JP2000325083A - 核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体及びその薄片 - Google Patents

核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体及びその薄片

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JP2000325083A
JP2000325083A JP11138155A JP13815599A JP2000325083A JP 2000325083 A JP2000325083 A JP 2000325083A JP 11138155 A JP11138155 A JP 11138155A JP 13815599 A JP13815599 A JP 13815599A JP 2000325083 A JP2000325083 A JP 2000325083A
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Chiho Ito
千穂 伊藤
Takashi Akita
隆 秋田
Kei Murase
圭 村瀬
Fujio To
不二夫 湯
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Mitsubishi Rayon Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体及
びその薄片と核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層体
及びその薄片。 【効果】 本発明によれば、核酸が任意に高密度且つ正
確に二次元に配列された薄片を再現性よく効率的に得る
ことができる。この薄片を用いて、検体中の核酸の種類
および量を調べることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸が固定化され
た高分子材料に関する。詳しくは、核酸固定化ゲル保持
フィルムの積層体及びその薄片に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、各種生物におけるゲノムプロジェ
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ
る。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各
種の方法で調べることができるが、その有力な方法の一
つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝
子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリ
ダイゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸
間ハイブリダイゼーション反応や各種のPCR反応を利用
した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその
生体機能発現との関係を調べることができる。しかしな
がら、これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限が
ある。したがって、今日のゲノムプロジェクトを通して
明らかにされつつあるような、一個体レベルという極め
て多数の遺伝子から構成される複雑な反応系全体からみ
ると、上記方法により遺伝子の総合的・系統的解析を行
うことは困難である。最近になって、多数遺伝子の一括
発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡ
チップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開
発され、注目を集めている。
【０００３】これらの方法は、いずれも核酸：核酸間ハ
イブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法で
ある点で原理的には従来の方法と同じであるが、マイク
ロアレイ又はチップと呼ばれる平面基盤片上に、多数の
ＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられ
ている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体
的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子
等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基盤片上でハ
イブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色
素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方
法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺
伝子量を迅速に推定できる。即ち、この新しい方法の本
質は、基本的には反応試料の微量化と、その反応試料を
再現性よく多量・迅速・系統的に分析、定量しうる形に
配列・整列する技術との統合であると理解される。核酸
を基盤上に固定化するための技術としては、上記ノーザ
ン法同様、ナイロンシート等の上に高密度に固定化する
方法の他、更に密度を高めるため、ガラス等の基盤の上
にポリリジン等をコーティングして固定化する方法、あ
るいはシリコン等の基盤の上に短鎖の核酸を直接固相合
成していく方法などが開発されている。
【０００４】しかし、例えば、ガラス等の固体表面を化
学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸をスポッティン
グ固定化する方法[Science 270, 467-470(1995)]は、ス
ポット密度でシート法より優れるものの、スポット密度
及びスポット当たり固定できる核酸量がシリコン基盤上
における直接合成法(U.S.Patent 5,445,934、U.S.Paten
t 5,774,305）と比較して少量であり、再現が困難であ
る点が指摘されている。他方、シリコン等の基盤の上に
フォトリソグラフィー技術を用い、多種の短鎖核酸をそ
の場で規則正しく固相合成していく方法に関しては、単
位面積当たりに合成しうる核酸種数（スポット密度）及
びスポット当たりの固定化量（合成量）、並びに再現性
等において、スポッティング法より優れるとされるもの
の、固定化しうる化合物種は、フォトリソグラフィーに
より制御可能な比較的短鎖の核酸に限られる。さらに、
高価な製造装置と多段の製造プロセスにより、チップ当
たりの大きなコストダウンが困難とされる。その他、微
小な担体上に核酸を固相合成しライブラリー化する手法
として、微小なビーズを利用する方法が知られている。
この方法は、チップ法より長鎖の核酸を多種・安価に合
成することが可能であり、またｃＤＮＡ等より長鎖の核
酸も固定可能と考えられる。しかしながら、チップ法と
異なり、指定の化合物を指定の配列基準で再現性よく整
列させたものを作製することは困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このような状況下、鎖
長によらず核酸を所定の濃度に固定化でき、測定可能な
形に高密度に再現よく配列化可能で、安価な大量製造に
適応しうる新たな体系的方法論の確立は、今後重要性を
増すと考えられる遺伝子解析に強く求められるものであ
り、本発明が解決しようとする課題である。
【０００６】具体的には、本発明が解決しようとする課
題は、ナイロンシートやガラス基盤のような二次元担体
上への微量スポッティングや微量分注による核酸配列体
製造法に比べ、核酸固定化量が高く、単位面積あたり配
列される核酸分子種の高密度化が可能で、大量生産によ
り適した配列体、すなわち核酸が固定化された二次元的
（平面的）配列体（固定化核酸二次元配列体という）の
製造法の確立である。また、本発明が解決しようとする
課題はシリコン基盤上へのフォトリソグラフィーと固相
合成との組み合わせによる高密度オリゴ核酸配列体製造
法と比べ、ｃＤＮＡを含む長鎖の核酸にも適応可能で、
製造コストのより低い固定化核酸二次元配列体製造法の
確立である。そこで、本発明は、核酸が固定化された核
酸固定化ゲル保持フィルムの積層体及びその薄片を提供
することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の如
き課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、核酸配列
化プロセスと固定化プロセスとを同一の二次元担体上で
行う従来法の発想を改め、各種核酸の固定化プロセスを
フィルムにそれぞれ独立して行い、それらの配列化プロ
セスに各種のフィルム賦形、積層技術を導入することに
より核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体を作製し、得
られる積層体の薄片化プロセスを経ることで、固定化核
酸二次元配列体を作製し得ることを見いだし、本発明を
完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、核酸が固定化された
ゲルを保持する核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）を積
層してなる、核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体
（Ａ）である。該積層体（Ａ）としては、１ｃｍあたり
１０層以上の核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）を含む
ものが挙げられる。また、固定化する核酸の種類が、核
酸固定化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）を構成する各
核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）の全部又は一部にお
いて異なるものも、本発明の核酸固定化フィルムの積層
体（Ａ）に含まれる。
【０００９】さらに、本発明は、前記核酸固定化ゲル保
持フィルムの積層体（Ａ）をフィルムの厚さ方向に切断
してなる、核酸固定化ゲル保持フィルム積層体断面を有
する薄片（Ｓ）である。さらに、本発明は、前記薄片
（Ｓ）の切断面を接合面として順次積層してなる、核酸
固定化ゲル保持フィルム断面を有する薄片の積層体
（Ｂ）である。該積層体（Ｂ）としては、１ｃｍあたり
１０層以上の薄片（Ｓ）を含むものが挙げられる。ま
た、固定化する核酸の種類が、積層体（Ａ）及び積層体
（Ｂ）を構成する各核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）
の全部又は一部において異なるものも、本発明の積層体
（Ｂ）に含まれる。
【００１０】さらに、本発明は、前記核酸固定化ゲル保
持フィルム断面を有する薄片の積層体（Ｂ）を薄片の厚
さ方向に切断してなる、核酸固定化ゲル保持フィルム断
面を有する薄片（Ｐ）である。該薄片（Ｐ）としては、
１cm2あたり、１００以上の核酸固定化ゲル保持フィル
ム（Ｆ）の断面を含むものが挙げられる。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、核酸が固定されたゲルを保持するフィルムを
重ねて層状にした積層体に関し、また、該積層体をフィ
ルムの厚さ方向に切断することにより得られる薄片に関
する。本発明の積層体及び薄片を作製するための概要を
以下に説明する（図８）。
【００１２】図８において、フィルム11〜16の6種類を
積層すべきフィルムとして使用する場合を例示する。こ
れらフィルムには核酸が固定化されたゲルが含まれてい
る。上記フィルムは、ｘ、ｙ及びｚ軸の3次元座標にお
いて、ｘｙ平面を基準として、ｚ軸方向に積層する。そ
して、フィルム11〜13を積層すると積層体（A1)、フィ
ルム14〜16を積層すると積層体（A2)を得ることができ
る（図８(b)）。次に、フィルムの厚さ方向に積層体を
切断（スライス）する。すなわち、積層体(A1)及び(A2)
を、ｙｚ平面により、x軸に交差する方向に切断する
（図8(c))。その結果、積層体(A1)については薄片S1
を、積層体(A2)については薄片S2を得ることができる。
【００１３】薄片S1及びS2には、それぞれフィルム11〜
13、フィルム14〜16に対応する層が作られている。フィ
ルム11〜13及びフィルム14〜16に固定する核酸の種類を
変えると、それぞれ3種類の核酸の層からなる薄片を得
ることができる。従って、薄片S1及びS2を任意に組み合
わせて積層することにより、種々の核酸が固定されたゲ
ルを含むフィルムの積層体を得ることができる。例え
ば、図８においてS1、S2、S1の順に積層したとすると
（図8(d))、得られる積層体の1層目にはフィルム11〜1
3、2段目にはフィルム14〜16、3段目にはフィルム11〜1
3の層からなる積層体(B)を得ることができる（図８
(e))。積層体(B)は、ｘｚ平面においてフィルム１〜６
がすべて表出している（露出している）ため、本発明に
おいてはこのすべてのフィルムが表れている面を切断面
として切断する。すなわち、積層体(B)をｘｚ平面でy軸
方向に交差するように切断する。その結果、フィルム11
〜16に含まれる核酸のすべてを含む薄片（薄片P)を得る
ことができる（図８(f))。本発明において、ゲルに固定
化する対象となる核酸としては、デオキシリボ核酸（Ｄ
ＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。本発明に用
いる核酸は、市販のものでもよく、また、生細胞などか
ら得られた核酸でもよい。
【００１４】生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、
公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの
方法（ Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (19
76)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Faval
oroらの方法（ Favaloro etal., Methods Enzymol.65:
718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核
酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮ
Ａや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化
学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合
成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド
等を用いることもできる。
【００１５】本発明に用いることができるゲルの種類は
特に制限されないが、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ
−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールア
クリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチ
ルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキス
トリン等の単量体の一種類または二種類以上とメチレン
ビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコール
ジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体を共重合
したゲルを用いることができる。その他本発明に用いる
ことができるゲルとして、例えば,アガロース、アルギ
ン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチ
レングリコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲル
を用いることができる。
【００１６】本発明では、核酸をそのままゲルに固定化
してもよく、また、核酸に化学的修飾を施した誘導体
や、必要に応じて変成させた核酸を固定化してもよい。
核酸のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方
法や、ゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよ
く、核酸を一旦高分子体や無機粒子などの担体に共有結
合又は非共有結合により結合させ、その担体をゲルに固
定化してもよい。
【００１７】例えば、核酸の末端基にビニル基を導入し
（ＷＯ98/39351）、アクリルアミド等のゲルの構成成分
と共重合させることができる。共重合においては、単量
体、多官能性単量体及び重合開始剤と共に共重合する方
法、単量体及び重合開始剤と共に共重合したのち、架橋
剤でゲル化する方法などがある。
【００１８】また、アガロースを臭化シアン法でイミド
カルボネート化しておき、末端アミノ化した核酸のアミ
ノ基と結合させてからゲル化することもできる。この
際、核酸固定化したアガロースと他のゲル、例えばアク
リルアミドゲル等との混合ゲルにしてもよい。
【００１９】その他の方法としては、高分子粒子や無機
粒子等の担体に核酸を結合し、該粒子を上述のゲルに包
括固定化する方法が挙げられる。例えば、ビオチン化し
た核酸とアビジン化したアガロースビーズ（シグマ社製
アビジン化アガロース等）を反応させることによっ
て、核酸が固定化されたアガロースビーズを得ることが
できる。核酸固定化アガロースビーズはアクリルアミド
ゲル等に包括固定化することができる。また、ゲルや担
体への結合においては、グルタルアルデヒドや１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド(EDC)等の架橋剤を用いて結合させることもできる。
【００２０】核酸の一般的な化学的修飾としては、アミ
ノ化、ビオチン化、ディゴキシゲニン化等が知られてい
るが[Current Protocols In Molecular Biology, Ed.;
Frederick M. Ausubel et al.(1990)、脱アイソトープ
実験プロトコール(1)ＤＩＧハイブリダイゼーション
（秀潤社）]、本発明ではこれらのいずれの修飾法も採
用することができる。一例として、核酸へのアミノ基導
入に関して説明する。
【００２１】アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本
鎖核酸との結合位置は特に限定されるものではなく、核
酸の５’末端または３’末端のみならず核酸の鎖中（例
えば、リン酸ジエステル結合部位または塩基部位）であ
ってもよい。この一本鎖核酸誘導体は、特公平3-74239
号公報、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等
に記載の方法にしたがって調製することができる。この
方法以外にも、例えば、市販のアミノ基導入用試薬［例
えば、アミノリンクII（商標名）；ＰＥバイオシステム
ズジャパン社、Amino Modifiers（商標名）；クロンテ
ック社］などを用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン酸
にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の
方法（Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983) ）にし
たがって調製することができる。
【００２２】本発明において、核酸の固定化したゲルを
保持することができるフィルム材料としては、特に限定
されるものではないが、合成高分子、半合成高分子、天
然高分子等を材料とするフィルムを用いることができ
る。合成高分子としては、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリスチレン及びその共重合物、ポリ塩化ビニル、
ポリ塩化ビニリデン、ポリカーボネート、ポリメチルメ
タクリレート、飽和ポリエステル、ポリビニルアルコー
ル、ポリアミド（例えばナイロン６、ナイロン６６、ナ
イロン６１０、ナイロン１１等）、ポリイミド、ポリフ
ェニレンオキシド、ポリスルホン、ポリパラキシレン、
ポリアミドイミド、ポリエステルイミド、ポリベンゾイ
ミダゾール等が挙げられる。
【００２３】半合成樹脂の代表例としては、ジアセテー
ト、トリアセテート、キトサン等のセルロース系誘導体
が挙げられる。天然高分子の代表例としては、セルロー
ス、でんぷん、キチン、コラーゲン等が挙げられる。本
発明に用いるフィルムの厚みは、特に規定されるもので
はないが、好ましくは０．１μｍから１０００μｍであ
る。
【００２４】本発明に用いるフィルムは、特にその形態
が規定されるものではない。例えば、平滑な表面を有す
るものでもよく、多孔質膜又は多孔質表面を有するもの
でもよく、不織布等でもよい。この場合、核酸の固定化
したゲルを保持する領域としてフィルム表面、フィルム
内部又はフィルム内部の空隙等を利用することも可能で
ある。本発明に用いるフィルムは、無処理の状態でその
まま用いてもよいが、必要に応じて、反応性官能基を導
入したフィルムであってもよく、また、プラズマ処理や
γ線、電子線などの放射線処理を施したフィルムであっ
てもよい。
【００２５】核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）を作製
する方法は、特に制限されるものではない。例えば、
核酸自体若しくは末端に重合性基を有する核酸、または
高分子粒子若しくは無機粒子等の担体に核酸を結合した
粒子を、単量体、多官能性単量体及び開始剤を含む反応
液に混合し、得られる液をフィルムにスピンコート、ロ
ールコート、ディップコート、スクリーン印刷等により
塗布または含浸し、重合してゲル化させる方法、単量
体、開始剤及び末端に重合性基を有する核酸を共重合し
たものと架橋剤とを混合した液を、上記と同様に塗布
または含浸しゲル化する方法、核酸自体、または高分
子粒子若しくは無機粒子等の担体に核酸を結合した粒子
に、単量体を開始剤で重合したものおよび架橋剤を混合
し、得られる液を、と同様に塗布または含浸しゲル化
する方法、アガロース等に固定化された核酸を加熱溶
解し、同様にフィルムに塗布または含浸し、冷却ゲル化
させる方法等が挙げられる。
【００２６】上記の通り調製された核酸固定化ゲル保持
フィルム（Ｆ）（図１）は、本発明の核酸固定化ゲル保
持フィルム積層体（Ａ）を構成する基本単位とすること
ができる。そして、これらの核酸固定化ゲル保持フィル
ム（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，・・・・Ｆｎ）を順次積層し
て、核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）となす
ことができる（図２）。この際、積層するフィルムの層
数は特に限定されるものではないが、通常は、１０〜
１,０００層となるように積層することが好ましい。各
核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，・・
・・Ｆｎ）の各々のフィルムに固定化されている核酸の
種類は、それぞれ異なる種類の核酸とすることが可能で
あり、また、同一の核酸が固定化されたフィルムは、任
意の層数に積層させることも可能である。
【００２７】フィルムの積層方法は、特に限定されるも
のではなく、一般的に知られる積層方法、たとえばラミ
ネート加工法により接着することができる。ラミネート
加工法としては、ホットメルトラミネート、ドライラミ
ネート、ウェットラミネート等が挙げられる。
【００２８】ホットラミネートに用いられる接着剤とし
ては低分子量ポリエチレン−酢酸ビニル共重合体、パラ
フィンワックス、エチレン−アクリル酸エステル共重合
体などが使用され、これらを加熱溶融して塗布した後直
ちに圧着し積層することができる。
【００２９】ドライラミネートに用いられる接着剤とし
ては、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデンなどの
ビニル系樹脂、ニトロセルロース、エチルセルロースな
どのセルロース系樹脂、エポキシ系樹脂、ゴム系樹脂な
どが挙げられ、これらの溶液をフィルムにコーティング
した後乾燥し、その後加圧または、加熱加圧して圧着
し、積層することができる。
【００３０】ウェットラミネートに用いられる接着剤と
しては例えばカゼイン、グルテン、ゼラチン、デキスト
リン、澱粉等の水溶性の接着剤や、ポリ塩化ビニル、ポ
リ酢酸ビニル、ポリビニルブチラール、酢酸ビニル−ア
クリル酸エステルの共重合体等のエマルション、合成ゴ
ムラテックス等が挙げられ、これらを塗布した後直ちに
圧着し、乾燥して積層することができる。
【００３１】上記の通り調製された核酸固定化ゲル保持
フィルムの積層体（Ａ）を、図３に示すごとくフィルム
の厚さ方向、好ましくはフィルム積層平面に対して垂直
な平面方向に切断することにより、図４に示すような核
酸固定化ゲル保持フィルム積層体断面を有する薄片
（Ｓ）を得ることができる。この際の切断方法として
は、例えば、ミクロトームを用いて配列体から薄片を切
り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整す
ることができるが、通常０．１〜１０００μｍである。
核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ１，Ａ２，Ａ
３，・・・Ａｎ）を切断することにより得られた核酸固
定化ゲル保持フィルム断面を有する薄片（Ｓ１，Ｓ２，
Ｓ３，・・・・Ｓｎ）は、その断面を接合面として順次
積層することで、図５に示す核酸固定化ゲル保持フィル
ム断面を有する薄片の積層体（Ｂ）を得ることができ
る。この際、積層する薄片の層数は特に限定されるもの
ではないが、通常は、１０〜１,０００層となるように
積層することが好ましく、積層体の厚さ方向に１ｃｍあ
たり１０層以上の薄片（Ｓ）を含むものが好ましい。各
薄片（Ｓ）は、各々異なる核酸固定化ゲル保持フィルム
の積層体（Ａ）から得られたものでも、同一の核酸固定
化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）から得られたもので
もよい。核酸固定化ゲル保持フィルム断面を有する薄片
の積層体（Ｂ）中の各々の核酸固定化ゲル保持フィルム
（Ｆ）に固定化されている核酸の種類は、それぞれ異な
る種類の核酸とすることが可能である。また、同一の核
酸が固定化された核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）は
任意の数を含むこともできる。即ち、本発明によれば、
固定化された核酸の種類と配列の順序に関しては、目的
に応じて任意に設定することが可能である。
【００３２】この場合に、フィルムに保持されたゲルに
固定化された核酸の種類があらかじめ決められた状態で
積層することが望ましいが、必ずしもそのように積層さ
せる必要はない。その理由は、積層体を形成する段階で
はフィルムに保持されたゲルに固定化した核酸の種類が
不明でも、積層体の断面を切断した後、一旦ハイブリダ
イゼーション手法等を用いて断面における核酸の種類と
配置位置を決定することにより、特定の核酸が固定され
たゲルが保持されたフィルムの位置を確認することがで
きるためである。従って、この手法を用いて、一度、薄
片内に配置された複数種類の核酸の種類と位置を決定し
ておけば、同一配列体から得られる薄片はすべて同一の
位置配置であるので、同一積層体から得られるすべての
薄片の核酸の位置配置がわかる。
【００３３】本発明においては、上記の通り調整された
核酸固定化ゲル保持フィルム断面を有する薄片の積層体
（Ｂ）を、図６に示すごとく薄片の厚さ方向、好ましく
は薄片積層面に対して垂直な平面方向に切断することに
より、図７に示す核酸固定化ゲル保持フィルム断面を有
する薄片（Ｐ）を得ることができる。この際の切断方法
としては、例えば、ミクロトームを用いて配列体から薄
片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に
調整することができるが、通常１〜５,０００μｍ、好
ましくは１０〜２,０００μｍである。
【００３４】得られた核酸固定化ゲル保持フィルム断面
を有する薄片の積層体（Ｂ）の薄片（Ｐ）には、該配列
体を構成する核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）の数に
応じた核酸が存在する。薄片の断面積あたりの核酸の数
に関しては、用いる核酸固定化ゲル保持フィルムの厚さ
又は固定化方法等を適宜選択することにより、薄片断面
積１ｃｍ2あたり１００以上、更には１０００以上の核
酸が固定化された薄片を作製することも可能である。
【００３５】これら核酸固定化ゲル保持フィルム断面を
有する薄片（Ｓ）及び（Ｐ）は、固定化された核酸をプ
ローブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーショ
ンを行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する
核酸の検出に用いることができる。本発明で言うプロー
ブとは、狭義には検出すべき遺伝子の塩基配列に少なく
とも一部が相補的な塩基配列を有する核酸を指す。即
ち、薄片（Ｓ）又は薄片（Ｐ）を検体と反応させてハイ
ブリダイゼーションを行い、プローブと相補的な検体中
に存在する核酸とのハイブリッドを形成させ、このハイ
ブリッドを検出することにより、目的とする塩基配列を
有する検体中の核酸を検出することができる。
【００３６】また、本発明で言うプローブとは、広義に
は検体中に存在するタンパク質や低分子化合物等と特異
的に結合することができる核酸を指す。従って、これら
の薄片の利用法としては、固定化された核酸（プロー
ブ）とハイブリッドを形成する核酸を検出するための利
用に留まらず、固定化された核酸と特異的に結合するタ
ンパク質や低分子化合物等の各種試料（例えば生体成分
等）を検出するための利用が挙げられる。
【００３７】固定化された核酸とハイブリッドを形成す
る核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生
体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。
例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等
に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標
識体を作用させ、この標識体を検出することができる。
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、
何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用い
ることができる。
【００３８】
【実施例】本発明を以下の実施例によって更に詳細に説
明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的
範囲が限定されるものではない。 〔参考例１〕オリゴヌクレオチド及び5'末端にアミノ基
を有するオリゴヌクレオチドの調製：以下に示したオリ
ゴヌクレオチド（プローブＡ、プローブＢ）を合成し
た。
【００３９】プローブＡ: GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCG
AGGGCTC（配列番号１） プローブＢ: GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配
列番号２） オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシステムズ社の
自動合成機DNA/RNA synthesizer (model394)を用いて行
い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、ビオチンアミダイト
を用いてビオチン化したプローブを調製した。これら
は、一般的手法により脱保護及び精製して使用した。
【００４０】〔実施例１〕核酸固定化ゲル保持フィルム
の作製（１）：ポリエチレンテレフタレートフィルム
（帝人テトロン フィルム厚み２０μｍ）に、オリゴヌ
クレオチド（プローブＡ及びＢ）を固定化したゲルをそ
れぞれ、以下の方法により保持させた。参考例１で得ら
れた５’末端にビオチン基を有するオリゴヌクレオチド
を含む、以下の組成からなる溶液を作製した。
【００４１】 アクリルアミド 3.8重量部 メチレンビスアクリルアミド 0.3重量部 2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 0.1重量部 ビオチン化オリゴヌクレオチド（プローブＡまたはプローブＢ） 0.005重量部 アビジン化アガロース（６％）懸濁液（シグマ社） 1.0重量部 アガロース水溶液（０．２％） 94.8重量部
【００４２】２cm角のポリエチレンテレプタレートフィ
ルムを、ヤマト化学株式会社製プラズマエッチング装置
(PLASMA REACTOR MODEL PR-302)を用いて、酸素流量
１００ml/min、ＲＦ出力１００Ｗで、１分間プラズマエ
ッティングを行った後、上記溶液を厚さ３０μｍになる
ようにドクターブレードを用いて塗布し、窒素置換され
内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、８０
℃にて４時間放置することにより重合反応を行った。そ
の結果、オリゴヌクレオチド（プローブＡまたはプロー
ブＢ）がビオチン−アビジン結合を介して固定化された
ゲルをその表面に保持した核酸固定化ゲル保持フィルム
が得られた。
【００４３】〔実施例２〕核酸固定化ゲル保持フィルム
の作製（２）:セルロースアセテートフィルム（アドバ
ンテック製、厚さ１２５μｍ）に対し実施例１に記載
の、参考例１で得られた５’末端にビオチン基を有する
オリゴヌクレオチドを含む溶液を含浸させ実施例１と同
様に重合反応を行った。その結果、オリゴヌクレオチド
（プローブＡまたはプローブＢ）がビオチン−アビジン
結合を介して固定化されたゲルをその内部に保持した核
酸固定化ゲル保持フィルムが得られた。
【００４４】〔実施例３〕核酸固定化ゲル保持フィルム
の積層体（Ａ）の作製：実施例１で得た、プローブＡが
固定化されたゲルがポリエチレンテレフタレートフィル
ムに保持された核酸固定化ゲル保持フィルムの非固定化
面に、実施例１で得られた、プローブＢが固定化された
核酸固定化ゲル保持フィルムの固定化面を圧着した。同
様な操作を繰り返すことで、積層数２０層の核酸固定化
ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）を得た。
【００４５】実施例２で得た、オリゴヌクレオチド（プ
ローブＡまたはプローブＢ）がビオチン−アビジン結合
を介して固定化されたゲルをその内部に保持した核酸固
定化ゲル保持フィルムについても同様の操作により積層
数２０層の核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体
（Ａ’）を得た。
【００４６】〔実施例４〕核酸固定化ゲル保持フィルム
積層体断面を有する薄片（Ｓ）の作成：実施例３で得ら
れた核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）及び
（Ａ’）を、フィルムの厚さ方向に、フィルムに垂直に
ミクロトームを用いて１００μｍの厚さに切り出すこと
により、核酸固定化ゲル保持フィルム積層体断面を有す
る薄片（Ｓ）及び（Ｓ’）を得た。 〔実施例５〕核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層体
（Ｂ）の作成：実施例４で得られた断面を接合面として
順次積層し、積層数２０層の核酸固定化ゲル保持フィル
ム断面の積層体（Ｂ）及び（Ｂ’）を得た。
【００４７】〔実施例６〕前記核酸固定化ゲル保持フィ
ルム断面の積層体の薄片（Ｐ）の作製：実施例５で得ら
れた核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層体（Ｂ）及
び（Ｂ’）を、図に示すごとくミクロトームを用いて１
００μｍの厚さに切り出すことにより、縦横各々２０層
計４００層の核酸固定化ゲル保持フィルムが規則的に
正方に配列された前記核酸固定化ゲル保持フィルム断面
の積層体の薄片（Ｐ）および（Ｐ’）を得た。
【００４８】〔参考例２〕試料核酸の標識：試料核酸の
モデルとして、参考例４で合成したオリゴヌクレオチド
（プローブＡ、プローブＢ）の配列の一部に相補的なオ
リゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ）を合成した。 オリゴヌクレオチドＣ： GAGCCCTCGCTCGTACAGCAAGGTTTC
G（配列番号３） オリゴヌクレオチドＤ： CTGCTGTCCCAAACCCTGACCTCCACC
（配列番号４）
【００４９】これらのオリゴヌクレオチドの5'末端を、
参考例１と同様にしてアミノリンクII（商標名）（ＰＥ
バイオシステムズジャパン社）を用いてそれぞれのオリ
ゴヌクレオチドの５'未端にＮＨ2（ＣＨ2）6−を導入し
た後、以下のようにしてディゴキシゲニン(DIG: Digoxi
genin、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で標
識した。
【００５０】末端アミノ化されたオリゴヌクレオチドを
それぞれ100 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)に終濃度2 mMにな
るように溶かした。等量のＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−３
−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ−ε−ａｍｉｎｏ
ｃａｐｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓ
ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ （２６ｍｇ／ｍｌ
ジメチルホルムアミド溶液)を加え、室温にて一晩静置
した。
【００５１】量を100μlに調整し、2μlのグリコーゲン
（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、10μl
の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)、300μlの冷エタノールを加
え、15,000rpm 15分の遠心により沈殿を回収した。沈殿
に500μlの70%エタノールを加え15,000rpm 5分の遠心に
より沈殿を再びチューブの底に集めた。沈殿を風乾し、
100μlの10 mM Tris-HCl (pH7.5),1 mM EDTAに溶かし
た。こうして得られたDIG標識オリゴヌクレオチドを試
料核酸のモデルとして用いた。
【００５２】〔参考例３〕ハイブリダイゼーション：実
施例４で作製した核酸固定化ゲル保持フィルム積層体断
面を有する薄片（Ｓ）及び（Ｓ’）並びに実施例（６）
で製作した前記核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層
体の薄片（Ｐ）および（Ｐ’）をハイブリダイゼーショ
ン用のバッグに入れ、以下の組成からなるハイブリダイ
ゼーション溶液を注ぎ込み、４５℃で30分間プレハイブ
リダイゼーションを行った。次に、参考例２で得られた
ＤＩＧ標識ＤＮＡを加え、４５℃で １５時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。
【００５３】 ハイブリダイゼーション溶液組成： ─────────────────────────────────── 5xSSC(0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、pH7.0） 5% ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社） 0.1% N- ラウロイルザルコシンナトリウム 0.02% SDS（ラウリル硫酸ナトリウム） 50%ホルムアミド ───────────────────────────────────
【００５４】〔参考例４〕検出：ハイブリダイゼーショ
ン終了後、核酸固定化薄片を、あらかじめ保温しておい
た５０ｍｌの0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液に移し、振盪し
ながら20分間の洗浄を４５℃で３回行った。
【００５５】下記組成のDIG緩衝液１を加え、室温で振
盪しながらSDSの除去を行った。これを再度繰り返した
後、下記組成のDIG緩衝液２を加え１時間振盪した。緩
衝液を除いた後、DIG緩衝液２に10000分の１量の抗DIG
アルカリフォスファターゼ標識抗体溶液を加えた溶液１
０mlを加え、30分間ゆっくり振盪させることにより抗原
抗体反応を行わせた。次に0.2% Tween 20を含むDIG緩衝
液１で15分間２回振盪することにより洗浄し、引き続き
下記組成のDIG緩衝液３に３分間浸した。 DIG緩衝液３
を除いた後、AMPPDを含むDIG緩衝液３mlを加え、10分間
平衡化した。
【００５６】水分をきり、新しいハイブリダイゼーショ
ン用バッグに移し、37℃で１時間おいた後、X線フィル
ム用のバインダーにX線フィルムとともに挟みフィルム
を感光させた。その結果、何れも、プローブＡが配置さ
れた場所には、オリゴヌクレオチドＣが結合し、プロー
ブＢが配置された場所には、オリゴヌクレオチドＤが結
合していることが確認された。
【００５７】DIG緩衝液１： 0.1 Mマレイン酸、0.15M塩
化ナトリウム(pH7.5) DIG緩衝液２： DIG緩衝液１に0.5%濃度でブロッキング
試薬を添加したもの DIG緩衝液３： 0.1 Mトリス−塩酸(pH9.5)、0.1 M塩化
ナトリウム、0.05M 塩化マグネシウム ブロッキング試薬 ： 抗DIGアルカリフォスファター
ゼ標識抗体溶液および AMPPDはDIG Detectionキット
（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)中の試薬
である。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、核酸固定化ゲル保持フィ
ルムの積層体及びその薄片と核酸固定化ゲル保持フィル
ム断面の積層体及びその薄片が提供される。本発明によ
れば、核酸が任意に高密度且つ正確に二次元に配列され
た薄片を再現性よく効率的に得ることができる。この薄
片を用いて、検体中の核酸の種類および量を調べること
ができる。
【００５９】本発明を従来法と比較した利点、有用性と
しては、例えば、固定化プロセスをフィルム上で分離・
独立して行うことにより、鎖長によらず核酸の定量的固
定が可能となったこと、任意の厚みのフィルムを積層す
ることにより測定可能な形に高密度に再現よく配列化可
能となったこと、また、その結果得られる選られる三次
元構造体としての積層体から目的とする二次元配列体を
作製するため、従来法にはない薄片化プロセスが新たに
導入されたが、それに伴いスポッティング法のような誤
差の多い微量分注操作が不要となり、連続切片化を通し
た多量生産が可能となったこと等があげられる。
【００６０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUBISHI RAYON CO., LTD. <120> AN ARRAY OF A FILM HOLDING NUCLEIC ACID-FIXED GEL, AND A SLICE OF THE ARRAY <130> P99-0239 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27
【００６１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）を示す図で
ある。
【図２】核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）を
示す図である。
【図３】核酸固定化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）の
切断方法の概念を示す図である。
【図４】核酸固定化ゲル保持フィルム積層体断面を有す
る薄片（Ｓ）を示す図である。
【図５】核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層体
（Ｂ）を示す図である。
【図６】核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層体
（Ｂ）を薄片状に切断する切断方法の概念を示す図であ
る。
【図７】核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層体の薄
片（Ｐ）を示す図である。
【図８】本発明の積層体及び薄片を作製するための概要
を示す図である。
【符号の説明】
１…核酸固定化ゲルを保持するフィルム, ２…核酸固定
化ゲルを保持した面 ３…１層目の核酸固定化ゲル保持フィルムＦ１, ４…２
層目の核酸固定化ゲル保持フィルムＦ２,５…３層目の
核酸固定化ゲル保持フィルムＦ３, ６…n層目の核酸固
定化ゲル保持フィルムＦｎ, ７…切断された核酸固定化
ゲル保持フィルム積層体断面を有する薄片（Ｓ）,８…
１層目の核酸固定化ゲル保持フィルム積層体断面を有す
る薄片（Ｓ１）,９…ｎ層目の核酸固定化ゲル保持フィ
ルム積層体断面を有する薄片（Ｓｎ）,１０…切断され
た前記核酸固定化ゲル保持フィルム断面の積層体の薄片
（Ｐ） １１…核酸固定化ゲル保持フィルム, １２…核酸固定化
ゲル保持フィルム,１３…核酸固定化ゲル保持フィルム,
１４…核酸固定化ゲル保持フィルム,１５…核酸固定化
ゲル保持フィルム, １６…核酸固定化ゲル保持フィルム
フロントページの続き (72)発明者 村瀬 圭 広島県大竹市御幸町20番１号 三菱レイヨ ン株式会社中央技術研究所内 (72)発明者 湯 不二夫 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC03 CC05 FA15 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR55 QR56 QR84 QR85 QR90 QS34 QS35 QS39 QX02 4F100 AJ09A BA01 BA22 BA25 BA26 BA42 DE10 EJ32 JC00 JL02 JM10A YY00A

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸が固定化されたゲルを保持する核酸
    固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）を積層してなる、核酸固
    定化ゲル保持フィルムの積層体（Ａ）。
  2. 【請求項２】 積層体（Ａ）が、１ｃｍあたり１０層以
    上の核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）を含むものであ
    る、請求項１記載の積層体（Ａ）。
  3. 【請求項３】 固定化する核酸の種類が、核酸固定化ゲ
    ル保持フィルムの積層体（Ａ）を構成する各核酸固定化
    ゲル保持フィルム（Ｆ）の全部又は一部において異なる
    ものである、請求項１または２に記載の積層体（Ａ）。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３記載のいずれか1項に記載
    の積層体（Ａ）をフィルムの厚さ方向に切断してなる、
    核酸固定化ゲル保持フィルム断面を有する薄片（Ｓ）。
  5. 【請求項５】 請求項４記載の薄片（Ｓ）の切断面を接
    合面として積層してなる、核酸固定化ゲル保持フィルム
    断面を有する薄片の積層体（Ｂ）。
  6. 【請求項６】 積層体（Ｂ）が、１ｃｍあたり１０層以
    上の薄片（Ｓ）を含むものである、請求項５記載の積層
    体（Ｂ）。
  7. 【請求項７】 固定化する核酸の種類が、積層体（Ａ）
    及び積層体（Ｂ）を構成する各核酸固定化ゲル保持フィ
    ルム（Ｆ）の全部又は一部において異なるものである、
    請求項５または６に記載の積層体（Ｂ）。
  8. 【請求項８】 請求項５〜７のいずれか１項に記載の積
    層体（Ｂ）を薄片の厚さ方向に切断してなる、核酸固定
    化ゲル保持フィルム断面を有する薄片（Ｐ）。
  9. 【請求項９】 薄片（Ｐ）が、１cm2あたり１００以上
    の核酸固定化ゲル保持フィルム（Ｆ）の断面を含むもの
    である、請求項８記載の薄片（Ｐ）。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002254554A (ja) * 2001-02-27 2002-09-11 Asahi Denka Kogyo Kk デオキシリボ核酸材料
JP2002347164A (ja) * 2001-05-23 2002-12-04 Sumitomo Chem Co Ltd 配向薄膜及びその製造方法

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