたアガロースビーズを得ることが
できる。核酸固定化アガロースビーズはアクリルアミド
ゲル等に包括固定化することができる。また、ゲルや担
体への結合においては、グルタルアルデヒドや１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド(EDC)等の架橋剤を用いて結合させることもできる。

【００１６】核酸の一般的な化学的修飾としては、アミ
ノ化、ビオチン化、ディゴキシゲニン化等が知られてい
るが[Current Protocols In Molecular Biology, Ed.;
Frederick M. Ausubel et al.(1990)、脱アイソトープ
実験プロトコール(1)ＤＩＧハイブリダイゼーション
（秀潤社）]、本発明ではこれらのいずれの修飾法も採
用することができる。一例として、核酸へのアミノ基導
入に関して説明する。

【００１７】アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本
鎖核酸との結合位置は特に限定されるものではなく、核
酸の５’末端または３’末端のみならず核酸の鎖中（例
えば、リン酸ジエステル結合部位または塩基部位）であ
ってもよい。この一本鎖核酸誘導体は、特公平3-74239
号公報、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等
に記載の方法にしたがって調製することができる。この
方法以外にも、例えば、市販のアミノ基導入用試薬［例
えば、アミノリンクII（商標名）；ＰＥバイオシステム
ズジャパン社、Amino Modifiers（商標名）；クロンテ
ック社］などを用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン酸
にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の
方法（Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983) ）にし
たがって調製することができる。本発明において、核酸
固定化ゲル保持繊維として用いることができる繊維とし
ては、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のご
とき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる。

【００１８】合成繊維の代表例としては、ナイロン６、
ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各
種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテ
レフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエ
ステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリ
ル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポ
リオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の
各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化
ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール
系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエ
チレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオ
キシベンゾエート系の各種繊維などが挙げられる。ま
た、衣料用以外の繊維、例えば、ポリメチルメタクリレ
ートやポリスチレンなどの透明非晶質高分子を主材料と
した光学繊維なども用いることができる。

【００１９】半合成繊維の代表例としては、ジアセテー
ト、トリアセテート、キチン、キトサン等を原料とした
セルロース系誘導体系各種繊維、プロミックスと呼称さ
れる蛋白質系の各種繊維などが挙げられる。再生繊維の
代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、あ
るいは有機溶剤法により得られるセルロース系の各種再
生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）などが
挙げられる。無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、
炭素繊維などが挙げられる。

【００２０】天然繊維の代表例としては、綿、亜麻、苧
麻、黄麻などの植物繊維、羊毛、絹などの動物繊維、石
綿などの鉱物繊維などが挙げられる。本発明に用いる繊
維は、特にその形態が規定されるものではない。また、
モノフィラメントであってもよく、マルチフィラメント
であってもよい。さらに、短繊維を紡績した紡績糸でも
よい。尚、マルチフィラメントや紡績糸の繊維を用いる
場合には、核酸固定化ゲルの保持に単繊維間の空隙等を
利用することも可能である。本発明に用いる繊維は、無
処理の状態でそのまま用いてもよいが、必要に応じて、
反応性官能基を導入した繊維であってもよく、また、プ
ラズマ処理やγ線、電子線などの放射線処理を施した繊
維であってもよい。

【００２１】核酸固定化ゲル保持繊維を作製する方法
は、特に制限されるものではないが、繊維とゲルとの間
における各種化学的又は物理的な相互作用、すなわち繊
維が有している官能基と、ゲルを構成する成分との間の
化学的又は物理的な相互作用を利用することができる。
例えば単量体、多官能性単量体、開始剤及び核酸または
末端にビニル基を有する核酸を混合した液に繊維を浸し
重合、ゲル化させる方法が挙げられる。また、単量体、
多官能性単量体、開始剤及び高分子粒子や無機粒子等の
担体に核酸を結合したものを混合した液に繊維を浸し重
合、ゲル化させる方法が挙げられる。

【００２２】その他に、単量体、開始剤及び末端にビニ
ル基を有する核酸を共重合したものと架橋剤を混合した
液に繊維を浸しゲル化する方法、単量体を開始剤で重合
したもの、架橋剤および核酸または高分子粒子や無機粒
子等の担体に核酸を結合した粒子を混合した液に繊維を
浸しゲル化する方法、核酸を固定化したアガロース等を
加熱溶解し、繊維を浸し、冷却ゲル化させる方法等が挙
げられる。

【００２３】上述の方法により得られた核酸固定化ゲル
保持繊維は、ゲルが破壊されない限りにおいて適当な処
理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ処
理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定化され
た核酸を変成させる。あるいは、細胞、菌体などの生材
料から得られた核酸を使用する場合は、不要な細胞成分
などを除去する。そして、処理後の核酸固定化ゲル保持
繊維を核酸を検出する材料として用いることができる。
なお、これらの処理は別々に実施してもよく、同時に実
施してもよい。また、核酸を含む試料を繊維に保持する
前に適宜実施してもよい。

【００２４】上記の通り調製された核酸固定化ゲル保持
繊維は、本発明の核酸固定化ゲル保持繊維配列体を構成
する基本単位とすることができる。そして、これらの核
酸固定化ゲル保持繊維を集束した後に接着して、核酸固
定化ゲル保持繊維配列体となすことができる。この際、
核酸固定化ゲル保持繊維を規則的に配列し、樹脂接着剤
等で接着することにより、例えば、縦横に核酸固定化ゲ
ル保持繊維が整然と規則的に配列した核酸固定化ゲル保
持繊維配列体を得ることができる。核酸固定化ゲル保持
繊維配列体の形状は特に限定されるものではないが、通
常は、核酸固定化ゲル保持繊維を規則的に配列させるこ
とにより正方形又は長方形に形成される。

【００２５】「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中
に含まれる核酸固定化ゲル保持繊維の本数が一定となる
ように順序よく配列させることをいう。例えば、直径１
ｍｍの核酸固定化ゲル保持繊維を束にして断面が縦１０
ｍｍ、横１０ｍｍの正方形となるように配列させようと
する場合は、その正方形の枠内（１ｃｍ²）における１
辺に含まれる核酸固定化ゲル保持繊維の数を10本とし、
この10本の核酸固定化ゲル保持繊維を1列に束ねて1層の
シートとした後、このシートが10層になるように重ね
る。その結果、縦に10本、横に10本、合計100本の核酸
固定化ゲル保持繊維を配列させることができる。但し、
核酸固定化ゲル保持繊維を規則的に配列させる手法は、
上記のようにシートを重層するものに限定されるもので
はない。

【００２６】この場合に、特定の核酸が固定化された核
酸固定化ゲル保持繊維の位置があらかじめ決められた状
態で配列することが望ましいが、必ずしもそのように配
列させる必要はない。その理由は、配列体を形成した段
階では特定の核酸を固定化した核酸固定化ゲル保持繊維
がどの位置に存在するのかが不明でも、配列体の断面を
切断した後、一旦ハイブリダイゼーション手法等を用い
て断面における核酸の配置位置を決定することにより、
特定の核酸が固定された核酸固定化ゲル保持繊維の位置
を確認することができるためである。従って、この手法
を用いて、一度、薄片内に配置された複数種類の核酸の
位置を決定しておけば、同一配列体から得られる薄片は
すべて同一の位置配置であるので、同一配列体から得ら
れるすべての薄片の核酸の位置配置がわかる。

【００２７】なお、本発明において束にする核酸固定化
ゲル保持繊維の本数は１００本以上、好ましくは１,０
００〜１０,０００,０００本であり、目的に応じて適宜
設定することができる。但し、配列体における核酸固定
化ゲル保持繊維の密度が、１ｃｍ²当たり１００〜１,０
００,０００本となるように調製することが好ましい。
そして、高密度に核酸が固定化された配列体の薄片を得
るべく核酸固定化ゲル保持繊維を配列させるためには、
核酸固定化ゲル保持繊維の太さは細い方が好ましい。本
発明の好ましい実施態様においては、核酸固定化ゲル保
持繊維１本の太さは１ｍｍ以下であることが必要であ
る。モノフィラメントでは、例えば、市販の釣糸の場合
５０−９００μｍの太さの糸である。さらに、最近の紡
糸技術によれば１ｄｔｅｘ（ポリエチレンテレフタレー
トの場合、直径約１４μｍとなる）のモノフィラメント
も製造可能であり、更に細い繊維（極細繊維又は超極細
繊維）の製造も可能である（直径１〜１０μm）。

【００２８】核酸固定化ゲル保持繊維が直径５０μｍの
モノフィラメントの場合、１ｃｍあたり２００本の繊維
を配列させることができるため、１ｃｍ²の正方形内に
配列させることのできる繊維の本数は40,000本である。
したがって、この場合は１ｃｍ²あたり最高40,000種類
の核酸を固定化することができる。一方、マルチフィラ
メントにおいては８３ｄｔｅｘ／３６フィラメントや８
２ｄｔｅｘ／４５フィラメント等をそのまま用いること
もできる。

【００２９】ゲルに固定化されている核酸の種類は、配
列体中の各繊維ごとにそれぞれ異なるものとすることが
可能であり、また、同一の核酸が固定化された繊維から
任意の本数の繊維を選択し、その選択された繊維を束ね
て適宜配列させることも可能である。即ち、本発明によ
れば、固定化された核酸の種類と配列の順序に関して
は、目的に応じて任意に設定することが可能である。

【００３０】本発明においては、上記の核酸固定化ゲル
保持繊維配列体を繊維軸と交差する方向、好ましくは繊
維軸に対して垂直方向に切断することにより、核酸固定
化ゲル保持繊維配列体断面を有する薄片を得ることがで
きる。この際の切断方法としては、例えば、ミクロトー
ムを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が挙げられ
る。薄片の厚みは任意に調整することができるが、通常
１〜５,０００μｍ、好ましくは１０〜２,０００μｍで
ある。

【００３１】得られた核酸固定化ゲル保持繊維配列体断
面を有する薄片には、該配列体を構成する核酸固定化ゲ
ル保持繊維の数に応じた核酸が存在する。薄片の断面積
あたりの核酸の数に関しては、用いる核酸固定化ゲル保
持繊維の外径や配列体作製時の方法等を適宜選択するこ
とにより、薄片断面積１ｃｍ²あたり１００以上、更に
は１０００以上の核酸が固定化された薄片を作製するこ
とも可能である。

【００３２】これら薄片は、固定化された核酸をプロー
ブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーションを
行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する核酸
の検出に用いることができる。本発明で言うプローブと
は、狭義には検出すべき遺伝子の塩基配列に相補的な塩
基配列を有する核酸を指す。即ち、本発明の核酸固定化
ゲル保持繊維配列体断面を有する薄片を検体と反応させ
てハイブリダイゼーションを行い、プローブと相補的な
検体中に存在する核酸とのハイブリッドを形成させ、こ
のハイブリッドを検出することにより、目的とする塩基
配列を有する検体中の核酸を検出することができる。ま
た、本発明で言うプローブとは、広義には検体中に存在
するするタンパク質や低分子化合物等と特異的に結合す
ることができる核酸を指す。従って、これらの薄片の利
用法としては、固定化された核酸（プローブ）とハイブ
リッドを形成する核酸を検出するための利用に留まら
ず、固定化された核酸と特異的に結合するタンパク質や
低分子化合物等の各種試料（例えば生体成分等）を検出
するための利用が挙げられる。

【００３３】固定化された核酸とハイブリッドを形成す
る核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生
体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。
例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等
に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標
識体を作用させ、この標識体を検出することができる。
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、
何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用い
ることができる。

【００３４】

【実施例】本発明を以下の実施例によって更に詳細に説
明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的
範囲が限定されるものではない。参考例１オリゴヌクレオチド及び5'末端にアミノ基またはビオチ
ンを有するオリゴヌクレオチドの調製：以下に示したオ
リゴヌクレオチド（プローブＡ、プローブＢ）を合成し
た。プローブＡ: GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTC（配
列番号１）プローブＢ: GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配列
番号２）

【００３５】オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシ
ステムズ社の自動合成機DNA/RNA synthesizer (model39
4)を用いて行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノ
リンクII（商標名）（アプライドバイオシステム社）を
用いてそれぞれのオリゴヌクレオチドの５′未端にＮＨ
₂（ＣＨ₂）₆−を導入しアミノ化したプローブを、およ
びビオチンアミダイトを用いてビオチン化したプローブ
を調製した。これらは、一般的手法により脱保護及び精
製して使用した。

【００３６】実施例１核酸固定化ゲル保持繊維の作製参考例１で得られた５'末端にビオチン基を有するオリ
ゴヌクレオチドを含む、以下の組成からなる水溶液を作
製した。アクリルアミド 3.7重量部メチレンビスアクリルアミド 0.3重量部 2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 0.1重量部ビオチン化オリゴヌクレオチド（プローブＡまたはプローブＢ） 0.005重量部アビジン化アガロース（６％）懸濁液 1.0重量部

【００３７】本溶液に25texの紡績糸2本を合糸した綿糸
（あらかじめメチルエチルケトンで洗浄後、乾燥）を浸
した後、内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移
し、８０℃にて４時間放置することにより重合反応を行
った。その結果、オリゴヌクレオチド（プローブＡまた
はプローブＢ）がビオチン−アビジン結合を介して固定
化されたゲルを保持した繊維が得られた。

【００３８】実施例２核酸固定化ゲル保持繊維配列体
の作製実施例１で得たプローブＡが固定化されたゲルを保持す
る繊維２０本を、テフロン板状に互いに重なることな
く、且つ密着させて配列し両端を固定した。これに、ポ
リウレタン樹脂接着剤(日本ポリウレタン工業(株)コロ
ネート4403、ニッポラン4223)を薄く塗布し、ポリウレ
タン樹脂が十分に固まった後、これをテフロン板上から
剥がし、プローブＡが固定化された核酸固定化ゲル保持
繊維が一列に配列したシート状物を得た。一方、プロー
ブＢが固定化された核酸固定化ゲル保持繊維について
も、同様の操作によりシート状物を得た。次いで、これ
らのシート状物を図１（３）の配列となるように２０枚
積層し、上記接着剤を使用して接着し、縦横各々２０本
ずつ、計４００本の繊維が規則的に正方に配列した核酸
固定化繊維配列体を得た。

【００３９】実施例３核酸固定化ゲル保持繊維配列体の薄片の作製：実施例２
で得られた核酸固定化ゲル保持繊維配列体を、繊維軸に
直角方向にミクロトームを用いて１００μｍの厚さに切
り出すことにより、縦横各々２０本、計４００本の繊維
断面が規則的に正方に配列された核酸固定化ゲル保持繊
維配列体の薄片を得た(図1(4))。

【００４０】参考例２試料核酸の標識：試料核酸のモデルとして、参考例１で
合成したオリゴヌクレオチド（プローブＡ、プローブ
Ｂ）の配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチド（Ｃ、
Ｄ）を合成した。オリゴヌクレオチドＣ： GAGCCCTCGCTCGTACAGCAAGGTTTC
G（配列番号３）オリゴヌクレオチドＤ： CTGCTGTCCCAAACCCTGACCTCCACC
（配列番号４）これらのオリゴヌクレオチドの5'末端を、参考例４と同
様にしてアミノリンクII（商標名）（ＰＥバイオシステ
ムズジャパン社）を用いてそれぞれのオリゴヌクレオチ
ドの５′未端にＮＨ₂（ＣＨ₂）₆−を導入した後、以下
のようにしてディゴキシゲニン(DIG: Digoxigenin、ロ
シュ・ダイアグノスティックス株式会社)で標識した。

【００４１】末端アミノ化されたオリゴヌクレオチドを
それぞれ100 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)に終濃度2 mMにな
るように溶かした。等量のDigoxigenin-3-O-methylcarb
onyl-ε-aminocapronic acid-N-hydroxy-succinimide e
ster (26mg/mlジメチルホルムアミド溶液)を加え、室温
にて一晩静置した。量を100μlに調整し、2μlのグリコ
ーゲン（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、
10μlの3M酢酸ナトリウム(pH5.2)、300μlの冷エタノー
ルを加え、15,000rpm 15分の遠心により沈殿を回収し
た。沈殿に500μlの70%エタノールを加え15,000rpm 5分
の遠心により沈殿を再びチューブの底に集めた。沈殿を
風乾し、100μlの10 mM Tris-HCl (pH7.5),1 mM EDTAに
溶かした。こうして得られたDIG標識オリゴヌクレオチ
ドを試料核酸のモデルとして用いた。

【００４２】参考例３ハイブリダイゼーション：実施例３で作製した核酸固定
ゲル保持繊維配列体の薄片をハイブリダイゼーション用
のバッグに入れ、以下の組成からなるハイブリダイゼー
ション溶液を注ぎ込み、４５℃で30分間プレハイブリダ
イゼーションを行った。参考例２で得られたＤＩＧ標識
ＤＮＡを加え、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。

【００４３】

【００４４】参考例４検出：ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定ゲル保
持繊維配列体の薄片を、あらかじめ保温しておいた５０
ｍｌの0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液に移し、振盪しながら2
0分間の洗浄を４５℃で３回行った。DIG緩衝液１を加
え、室温で振盪しながらSDSの除去を行った。これを再
度繰り返した後、DIG緩衝液２を加え１時間振盪した。
緩衝液を除いた後、DIG緩衝液２に10000分の１量の抗DI
Gアルカリフォスファターゼ標識抗体溶液を加えた溶液
１０mlを加え、30分間ゆっくり振盪させることにより抗
原抗体反応を行わせた。次に0.2% Tween 20を含むDIG緩
衝液１で15分間２回振盪することにより洗浄し、引き続
き DIG緩衝液３に３分間浸した。 DIG緩衝液３を除いた
後、AMPPDを含むDIG緩衝液３mlを加え、10分間平衡化し
た。

【００４５】水分をきり、新しいハイブリダイゼーショ
ン用バッグに移し、37℃で１時間おいた後、X線フィル
ム用のバインダーにX線フィルムとともに挟みフィルム
を感光させた。その結果、プローブＡが配置された場所
には、オリゴヌクレオチドＣが結合し、プローブＢが配
置された場所には、オリゴヌクレオチドＤが結合してい
ることが確認された。 DIG緩衝液１： 0.1 Mマレイン酸、0.15M塩化ナトリウム
(pH7.5) DIG緩衝液２： DIG緩衝液１に0.5%濃度でブロッキング
試薬を添加したもの DIG緩衝液３： 0.1 Mトリス−塩酸(pH9.5)、0.1 M塩化
ナトリウム、0.05M塩化マグネシウムブロッキング試薬：抗DIGアルカリフォスファター
ゼ標識抗体溶液および AMPPDはDIG Detectionキット
（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)中の試薬
である。

【００４６】

【発明の効果】本発明により、核酸固定ゲル保持繊維並
びに核酸固定ゲル保持繊維配列体及びその薄片が提供さ
れる。本発明によれば、核酸が任意に高密度且つ正確に
配列された核酸固定ゲル保持繊維配列体の繊維断面を有
する薄片を再現性よく効率的に得ることができる。この
薄片を用いて、検体中の核酸の種類および量を調べるこ
とができる。本発明を従来法と比較した利点、有用性と
しては、例えば、固定化プロセスを二次元平面上で行わ
ず、一次元構造体としての繊維上で分離・独立して行う
ことにより、鎖長によらず核酸の定量的固定が可能とな
ったこと、整列化プロセスに各種の繊維賦形技術、ない
し織物作製技術の導入による高密度化が可能となったこ
と、また、その結果得られる選られる三次元構造体とし
ての繊維束から目的とする二次元配列体を作製するた
め、従来法にはない薄片化プロセスが新たに導入された
が、それに伴いスポッティング法のような誤差の多い微
量分注操作が不要となり、連続切片化を通した多量生産
が可能となったこと等があげられる。

【００４７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUBISHI RAYON CO., LTD. <120> A FIBER HOLDING NUCLEIC ACID-FIXED GEL, AN ARRAY OF THE FIBERS AND A SLICE OF THE ARRAY <130> P99-0167 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27

【００４８】

【配列表フリーテキスト】

配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は核酸固定化ゲル保持繊維並びに核酸固定
ゲル保持繊維配列体及びその薄片の模式図である。(1)
はプローブＡが固定化された核酸固定ゲル保持繊維、
(2)はプローブＢが固定化された核酸固定ゲル保持繊
維、(3)はこれら２種の核酸固定ゲル保持繊維からなる
核酸固定ゲル保持繊維配列体、及び(4)はこの核酸固定
ゲル保持繊維配列体を繊維軸に対して垂直方向に切断し
た断面を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者藤井渉神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号三菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 (72)発明者秋田隆広島県大竹市御幸町20番１号三菱レイヨン株式会社中央技術研究所内 (72)発明者村瀬圭広島県大竹市御幸町20番１号三菱レイヨン株式会社中央技術研究所内 (72)発明者伊藤千穂広島県大竹市御幸町20番１号三菱レイヨン株式会社中央技術研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA09 HA11 4B029 AA21 BB20 CC05 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR55 QS34 4L033 AB02 AC15 BA45 BA76 CA01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】繊維の表面に核酸固定化ゲルが保持され
た核酸固定化ゲル保持繊維。
【請求項２】請求項１記載の核酸固定化ゲル保持繊維
の束を含む核酸固定化ゲル保持繊維配列体。
【請求項３】繊維配列体中の繊維が規則的に配列され
たものである請求項２記載の核酸固定化ゲル保持繊維配
列体。
【請求項４】繊維の束が、１ｃｍ²あたり１００本以
上の繊維を含むものである請求項２又は３記載の核酸固
定化ゲル保持繊維配列体。
【請求項５】核酸の種類が、各繊維の全部又は一部に
おいて異なるものである請求項２〜４のいずれか１項に
記載の核酸固定化ゲル保持繊維配列体。
【請求項６】請求項２〜５のいずれか１項に記載の繊
維配列体の繊維軸と交差する切断面を有する、前記核酸
固定化ゲル保持繊維配列体の薄片。